अलगाव और संवर्धित कोशिकाओं और माउस के ऊतकों से माइटोकॉन्ड्रिया के कार्यात्मक विश्लेषण

Biology

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Lampl, T., Crum, J. A., Davis, T. A., Milligan, C., Del Gaizo Moore, V. Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue. J. Vis. Exp. (97), e52076, doi:10.3791/52076 (2015).

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Abstract

Introduction

जीवित कोशिकाओं में वसा और कार्बोहाइड्रेट के रूप में चयापचय ऊर्जा बैंक और जैव संश्लेषण, झिल्ली परिवहन और आंदोलन के लिए इस ऊर्जा का उपयोग करें। कुछ ऊर्जा ग्लाइकोलाइसिस के दौरान सीधे एटीपी में आहार शर्करा के रूपांतरण के माध्यम से cytosol में प्राप्त की है। हालांकि, एक सेल में एटीपी उत्पादन का मुख्य स्रोत mitochondrial श्वसन श्रृंखला 1 के माध्यम से माइटोकॉन्ड्रिया के भीतर इस्तेमाल किया जाता है। माइटोकॉन्ड्रिया की वास्तुकला प्रभावी और कुशल एटीपी उत्पादन के लिए आवश्यक स्थानिक उन्मुखीकरण प्रदान करता है। माइटोकॉन्ड्रिया घटकों एक intermembrane अंतरिक्ष से और एक साथ मैट्रिक्स, अंतरतम माइटोकॉन्ड्रियल डिब्बे, घर के साथ अलग से एक डबल झिल्ली के अधिकारी और एटीपी पीढ़ी में शामिल रासायनिक प्रतिक्रियाओं समन्वय। भीतरी झिल्ली सांस की श्रृंखला के साथ ही एटीपी synthase, एटीपी के गठन के लिए एक साथ ADP और अनुकरणीय लाता है कि प्रोटीन जटिल है कि शामिल झिल्ली बाध्य प्रोटीन परिसरों की एक श्रृंखला शामिल है। इनईआर झिल्ली cristae में जोड़ रहा है और इलेक्ट्रॉनों साइटोक्रोम सी, intermembrane अंतरिक्ष के भीतर परिसरों के बीच चलता है जो एक घुलनशील इलेक्ट्रॉन वाहक के माध्यम से सांस की श्रृंखला परिसरों के साथ पारित कर रहे हैं। इलेक्ट्रॉनों ले जाते हैं, को कम करने के समकक्ष का ऑक्सीकरण होता है और हाइड्रोजन आयनों intermembrane अंतरिक्ष के लिए मैट्रिक्स से पंप हैं। Intermembrane अंतरिक्ष के भीतर उच्च आयन एकाग्रता का एक परिणाम के रूप में, एक विद्युत ढाल भीतरी mitochondrial झिल्ली (Δψ) दो भर में एक झिल्ली क्षमता में जिसके परिणामस्वरूप बनाता है। ऑक्सीजन इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला के अंतिम इलेक्ट्रॉन स्वीकर्ता है, और हाइड्रोजन आयनों मैट्रिक्स को वापस intermembrane अंतरिक्ष से एटीपी synthases के माध्यम से प्रवाह है, और इसलिए सीधे करने में एटीपी गठन का कारण। अपनी संपूर्णता में वर्णित के रूप में इस प्रक्रिया को ऑक्सीडेटिव फास्फारिलीकरण के रूप में जाना जाता है। cristae की सिलवटों अधिक से अधिक इलेक्ट्रॉन परिवहन और एटीपी उत्पादन के भीतर की अनुमति के लिए भीतरी झिल्ली की सतह के क्षेत्र में वृद्धिप्रत्येक mitochondrion। प्रोटीन, एंजाइम और ऑक्सीडेटिव फास्फारिलीकरण में शामिल अन्य अणुओं के परमाणु और mitochondrial जीन दोनों से निकाली गई है। माइटोकॉन्ड्रिया 13 प्रोटीन के रूप में अच्छी तरह से tRNAs और एटीपी उत्पादन 3 के लिए आवश्यक mRNAs के लिए अपने स्वयं के परिपत्र डीएनए, एन्कोडिंग होते हैं। हालांकि, कई और अधिक प्रोटीन की जरूरत होती है और इस तरह इनकोडिंग परमाणु रहे हैं। इन परमाणु इनकोडिंग प्रोटीन के अधिकांश अग्रदूत प्रोटीन के एन टर्मिनस पर presequences के उपयोग के द्वारा माइटोकॉन्ड्रियल मैट्रिक्स को लक्षित कर रहे हैं, और उनके आयात Δψ 4,5 में भाग द्वारा संचालित है।

एक सेल का बायोइनरजेटिक्स में योगदान करने के अलावा, माइटोकॉन्ड्रिया भी ऐसे टीसीए और बीटा ऑक्सीकरण, विनियमन कैल्शियम के माध्यम से सेलुलर संकेत है, साथ ही apoptosis के छह में एक महत्वपूर्ण भूमिका के रूप में प्रमुख चयापचय की प्रक्रिया को प्रभावित करती है। विशेष रूप से, सेलुलर तनाव के समय के दौरान, पर रहते हैं या कि बीसीएल -2 परिवार प्रोटीन माइटोकॉन्ड्रियल पैदा कर सकता है माइटोकॉन्ड्रियल बाहरी झिल्ली पर बातचीतबाहरी झिल्ली पारगम्यता (MOMP) 7,8। MOMP के दौरान, साइटोक्रोम और अन्य प्रोटीन कई साइटोसोलिक प्रोटीन के साथ एक साथ एक जटिल apoptosome 9,10 बुलाया फार्म साइटोसॉल में जारी है, और कर रहे हैं। apoptosome apoptosis के निष्पादन चरण के दौरान सेलुलर प्रोटीन और डीएनए फोड़ना पर जाने के लिए कि caspases को सक्रिय करता है। MOMP तब होता है, जैसे ही ΔΨ ढह गई है और एटीपी उत्पादन रुका। इस प्रकार, apoptosis के रूप में शुरू की है mitochondrial समारोह समझौता किया है और ΔΨ में परिवर्तन माइटोकॉन्ड्रियल और सेल स्वास्थ्य से 12 सहसंबद्ध किया जा सकता है। Apoptosis को भी रोग व्युत्पत्ति और / या प्रगति के बारे में बहुमूल्य जानकारी उपज कर सकते हैं कई रोग मॉडल, ΔΨ को mitochondrial समारोह और परिवर्तन में एक समापन बिंदु है। उदाहरण के लिए, माइटोकॉन्ड्रियल संरचनात्मक और कार्यात्मक परिवर्तन neurodegenerative रोगों 13,14 के दौरान प्रलेखित किया गया है।

प्रोटोकॉल, आईएसओ के पहले भाग मेंउनके ΔΨ बरकरार रहती है बरकरार माइटोकॉन्ड्रिया की आबादी में वर्णित है। HEK-293T कोशिकाओं apoptosis को प्रेरित करने के लिए विभिन्न सांद्रता और पुनः संयोजक टीएनएफ-α, IL1-β और IFN-γ के संयोजन से अवगत कराया गया। वे अक्सर अपने रिसेप्टर 6 के लिए बाध्य टीएनएफ-α की बातचीत से शुरू हो सकता प्राथमिक मानव सेप्टिक नमूने 15 और apoptosis के बाह्य मार्ग में उच्च होने की रिपोर्ट कर रहे हैं क्योंकि ये साइटोकिन्स चुने गए हैं। संवर्धित कोशिकाओं की तुलना में प्राथमिक ऊतकों से कार्यात्मक माइटोकॉन्ड्रिया को अलग-थलग करने के लिए आवश्यक सूक्ष्म परिवर्तनों के बाद से वहाँ अधिक से अधिक शोध जानवरों का इस्तेमाल करता है, क्योंकि और, प्रोटोकॉल भी जिगर और पार्श्व काठिन्य (ए एल एस) माउस मॉडल पूर्वकाल की रीढ़ की हड्डी डोरियों से माइटोकॉन्ड्रिया अलग करने के लिए कैसे करें।

प्रोटोकॉल के दूसरे भाग में एक फ्लोरोसेंट प्लेट पाठक के साथ एक संभावित रूप से संवेदनशील फ्लोरोसेंट डाई का उपयोग mitochondrial झिल्ली क्षमता के लिए perturbations की निगरानी के लिए विकसित किया गया था। बेदसेलुलर स्थिति (अस्वस्थ बनाम यानी, स्वस्थ) के बीच की mitochondrial झिल्ली क्षमता का अपव्यय के कारण जो सभी के uncoupling एजेंटों, सांस की श्रृंखला निरोधक, जटिल inhibitors और ionophores, के साथ संयोजन के रूप में पृथक माइटोकॉन्ड्रिया के ΔΨ की ताकत quantitating से भेदभाव कर रहे हैं। इसलिए माइटोकॉन्ड्रिया की प्रतिक्रिया माइटोकॉन्ड्रियल (Dys) समारोह का एक संकेतक के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है माइटोकॉन्ड्रियल निरोधक, के साथ इलाज पर ΔΨ में परिवर्तन बड़ा, माइटोकॉन्ड्रिया स्वस्थ।

बल्कि समारोह के सीटू के आकलन की तुलना में अलग माइटोकॉन्ड्रिया के इस्तेमाल की एक विकृति या उपचार सीधे organelle 16-18 में परिवर्तन modulates कि निश्चित सबूत प्रदान करता है। संवर्धित कोशिकाओं से माइटोकॉन्ड्रिया को अलग करने के साहित्य में तरीके हैं, वहीं वे अस्पष्ट हैं 17 और / या विशेष उपकरणों 16 का उपयोग। इस प्रोटोकॉल में विस्तार से अलगाव विधि का वर्णन करता है और हैप्राथमिक ऊतक और संस्कृतियों 13,14,19,20 सहित अन्य सेल लाइनों, के लिए आसानी से अनुकूलनीय। कई अलग-थलग माइटोकॉन्ड्रिया पढ़ाई इस प्रोटोकॉल में, लेकिन एक क्लार्क इलेक्ट्रोड के साथ प्रयोग किया वही माइटोकॉन्ड्रियल uncouplers और अवरोधकों फिर से उपकरणों की एक बहुत विशिष्ट और विशिष्ट टुकड़ा है, जो (21 साहित्य में कई कागजात के एक प्रतिनिधि उदाहरण है) का उपयोग। इसके अलावा, इस पारंपरिक विधि इतनी कम throughput और उच्च जटिलता 22,23 रूप सीमाएँ हैं और माइटोकॉन्ड्रिया की एक पर्याप्त राशि (~ 500 माइक्रोग्राम प्रति / प्रतिक्रिया) की आवश्यकता है। इस प्रोटोकॉल में, फ्लोरोसेंट झिल्ली संवेदन संभावित जांच TMRE एक मानक मशीन कई प्रयोगशालाओं में है जो एक फ्लोरोसेंट प्लेट रीडर, साथ संयोजन के रूप में प्रयोग किया जाता है। इसे जल्दी से कोशिकाओं और पृथक माइटोकॉन्ड्रिया में प्रवेश करती है और कम मात्रा 24 में इस्तेमाल किया जा सकता है के बाद से TMRE व्यापक रूप से माना जाता है। एकाधिक प्रतिक्रियाओं जल्दी से मिलकर में स्थापित किया जा सकता है और बैच इस प्रोटोकॉल का उपयोग का विश्लेषण किया। इसके अलावा, प्रतिक्रियाएस पृथक माइटोकांड्रिया (~ / प्रतिक्रिया 10 माइक्रोग्राम प्रति) की एक बहुत छोटी राशि की आवश्यकता है। कम सामग्री की आवश्यकता द्वारा, छोटे ऊतक या सेल संस्कृति के नमूने माइटोकॉन्ड्रिया अलगाव के लिए एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में उपयोग किया जा सकता है, और अधिक प्रतिकृति या प्रतिक्रियाओं की स्थापना की है, और इस तरह के एटीपी उत्पादन, ऑक्सीजन की खपत, या आयात के रूप में अन्य पृथक माइटोकॉन्ड्रिया प्रयोगों के लिए संभावित रूप से पर्याप्त सामग्री किया जा सकता है assays के संभव हैं।

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Protocol

सभी पशु प्रयोगों स्वास्थ्य के दिशा निर्देशों के राष्ट्रीय संस्थानों को पुष्टि और जागो वन विश्वविद्यालय के पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया। SOD1G93A [B6SJL-TGN (SOD1-G93A) 1Gur] माउस मॉडल के लिए प्रजनन जोड़े जैक्सन प्रयोगशाला (बार हार्बर, इ) से प्राप्त किया गया। जंगली प्रकार (डब्ल्यूटी) महिलाओं और SOD1G93A पुरुषों Nontransgenic [B6SJL-TGN (SOD1-G93A) 1Gur] SOD1G93A चूहों और प्रयोगों में इस्तेमाल किया गया है कि nontransgenic गुम्मट littermates उत्पन्न करने के लिए पैदा किया गया।

जांच के लिए 1. मॉडल

  1. सेल संस्कृति
    1. 5% सीओ 2 में 37 डिग्री सेल्सियस पर मानव भ्रूण गुर्दे की कोशिकाओं (HEK-T293) 10% गर्मी निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम, 1% पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन, और 1% एल glutamine के साथ पूरक DMEM में कोशिकाओं, बनाए रखें।
    2. T75 बोतल में कोशिकाओं को विकसित करने और उन्हें 90% संगम तक पहुँचने के लिए अनुमति देते हैं।
    3. 5% सीओ 2 में 37 डिग्री सेल्सियस पर 3-5 मिनट के लिए trypsinization (0.25% trypsin-EDTA) के माध्यम से सेल बंटवारे के लिए बाहर ले
    4. मीडिया Aspirate और संस्कृति मीडिया में सेल गोली resuspend।
    5. 7 एक्स 10 4 कोशिकाओं एक T75 में उपयुक्त कुप्पी या थाली में बीज कोशिकाओं उपचार साइटोकाइन करने से पहले 48 घंटा फ्लास्क। इस इलाज के समय में 70% ~ घनत्व देना चाहिए।
    6. सीरम भूखा कोशिकाओं 24 घंटा बाद में मीडिया aspirating और सीरम मुक्त मीडिया के एक ही मात्रा (DMEM, बाँझ) के साथ जगह से।
    7. 5 स्नातकोत्तर / μl, 10 एनजी / μl का काम कर रहे सांद्रता में अति शुद्ध पानी के साथ lyophilized पाउडर से टीएनएफ-α, IL1-β, और IFN-γ, तैयार है, और 10 एनजी / μl, क्रमशः और कुओं के लिए उन्हें जोड़ने / बोतल।
    8. दावत सीरम सीधे उपयुक्त बोतल के सेल संस्कृति मीडिया के लिए solubilized साइटोकिन्स के अलावा द्वारा कोशिकाओं की कमी से जूझ। उपचार, व्यक्तिगत साइटोकिन्स के सभी तीन में से एक कॉकटेल शामिल (के रूप में "* 3" के लिए कहा गया है), या sterएक नियंत्रण के रूप में इले पानी ("शून्य" के रूप में करने के लिए कहा गया है)।
    9. मूल्यांकन और कटाई से पहले 24, 48 या 72 घंटे के लिए इलाज कोशिकाओं को सेते हैं।
  2. सेल व्यवहार्यता का आकलन
    1. 1x पीबीएस में 3- (4,5-dimethylthiazol-2-YL) के एक 5 मिलीग्राम / एमएल समाधान -2,5-diphenyltetrazolium ब्रोमाइड (MTT) बनाते हैं।
    2. 12 अच्छी तरह से प्लेटों के लिए, अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए MTT के समाधान के 100 μl जोड़ने और धीरे भी वितरण को आश्वस्त करने के ज़ुल्फ़।
    3. 5% सीओ 2 में 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट-एक घंटे के लिए प्लेटें सेते हैं, और बैंगनी रंग की उपस्थिति के लिए एक खुर्दबीन के नीचे की जाँच करें। कोई बैंगनी मौजूद है, तो फिर से चक्कर आने और बैंगनी मनाया जाता है जब तक कोशिकाओं 5 मिनट के अंतराल में सेते दें। आवश्यक समय की राशि प्रत्येक अन्वेषक द्वारा निर्धारित किया जाना चाहिए।
    4. सभी बैंगनी रंग की कोशिकाओं को छोड़ दिया था जब तक एक दोहराने pipettor का उपयोग, अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए MTT विलायक (isopropanol में 4 मिमी एचसीएल और 0.1% NP40) के 700 μl जोड़ने और 5-10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर थाली (एस) रॉक, या । बैंगनी हैंरंग, कोशिकाओं के बाहर आ विलायक के एक अतिरिक्त 200 μl जोड़ने और चक्कर आने के लिए जारी नहीं करता है।
    5. रीडिंग लगातार सेटिंग्स में लिया जाता है के रूप में हालांकि 595 एनएम के रूप में लंबे समय तक भी स्वीकार्य है, विश्लेषण के लिए, अच्छी तरह से प्रत्येक से 100 μl ले और एक 96 अच्छी तरह से थाली में डाल दिया है और 570 एनएम का उपयोग कर एक प्लेट रीडर और 630 एनएम के एक संदर्भ तरंगदैर्ध्य पर पढ़ें।
  3. ए एल एस के पशु मॉडल
    1. सभी पशु प्रयोगों स्वास्थ्य के दिशा निर्देशों के राष्ट्रीय संस्थानों को पुष्टि और जागो वन विश्वविद्यालय के पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया। SOD1G93A [B6SJL-TGN (SOD1-G93A) 1Gur] माउस मॉडल के लिए प्रजनन जोड़े जैक्सन प्रयोगशाला (बार हार्बर, इ) से प्राप्त किया गया। जंगली प्रकार (डब्ल्यूटी) महिलाओं और SOD1G93A पुरुषों Nontransgenic [B6SJL-TGN (SOD1-G93A) 1Gur] SOD1G93A चूहों और प्रयोगों में इस्तेमाल किया गया है कि nontransgenic गुम्मट littermates उत्पन्न करने के लिए पैदा किया गया।
    2. उत्परिवर्ती SOD1 25 के खिलाफ मानक प्राइमरों के साथ जीनोटाइपिंग प्रदर्शन करते हैं।

माइटोकॉन्ड्रिया के 2. अलगाव

नोट: यह जल्दी से काम करते हैं और प्रक्रिया के दौरान बर्फ पर सब कुछ रखने के लिए महत्वपूर्ण है।

  1. माइटोकॉन्ड्रियल अलगाव बफर (एमआईबी), रीढ़ की हड्डी अलगाव बफर (अनुसूचित जाति एमआईबी) और प्रयोगात्मक बफर की तैयारी (ईबी)
    1. आगे एमआईबी और ईबी के लिए समय की निम्नलिखित स्टॉक समाधान तैयार करें।
    2. एच 2 ओ के 70 मिलीलीटर में Tris आधार के 12.1 छ भंग करके 1 एम Tris / MOPS बनाओ 7.4 पीएच को पाने के लिए सूखी MOPS जोड़ें। 100 मिलीलीटर अंतिम करने के लिए मात्रा समायोजित करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर बाँझ फ़िल्टर और दुकान।
    3. 80.2 कश्मीर 2 HPO 4 मिलीलीटर और के.एच. 2 पीओ 4 के 19.8 मिलीलीटर के मिश्रण से एक एम Kphos बनाओ। कमरे के तापमान पर रखो।
    4. एच 2 ओ के 10 एमएल के लिए EGTA की 3.8 ग्राम जोड़कर 0.2 एम EGTA / Tris बनाओ भंग, ~ 30-40 मिलीलीटर तक 1 एम Tris / MOPS जोड़ें। 50 मिलीलीटर, कमरे के तापमान पर बाँझ फिल्टर और स्टोर करने के लिए समायोजित करें। पीएच ~ 6.7 हो जाएगा कि ध्यान दें।
    5. के 10 एमएल बनाकर 1 एम ग्लूटामेट बनाओGlutamic एसिड की 1 एम समाधान। फ़िल्टर बाँझ और दुकान 4 डिग्री सेल्सियस।
    6. सेब का तेज़ाब की 1 एम समाधान के 10 मिलीलीटर बनाकर 1 एम Malate बनाओ। 50 मिमी Tris / MOPS जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर बाँझ फ़िल्टर और दुकान।
    7. 200 मिमी सुक्रोज, 10 मिमी Tris / mops, 7.4 पीएच, और 1 मिमी EGTA / Tris की एकाग्रता में एमआईबी बनाओ। 4 डिग्री सेल्सियस पर बाँझ फ़िल्टर और दुकान।
    8. 250 मिमी सुक्रोज, 20 मिमी HEPES-KOH के पीएच 7.5, 10 मिमी KCl, 1.5 मिमी 2 MgCl, 1 मिमी EDTA, 1 मिमी EGTA, 1 मिमी डीटीटी, और protease अवरोध करनेवाला कॉकटेल के एक एकाग्रता में अनुसूचित जाति एमआईबी बनाओ।
    9. 125 मिमी KCl की एकाग्रता में ईबी बनाओ, 10 मिमी Tris / mops, पीएच 7.4, 5 मिमी ग्लूटामेट, 2.5 मिमी Malate, 1 मिमी कश्मीर फॉस्फेट, पीएच 7.4, और 10 मिमी EGTA / Tris। 4 डिग्री सेल्सियस पर बाँझ फ़िल्टर और दुकान।
  2. कोशिकाओं कटाई करने से पहले उपकरण तैयार करना।
    1. एक छोटे से कांच के बर्तन और homogenization के मूसल बाँझ पानी के साथ तीन बार कुल्ला और बर्फ पर जगह है।
    2. इस तरह के एक मानक ड्रिल, सेल scra के रूप में आवश्यक वस्तुओं को इकट्ठाpers, 1.5 मिलीग्राम, 15 मिलीग्राम और 50 मिलीलीटर ट्यूब और समाधान।
  3. माइटोकॉन्ड्रिया अलगाव
    1. संवर्धित कोशिकाओं
      1. प्रत्येक नमूने प्रकार, सेल के दो T175 बोतल का उपयोग करें।
      2. कोशिकाओं रहे हैं कि ~ 90% मिला हुआ सुनिश्चित करने और नियंत्रण प्रयोगों, या थाली में इस्तेमाल करते हैं और 1.2 चरण में ऊपर वर्णित के रूप में व्यवहार करते हैं।
      3. और बेंच शीर्ष, महाप्राण मीडिया पर 1x पीबीएस के 15 मिलीलीटर प्रत्येक समय के साथ दो बार पक्षपाती कोशिकाओं धो लें।
      4. बफर Aspirate और कुप्पी के नीचे से पक्षपाती कोशिकाओं को हटाने के लिए बोतल परिमार्जन।
      5. प्रत्येक फ्लास्क, चक्कर आने के लिए 1x पीबीएस के 15 मिलीलीटर जोड़ें, और बर्फ पर अलग-अलग 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब और जगह हस्तांतरण।
      6. Scraping के एक झूलते बाल्टी रोटर का उपयोग कर एक तालिका के शीर्ष सेंट्रीफ्यूज का उपयोग कर 700 XG, 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए, अपकेंद्रित्र ट्यूब बार किया जाता है।
      7. महाप्राण supernatants और एमआईबी के 1 मिलीलीटर में प्रत्येक गोली resuspend।
      8. दोनों के निलंबन का मिश्रण है और homogenization के लिए एक छोटे से कांच के बर्तन के लिए स्थानांतरण।
      9. एमआईबी जोड़ेंपोत के लिए बफर पहली पंक्ति तक पहुँचता। तीन गुजरता के लिए मध्यम गति से एक ड्रिल से जुड़ी मूसल के साथ कोशिकाओं homogenize। पोत तरल से ऊपर मूसल दूर करने के लिए और सतत गुजरता के साथ एक स्थिर गति का उपयोग करने के लिए नहीं, इस कदम के दौरान बर्फ पर है कि सुनिश्चित करें।
      10. एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब से homogenized समाधान स्थानांतरण।
      11. एक 18 गेज 1 आधा इंच सुई का उपयोग एक 3 मिलीलीटर सिरिंज में समाधान ड्रा और एक 27 गेज आधा इंच सुई के साथ बर्फ पर वापस शंक्वाकार ट्यूब में यह निष्कासित। कोशिका झिल्ली विघटन के लिए कि बल का उपयोग करने के रूप में ट्यूब के अंदर दीवार के खिलाफ समाधान निष्कासित करने का ख्याल रखना।
      12. पांच बार की कुल के लिए सिरिंज चरणों को दोहराएँ।
      13. एक झूलते बाल्टी रोटर का उपयोग कर एक तालिका के शीर्ष अपकेंद्रित्र में 600 XG, 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब और अपकेंद्रित्र में समाधान स्थानांतरण।
      14. ध्यान से सतह पर तैरनेवाला हटाने और तीन 1.5 मिलीलीटर ट्यूब के बीच वितरित।
        नोट: Mitochoकोशिका झिल्ली और अटूट कोशिकाओं pelleted कर रहे हैं, जबकि ndria, यह पहली, कम गति स्पिन के बाद सतह पर तैरनेवाला में हैं।
      15. 10,000 XG, 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक निश्चित कोण रोटर में अपकेंद्रित्र ट्यूब।
      16. महाप्राण supernatants 100 μl एमआईबी में छर्रों गठबंधन और तुरंत बर्फ पर जगह और।
        नोट: Mitochondria इस उच्च गति स्पिन के बाद गोली में हैं। माइटोकॉन्ड्रिया आम तौर पर अलगाव के बाद 2-3 आयन बर्फ ~ के लिए उनके झिल्ली क्षमता को बनाए रखने और एमआईबी में एक केंद्रित शेयर समाधान के रूप में सबसे अधिक स्थिर हो जाएगा।
    2. माउस के ऊतकों से माइटोकॉन्ड्रिया अलगाव
      1. IACUC प्रोटोकॉल के अनुसार माउस anesthetize। संज्ञाहरण प्रेरित करने के लिए 5.0% से कम एक vaporizer सेट करें। आँख का दरवाजा खटखटाया या एक कपास झाड़ू के साथ उपयोग किया जाता है जब पशु पैर चुटकी या झपकी पलटा के लिए पलटा की कमी से anesthetized पुष्टि की है कि। 1.5% और 2.0% के बीच vaporizer के रखने के द्वारा पूरे शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया के लिए संज्ञाहरण के तहत माउस रखें।
      2. Excआईएसई पीबीएस 1x बर्फ ठंड में अलग से प्रत्येक जानवर और जगह से जिगर और रीढ़ की हड्डी - / - किसी भी रक्त दूर कुल्ला करने के लिए।
      3. जिगर के लिए, बर्फ पर एक तौलना डिश के लिए ऊतक स्थानांतरण और 1 मिनट के लिए एक नए सिरे से धार का उपयोग ठीक टुकड़ों में काट लें।
      4. बफर पहली पंक्ति तक पहुँच जाता है जब तक पोत के लिए ऊतक और (रीढ़ की हड्डी के लिए जिगर या अनुसूचित जाति एमआईबी के लिए एमआईबी) उपयुक्त बफर जोड़ें। पांच गुजरता के लिए हाथ से मूसल के साथ ऊतक homogenize। पोत तरल से ऊपर मूसल दूर करने के लिए और सतत गुजरता के साथ एक स्थिर गति का उपयोग करने के लिए नहीं, इस कदम के दौरान बर्फ पर है कि सुनिश्चित करें।
      5. Homogenates 15 मिलीलीटर ट्यूब साफ करने के लिए स्थानांतरण।
      6. 750 XG, 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक निश्चित कोण रोटर में अपकेंद्रित्र ट्यूब।
      7. साफ ट्यूबों में supernatants बचाने के लिए और बर्फ पर उन्हें जगह है।
        नोट: कोशिका झिल्ली और अटूट कोशिकाओं pelleted कर रहे हैं, जबकि mitochondria, यह पहली बार है, कम गति स्पिन के बाद सतह पर तैरनेवाला में हैं।
      8. रीढ़ की हड्डी छर्रों पुनः निलंबित मैंएन अनुसूचित जाति एमआईबी के 500 μl।
      9. केवल अनुसूचित जाति एमआईबी साथ पोत आधे रास्ते में इस समय को भरने, प्रत्येक तीन बार पुन: homogenize।
      10. एक ताजा ट्यूब नई homogenate स्थानांतरण।
      11. अपकेंद्रित्र 750 XG, 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक निश्चित कोण रोटर में।
      12. प्रत्येक नमूने से पहले सतह पर तैरनेवाला के साथ, और अधिक माइटोकॉन्ड्रिया होते हैं जो इन नए supernatants गठबंधन।
      13. 10,000 XG, 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक निश्चित कोण रोटर में अपकेंद्रित्र ट्यूब।
      14. महाप्राण supernatants और 500 बी के μl और 50 μl अनुसूचित जाति एमआईबी में रीढ़ की हड्डी के छर्रों में जिगर छर्रों resuspend और तुरंत बर्फ पर जगह है।
        नोट: Mitochondria इस उच्च गति स्पिन के बाद गोली में हैं। माइटोकॉन्ड्रिया आम तौर पर अलगाव के बाद 2-3 आयन बर्फ ~ के लिए उनके झिल्ली क्षमता को बनाए रखने और एमआईबी में एक केंद्रित शेयर समाधान के रूप में सबसे अधिक स्थिर हो जाएगा।
      15. समाधान में माइटोकॉन्ड्रिया की एकाग्रता अनुमान लगाने के लिए एक प्रोटीन एकाग्रता परख प्रदर्शन करते हैं। निर्देश का पालन करेंएक वाणिज्यिक प्रोटीन परख किट या इसी तरह की विधि 26 उपयोग करने के लिए है। माइटोकॉन्ड्रिया की विशिष्ट सांद्रता हैं: 2 T175 बोतल पैदावार ~ 2 मिलीग्राम / एमएल, एक माउस जिगर ~ 3-5 मिलीग्राम / एमएल, और एक माउस रीढ़ की हड्डी ~ 1-3 मिग्रा / मिली।
  4. (निर्माता द्वारा प्रदान प्रोटोकॉल से अनुकूलित) Quantikine एलिसा किट सी एक अनुसंधान एवं विकास चूहे / माउस साइटोक्रोम का उपयोग कर साइटोक्रोम परख।
    1. इसके तत्काल बाद प्रतिक्रियाओं स्थापित करने से पहले, ईबी के साथ 0.5 मिलीग्राम / एमएल काम कर रहे एकाग्रता के लिए माइटोकॉन्ड्रिया पतला और प्रतिक्रियाओं (ट्यूब प्रति माइटोकॉन्ड्रिया की आम तौर पर 30-50 μl) के लिए 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में पतला माइटोकॉन्ड्रिया वितरित।
    2. पतला माइटोकॉन्ड्रिया के लिए, कुल मात्रा का 1% से कम, ईबी या DMSO के या तो जोड़ें और 7-10 मिनट के लिए बेंच शीर्ष पर प्रतिक्रियाओं सेते हैं। एक लंबे समय के फ्रेम की जरूरत है अगर इन प्रतिक्रियाओं कमरे के तापमान पर अप करने के लिए 30 मिनट के लिए स्थिर रहे हैं।
    3. 10,000 XG, 5 मिनट और सावधान के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक निश्चित कोण रोटर में centrifugation द्वारा गोली माइटोकॉन्ड्रियाly के सतह पर तैरनेवाला अलग है और एक अलग 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में हर जगह है।
      नोट: ट्यूब या तो बाद में विश्लेषण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए या तुरंत इस्तेमाल किया जा सकता है।
    4. एक गोली और सतह पर तैरनेवाला 27 में साइटोक्रोम की एकाग्रता की तुलना द्वारा साइटोक्रोम की रिहाई का निर्धारण करते हैं।
      1. 1x पीबीएस में 0.5% टीएक्स-100 के साथ प्रतिक्रिया के मूल मात्रा में छर्रों solubilizing से नमूने तैयार करें।
      2. प्रत्येक नमूना के लिए, एलिसा थाली पर दो कुओं, अब solubilized गोली के लिए एक और साइटोक्रोम सी साधना के 100 μl के अलावा द्वारा प्रतिक्रिया से सतह पर तैरनेवाला के लिए एक तैयार (बोतल से बाहर सीधे उपयोग) से अधिक 0.5% Tx- के 100 μl 1x पीबीएस में 100, और उसके बाद सभी गोली या सतह पर तैरनेवाला नमूने की।
      3. धीरे, कवर मिश्रण और 1 घंटा, 37 डिग्री सेल्सियस के लिए सेते करने के लिए 20 सेकंड के लिए थाली में एक कम सेटिंग (स्तर 2-4) भंवर।
      4. अगला, विनिर्माण के अनुसार प्लेट पतला धो बफर के साथ चार बार धोनेएर के निर्देशों। कागज तौलिया पर कुओं दोहन द्वारा किसी भी अतिरिक्त समाधान निकालें।
      5. अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए एक ए + बी विकासशील समाधान और कमरे के तापमान पर अंधेरे में 20-30 मिनट के लिए थाली सेते हैं: अगला, एक के 150 μl जोड़ें।
      6. अंत में, प्रत्येक अच्छी तरह से रोकने के समाधान के 50 μl जोड़ने के लिए और एक microplate रीडर का उपयोग कर 540 एनएम पर absorbance रीडिंग ले। प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए सतह पर तैरनेवाला बनाम गोली में साइटोक्रोम की राशि की तुलना द्वारा साइटोक्रोम रिलीज की राशि की गणना।

Mitochondrial (Dys) समारोह 3. आकलन

  1. प्रतिक्रियाओं स्थापित कर रहे हैं ठीक पहले, 0.5 मिलीग्राम माइटोकॉन्ड्रिया पतला / एमएल ईबी के साथ एकाग्रता से काम कर रहा है और (माइटोकॉन्ड्रिया की आम तौर पर 30-50 μl ट्यूब प्रति इस्तेमाल किया जाता है) प्रतिक्रियाओं के लिए 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में रखा।
  2. Mitochondrial उपचार
    1. 50 एनएम Valinomycin के साथ मिश्रित FCCP उचित उपचार जोड़ें (ईबी नियंत्रण, 1 माइक्रोन, 10 माइक्रोन rotenone, 5 माइक्रोन oligomycin, 2 मिमी KCN, या 200 माइक्रोन ADP, अंतिम सांद्रता) पतला माइटोकॉन्ड्रिया की कुल मात्रा वें 10/01 पर प्रतिक्रियाओं अलग करने के लिए। सात मिनट के लिए बेंच शीर्ष पर प्रतिक्रियाओं सेते हैं।
      नोट: हानिकारक हो सकता है त्वचा के माध्यम से आकस्मिक घूस या अवशोषण के रूप में इन पदार्थों से निपटने जब ध्यान रखा जाना चाहिए।
    2. 100 माइक्रोन के एक काम एकाग्रता में बाँझ पानी में पुनर्गठन और 2 माइक्रोन के लिए, -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत, TMRE पतला और mitochondrial प्रतिक्रिया मात्रा के बराबर मात्रा में जोड़ें।
    3. सात मिनट के लिए बेंच शीर्ष पर प्रतिक्रियाओं सेते हैं।
    4. 10,000 XG, 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक निश्चित कोण रोटर में centrifugation द्वारा गोली माइटोकॉन्ड्रिया।
    5. लोड एक 396 अच्छी तरह से थाली पर प्रत्येक नमूने की सतह पर तैरनेवाला मात्रा का आधा और प्रतिदीप्ति पढ़ें।
      नोट: TMRE की उत्तेजना और उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य के लिए उपयोग किया जाएगा कि मात्रा और प्लेट का उपयोग निर्माता के निर्देशों के अनुसार अनुकूलित किया जाना चाहिएपरख। / उत्तेजना उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य का उपयोग कर एक माइक्रोन TMRE के 25 μl के साथ एक मानक 384 अच्छी तरह से काले रंग की प्लेट (अंतिम प्रतिक्रिया एकाग्रता) मजबूत संकेत प्राप्त किया गया था का उपयोग करना   485 एनएम / 535 एनएम।
    6. नियंत्रण (ईबी) और नियंत्रण नमूना से RFU द्वारा प्रयोगात्मक नमूना के लिए प्लेट रीडर से प्राप्त रिश्तेदार प्रतिदीप्ति मूल्य (RFU) विभाजित करके प्रत्येक उपचार के बीच प्रतिदीप्ति में गुना अंतर की गणना।

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Representative Results

200 स्नातकोत्तर / मिलीलीटर टीएनएफ-α, 40 एनजी / एमएल IL1-β, और 75 एनजी / एमएल IFN-γ साथ HEK-293T कोशिकाओं के उपचार (* 3) 24-48 घंटे के लिए कोशिका मृत्यु के प्रगतिशील मात्रा में (चित्रा 1 ए की ओर जाता है )। सेल व्यवहार्यता MTT assays के उपयोग मूल्यांकन और लगातार ~ 24 घंटा उपचार के साथ सेल व्यवहार्यता में 10% की कमी और 48 घंटा उपचार के साथ ~ 20% कमी नहीं है यह दर्शाता है कि गया था। व्यक्तिगत साइटोकिन्स के साथ इसी तरह की सांद्रता (100 स्नातकोत्तर / मिलीलीटर टीएनएफ-α, 40 एनजी / एमएल IL1-β, और 75 एनजी / एमएल IFN-γ) 48 घंटा में इसी तरह की कोशिका मृत्यु परिणाम निकलेगा, और उपचार के साथ इलाज किया कोशिकाओं का पता चलता है कि कमी में व्यवहार्यता मिश्रित करने के लिए (चित्रा 1 बी) को प्रभावित करता है की वजह से है। चित्रा 1 बी में व्यवहार्यता डेटा 3 अलग प्रयोगों तीन प्रतियों में प्रत्येक रन का मतलब +/- मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं, और त्रुटि सलाखों की तंगी डेटा के reproducibility प्रदर्शित करता है। साइटोकिन्स की राशि आगे elucidat करने के लिए इस उपचार प्रोटोकॉल में समायोजित किया जा सकता हैकोशिका मृत्यु पर प्रत्येक साइटोकाइन का योगदान ई, और अतिरिक्त साइटोकिन्स या अन्य कारक भी रूप में लंबे समय के रूप में उपयुक्त नियंत्रण क्रियान्वित कर रहे हैं, को शामिल किया जा सकता है।

कोशिकाओं और ऊतकों से माइटोकॉन्ड्रिया के अलगाव से 1940 28,29 के बाद साहित्य में वर्णित किया गया है। प्रक्रिया के लिए आधार कच्चे माइटोकॉन्ड्रिया ~ 10,000 एक्स जी पर गोली के लिए जाना जाता है, जहां अंतर centrifugation के द्वारा पीछा सेल व्यवधान है। पृथक माइटोकॉन्ड्रिया उपयोग कि कई प्रोटोकॉल उनके झिल्ली क्षमता बनाए रख सकते हैं कि अक्षुण्ण डबल झिल्ली की आवश्यकता होती है, और इसलिए यह अलगाव पूरा हो गया है एक बार अखंडता का मूल्यांकन करने के लिए आवश्यक है। सुसंस्कृत HEK कोशिकाओं से माइटोकॉन्ड्रिया अलगाव प्रोटोकॉल के विकास के दौरान, एक साइटोक्रोम परख बरकरार माइटोकॉन्ड्रिया प्राप्त किया गया है अगर इंगित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। एलिसा किट सी व्यावसायिक रूप से उपलब्ध साइटोक्रोम का प्रयोग, माइटोकॉन्ड्रिया फिर अलगाव के बाद मात्रा निर्धारित और EB में पतला थे, और या तो ईबी या DMSO केजोड़ा और प्रतिक्रियाओं बेंच शीर्ष पर सेते हैं। फिर, सतह पर तैरनेवाला आसपास से माइटोकॉन्ड्रिया को अलग करके, दोनों भिन्न की साइटोक्रोम सी सामग्री का विश्लेषण mitochondrial झिल्ली intactness के लिए एक लाइन के रूप में इस्तेमाल किया गया था; साइटोक्रोम के बहुमत तो माइटोकॉन्ड्रियल गोली में बनाए रखा है साइटोक्रोम के 15% से अधिक सतह पर तैरनेवाला में पाया जाता है, तो माइटोकॉन्ड्रिया कार्यात्मक अध्ययन के लिए अनुपयुक्त माना जाता था, जबकि माइटोकॉन्ड्रिया बरकरार माना जाता है। तालिका 1 में देखा के रूप में अलग माइटोकॉन्ड्रिया पूर्व इलाज DMSO के साथ कर रहे हैं, जब प्रोटोकॉल पैदावार ~ 12% साइटोक्रोम जारी है और ~ 15% का वर्णन किया। इसी तरह के परिणाम अन्य सेल लाइनों या जानवरों के ऊतकों 19,20,27 से अलग माइटोकॉन्ड्रिया के लिए पहले से सूचित किया गया है। वैकल्पिक रूप से, माइटोकॉन्ड्रियल अखंडता भी माउस जिगर और रीढ़ की हड्डी माइटोकॉन्ड्रिया के अलगाव के दौरान इस्तेमाल किया गया था, जो TMRE, साथ मूल्यांकन किया जा सकता है। प्रारंभिक अलगाव प्रोटोकॉल विकास सेमिनारों के दौरानNT, परीक्षण के जिगर और स्वस्थ, सामान्य चूहों माइटोकॉन्ड्रिया की रीढ़ की हड्डी डोरियों से अलग माइटोकॉन्ड्रिया का मूल्यांकन किया। प्रत्येक नमूना के लिए, ΔΨ FCCP + Valinomycin (तालिका 2) के साथ incubated उन लोगों के लिए ईबी के साथ इलाज पृथक माइटोकॉन्ड्रिया से फ्लोरोसेंट संकेत की तुलना द्वारा मूल्यांकन किया गया था। 1> की और इलाज माइटोकॉन्ड्रिया के बीच प्रतिदीप्ति के अनुपात स्वस्थ बरकरार माइटोकॉन्ड्रिया का एक संकेत के रूप में इस्तेमाल किया गया था।

सफल माइटोकॉन्ड्रिया अलगाव प्रोटोकॉल विकसित किए गए एक बार, माइटोकॉन्ड्रिया नियंत्रण, इलाज कोशिकाओं से अलग और * 3 साइटोकाइन कोशिकाओं का इलाज किया, या सामान्य और SOD1 चूहों विश्लेषण किया गया। दोनों समूहों से HEK माइटोकॉन्ड्रिया TMRE तेज करने के लिए परिवर्तन द्वारा मापा विभिन्न uncouplers और inhibitors और ΔΨ के साथ इलाज किया गया। नियंत्रण ईबी में गुना अंतर काल (/ इलाज किया माइटोकॉन्ड्रिया अवरोध करनेवाला दो समूहों के बीच ΔΨ की ताकत में एक फर्क इंगित करता है uncoupler प्रतिनिधि डेटा और करने के माइटोकॉन्ड्रिया में इलाजतालिका 3 में culations)। इसके अलावा, 3 इलाज कोशिकाओं (चित्रा 2) सेल व्यवहार्यता डेटा corroborating, माइटोकॉन्ड्रियल स्वास्थ्य साइटोकाइन उपचार से प्रभावित किया गया था दर्शाता है कि * करने अनुपचारित कोशिकाओं से प्रतिशत की कमी। चार ए एल एस चूहों की तुलना में जिगर और चार व्यक्ति सामान्य, नियंत्रण चूहों की रीढ़ की हड्डी डोरियों से अलग माइटोकॉन्ड्रिया का उपयोग कर TMRE तेज माध्यम ΔΨ ताकत का मूल्यांकन ऊतक स्वास्थ्य भी इस प्रोटोकॉल का उपयोग मूल्यांकन किया जा सकता है कि संकेत मिलता है। ΔΨ में गुना मतभेद और प्रतिशत घटने से यह साफ के रूप में, ईबी उपचार और FCCP + नियंत्रण और रोग-प्रगति की जानवरों से माइटोकॉन्ड्रिया के Valinomycin उपचार की तुलना में काफी अलग हैं (तालिका 4; देख भी 13 और 14 संदर्भ)।

चित्र 1
चित्रा 1: कोशिका मृत्यु प्रेरित* 3 उपचार द्वारा डी (ए) HEK-293T कोशिकाओं 24 या 48 घंटा और कोशिका मृत्यु के लिए इलाज किया गया। समय के साथ प्रगतिशील और व्यक्तिगत साइटोकाइन उपचार के साथ अधिक से अधिक है एक MTT परख का उपयोग मापा गया था। मूल्यों पर नियंत्रण के लिए सामान्यीकृत थे, इलाज के नमूने और डेटा N के लिए तीन प्रतियों माप का प्रतिनिधित्व = 3, +/- मानक विचलन। (बी) HEK-293T कोशिकाओं व्यक्ति साइटोकिन्स या एक कॉकटेल (* 3) 48 घंटे के लिए और कोशिका मृत्यु का मूल्यांकन साथ इलाज किया गया MTT परख के माध्यम से। डाटा, के लिए व्यक्तिगत साइटोकाइन और एन = 6 में से प्रत्येक के लिए एन = 5 * 3 का प्रतिनिधित्व करता है +/- मानक विचलन।

गोली (एयू) सतह पर तैरनेवाला (एयू) % साइटोक्रोम रिलीज
0 0.818 0.115 12.6 ± 2.27
DMSO के 0.793 0.142 15.3 ±; 2.23

तालिका 1:। संवर्धित कोशिकाओं से अलग माइटोकॉन्ड्रिया में साइटोक्रोम की अवधारण डाटा, एन = 4 की औसत प्रतिनिधित्व +/- मानक विचलन।

जिगर 1 जिगर 2 रीढ़ की हड्डी 1 रीढ़ की हड्डी दो
RFU ईबी 97,830 94,132 339,716 290,154
एफ / वी 435,188 461,299 385,366 482,480
अनुपात 4.45 4.9 1.13 1.66
ईबी = प्रयोगात्मक बफर और एफ / वी = FCCP + valinomycin।

तालिका 2:। सामान्य माउस ऊतकों से अलग माइटोकॉन्ड्रिया से ΔΨ का उपाय दो अलग-अलग जानवरों (जैसे जिगर एक और रीढ़ की हड्डी एक ही जानवर से कर रहे हैं) मिलकर में जिगर और रीढ़ की हड्डी माइटोकॉन्ड्रिया अलग करने के लिए इस्तेमाल किया गया।

ईबी oligo सड़ांध KCN ADP एफ / वी
RFU 0 4844 12,507 12,734 9925 10,892 4844
* 3 6517 13,639 12,435 10,235 13,154 6517
गुना अंतर 0 एनए 2.58 2.63 2.05 2.25 2.65
* 3 एनए 2.09 1.91 1.57 2.02 2.18
% कमी 0 बनाम * 3 18.94 27.41 23.35 10.24 17.67
ईबी = प्रयोगात्मक बफर; oligo = oligomycin; = rotenone सड़ने; KCN पोटेशियम साइनाइड, और एफ / वी = FCCP + valinomycin =।

तालिका 3: सेल ग से कच्चे डेटा और गणनाulture माइटोकॉन्ड्रिया प्रयोगों अलग।

चित्र 2
चित्रा 2: Mitochondria साइटोकाइन इलाज कोशिकाओं से अलग झिल्ली क्षमता में कमी आई है। तालिका 2 में गणना के रूप में प्रत्येक उपचार के लिए शून्य बनाम * 3 के लिए ΔΨ का प्रतिशत कमी, नियंत्रण की तुलना में। डाटा या एन = 2 (= 3 (oligomycin, rotenone, और FCCP / Valinomycin) एन के लिए डुप्लिकेट प्रतिक्रियाओं का मूविंग प्रतिनिधित्व KCN और ADP) +/- मानक विचलन। गुना अंतर गणना पर आधारित * = सांख्यिकीय महत्वपूर्ण पी-मूल्यों; पी = 0.03, क्रमशः oligomycin, rotenone और FCCP / Valinomycin, के लिए 0.01, और 0.05।

मेरुदंड जिगर
अंतर मोड़ो नियंत्रण 1.54 ± 0.48 3.20 ± 1.56
SOD1 1.10 ± 0.30 3.12 ± 1.75
% कमी 28.1 2.48
पी मूल्य 0.03 0.41

। टेबल 4: समूह के अनुसार चार जानवरों की औसत प्रतिनिधित्व FCCP + Valinomycin डाटा द्वारा मूल्यांकन के रूप में Mitochondria SOD1 चूहों की रीढ़ की हड्डी डोरियों से अलग झिल्ली क्षमता में कमी आई है।

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Discussion

पुनः संयोजक साइटोकिन्स के साथ HEK-293T कोशिकाओं का उपचार 48 घंटा (चित्रा 1) से अधिक कोशिका मृत्यु के मध्यम मात्रा का कारण बनता है। टीएनएफ-अल्फा उपचार द्वारा प्रेरित कोशिका मृत्यु की राशि पहले की रिपोर्ट के अध्ययन के लिए 30 के समान है और सेल व्यवहार्यता अकेले भी साहित्य 31,32 के साथ संगत है किसी भी साइटोकाइन साथ योगात्मक मात्रा से अधिक कर रहे हैं कि कई साइटोकिन्स के सह-प्रशासन के बाद कम हो जाती है। राशि और साइटोकाइन उपचार के प्रकार के रूप में अच्छी तरह से व्यक्तिगत साइटोकिन्स के लिए कॉकटेल की तुलना समायोजित करने की क्षमता गुर्दे की कोशिकाओं पर साइटोकाइन लोगों तक पहुंचाने के विशिष्ट प्रभाव का अध्ययन करने के लिए इस सेल संस्कृति मॉडल आकर्षक बनाते हैं। इसके अलावा, परिणाम बहुत प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है और आसानी से (चित्रा 2) हासिल कर रहे हैं। ध्यान में रखने की बातें कोशिकाओं के संगम शामिल हैं। 70-80% चुनाव में इलाज करते हैं, उदाहरण के लिए, 100% संगम पर इलाज कोशिकाओं साइटोकिन्स का एक ही सांद्रता के रूप में अच्छी तरह से जवाब नहीं हैप्रभाव। सेल प्रतिक्रिया संभवतः (विगलन के बाद से अधिक 8-12 सप्ताह) भी लंबे समय के लिए संस्कृति में होने प्रभावित किया जा सकता है के रूप में इसके अलावा, कोशिकाओं के माध्यम से चले गए हैं मार्ग की संख्या, पर नज़र रखी जानी चाहिए। साइटोकिन्स के साथ संवर्धित कोशिकाओं का इलाज सेल व्यवहार्यता और बाद में माइटोकॉन्ड्रियल स्वास्थ्य में कमी आई है, यह कोई पूति से प्रति के लिए एक मॉडल के माध्यम से होता है। हालांकि, एक अधिक नैदानिक ​​प्रासंगिक मॉडल का उपयोग करते हैं, इस तरह उत्तेजित THP1 कोशिकाओं 33 से स्वाभाविक रूप से स्रावित साइटोकिन्स के साथ चूहों और / या उपचार से अलग प्राथमिक गुर्दे की कोशिकाओं को रोजगार के रूप में, इस काम का एक स्वाभाविक विस्तार है। तंत्र में प्रारंभिक अंतर्दृष्टि के रूप में अच्छी तरह के रूप में preventative या हस्तक्षेप उपचार के रूप में दवा यौगिकों के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए एक प्रारंभिक मंच प्रदान कर सकता माइटोकॉन्ड्रिया की पूति के दौरान गुर्दे की विफलता की समझ में अंतर है, इस तरह के सेल संस्कृति मॉडल और मूल्यांकन को देखते हुए।

माइटोकॉन्ड्रिया संवर्धित कोशिकाओं या जानवरों के ऊतकों से अलगतेजी से माइटोकॉन्ड्रियल स्वास्थ्य पर सेल उपचार या रोग प्रगति के प्रभाव का मूल्यांकन करने की क्षमता बनती हैं। अलगाव और मूल्यांकन प्रोटोकॉल तकनीकी रूप से प्रदर्शन करने की मांग नहीं कर रहे हैं, और आसानी से अन्य सेल लाइनों या प्राथमिक ऊतकों के साथ उपयोग के लिए संशोधित किया जा सकता है। प्रत्येक नमूना प्रकार के लिए इस्तेमाल एमआईबी और EB एक विशेष सेल या ऊतक प्रकार विभिन्न आवश्यकताओं की है के रूप में यदि आवश्यक समायोजित किया जा सकता है कि अच्छा प्रारंभिक व्यंजनों हैं। रीढ़ की हड्डी प्रोटोकॉल 15,34 के साथ शामिल के रूप में उदाहरण के लिए, फैटी एसिड मुक्त बीएसए के अलावा, न्यूरॉन्स के साथ उपयोग के लिए आम तौर पर आवश्यक है। सेल व्यवधान विधि भी ठीक इसके विपरीत अधिक सिरिंज निष्कासनों का उपयोग कर या हाथ को बदलने homogenization के बजाय एक ड्रिल का उपयोग कर या द्वारा बदला जा सकता है। रीढ़ की हड्डी में माइटोकॉन्ड्रिया प्रक्रिया में किया इसके अलावा, पहले centrifugation के गोली का फिर से homogenization, माइटोकॉन्ड्रिया की एक संतोषजनक राशि प्राप्त करने के लिए आवश्यक हो सकता है। एक अलगाव प्रोटोकॉल व्यवहार्य mitochondri का उत्पादन एक अच्छा संकेतएक एलिसा सी साइटोक्रोम का इस्तेमाल होता है। यह परख साइटोक्रोम रिहाई के पश्चिमी धब्बा विश्लेषण करने के लिए एक त्वरित और आसान विकल्प है और यह भी पेप्टाइड्स या अन्य यौगिकों 19,27 साथ माइटोकॉन्ड्रिया के उपचार के बाद साइटोक्रोम रिलीज के एक उपयोगी आकलन है। वैकल्पिक रूप से, TMRE प्रोटोकॉल के विकास के दौरान इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन यह स्वस्थ होने के लिए जाना जाता है कि एक नमूना से अलग माइटोकॉन्ड्रिया मूल्यांकन करने के लिए महत्वपूर्ण है। नियमित रूप से साहित्य में वर्णित नहीं कर रहे हैं कि माउस ऊतकों से माइटोकॉन्ड्रिया अलग-थलग करने के लिए जब एक आधारभूत सेट करने के लिए प्रयोग किया जाता है के रूप में इसके अलावा, जिगर माइटोकॉन्ड्रिया के रूप में अच्छी तरह से एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में सेवा कर सकते हैं। उदाहरण के लिए, इस प्रोटोकॉल के रूप में, हर जानवर से, दोनों प्रोटोकॉल विकास के साथ ही प्रयोगों के दौरान यकृत भी excised थे और mitochondria अलगाव के लिए इस्तेमाल किया। एक तैयार करने के लिए एक और विचार अलगाव की प्रक्रिया के अंत में प्राप्त माइटोकॉन्ड्रिया की राशि है। माइटोकॉन्ड्रिया की एकाग्रता तो 1 मिलीग्राम / मिलीलीटर या उससे कम है तोपरख परिणाम अविश्वसनीय (अप्रकाशित टिप्पणियों VDGM) साबित हो सकता है। या तो शुरू सामग्री, एमआईबी नुस्खा या विघटन विधि की राशि कार्यात्मक assays के लिए जाने से पहले अनुकूलित किया जाना चाहिए। एक सफल अलगाव प्रोटोकॉल उपलब्ध हो जाता है एक बार, माइटोकॉन्ड्रिया भी इस तरह के कुल एटीपी सामग्री और एटीपी पीढ़ी 13,14 के रूप में अन्य assays में इस्तेमाल किया जा सकता है।

यहाँ वर्णित माइटोकॉन्ड्रिया समारोह प्रोटोकॉल एक मानक फ्लोरोसेंट प्लेट रीडर का उपयोग संभावित संवेदन डाई TMRE के माइटोकॉन्ड्रियल तेज की अप्रत्यक्ष माप के लिए अनुमति देता है। माइटोकॉन्ड्रिया पृथक और उपयुक्त रसायन जोड़ा गया है के बाद, वे TMRE के साथ incubated और फिर pelleted कर रहे हैं। ऐसे बहु दवा प्रतिरोधी परिवहन या एटीपी प्रवाह के रूप में चर confounding, पूरे कोशिकाओं या पशुओं के उपचार और मूल्यांकन ΔΨ करने से पहले माइटोकॉन्ड्रिया अलग से परहेज कर रहे हैं। सतह पर तैरनेवाला में प्रतिदीप्ति की राशि तो माइटोकॉन्ड्रिया स्वस्थ है कि समझ के साथ विश्लेषण किया जाता हैमजबूत उनके ΔΨ और TMRE की इसलिए अधिक तेज। नतीजतन, सतह पर तैरनेवाला में प्रतिदीप्ति की राशि अस्वस्थ माइटोकॉन्ड्रिया में स्वस्थ माइटोकॉन्ड्रिया में कम और अधिक होना चाहिए। एक EB-ही इलाज है, इस पर नियंत्रण और uncoupled माइटोकॉन्ड्रिया के बीच प्रतिदीप्ति के गुना अंतर सहित द्वारा गणना की जा सकती है। चलाने प्रतिक्रियाओं के हर सेट के साथ एक अन्य महत्वपूर्ण नियंत्रण अकेले TMRE है। इस पर नियंत्रण से परिणाम एक अधिकतम संभव फ्लोरोसेंट पढ़ने प्रदान करता है। TMRE हौसले पतला है प्रतिक्रियाओं को जोड़ने के बाद से, निहित परिवर्तनशीलता है। उदाहरण के लिए, ~ 20,000, 25,000 और 30,000 के TMRE-केवल रीडिंग प्रोटोकॉल के विकास के दौरान विभिन्न समय पर प्राप्त किया गया। इलाज किया माइटोकॉन्ड्रिया इलाज से काफी अलग नहीं कर रहे हैं और / या अगर TMRE-केवल संकेत इलाज किया माइटोकॉन्ड्रिया के नमूनों में से किसी की तुलना में बहुत अधिक है, तो फिर युग्मित माइटोकॉन्ड्रिया के अलगाव सफल सबसे अधिक संभावना नहीं थी। ΔΨ में कमी प्राप्त एक अनुपात द्वारा मापाइस प्रोटोकॉल के बाद जब नियंत्रण के लिए पहले की रिपोर्ट मात्रा में है, स्वस्थ कोशिकाओं 2,35 के समान है। नियंत्रण से अलग माइटोकॉन्ड्रिया, इलाज HEK-293T कोशिकाओं और * 3 साइटोकाइन इलाज कोशिकाओं से ΔΨ परिवर्तनों की तुलना MTT assays में मनाया कमी आई सेल व्यवहार्यता माइटोकॉन्ड्रिया समारोह में कमी आई कि अनुवाद के लिए प्रदर्शन किया। यहाँ 13,14 प्रदर्शन के रूप में यह प्लेट पाठक परख आसानी से किसी भी स्रोत से अलग है और इस तरह के ए एल एस के रूप में रोग मॉडल जांच करने के लिए इस्तेमाल किया माइटोकॉन्ड्रिया के साथ प्रयोग किया जा सकता है।

कई अध्ययनों से इस प्लेट रीडर परख की उत्पत्ति में महत्वपूर्ण थे जो MOMP, पता लगाने के लिए माइटोकॉन्ड्रिया-विशिष्ट फ्लोरोसेंट रंगों का उपयोग किया है। हालांकि, उन अध्ययनों कि ब्लॉक यौगिकों स्क्रीन या MOMP 35,36 प्रेरित, का पता लगाने के नए ΔΨ संवेदन रंजक दो या इस तरह के एक माइक्रोचिप 37 पर प्रवाह cytometry के रूप में अन्य स्वरूपों की पहचान करने के लिए पूरे कोशिकाओं का उपयोग या तो। यह विज्ञापन का वर्णन करता है कि में इस प्रोटोकॉल में अद्वितीय हैetailed विधि अलग करने और तेजी से जाना जाता ΔΨ फेरबदल यौगिकों के जवाब के माध्यम से पूरे सेल उपचार के प्रभाव की जांच करने के लिए माइटोकॉन्ड्रिया उपयोग करने के लिए। इस प्रोटोकॉल uncouplers और अवरोधकों की एक किस्म का इस्तेमाल करता है, और उनमें से किसी को माइटोकॉन्ड्रियल स्वास्थ्य का आकलन करने के लिए उपयुक्त होगा कि इंगित करता है। इस प्रकार, कारण सेलुलर तनाव या प्रगतिशील सेलुलर में शिथिलता के लिए माइटोकॉन्ड्रियल परिवर्तन पर इस विशेष जांच केन्द्रों, प्रोटोकॉल भी विशिष्ट यौगिकों और / या ऐसे succinate और एनएडीएच के रूप में इलेक्ट्रॉन स्रोतों के अलावा के उपयोग के माध्यम से माइटोकॉन्ड्रियल चयापचय में परिवर्तन का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जबकि ।

पृथक माइटोकॉन्ड्रिया आकलन जब प्रदर्शन महत्वपूर्ण विचार उपचार खंडों में स्थिरता, एमआईबी में माइटोकॉन्ड्रिया रखने और उपचार के लिए स्थापित होने जा रहे हैं तुरंत पहले ईबी में उन्हें गिराए, और उनके ΔΨ अभी भी है सुनिश्चित करने के लिए अलगाव की तीन घंटा के भीतर माइटोकॉन्ड्रिया का उपयोग शामिल बनाए रखा जा रहा है।ऐसे जे.सी.-1 के रूप में अन्य माइटोकॉन्ड्रिया-विशिष्ट फ्लोरोसेंट रंगों से अधिक TMRE की पसंद छोटे सांद्रता और केवल एक तरंग दैर्ध्य का उपयोग कर प्रतिदीप्ति का विश्लेषण करने की सादगी का उपयोग करने की क्षमता की वजह से था। इस विधि इसी प्रकार हालांकि एक प्लेट रीडर का उपयोग कम समय लगता है और कम अनुकूलन 35 की आवश्यकता है, फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी 2,38 का उपयोग कर या cytometry के 37 प्रवाह का आयोजन किया जा सकता है। एक क्लार्क इलेक्ट्रोड 22 (डेल Gaizo मूर, अप्रकाशित टिप्पणियों) का उपयोग की तुलना में इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल बहुत कम तकनीकी रूप से मांग की है, जल्दी प्रदर्शन करने के लिए, और अधिक आसानी से प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है। प्रत्येक माइटोकॉन्ड्रियल उपचार की मात्रा titrating mitochondrial समारोह और सांद्रता के अनुकूलन में आगे अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है किया जाना चाहिए। माइटोकॉन्ड्रियल प्रतिक्रियाओं की कुल मात्रा अलगाव के रूप में अच्छी तरह के रूप में आवश्यक उपचार प्रतिक्रियाओं की संख्या के दौरान प्राप्त नमूना की राशि सूट करने के लिए समायोजित किया जा सकता है। 50 μ की यदि संभव हो तो, एक मानक राशि; एल प्रयोग किया जाता है; हालांकि, माइटोकॉन्ड्रिया के रूप में छोटा रूप में 20 μl विश्वसनीय परिणाम पैदा करता है।

ΔΨ ऑक्सीजन की खपत को संबद्ध करते हैं, परख सीधे ऑक्सीजन की खपत उपाय नहीं करता प्रस्तुत किया। ऐसे MitoExpress के रूप में फ्लोरोसेंट ऑक्सीजन संवेदन जांच विकसित किया गया है, संभवतः एक क्लार्क इलेक्ट्रोड ऊपर उद्धृत का उपयोग करने के पतन के कुछ से बचने के लिए, प्रतिक्रिया प्रति कीमत और परख प्रति माइटोकॉन्ड्रिया की बड़ी मात्रा की आवश्यकता सीमित रहते हैं। इसलिए, TMRE और शास्त्रीय ΔΨ uncouplers या inhibitors का उपयोग कई फायदे हैं। फिर, कई नमूने या कई उपचार / नमूना, reproducibility के, कम मूल्य उस सामग्री की आवश्यकता है और / या प्रतिक्रिया प्रति अपेक्षित पृथक माइटोकॉन्ड्रिया की कम राशि के बैच विश्लेषण इस प्रोटोकॉल आकर्षक प्रस्तुत करना।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
L-glutamic acid Sigma G1251 Can use the potassium salt instead.
malic acid Sigma M8304 Can use the potassium salt instead.
KH2PO4 Sigma P0662
K2HPO4 Sigma P3786
EGTA Sigma E3889
Trisma base Sigma T6066
MOPS Sigma M3183
CCCP Sigma C2920 Dilute down to 100 μM as a working stock in ethanol and store at -20 °C.
Valinomycin Sigma V0627 Make in DMSO and use as a 5 μM working stock. Store at -20 °C.
sucrose Fisher S5-500
KCN Mallinckrodt 6379 Make a concentrated stock in ethanol and then dilute with water 
rotenone Sigma R8875 Highly toxic. Made in ethanol.
oligomycin Sigma O4876 Highly toxic. Made in ethanol.
ADP Sigma A2754
TMRE Sigma 8717-25mg Dilute 100 μM stock with EB immediatley before use.
DMEM Gibco 11965-084 1x regular (high glucose).
Pen/Strep Invitrogen 15140-155
L-glutamine Fisher SH3002101 Store aliquots at -20 °C
FBS Lonza 14-501F US origin, premium quality. Heat inactivate and store aliquots at -20 °C.
Trypsin-EDTA Sigma T4049
DMSO SIgma D2650
Protien Assay Dye (5x) Bio-Rad 500-0006 Any protein assay can substitute.
BSA Fisher BP1600-100 Make 2 mg/ml stock in water for protein assay.
MTT powder Sigma M2128 Filter sterlize 5 mg/ml stock made in PBS. Store aliquots at -20 °C; store at 4 °C for up to 1 week.
Tergitol solution (NP-40) Sigma NP40S
Recombinant Human IL-1B Gibco PCH08014 Once opened store aliquots at -20 °C
Recombinant Human TNF-alpha Gibco PHC3015L
Recombinant Human IFN-gamma Gibco PHC4031
Dulbeccos PBS (-/-) Sigma D8537 Make sure it is without Mg2+ and Ca2+ ions.
Cytochrom c ELISA kit R&D systems DTC0 Human for HEK-293T cells. 

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