العزلة والتحليل الوظيفي من الميتوكوندريا من الخلايا المستزرعة وماوس الأنسجة

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Lampl, T., Crum, J. A., Davis, T. A., Milligan, C., Del Gaizo Moore, V. Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue. J. Vis. Exp. (97), e52076, doi:10.3791/52076 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

الخلايا الحية مصرف الطاقة الأيضية في شكل الدهون والكربوهيدرات وتستخدم هذه الطاقة لالحيوي والنقل الغشاء والحركة. يتم الحصول على بعض الطاقة في العصارة الخلوية من خلال تحويل السكريات الغذائية مباشرة إلى ATP خلال تحلل. ومع ذلك، يتم تسخير المصدر الرئيسي لإنتاج ATP في زنزانة داخل الميتوكوندريا عبر السلسلة التنفسية الميتوكوندريا 1. بنية الميتوكوندريا توفر التوجه المكاني الضروري لإنتاج ATP فعالية وكفاءة. الميتوكوندريا تمتلك غشاء مزدوج مفصولة مساحة intermembrane وجنبا إلى جنب مع المصفوفة، حجرة الميتوكوندريا أعمق، منزل مكونات وتنسيق التفاعلات الكيميائية تشارك في توليد ATP. يحتوي الغشاء الداخلي سلسلة من المجمعات بروتين محدد الغشاء الذي تتكون من السلسلة التنفسية وكذلك سينسيز اعبي التنس المحترفين، مجمع البروتين الذي يجلب ADP وبي معا لتشكيل ATP. نزليتم طي الغشاء إيه إلى أعراف ويتم تمرير الإلكترونات على طول سلسلة المجمعات الجهاز التنفسي عن طريق السيتوكروم ج، حاملة الإلكترون القابلة للذوبان والتي تتحرك بين المجمعات داخل الفضاء intermembrane. كما تتحرك الإلكترونات، والأكسدة للحد من حكمه يحدث ويتم ضخ أيونات الهيدروجين من المصفوفة إلى الفضاء intermembrane. ونتيجة لتركيز أيون عالية ضمن مساحة intermembrane، والتدرج الكهروكيميائية يبني مما أدى إلى غشاء المحتملة عبر غشاء الميتوكوندريا الداخلية (Δψ) 2. الأكسجين هو متقبل الإلكترون الأخير من سلسلة نقل الإلكترون، وتتدفق أيونات الهيدروجين من خلال synthases ATP من الفضاء intermembrane إلى المصفوفة، وبذلك مباشرة يسبب تشكيل ATP. وتعرف هذه العملية كما هو موضح في مجملها كما الفسفرة التأكسدية. طيات من أعراف زيادة المساحة السطحية للغشاء الداخلي، والسماح لنقل الإلكترون القصوى والإنتاج ATP داخلكل الحبيبات الخيطية. وتستمد البروتينات والإنزيمات والجزيئات الأخرى المشاركة في الفسفرة التأكسدية من كل من الجينات النووية والميتوكوندريا. الميتوكوندريا تحتوي الخاصة بهم DNA دائري، وترميز لمدة 13 البروتينات وكذلك tRNAs ومن mRNAs اللازمة لإنتاج ATP 3. ومع ذلك، هناك حاجة العديد من البروتينات، وبالتالي فهي النووية المشفرة. وتستهدف معظم هذه البروتينات المشفرة النووية إلى مصفوفة الميتوكوندريا عن طريق استخدام presequences في N-محطة من البروتين السلائف، ومدفوعة وارداتها في جزء من Δψ 4،5.

ما وراء المساهمة في الطاقة الحيوية من خلية، تؤثر الميتوكوندريا أيضا عمليات التمثيل الغذائي الكبرى مثل TCA وبيتا للأكسدة، مما يشير الخلوية من خلال تنظيم الكالسيوم، وكذلك دور رئيسي في موت الخلايا المبرمج 6. على وجه التحديد، اثناء اوقات التوتر الخلوي، البروتينات BCL-2 الأسرة الموجودة على أو تتفاعل في الغشاء الخارجي الميتوكوندريا يمكن أن يسبب الميتوكوندريانفاذية الغشاء الخارجي (MOMP) 7،8. خلال MOMP، يتم الإفراج السيتوكروم ج وبروتينات أخرى في العصارة الخلوية، وجنبا إلى جنب مع العديد من البروتينات عصاري خلوي تشكيل دعا مجمع للapoptosome 9،10. وapoptosome ينشط caspases التي تذهب إلى يلتصق البروتينات الخلوية وDNA خلال مرحلة التنفيذ من موت الخلايا المبرمج. في أقرب وقت كما يحدث MOMP، وانهارت ΔΨ وإنتاج ATP توقف. للخطر وهكذا، كما موت الخلايا المبرمج يبدأ ظيفة الميتوكوندريا والتغيرات في ΔΨ يمكن ربطها الميتوكوندريا وخلية الصحة 12. في حين موت الخلايا المبرمج هو نقطة النهاية في العديد من النماذج المرض، وظيفة الميتوكوندريا وتغييرات على ΔΨ يمكن أيضا أن تعطي معلومات قيمة عن نشأة المرض و / أو التقدم. على سبيل المثال، تم توثيق التغييرات الهيكلية والوظيفية الميتوكوندريا أثناء أمراض الاعصاب 13،14.

في الجزء الأول من البروتوكول، ISOيوصف lation من الميتوكوندريا سليمة التي تحتفظ ΔΨ بهم. تعرض خلايا HEK-293T لتركيزات ومجموعات من المؤتلف TNF-α، β-IL1 وIFN-γ مختلفة للحث على موت الخلايا المبرمج. وقد تم اختيار هذه السيتوكينات لأن ذكرت في كثير من الأحيان أن تكون عالية في الابتدائية عينات الصرف الصحي الإنسان (15) ومسار خارجي من موت الخلايا المبرمج يمكن أن يكون سببها تفاعل ملزمة لمستقبله 6 TNF-α. وبما أن هناك اختلافات دقيقة اللازمة لعزل الميتوكوندريا وظيفية من الأنسجة الابتدائية بالمقارنة مع الخلايا المستزرعة، ولأن الكثير من البحث ويستخدم الحيوانات، ويصف البروتوكول أيضا كيفية عزل الميتوكوندريا من الكبد والنخاع الشوكي من التصلب الجانبي الأمامي (ALS) نموذج الفأر.

وقد تم تطوير الجزء الثاني من بروتوكول لمراقبة الاضطرابات إلى إمكانية غشاء الميتوكوندريا باستخدام صبغة الفلورسنت حساسة إمكانات مع قارئ لوحة الفلورسنت. فرقوتختلف الصورة بين الحالة الخلوي (أي وصحية مقابل غير صحية) من خلال quantitating قوة ΔΨ الميتوكوندريا معزولة بالتعاون مع وكلاء فك ربط، وسلسلة مثبطات الجهاز التنفسي، ومثبطات معقدة وionophores، وكلها تسبب تبديد للإمكانات غشاء الميتوكوندريا. وصحة الميتوكوندريا، أكبر تغيير في ΔΨ على العلاج مع مثبطات الميتوكوندريا، وبالتالي فإن استجابة من الميتوكوندريا يمكن استخدام كمؤشر على الميتوكوندريا (DYS) وظيفة.

استخدام الميتوكوندريا المعزولة بدلا من التقييم في الموقع من وظيفة يقدم دليل قاطع على أن علم الأمراض أو علاج ينظم مباشرة تغييرات على عضية 16-18. في حين أن هناك أساليب في الأدب لعزل الميتوكوندريا من الخلايا المستزرعة، فهي غامضة 17 و / أو استخدام المعدات المتخصصة 16. يصف هذا البروتوكول بالتفصيل طريقة العزل وغيرقابلة للتكيف بسهولة إلى خطوط الخلايا الأخرى، بما في ذلك الأنسجة والثقافات 13،14،19،20 الأولية. العديد من الدراسات الميتوكوندريا معزولة تستخدم نفس uncouplers ومثبطات الميتوكوندريا المستخدمة في هذا البروتوكول ولكن مع القطب كلارك (21 مثال تمثيلي من العديد من الأوراق في الأدب)، وهو مرة أخرى على قطعة محددة جدا ومتخصص من المعدات. وعلاوة على ذلك، وهذه الطريقة التقليدية لديها قيود مثل انخفاض الإنتاجية وعالية التعقيد 22،23 ويتطلب كمية كبيرة من الميتوكوندريا (~ 500 ميكروغرام / رد فعل). في هذا البروتوكول، يتم استخدام الاستشعار الغشاء الفلورسنت المحتملين TMRE التحقيق بالاشتراك مع قارئ لوحة الفلورسنت، والذي هو آلة قياسية في العديد من المختبرات. ويعتبر على نطاق واسع منذ TMRE فإنه يدخل بسرعة الخلايا والميتوكوندريا معزولة، ويمكن استخدامها بتركيزات منخفضة 24. يمكن بسرعة ضبط ردود فعل متعددة تصل جنبا إلى جنب وتحليلها دفعة باستخدام هذا البروتوكول. وعلاوة على ذلك، فإن رد الفعلالصورة تتطلب كمية صغيرة الكثير من الميتوكوندريا معزولة (~ 10 ميكروغرام / رد فعل). عن طريق اشتراط أقل من المواد والأنسجة أو ثقافة الخلية عينات أصغر يمكن أن تستخدم كنقطة انطلاق لالميتوكوندريا العزلة، ويمكن تعيين المزيد من مكررات أو ردود الفعل تصل، والمواد المحتمل أن يكفي لغيرها من التجارب الميتوكوندريا المعزولة مثل إنتاج ATP، واستهلاك الأكسجين، أو استيراد المقايسات ممكنة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تتفق جميع التجارب على الحيوانات إلى المعاهد الوطنية للصحة المبادئ التوجيهية وتمت الموافقة من قبل جامعة ويك فوريست رعاية الحيوان واللجنة الاستخدام. وقد تم الحصول على أزواج خصبة للSOD1G93A [B6SJL-تيراغرام نتروز (SOD1-G93A) 1Gur] نموذج الفأر من مختبر جاكسون (بار هاربور، ME). البرية من نوع (WT) من الإناث والذكور SOD1G93A Nontransgenic [B6SJL-تيراغرام نتروز (SOD1-G93A) 1Gur] كانت ولدت لتوليد الفئران SOD1G93A وتتزاحم WT nontransgenic التي تم استخدامها في التجارب.

1. نماذج للتحقيق

  1. ثقافة الخلية
    1. الحفاظ على خلايا الكلى الجنينية البشرية (HEK-T293) الخلايا في DMEM تستكمل مع 10٪ الحرارة المعطل مصل الجنين البقري، 1٪ البنسلين، الستربتومايسين، و 1٪ L-الجلوتامين، عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2.
    2. تنمو الخلايا في قوارير T75 والسماح لهم لتصل إلى 90٪ التقاء.
    3. تنفيذ تقسيم الخلية عن طريق trypsinization (0.25٪ التربسين-EDTA) لمدة 3-5 دقائق عند 37 درجة مئوية في CO 2
    4. نضح في وسائل الإعلام و resuspend بيليه خلية في وسائل الإعلام الثقافة.
    5. خلايا البذور في قارورة أو لوحة المناسبة 7 × 10 4 الخلايا في قارورة T75 48 ساعة قبل خلوى العلاج. هذا يجب أن تعطي ~ 70٪ الكثافة في وقت من العلاج.
    6. خلايا تجويع المصل بعد 24 ساعة بواسطة الشفط وسائل الإعلام واستبدالها مع نفس الحجم من المصل خالية وسائل الإعلام (DMEM، عقيم).
    7. إعداد TNF-α، β-IL1، وIFN-γ، من مسحوق مجفف بالتجميد بالماء نقي للغاية بتركيزات العمل من 5 خريج / ميكرولتر، 10 نانوغرام / ميكرولتر، و 10 نانوغرام / ميكرولتر، على التوالي وإضافتها إلى الآبار / قوارير.
    8. مصل علاج تجويع الخلايا عن طريق إضافة السيتوكينات تذوب مباشرة إلى وسائل الإعلام ثقافة الخلية قوارير المناسبة. وتألفت العلاجات السيتوكينات الفردية، وهي مزيج من كل 3 (المشار إليها باسم "* 3")، أو ster يسودالمياه إيل كعنصر تحكم (المشار إليها باسم "0").
    9. احتضان الخلايا المعالجة لمدة 24، 48 أو 72 ساعة قبل التقييم والحصاد.
  2. تقييم بقاء الخلية
    1. جعل حل 5 ملغ / مل من 3- (4،5-dimethylthiazol-2-يل) بروميد -2،5-diphenyltetrazolium (MTT) في برنامج تلفزيوني 1X.
    2. لوحات 12-جيدا، إضافة 100 ميكرولتر من محلول MTT إلى كل بئر وبلطف دوامة لضمان التوزيع حتى.
    3. احتضان لوحات لمدة 15 دقيقة، 1 ساعة على 37 درجة مئوية في CO 2 5٪، وتحقق تحت المجهر لوجود تلوين الأرجواني. إذا لم يكن هناك الأرجواني موجود، عباب مرة أخرى وتسمح للخلايا لاحتضان في 5 فترات دقيقة حتى لوحظ الأرجواني. وينبغي تحديد مقدار الوقت اللازم من قبل كل محقق.
    4. عن طريق تكرار pipettor، إضافة 700 ميكرولتر من MTT المذيبات (4 ملم حمض الهيدروكلوريك و 0.1٪ NP40 في الأيزوبروبانول) إلى كل بئر والصخور لوحة (ق) في درجة حرارة الغرفة لمدة 5-10 دقيقة، أو حتى عن اللون الأرجواني تركت الخلايا . إذا الأرجوانيلا يأتي لون من الخلايا، إضافة إلى 200 ميكرولتر إضافية من المذيبات والاستمرار في دوامة.
    5. للتحليل، واتخاذ 100 ميكرولتر من كل بئر ومكان في لوحة 96-جيدا وتقرأ على قارئ لوحة باستخدام 570 نانومتر، والطول الموجي إشارة من 630 نانومتر، ولكن 595 نانومتر هو أيضا مقبول طالما يتم أخذ قراءات في ضبط متسقة.
  3. نموذج حيواني من ALS
    1. تتفق جميع التجارب على الحيوانات إلى المعاهد الوطنية للصحة المبادئ التوجيهية وتمت الموافقة من قبل جامعة ويك فوريست رعاية الحيوان واللجنة الاستخدام. وقد تم الحصول على أزواج خصبة للSOD1G93A [B6SJL-تيراغرام نتروز (SOD1-G93A) 1Gur] نموذج الفأر من مختبر جاكسون (بار هاربور، ME). البرية من نوع (WT) من الإناث والذكور SOD1G93A Nontransgenic [B6SJL-تيراغرام نتروز (SOD1-G93A) 1Gur] كانت ولدت لتوليد الفئران SOD1G93A وتتزاحم WT nontransgenic التي تم استخدامها في التجارب.
    2. أداء التنميط الجيني مع الاشعال القياسية ضد SOD1 متحولة 25.

2. عزل الميتوكوندريا

ملاحظة: من المهم أن تعمل بسرعة وإبقاء كل شيء على الجليد في جميع أنحاء الداخلي.

  1. إعداد الميتوكوندريا العزلة عازلة (MIB)، العمود الفقري عازلة عزل الحبل (SC MIB) وعازلة التجريبية (EB)
    1. إعداد الحلول الأسهم التالية قبل الموعد المحدد لMIB وEB.
    2. جعل 1 M تريس / اجتماعات الأطراف عن طريق إذابة 12.1 غرام من قاعدة تريس في 70 مل من H 2 O. إضافة اجتماعات الأطراف الجافة للحصول على درجة الحموضة إلى 7.4. ضبط مستوى الصوت إلى 100 مل نهائي. فلتر تعقيم وتخزين عند 4 درجات مئوية.
    3. جعل 1 M Kphos عن طريق خلط 80.2 مل من K 2 هبو 4 و 19.8 مل من KH 2 PO 4. يخزن في درجة حرارة الغرفة.
    4. جعل 0.2 M EGTA / تريس عن طريق إضافة 3.8 غرام من EGTA إلى 10 مل من H 2 O. إضافة 1 M تريس / اجتماعات الأطراف حتى يذوب، ~ 30-40 مل. ضبط 50 مل، تصفية العقيمة وتخزينها في درجة حرارة الغرفة. لاحظ أن الرقم الهيدروجيني سيكون ~ 6.7.
    5. جعل 1 M الغلوتامات بجعل 10 مل من1 M محلول حامض الجلوتاميك. فلتر تعقيم وتخزين 4 ° C.
    6. جعل 1 M مالات بجعل 10 مل من 1 M حل من حمض الماليك. إضافة تريس / اجتماعات الأطراف إلى 50 ملم. فلتر تعقيم وتخزين عند 4 درجات مئوية.
    7. جعل MIB بتركيز 200 ملي السكروز، 10 ملي تريس / اجتماعات الأطراف، ودرجة الحموضة 7.4، و 1 ملي EGTA / تريس. فلتر تعقيم وتخزين عند 4 درجات مئوية.
    8. جعل SC MIB بتركيز 250 ملي السكروز، 20 ملي HEPES KOH-7.5 درجة الحموضة، 10 ملي بوكل، 1.5 ملي MgCl 1 ملم EDTA، 1 ملم EGTA، 1 ملم DTT، ومثبط البروتياز كوكتيل.
    9. جعل EB بتركيز 125 ملي بوكل، 10 ملي تريس / اجتماعات الأطراف، ودرجة الحموضة 7.4، 5 ملي الغلوتامات، 2.5 ملي مالات، 1 ملم K الفوسفات، ودرجة الحموضة 7.4 و 10 ملي EGTA / تريس. فلتر تعقيم وتخزين عند 4 درجات مئوية.
  2. إعداد المعدات قبل حصاد الخلايا.
    1. شطف عاء زجاجي والتجانس صغيرة مدقة ثلاث مرات مع الماء المعقم ومكان على الجليد.
    2. جمع العناصر الضرورية مثل الحفر القياسية، SCRA خليةبيرس، 1.5 مل، 15 مل و 50 مل أنابيب والحلول.
  3. الميتوكوندريا العزلة
    1. الخلايا المستزرعة
      1. لكل نوع العينة، واستخدام اثنين من قوارير T175 من الخلايا.
      2. تأكد من أن الخلايا هي ~ 90٪ متموجة واستخدامها في التجارب السيطرة، أو لوحة وعلاج كما هو موضح أعلاه في الخطوة 1.2.
      3. على رأس مقاعد البدلاء، وسائل الإعلام نضح وغسل الخلايا الملتصقة مرتين مع 15 مل من برنامج تلفزيوني 1X في كل مرة.
      4. نضح العازلة وكشط قوارير لإزالة الخلايا الملتصقة من قاع القارورة.
      5. إضافة 15 مل من برنامج تلفزيوني 1X إلى كل قارورة، دوامة، ونقل إلى الفردية 15 مل أنابيب مخروطية ومكان على الجليد.
      6. مرة واحدة ويتم كشط، أنابيب الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 700 x ج، 4 ° C باستخدام أجهزة الطرد المركزي كبار الجدول باستخدام الدوار الدلو المتأرجح.
      7. supernatants نضح و resuspend كل بيليه في 1 مل من MIB.
      8. الجمع بين كل من المعلقات ونقل إلى وعاء زجاجي صغير لالتجانس.
      9. إضافة MIBإلى السفينة حتى يصل عازلة في السطر الأول. التجانس الخلايا مع مدقة تعلق على الحفر على سرعة متوسطة لمدة ثلاثة يمر. تأكد من أن السفينة على الجليد خلال هذه الخطوة، لا لإزالة مدقة فوق السائل واستخدام سرعة ثابتة مع يمر مستمرة.
      10. نقل الحل المتجانس إلى أنبوب مخروطي 50 مل.
      11. رسم الحل في حقنة 3 مل باستخدام قياس 18 بوصة 1 ½ إبرة وطرد مرة أخرى في أنبوب مخروطي على الجليد مع قياس 27 بوصة ½ الإبرة. احرص على طرد الحل ضد الجدار الداخلي للأنبوب لاستخدام تلك القوة لتعطيل غشاء الخلية.
      12. كرر الخطوات حقنة ليصبح المجموع خمس مرات.
      13. نقل الحل إلى 15 مل أنبوب مخروطي الشكل وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 600 x ج، 4 ° C في كبار الطرد المركزي الجدول باستخدام الدوار الدلو المتأرجح.
      14. إزالة بعناية طاف وتوزيعها بين ثلاثة أنابيب 1.5 مل.
        ملاحظة: Mitochondria هي في طاف بعد هذا أولا، وسرعة منخفضة تدور، في حين مكعبات أغشية الخلايا والخلايا غير منقطعة.
      15. أنابيب الطرد المركزي في الدوار زاوية ثابتة في 10،000 x ج، 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
      16. supernatants نضح والجمع بين الكريات في 100 ميكرولتر MIB ووضع على الفور على الجليد.
        ملاحظة: الميتوكوندريا هي في بيليه بعد هذا فائق السرعة تدور. سوف الميتوكوندريا الحفاظ على عادة غشاء المحتملة من أجل ~ 2-3 أيون الجليد بعد العزلة وهي الأكثر استقرارا كحل الأسهم تتركز في MIB.
    2. الميتوكوندريا العزلة من الأنسجة الماوس
      1. تخدير الماوس وفقا لبروتوكول IACUC. تعيين المرذاذ عند 5.0٪ للحث على التخدير. وأكد أن هذا الحيوان هو تخدير بسبب عدم وجود رد فعل لقرصة القدم أو لا ارادي وميض عند اقترب من العين أو استغلالها مع مسحة القطن. الحفاظ على الماوس تحت التخدير لإجراء العمليات الجراحية بأكمله عن طريق الحفاظ على المرذاذ بين 1.5٪ و 2.0٪.
      2. مريض بالحبايسي الكبد والنخاع الشوكي من كل حيوان ومكان منفصل في الجليد الباردة برنامج تلفزيوني 1X - / - لشطف بعيدا أي دم.
      3. للكبد، ونقل الأنسجة إلى وزن الطبق على الجليد وختم الى قطع صغيرة باستخدام شفرة حلاقة جديدة لمدة 1 دقيقة.
      4. إضافة الأنسجة وعازلة المناسب (MIB للكبد أو SC MIB للالحبل الشوكي) إلى وعاء حتى يصل عازلة في السطر الأول. التجانس الأنسجة مع مدقة باليد لمدة خمس يمر. تأكد من أن السفينة على الجليد خلال هذه الخطوة، لا لإزالة مدقة فوق السائل واستخدام سرعة ثابتة مع يمر مستمرة.
      5. نقل الخليط لتنظيف 15 مل الأنابيب.
      6. أنابيب الطرد المركزي في الدوار زاوية ثابتة في 750 x ج، 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
      7. حفظ supernatants في أنابيب نظيفة ووضعها على الجليد.
        ملاحظة: الميتوكوندريا هي في طاف بعد هذا أولا، وسرعة منخفضة تدور، في حين مكعبات أغشية الخلايا والخلايا غير منقطعة.
      8. اعادة تعليق الكريات الحبل الشوكي طن 500 ميكرولتر من SC MIB.
      9. إعادة التجانس كل ثلاث مرات، إلا ملء السفينة في منتصف الطريق مع SC MIB هذا الوقت.
      10. نقل جناسة جديد لأنبوب جديد.
      11. الطرد المركزي في الدوار زاوية ثابتة في 750 x ج، 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
      12. الجمع بين هذه supernatants الجديدة، والتي تحتوي على أكثر الميتوكوندريا، مع طاف الأول من كل عينة.
      13. أنابيب الطرد المركزي في الدوار زاوية ثابتة في 10،000 x ج، 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
      14. supernatants نضح و resuspend الكريات الكبد في 500 ميكرولتر من MIB والكريات الحبل الشوكي في 50 ميكرولتر SC MIB ووضع على الفور على الجليد.
        ملاحظة: الميتوكوندريا هي في بيليه بعد هذا فائق السرعة تدور. سوف الميتوكوندريا الحفاظ على عادة غشاء المحتملة من أجل ~ 2-3 أيون الجليد بعد العزلة وهي الأكثر استقرارا كحل الأسهم تتركز في MIB.
      15. إجراء فحص تركيز البروتين لتقدير تركيز الميتوكوندريا في الحل. اتبع التعليماتالصورة للاستخدام التجاري كيت فحص البروتين أو طريقة مماثلة 26. تركيزات نموذجية من الميتوكوندريا هي: قوارير 2 T175 عوائد ~ 2 ملغ / مل، 1 كبد الفأر ~ 3-5 ملغ / مل، و 1 الماوس الحبل الشوكي ~ 1-3 ملغ / مل.
  4. السيتوكروم ج الفحص باستخدام R & D الجرذ / الماوس السيتوكروم ج Quantikine ELISA كيت (مقتبس من بروتوكول المقدمة من قبل الشركة المصنعة).
    1. مباشرة قبل وضع ردود الفعل، وتمييع الميتوكوندريا إلى 0.5 ملغ / مل تركيز العمل مع EB وتوزيع الميتوكوندريا المخفف في 1.5 مل أنابيب لردود الفعل (عادة 30-50 ميكرولتر من الميتوكوندريا في أنبوب).
    2. إضافة إما EB أو DMSO، في 1٪ من إجمالي حجم، إلى الميتوكوندريا المخفف واحتضان ردود الفعل على أعلى مقاعد البدلاء لمدة 7-10 دقيقة. ردود الفعل هذه هي مستقرة لمدة تصل إلى 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة إذا كانت هناك حاجة لإطار زمني أطول.
    3. الميتوكوندريا بيليه بواسطة الطرد المركزي في الدوار زاوية ثابتة في 10،000 x ج، 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق والحذرلاي فصل طاف ووضع كل في منفصلة 1.5 مل أنابيب.
      ملاحظة: أنابيب يمكن أن تكون إما المجمدة في -20 ° C لتحليلها فيما بعد أو استخدامها على الفور.
    4. تحديد الإفراج عن السيتوكروم ج من مقارنة تركيز السيتوكروم ج في بيليه وطاف 27.
      1. إعداد العينات بواسطة الانحلال الكريات في حجم الأصلي للتفاعل مع 0.5٪ TX-100 في برنامج تلفزيوني 1X.
      2. لكل عينة، وإعداد 2 الآبار على لوحة ELISA، واحدة لبيليه الآن يذوب واحد لطاف من رد فعل من جانب إضافة 100 ميكرولتر من السيتوكروم ج المترافقة (استخدام مباشرة من الزجاجة)، بالإضافة إلى 100 ​​ميكرولتر من 0.5٪ Tx- 100 في برنامج تلفزيوني 1X، وبعد ذلك كل من بيليه أو طاف العينة.
      3. دوامة بلطف لوحة إعداد منخفض (مستوى 2-4) لمدة 20 ثانية إلى المزيج، وغطاء واحتضان لمدة 1 ساعة، 37 ° C.
      4. التالي، وغسل لوحة أربع مرات مع العازلة غسل المخفف وفقا لإنتاج موادتعليمات إيه في. إزالة أي حل الزائد عن طريق التنصت على الآبار على منشفة ورقية.
      5. المقبل، إضافة 150 ميكرولتر من 1: 1 A + B حل النامية من كل بئر واحتضان لوحة لمدة 20-30 دقيقة في الظلام في درجة حرارة الغرفة.
      6. وأخيرا، إضافة 50 ميكرولتر من حل توقف إلى كل بئر وأخذ قراءات الامتصاصية في 540 نانومتر باستخدام قارئ صفيحة ميكروسكوبية. حساب كمية السيتوكروم ج الافراج بمقارنة كمية السيتوكروم ج في بيليه مقابل طاف لكل رد فعل.

3. تقييم الميتوكوندريا (DYS) وظيفة

  1. على الفور قبل أن يتم تحديد ردود الفعل تصل، وتمييع الميتوكوندريا إلى 0.5 ملغ / مل تركيز العمل مع EB ووضعها في 1.5 مل أنابيب لردود الفعل (تستخدم عادة 30-50 ميكرولتر من الميتوكوندريا في أنبوب).
  2. العلاجات الميتوكوندريا
    1. إضافة العلاجات المناسبة (EB السيطرة، 1 ميكرومتر FCCP مختلطة مع 50 نانومتر Valinomycin، 10 ميكرومتر روتينونو 5 ميكرومتر أوليغوميسين، 2 مم KCN، أو 200 ميكرومتر ADP، وتركيزات النهائية) للفصل بين ردود الفعل على 1/10 عشر إجمالي حجم الميتوكوندريا المخفف. احتضان ردود الفعل على أعلى مقاعد البدلاء لمدة 7 دقائق.
      ملاحظة: يجب توخي الحذر عند التعامل مع هذه المواد كما تناول عرضي أو الامتصاص عن طريق الجلد يمكن أن تكون ضارة.
    2. تمييع TMRE، أعيد في الماء المعقم عند تركيز عمل 100 ميكرومتر وتخزينها في -20 ° C، إلى 2 ميكرومتر وإضافة حجم مساو لحجم رد الفعل الميتوكوندريا.
    3. احتضان ردود الفعل على أعلى مقاعد البدلاء لمدة 7 دقائق.
    4. الميتوكوندريا بيليه بواسطة الطرد المركزي في الدوار زاوية ثابتة في 10،000 x ج، 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    5. تحميل نصف حجم طاف من كل عينة على طبق من ذهب 396 جيدا وقراءة مضان.
      ملاحظة: يجب أن يكون الأمثل الإثارة وانبعاث موجات من TMRE وفقا لتعليمات الشركة الصانعة باستخدام لوحة حجم والتي سيتم استخدامها لالفحص. استخدام معيار 384-جيدا لوحة سوداء مع 25 ميكرولتر من 1 ميكرومتر TMRE (تركيز رد الفعل النهائي) تم الحصول على أقوى إشارة باستخدام موجات الإثارة / الانبعاثات   485 نانومتر / 535 نانومتر.
    6. حساب فارق أضعاف في مضان بين التحكم (EB) وكل معاملة بقسمة قيمة مضان النسبية (RFU) تم الحصول عليها من قارئ لوحة للعينة التجريبية التي RFU من العينة الضابطة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

علاج الخلايا HEK-293T مع 200 جزء من الغرام / مل TNF-α، 40 نانوغرام / مل IL1-β، و 75 نانوغرام / مل IFN-γ (* 3) لمدة 24-48 ساعة يؤدي إلى كميات التدريجي للموت الخلايا (الشكل 1A ). تم تقييم بقاء الخلية باستخدام المقايسات MTT ويوضح باستمرار أن هناك ~ انخفاض بنسبة 10٪ في بقاء الخلية مع العلاج 24 ساعة و~ انخفاض 20٪ مع العلاج 48 ساعة. الخلايا تعامل مع تركيزات مماثلة (100 جزء من الغرام / مل TNF-α، 40 نانوغرام / مل IL1-β، و 75 نانوغرام / مل IFN-γ) تسفر عن نتائج موت الخلايا مماثلة في 48 ساعة، والعلاج مع السيتوكينات الفردية تكشف أن الانخفاض في جدوى ويرجع ذلك إلى اندماجي يؤثر (الشكل 1B). البيانات جدوى في الشكل 1B تمثل متوسط ​​+/- الانحراف المعياري من 3 تجارب منفصلة كل تشغيل في ثلاث نسخ، وضيق من أشرطة الخطأ إظهار استنساخ البيانات. يمكن تعديل كمية السيتوكينات في هذا البروتوكول لمواصلة العلاج elucidatالبريد مساهمة كل خلوى على موت الخلايا، ويمكن أيضا أن يدرج السيتوكينات إضافية أو عوامل أخرى، طالما يتم تنفيذ الضوابط حسب مقتضى الحال.

وقد وصفت عزل الميتوكوندريا من الخلايا والأنسجة في الأدب منذ 1940s 28،29. فرضية لهذا الإجراء هو تمزيق الخلايا تليها الطرد المركزي التفاضلي، حيث من المعروف أن الميتوكوندريا الخام لتكوير في ~ 10،000 ز س. العديد من البروتوكولات التي تستخدم الميتوكوندريا المعزولة تتطلب أغشية مزدوجة سليمة يمكن أن الحفاظ على غشاء المحتملة لها، وبالتالي فمن الضروري لتقييم سلامة مرة واحدة عزلة كاملة. أثناء وضع بروتوكول الميتوكوندريا العزلة من خلايا كلوة مثقف، تم استخدام السيتوكروم ج فحص لبيان ما إذا تم الحصول على الميتوكوندريا سليمة. باستخدام السيتوكروم متاحة تجاريا ج مجموعات ELISA، تم كميا الميتوكوندريا بعد العزلة وتضعف في EB، ومن ثم إما EB أو DMSOوأضاف وردود الفعل لاحتضان على أعلى مقاعد البدلاء. ثم، عن طريق فصل الميتوكوندريا من طاف المحيطة، تم استخدام تحليل السيتوكروم ج محتوى كل الكسور كمقياس لالميتوكوندريا intactness الغشاء. إذا تم الإبقاء على غالبية السيتوكروم ج في بيليه الميتوكوندريا ثم تعتبر الميتوكوندريا سليمة، بينما إذا تم العثور على أكثر من 15٪ من السيتوكروم ج في طاف، ثم كانت تعتبر الميتوكوندريا غير صالحة للدراسات وظيفية. كما رأينا في الجدول 1، وصف بروتوكول عوائد ~ 12٪ السيتوكروم ج الافراج عن و~ 15٪ عندما الميتوكوندريا المعزولة هي مع DMSO تعامل مسبقا. وقد تم الإبلاغ عن نتائج مماثلة في السابق لالميتوكوندريا المعزولة من خطوط الخلايا الأخرى أو الأنسجة الحيوانية 19،20،27. بدلا من ذلك، يمكن أيضا أن يتم تقييم سلامة الميتوكوندريا مع TMRE، والتي تم استخدامها أثناء عزل كبد الفأر والميتوكوندريا في النخاع الشوكي. أثناء الأولي الإنمائية لل بروتوكول العزلةالإقليم الشمالي، والمحاكمات تقييم الميتوكوندريا المعزولة من الكبد والنخاع الشوكي صحية والميتوكوندريا الفئران العادية. لكل عينة، تم تقييم ΔΨ بمقارنة إشارة الفلورسنت من الميتوكوندريا المعزولة تعامل مع EB لتلك حضنت مع FCCP + Valinomycin (الجدول 2). تم استخدام نسبة مضان بين الميتوكوندريا المعالجة وغير المعالجة من> 1 كمؤشر صحية، الميتوكوندريا سليمة.

مرة واحدة وقد وضعت بروتوكولات الميتوكوندريا العزلة الناجحة، الميتوكوندريا معزولة عن السيطرة، والخلايا غير المعالجة و* 3 خلوى تعامل الخلايا، أو تم تحليل الفئران العادية وSOD1. وعولج الميتوكوندريا HEK من كلا الفريقين مع مختلف uncouplers ومثبطات وΔΨ تقاس تغييرات على TMRE امتصاص. الفرق أضعاف في السيطرة EB تعامل الميتوكوندريا إلى uncoupler / المانع الميتوكوندريا تعامل يشير إلى وجود اختلاف في قوة ΔΨ بين المجموعتين (بيانات تمثيلية وكالculations في الجدول 3). وعلاوة على ذلك، فإن الانخفاض في المئة من الخلايا غير المعالجة إلى * دلالة 3 الخلايا المعالجة أن الصحة الميتوكوندريا كان يتأثر العلاجات خلوى، مؤيدة البيانات بقاء الخلية (الشكل 2). تقييم قوة ΔΨ عبر TMRE امتصاص باستخدام الميتوكوندريا المعزولة من الكبد والنخاع الشوكي من أربعة الفئران الفردية العادية، والتحكم بالمقارنة مع أربعة الفئران ALS تشير إلى أن صحة الأنسجة ويمكن أيضا أن يتم تقييم باستخدام هذا البروتوكول. كما يتضح من الاختلافات أضعاف وانخفاض نسبة في ΔΨ، مقارنة EB-العلاج وFCCP + Valinomycin-علاج الميتوكوندريا من السيطرة والحيوانات تقدم المرض تختلف اختلافا كبيرا (الجدول 4؛ انظر أيضا يحيل الى 13 و 14).

الشكل (1)
الشكل 1: موت الخلايا لحثد كتبها * 3 العلاج التدريجي مع مرور الوقت وأكبر من مع العلاجات خلوى الفردية. وعولج (A) خلايا HEK-293T لمدة 24 أو 48 ساعة وخلية الموت تم قياس باستخدام فحص MTT. كانت قيم تطبيع للسيطرة، والعينات والبيانات غير المعالجة تمثل قياسات ثلاث نسخ ل n = 3، +/- الانحراف المعياري. وعولج (B) خلايا HEK-293T مع السيتوكينات الفردية أو كوكتيل (* 3) لمدة 48 ساعة وموت الخلايا تقييم عبر MTT الفحص. تمثل البيانات ن = 5 لكل من خلوى الفردي ون = 6 ل* 3، +/- الانحراف المعياري.

بيليه (AU) طاف (AU) ٪ السيتوكروم ج الافراج
0 0.818 0.115 12.6 ± 2.27
DMSO 0،793 0.142 15.3 ±. 2.23

الجدول 1: الاحتفاظ السيتوكروم ج في الميتوكوندريا معزولة عن الخلايا المستزرعة تمثل بيانات متوسط ​​ن = 4، +/- الانحراف المعياري.

الكبد 1 الكبد 2 الحبل الشوكي 1 الحبل الشوكي 2
RFU EB 97830 94132 339716 290154
F / V 435188 461299 385366 482480
نسبة 4.45 4.9 1.13 1.66
EB = عازلة التجريبية وF / V = ​​FCCP + valinomycin.

الجدول 2: قياس من ΔΨ من الميتوكوندريا المعزولة من الأنسجة الماوس العادية استخدمت اثنين من الحيوانات منفصلة لعزل الكبد والنخاع الشوكي الميتوكوندريا جنبا إلى جنب (مثل الكبد والنخاع الشوكي 1 1 هم من نفس الحيوان).

EB بنسبة ضئيلة تعفن KCN ADP F / V
RFU 0 4،844 12507 12734 9925 10892 4،844
* 3 6،517 13639 12435 10،235 13،154 6،517
الفرق أضعاف 0 NA 2.58 2.63 2.05 2.25 2.65
* 3 NA 2.09 1.91 1.57 2.02 2.18
انخفاض٪ 0 مقابل 3 * 18.94 27.41 23.35 10.24 17.67
EB = عازلة التجريبي؛ بنسبة ضئيلة = أوليغوميسين. تعفن = روتينون. KCN = السيانيد البوتاسيوم، وF / V = ​​FCCP + valinomycin.

الجدول 3: البيانات الخام والحسابات من خلية جulture معزولة التجارب الميتوكوندريا.

الشكل 2
الشكل 2: الميتوكوندريا المعزولة من الخلايا المعالجة خلوى انخفضت غشاء المحتملة. انخفاض في المئة من ΔΨ ل0 مقابل * 3 لكل معاملة مقارنة السيطرة عليها، كما المحسوبة في الجدول 2. تمثل البيانات المتوسطات من ردود الفعل المكررة ل n = 3 (أوليغوميسين، روتينون، وFCCP / Valinomycin) أو ن = 2 ( KCN وADP) +/- الانحراف المعياري. * = القيم ص ذات دلالة إحصائية مبنية على حسابات الفرق أضعاف. ع = 0.03، 0.01، و 0.05 لأوليغوميسين، روتينون وFCCP / Valinomycin، على التوالي.

الحبل الشوكي كبد
أضعاف الفرق سيطرة 1.54 ± 0.48 3.20 ± 1.56
SOD1 1.10 ± 0.30 3.12 ± 1.75
انخفاض٪ 28.1 2.48
ف القيمة 0.03 0.41

الجدول 4: الميتوكوندريا المعزولة من النخاع الشوكي من الفئران SOD1 انخفضت غشاء المحتملة والمقررة من قبل FCCP + Valinomycin البيانات تمثل المتوسط ​​من 4 حيوانات في كل مجموعة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

علاج الخلايا HEK-293T مع السيتوكينات المؤتلف تسبب كميات معتدلة من موت الخلايا خلال 48 ساعة (الشكل 1). كمية من موت الخلايا الناجم عن العلاج TNF-ألفا مشابه لدراسات نشرت سابقا 30 وتنخفض بقاء الخلية بعد المشاركة في إدارة السيتوكينات المتعددة التي هي أكبر من كميات تجميعية مع أي خلوى وحده هو أيضا بما يتفق مع الأدب 31،32. القدرة على ضبط كميات وأنواع من العلاجات خلوى وكذلك المقارنة من الكوكتيلات إلى السيتوكينات الفردية تجعل هذا النموذج ثقافة الخلية جذابة لدراسة آثار محددة من التعرض خلوى على خلايا الكلى. وعلاوة على ذلك، فإن النتائج هي استنساخه ويتحقق بسهولة (الشكل 2) جدا. وتشمل الاعتبارات أن نأخذ في الاعتبار التقاء الخلايا. على سبيل المثال، الخلايا المعالجة عند 100٪ التقاء لا تستجيب كذلك لنفس تركيزات السيتوكينات عندما تعامل في يخدع 70-80٪فلوينس. وعلاوة على ذلك، ينبغي أن تتبع عدد من الممرات قد ذهب الخلايا من خلال، وربما يمكن أن تتأثر استجابة الخلايا علما انه كان في الثقافة لفترة طويلة جدا (أكثر من 8-12 أسابيع منذ الذوبان). بينما علاج الخلايا المستزرعة مع السيتوكينات انخفضت بقاء الخلية والصحة الميتوكوندريا في وقت لاحق، هو بأي حال من الأحوال نموذجا للتعفن الدم في حد ذاتها. ومع ذلك، واستخدام نموذج أكثر أهمية سريريا، مثل استخدام خلايا الكلى الأولية المعزولة من الفئران و / أو العلاج مع السيتوكينات يفرز بشكل طبيعي من الخلايا THP1 حفز 33، هو امتداد طبيعي لهذا العمل. ونظرا للفجوة في فهم الفشل الكلوي خلال تعفن الدم، مثل هذه النماذج زراعة الخلايا وتقييم الميتوكوندريا يمكن أن توفر نظرة أولية في آليات فضلا عن منصة الأولية لاختبار فعالية من المركبات الدوائية كما علاجات وقائية أو التدخل.

الميتوكوندريا معزولة عن الخلايا المستزرعة أو الأنسجة الحيوانيةتحمل القدرة على تقييم بسرعة تأثير العلاج بالخلايا أو تطور المرض على الصحة الميتوكوندريا. البروتوكولات العزلة والتقييم لا يطالبون من الناحية الفنية على القيام بها، ويمكن بسهولة تعديل للاستخدام مع خطوط الخلايا الأخرى أو الأنسجة الابتدائية. وMIB وEB المستخدمة لكل نوع العينة وصفات البداية الجيدة التي يمكن تعديلها عند الضرورة إذا معين الخلايا او الانسجة نوع له متطلبات مختلفة. على سبيل المثال، إضافة الأحماض الدهنية الحرة BSA عادة اللازمة للاستخدام مع الخلايا العصبية، كما هي واردة مع بروتوكول الحبل الشوكي 15،34. ويمكن أيضا أن طريقة تمزيق الخلايا يمكن تعديلها باستخدام المزيد من عمليات طرد حقنة أو تغيير لتسليم التجانس بدلا من استخدام الحفر أو العكس بالعكس. وعلاوة على ذلك، وإعادة التجانس لأول بيليه الطرد المركزي، كما فعلت في الإجراء الميتوكوندريا الحبل الشوكي، قد يكون من الضروري الحصول على كمية مرضية من الميتوكوندريا. وهناك مؤشر جيد على أن تنتج بروتوكول العزلة mitochondri قابلة للحياةمن هو استخدام السيتوكروم ج ELISA. هذا الاختبار هو البديل السريع والسهل إلى تحليل لطخة الغربي من الإفراج السيتوكروم ج وأيضا تقييما مفيدا من السيتوكروم ج الافراج بعد العلاج من الميتوكوندريا مع الببتيدات أو غيرها من المركبات 19،27. بدلا من ذلك، TMRE يمكن استخدامها خلال تطوير البروتوكول، ولكن من المهم لتقييم الميتوكوندريا المعزولة من عينة ما هو معروف أن تكون صحية. وعلاوة على ذلك، عندما عزل الميتوكوندريا من أنسجة الفأر التي لم يتم وصفها بشكل روتيني في الأدب، يمكن الميتوكوندريا الكبد بمثابة السيطرة الإيجابية وكذلك تستخدم لتحديد خط الأساس. على سبيل المثال، كما هو الحال في هذا البروتوكول، تم رفعه أيضا الأكباد من كل حيوان، سواء أثناء وضع البروتوكولات وكذلك التجارب واستخدامها لالميتوكوندريا العزلة. وهناك اعتبار آخر لإعداد هو مقدار الميتوكوندريا التي تم الحصول عليها في نهاية الإجراء العزلة. إذا كان تركيز الميتوكوندريا هي 1 ملغ / مل أو أقل ثمنتائج الفحص قد يكون غير موثوق بها (الملاحظات غير منشورة VDGM). إما أن يكون الأمثل كمية المواد بدءا، MIB وصفة أو طريقة التعطيل قبل أن ينتقل إلى المقايسات الفنية. مرة واحدة يتحقق بروتوكول العزلة ناجحة، الميتوكوندريا ويمكن أيضا أن تستخدم في فحوصات أخرى مثل المحتوى الكلي للاعبي التنس المحترفين وتوليد ATP 13،14.

بروتوكول ظيفة الميتوكوندريا الموصوفة هنا يسمح لقياس غير مباشر لامتصاص الميتوكوندريا من TMRE الاستشعار المحتملين صبغ باستخدام معيار قارئ لوحة الفلورسنت. بعد الميتوكوندريا تم عزلها واضاف المواد الكيميائية المناسبة، يتم تحضين أنها مع TMRE ثم مكعبات. عن طريق علاج الخلايا بأكملها أو الحيوانات وعزل الميتوكوندريا قبل ΔΨ التقييم، يتيه متغيرات مثل النقل المقاوم للعقاقير المتعددة أو ATP تدفق وتجنبها. ثم يتم تحليل كمية مضان في طاف مع فهم أن صحة الميتوكوندرياوΔΨ أقوى، وبالتالي المزيد من الإقبال على TMRE. ونتيجة لذلك، يجب أن تكون كمية مضان في طاف أقل في الميتوكوندريا أكثر صحة وأكثر في الميتوكوندريا غير صحية. من قبل بما في ذلك العلاج EB-الوحيدة، والفرق أضعاف من مضان بين هذه السيطرة والميتوكوندريا وفكت يمكن حساب. آخر السيطرة الهامة مع كل مجموعة من التفاعلات تشغيل هي TMRE وحدها. النتيجة من هذا التحكم يوفر أقصى قدر من قراءة الفلورسنت الممكنة. منذ أضاف TMRE إلى ردود فعل غير المخفف الطازج، هناك تقلب المتأصل. على سبيل المثال، تم تحقيق قراءات TMRE فقط من ~ 20،000، 25،000 و 30،000 في أوقات مختلفة خلال تطوير البروتوكول. إذا كانت إشارة TMRE-الوحيدة هي أكبر بكثير من أي من الميتوكوندريا عينات تعامل و / أو إذا الميتوكوندريا معاملة لا تختلف كثيرا عن دون علاج، ثم كانت على الأرجح لم تكن ناجحة عزل الميتوكوندريا جانب. انخفاض ΔΨ مقاسا نسبة الحصول عليهاعند اتباع هذا البروتوكول هو مماثل لالمبالغ المعلنة سابقا عن السيطرة، والخلايا السليمة 2،35. أظهرت المقارنة بين التغيرات ΔΨ من الميتوكوندريا معزولة عن السيطرة، وخلايا HEK-293T غير المعالجة و* 3 خلايا المعالجة خلوى أن بقاء الخلية الملاحظ في المقايسات MTT يترجم إلى انخفاض وظيفة الميتوكوندريا. يمكن بسهولة أن تستخدم هذا القارئ لوحة الفحص مع الميتوكوندريا المعزولة من أي مصدر واستخدامه لفحص نماذج المرض مثل ALS، كما هو موضح هنا 13،14.

وقد استخدمت العديد من الدراسات الميتوكوندريا محددة الأصباغ الفلورية للكشف عن MOMP، والتي كانت مهمة في نشأة هذا القارئ لوحة الفحص. ومع ذلك، هذه الدراسات إما استخدام الخلايا الكاملة لفحص المركبات التي تعمل على منع أو حث MOMP 35،36، واستكشاف الأصباغ الاستشعار ΔΨ الجديد 2 أو تحديد الصيغ الأخرى مثل التدفق الخلوي على رقاقة 37. هذا البروتوكول هو فريد من نوعه من حيث أنه يصف الإعلانطريقة etailed لعزل واستخدام الميتوكوندريا للتحقيق بسرعة آثار العلاج خلية كاملة من خلال الاستجابة لمركبات ΔΨ-تغيير المعروفة. هذا البروتوكول يستخدم مجموعة متنوعة من uncouplers ومثبطات، ويشير إلى أن أي منها سيكون مناسبة لتقييم الصحة الميتوكوندريا. وهكذا، في حين أن هذا التحقيق مراكز معينة على التغيرات الميتوكوندريا بسبب الإجهاد الخلوي أو اختلال وظيفي الخلوي التدريجي، ويمكن أيضا أن تستخدم بروتوكول لاستكشاف التغيرات في استقلاب الميتوكوندريا من خلال استخدام مركبات معينة و / أو إضافة مصادر الإلكترون مثل ساكسينات وNADH .

اعتبارات هامة عند إجراء تقييم الميتوكوندريا معزولة تشمل التناسق في حجم العلاج، والحفاظ على الميتوكوندريا في MIB وتمييع لهم في EB مباشرة قبل العلاج تسير على إقامتها، واستخدام الميتوكوندريا خلال 3 ساعة من العزلة لضمان ΔΨ من لا يزال يجري الحفاظ عليها. الكان من المقرر أن القدرة على استخدام تركيزات الصغيرة وبساطة تحليل مضان باستخدام طول موجي واحد فقط اختيار TMRE اكثر من غيرها من الأصباغ الميتوكوندريا محددة الفلورسنت مثل JC-1. يمكن بالمثل أن تتم هذه الطريقة باستخدام فلوري المجهر 2،38 أو التدفق الخلوي 37، ولكن استخدام قارئ لوحة يستغرق وقتا أقل ويتطلب أقل الأمثل 35. وبالإضافة إلى ذلك، وهذا البروتوكول هو أقل تطلبا من الناحية الفنية استنساخه من ذلك بكثير، أسرع إلى القيام بها، وأكثر من ذلك بسهولة كما مقارنة باستخدام القطب كلارك 22 (ديل Gaizo مور، والملاحظات غير منشورة). المعايرة مبالغ كل معاملة الميتوكوندريا قد توفر مزيد من التبصر في وظيفة الميتوكوندريا والاستفادة المثلى من تركيزات يجب أن يتم تنفيذ. إجمالي حجم ردود الفعل الميتوكوندريا يمكن تعديلها لتناسب حجم العينة التي تم الحصول عليها خلال العزلة فضلا عن عدد من ردود الفعل العلاج اللازم. إذا كان ذلك ممكنا، وكمية قياسية من 50 μ، وهي تستخدم ل. ومع ذلك، ما لا يزيد عن 20 ميكرولتر من الميتوكوندريا تنتج نتائج موثوقة.

في حين ΔΨ يرتبط استهلاك الأوكسجين، قدم الفحص لا يقيس مباشرة استهلاك الأوكسجين. في حين الفلورسنت الأكسجين التحقيق الاستشعار مثل MitoExpress تم وضعها، ويفترض أن تجنب بعض القصور في استخدام استشهد كلارك الكهربائي أعلاه، فإن سعر في رد الفعل وشرط من كميات أكبر من الميتوكوندريا في فحص يبقى مقيدا. ولذلك، فإن استخدام TMRE وuncouplers ΔΨ الكلاسيكية أو مثبطات ديها العديد من المزايا. مرة أخرى، وتحليل مجموعة من عينات متعددة أو معالجات متعددة / عينة، استنساخ، أقل متطلبات المواد انطلاق و / أو كمية أقل من الميتوكوندريا معزولة المطلوبة لكل رد فعل يجعل هذا البروتوكول جاذبية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
L-glutamic acid Sigma G1251 Can use the potassium salt instead.
malic acid Sigma M8304 Can use the potassium salt instead.
KH2PO4 Sigma P0662
K2HPO4 Sigma P3786
EGTA Sigma E3889
Trisma base Sigma T6066
MOPS Sigma M3183
CCCP Sigma C2920 Dilute down to 100 μM as a working stock in ethanol and store at -20 °C.
Valinomycin Sigma V0627 Make in DMSO and use as a 5 μM working stock. Store at -20 °C.
sucrose Fisher S5-500
KCN Mallinckrodt 6379 Make a concentrated stock in ethanol and then dilute with water 
rotenone Sigma R8875 Highly toxic. Made in ethanol.
oligomycin Sigma O4876 Highly toxic. Made in ethanol.
ADP Sigma A2754
TMRE Sigma 8717-25mg Dilute 100 μM stock with EB immediatley before use.
DMEM Gibco 11965-084 1x regular (high glucose).
Pen/Strep Invitrogen 15140-155
L-glutamine Fisher SH3002101 Store aliquots at -20 °C
FBS Lonza 14-501F US origin, premium quality. Heat inactivate and store aliquots at -20 °C.
Trypsin-EDTA Sigma T4049
DMSO SIgma D2650
Protien Assay Dye (5x) Bio-Rad 500-0006 Any protein assay can substitute.
BSA Fisher BP1600-100 Make 2 mg/ml stock in water for protein assay.
MTT powder Sigma M2128 Filter sterlize 5 mg/ml stock made in PBS. Store aliquots at -20 °C; store at 4 °C for up to 1 week.
Tergitol solution (NP-40) Sigma NP40S
Recombinant Human IL-1B Gibco PCH08014 Once opened store aliquots at -20 °C
Recombinant Human TNF-alpha Gibco PHC3015L
Recombinant Human IFN-gamma Gibco PHC4031
Dulbeccos PBS (-/-) Sigma D8537 Make sure it is without Mg2+ and Ca2+ ions.
Cytochrom c ELISA kit R&D systems DTC0 Human for HEK-293T cells. 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Madeira, V. M. Overview of mitochondrial bioenergetics. Methods In Molecular Biology. 810, 1-6 (2012).
  2. Sakamuru, S., et al. Application of a homogenous membrane potential assay to assess mitochondrial function. Physiological Genomics. 44, 495-503 (2012).
  3. Clayton, D. A. Structure and function of the mitochondrial genome. Journal Of Inherited Metabolic Disease. 15, 439-447 (1992).
  4. Schatz, G. The protein import system of mitochondria. The Journal of Biological Chemistry. 271, 31763-31766 (1996).
  5. Mayer, A., Neupert, W., Lill, R. Mitochondrial protein import: reversible binding of the presequence at the trans side of the outer membrane drives partial translocation and unfolding. Cell. 80, 127-137 (1995).
  6. Green, D. R., Kroemer, G. The pathophysiology of mitochondrial cell death. Science. 305, 626-629 (2004).
  7. Shamas-Din, A., Kale, J., Leber, B., Andrews, D. W. Mechanisms of action of Bcl-2 family proteins. Cold Spring Harbor Perspectives In Biology. 5, a008714 (2013).
  8. Hardwick, J. M., Youle, R. J. SnapShot: BCL-2 proteins. Cell. 138, 404 (2009).
  9. Zoratti, M., Szabo, I. The mitochondrial permeability transition. Biochimica et Biophysica Acta. 1241, 139-176 (1995).
  10. Wu, C. C., Bratton, S. B. Regulation of the intrinsic apoptosis pathway by reactive oxygen species. Antioxidants & Redox Signaling. 19, 546-558 (2013).
  11. Kuwana, T., et al. BH3 domains of BH3-only proteins differentially regulate Bax-mediated mitochondrial membrane permeabilization both directly and indirectly. Molecular Cell. 17, 525-535 (2005).
  12. Joshi, D. C., Bakowska, J. C. Determination of mitochondrial membrane potential and reactive oxygen species in live rat cortical neurons. Journal Of Visualized Experiments. (2011).
  13. Vinsant, S., et al. Characterization of early pathogenesis in the SOD1(G93A) mouse model of ALS: part I, background and methods. Brain and Behavior. 3, 335-350 (2013).
  14. Vinsant, S., et al. Characterization of early pathogenesis in the SOD1(G93A) mouse model of ALS: part II, results and discussion. Brain and Behavior. 3, 431-457 (2013).
  15. Rajapakse, N., Shimizu, K., Payne, M., Busija, D. Isolation and characterization of intact mitochondria from neonatal rat brain. Brain research. Brain Research Protocols. 8, 176-183 (2001).
  16. Schmitt, S., et al. A semi-automated method for isolating functionally intact mitochondria from cultured cells and tissue biopsies. Analytical Biochemistry. 443, 66-74 (2013).
  17. Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts. Nature Protocols. 2, 287-295 (2007).
  18. Debatin, K. M., Poncet, D., Kroemer, G. Chemotherapy: targeting the mitochondrial cell death pathway. Oncogene. 21, 8786-8803 (2002).
  19. Del Gaizo Moore, V., et al. Chronic lymphocytic leukemia requires BCL2 to sequester prodeath BIM, explaining sensitivity to BCL2 antagonist ABT-737. The Journal of Clinical Investigation. 117, 112-121 (2007).
  20. Del Gaizo Moore, V., Schlis, K. D., Sallan, S. E., Armstrong, S. A., Letai, A. BCL-2 dependence and ABT-737 sensitivity in acute lymphoblastic leukemia. Blood. 111, 2300-2309 (2008).
  21. Li, N., et al. Mitochondrial complex I inhibitor rotenone induces apoptosis through enhancing mitochondrial reactive oxygen species production. The Journal of Biological Chemistry. 278, 8516-8525 (2003).
  22. Hynes, J., et al. Investigation of drug-induced mitochondrial toxicity using fluorescence-based oxygen-sensitive probes. Toxicological Sciences : An Official Journal Of The Society of Toxicology. 92, 186-200 (2006).
  23. Papkovsky, D. B. Methods in optical oxygen sensing: protocols and critical analyses. Methods in enzymology. 381, 715-735 (2004).
  24. Galluzzi, L., et al. Methods for the assessment of mitochondrial membrane permeabilization in apoptosis. Apoptosis : An International Journal On Programmed Cell Death. 12, 803-813 (2007).
  25. Gurney, M. E., et al. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation. Science. 264, 1772-1775 (1994).
  26. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry. 150, 76-85 (1985).
  27. Certo, M., et al. Mitochondria primed by death signals determine cellular addiction to antiapoptotic BCL-2 family members. Cancer Cell. 9, 351-365 (2006).
  28. Hogeboom, G. H., Schneider, W. C., Pallade, G. E. Cytochemical studies of mammalian tissues; isolation of intact mitochondria from rat liver; some biochemical properties of mitochondria and submicroscopic particulate material. The Journal Of Biological Chemistry. 172, 619-635 (1948).
  29. Hogeboom, G. H., Claude, A., Hotch-Kiss, R. D. The distribution of cytochrome oxidase and succinoxidase in the cytoplasm of the mammalian liver cell. The Journal of Biological Chemistry. 165, 615-629 (1946).
  30. Marques-Fernandez, F., et al. TNFalpha induces survival through the FLIP-L-dependent activation of the MAPK/ERK pathway. Cell Death & Disease. 4, e493 (2013).
  31. Chao, C. C., Hu, S., Ehrlich, L., Peterson, P. K. Interleukin-1 and tumor necrosis factor-alpha synergistically mediate neurotoxicity: involvement of nitric oxide and of N-methyl-D-aspartate receptors. Brain, Behavior, And Immunity. 9, 355-365 (1995).
  32. Downen, M., Amaral, T. D., Hua, L. L., Zhao, M. L., Lee, S. C. Neuronal death in cytokine-activated primary human brain cell culture: role of tumor necrosis factor-alpha. Glia. 28, 114-127 (1999).
  33. Schildberger, A., Rossmanith, E., Weber, V., Falkenhagen, D. Monitoring of endothelial cell activation in experimental sepsis with a two-step cell culture model. Innate Immunity. 16, 278-287 (2010).
  34. Brown, M. R., et al. Nitrogen disruption of synaptoneurosomes: an alternative method to isolate brain mitochondria. Journal Of Neuroscience Methods. 137, 299-303 (2004).
  35. Wong, A., Cortopassi, G. A. High-throughput measurement of mitochondrial membrane potential in a neural cell line using a fluorescence plate reader. Biochemical and Biophysical Research Communications. 298, 750-754 (2002).
  36. Blattner, J. R., He, L., Lemasters, J. J. Screening assays for the mitochondrial permeability transition using a fluorescence multiwell plate reader. Analytical Biochemistry. 295, 220-226 (2001).
  37. Kataoka, M., Fukura, Y., Shinohara, Y., Baba, Y. Analysis of mitochondrial membrane potential in the cells by microchip flow cytometry. Electrophoresis. 26, 3025-3031 (2005).
  38. Del Gaizo Moore, V., Payne, R. M. Transactivator of transcription fusion protein transduction causes membrane inversion. The Journal of Biological Chemistry. 279, 32541-32544 (2004).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics