Isolierung und funktionale Analyse von Mitochondrien aus kultivierten Zellen und Maus-Gewebe

Biology

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Lampl, T., Crum, J. A., Davis, T. A., Milligan, C., Del Gaizo Moore, V. Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue. J. Vis. Exp. (97), e52076, doi:10.3791/52076 (2015).

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Abstract

Introduction

Lebende Zellen Bank Stoffwechselenergie in Form von Fetten und Kohlenhydraten und die Nutzung dieser Energie für Biosynthese, Membrantransport und Bewegung. Etwas Energie wird in das Cytosol durch die Umwandlung von diätetischen Zuckern direkt in ATP während Glykolyse erhalten. Jedoch ist die Hauptquelle für die ATP-Produktion in einer Zelle, in die Mitochondrien über das mitochondriale Atmungskette 1 genutzt. Die Architektur der Mitochondrien liefert die notwendige räumliche Orientierung für die effektive und effiziente Produktion von ATP. Mitochondrien besitzen ein Doppelmembran von einem Intermembranraum und zusammen mit der Matrix, dem innersten mitochondrialen Raum, Haus der Komponenten getrennt und zu koordinieren, die chemischen Reaktionen in ATP-Generation beteiligt. Die innere Membran enthält eine Reihe von membrangebundenen Proteinkomplexe der Atmungskette als auch die ATP-Synthase, den Proteinkomplex, ADP und Pi für die Bildung von ATP vereint umfassen. Das Gasthauser Membran in Cristae gefaltet und Elektronen entlang der Atmungskette Komplexe durch das Cytochrom c, einem löslichen Elektronenüberträger, die zwischen Komplexen im Intermembranraum bewegt sich übergeben. Elektronen bewegen, Oxidation von Reduktionsäquivalenten eintritt und Wasserstoffionen werden aus der Matrix in den Intermembranraum gepumpt. Als Folge der hohen Ionenkonzentration innerhalb des Intermembranraum, baut sich ein elektrochemischer Gradient was zu einem Membranpotential über die innere Mitochondrienmembran (Δψ) 2. Sauerstoff ist das endgültige Elektronenakzeptor der Elektronentransportkette, und Wasserstoffionen strömen durch die ATP-Synthase aus dem Intermembranraum zurück in die Matrix und in so direkt tun ATP-Bildung führen. Das Verfahren in seiner Gesamtheit beschrieben wird als oxidative Phosphorylierung bekannt. Die Falten der Cristae vergrößern die Oberfläche der inneren Membran, so dass für maximale Elektronentransport und die ATP-Produktion imjedes Mitochondrium. Die Proteine, Enzyme und andere Moleküle in der oxidativen Phosphorylierung beteiligt sind sowohl aus Kern- und mitochondrialen Genen abgeleitet. Mitochondrien ihre eigene kreisförmige DNA, kodierend für 13 Proteine ​​sowie tRNAs und mRNAs für die ATP-Produktion 3 notwendig. Jedoch sind viele andere Proteine ​​erforderlich ist, und somit sind nukleär kodierten. Die meisten dieser kerncodierte Proteine ​​an der mitochondrialen Matrix durch Verwendung Präsequenzen am N-Terminus des Vorläuferproteins gezielt und deren Import wird teilweise durch Δψ 4,5 angetrieben.

Über die zur Erreichung der bioenergetischen einer Zelle, Mitochondrien beeinflussen ebenfalls wichtige Wechselprozessen wie TCA und beta-Oxidation, zelluläre Signalwege, durch Regulieren Calcium, sowie eine zentrale Rolle bei der Apoptose. 6 Insbesondere in Zeiten der zellulären Stress, BCL-2-Familie Proteine, die am Wohnsitz oder die Interaktion an der mitochondrialen Außenmembran der Mitochondrien verursachenPermeabilität der äußeren Membran (MOMP) 7,8. Während MOMP sind Cytochrom c und anderen Proteinen in das Cytosol mit mehreren cytosolischen Proteine ​​freigesetzt, und bilden zusammen einen Komplex genannt apoptosome 9,10. Die Apoptosom aktiviert Caspasen, die gehen an zelluläre Proteine ​​und DNA während der Ausführungsphase der Apoptose zu spalten. Sobald MOMP auftritt, ΔΨ ist zusammengebrochen und die ATP-Produktion gestoppt. Somit ist, wie die Apoptose ausgelöst wird die Funktion der Mitochondrien beeinträchtigt und Veränderungen in ΔΨ können mitochondriale und Zellgesundheit 12 korreliert werden. Während die Apoptose ist ein Endpunkt in vielen Krankheitsmodelle, die Funktion der Mitochondrien und Änderungen ΔΨ können auch wertvolle Informationen über die Krankheit Entstehung und / oder Progression ergeben. Zum Beispiel haben die mitochondriale strukturelle und funktionelle Veränderungen im Verlauf von neurodegenerativen Erkrankungen 13,14 dokumentiert.

Im ersten Teil des Protokolls, isonung intakter Mitochondrien, die ihre ΔΨ behalten beschrieben. HEK-293T-Zellen wurden verschiedenen Konzentrationen und Kombinationen von rekombinanten TNF-α, IL1-β und IFN-γ ausgesetzt, um die Apoptose zu induzieren. Diese Zytokine wurden ausgewählt, weil sie häufig berichteten hohen in primären humanen septischen Proben 15 und dem extrinsischen Weg der Apoptose kann durch die Wechselwirkung von TNF-α-Bindung an seinen Rezeptor 6 ausgelöst werden. Da es subtile Variationen notwendig funktionelle Mitochondrien aus primären Geweben zu isolieren, verglichen mit kultivierten Zellen und weil viel Forschung verwendet Tieren, beschreibt das Protokoll auch, wie Mitochondrien aus Leber und Rückenmark von anteriore laterale Sklerose (ALS) Mausmodell zu isolieren.

Der zweite Teil des Protokolls wurde entwickelt, um Störungen des mitochondrialen Membranpotenzials überwacht unter Verwendung eines potentialsensitiven Fluoreszenzfarbstoffes mit einem Fluoreszenzplattenlesegerät. Unterschieds zwischen zellulären Status (dh gesunden vs. ungesunden) durch Quantifizieren der Stärke der ΔΨ von isolierten Mitochondrien in Verbindung mit Trennmitteln, die Atmungsketteninhibitoren, Komplex Inhibitoren und Ionophore, die alle Abfuhr des mitochondrialen Membranpotentials verursachen differenziert. Desto gesünder die Mitochondrien, je größer die Änderung ΔΨ bei Behandlung mit mitochondrialen Inhibitoren, damit die Reaktion von Mitochondrien kann als Indikator für die mitochondriale (Dysfunktionen) Funktion verwendet werden.

Die Verwendung von isolierten Mitochondrien statt in situ Einschätzung Funktion bietet endgültigen Beweise dafür, dass eine Pathologie oder Behandlung Änderungen an der Organelle 16-18 direkt moduliert. Es gibt zwar Methoden, die in der Literatur zu den Mitochondrien aus kultivierten Zellen zu isolieren, vage sind sie 17 ab und / oder Spezialausrüstung 16. Dieses Protokoll beschreibt im Detail die Isolierungsmethode undleicht an andere Zelllinien, einschließlich der Primärgewebe und Kulturen 13,14,19,20. Viele isolierte Mitochondrien Untersuchungen verwenden die gleichen mitochondrialen Entkuppler und Inhibitoren in diesem Protokoll, jedoch mit einer Clark-Elektrode verwendet wird (21 ist ein repräsentatives Beispiel für viele Arbeiten in der Literatur), die wiederum eine sehr spezifische und Spezialmaschine. Darüber hinaus hat diese traditionelle Methode Einschränkungen wie geringe Durchsatz und hohe Komplexität 22,23 und erfordert eine erhebliche Menge an Mitochondrien (~ 500 ug / Reaktion). In diesem Protokoll wird die Leuchtstoffmembran-Sensing-Potentialsonde TMRE in Verbindung mit einem Fluoreszenz-Plattenlesegerät, das eine Standardmaschine in vielen Labors ist eingesetzt. TMRE ist weithin angesehen, da es schnell geht Zellen und Mitochondrien isoliert und kann bei niedrigen Konzentrationen 24 verwendet werden. Mehrere Umsetzungen können schnell hintereinander gesetzt werden und Batch analysiert mit diesem Protokoll. Weiterhin wird die Reaktions erfordern eine wesentlich geringe Menge an isolierten Mitochondrien (~ 10 & mgr; g / Reaktion). Um weniger Material erfordern können kleinere Gewebe- oder Zellkulturproben als Ausgangspunkt für Mitochondrien Isolierung verwendet werden, mehrere Wiederholungen oder Reaktionen können möglicherweise genügend Material für die anderen isolierten Mitochondrien Experimente wie die ATP-Produktion, der Sauerstoffverbrauch oder Importieren eingestellt werden, und Assays sind möglich.

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Protocol

Alle Tierversuchen entsprach National Institutes of Health Leitlinien und wurden von der Wake Forest University Animal Care und Verwenden Committee genehmigt. Brutpaare für SOD1G93A [B6SJL-TgN (SOD1-G93A) 1Gur] Maus-Modell wurden von The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) erhalten. Nicht-transgenen Wildtyp (WT) Frauen und Männer SOD1G93A [B6SJL-TgN (SOD1-G93A) 1Gur] wurden gezüchtet, um SOD1G93A Mäusen und nicht transgenen WT Geschwistern, die in den Experimenten verwendet wurden zu generieren.

1. Modelle zur Untersuchung

  1. Zellkultur
    1. Pflege der menschlichen embryonalen Nierenzellen (HEK-T293) Zellen in DMEM mit 10% hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum, 1% Penicillin-Streptomycin und 1% L-Glutamin ergänzt, bei 37 ° C in 5% CO 2.
    2. Wachsen Zellen in T75-Flaschen und lassen Sie sie 90% Konfluenz erreichen.
    3. Durchführung Zellteilung über Trypsinisierung (0,25% Trypsin-EDTA) für 3-5 Minuten bei 37 ° C in 5% CO 2
    4. Saugen Sie die Medien und Zellpellet in Kulturmedien.
    5. Samenzellen in der entsprechenden Kolben oder der Platte 7 × 10 4 Zellen in einer T75-Flasche 48 Stunden vor der Behandlung Zytokin. Dies sollte bei der Behandlung zu geben ~ 70% Dichte.
    6. Serum verhungern Zellen 24 h später durch Ansaugen der Medien und mit dem gleichen Volumen von Serum-freien Medien (DMEM, steril) ersetzen.
    7. Bereiten TNF-α, IL1-β und IFN-γ aus lyophilisierten Pulvers mit ultrareinem Wasser bei Arbeitskonzentrationen von 5 pg / ul, 10 ng / & mgr; l, und 10 ng / ul, jeweils und sie in die Vertiefungen / Kolben.
    8. Treat Serum ausgehungert Zellen durch die Zugabe von solubilisiertem Cytokine direkt an den Zellkulturmedien der entsprechenden Kolben. Die Behandlungen bestanden aus einzelnen Cytokine, einen Cocktail aus allen 3 (bezeichnet als "* 3") oder sterile Wasser als Kontrolle (als "0" bezeichnet).
    9. Vor Beurteilung und Ernte inkubieren behandelten Zellen für 24, 48 oder 72 Std.
  2. Die Lebensfähigkeit der Zellen Bewertung
    1. Eine 5 mg / ml Lösung von 3- (4,5-Dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) in 1x PBS.
    2. Für 12-Well-Platten, fügen Sie 100 ul der MTT-Lösung in jede Vertiefung und leicht schwenken, um eine gleichmäßige Verteilung zu gewährleisten.
    3. Platten für 15 min-1 h bei 37 ° C in 5% CO 2, und prüfen unter einem Mikroskop auf die Anwesenheit von Purpurfärbung. Wenn keine vorhanden ist lila, wirbeln wieder und erlauben Zellen in 5-Minuten-Intervallen inkubieren, bis lila beobachtet. Die Menge an Zeit, die notwendig ist, indem jeder Untersuchenden bestimmt werden.
    4. Mit einem Wiederholungspipette 700 ul der MTT Lösungsmittel (4 mM HCl und 0,1% NP40 in Isopropanol) in jede Vertiefung und Rock die Platte (n) bei Raumtemperatur für 5-10 Minuten, oder bis alle lila Farbe hatten die Zellen links . Wenn lilaFarbe nicht aus den Zellen kommen, fügen Sie zusätzliche 200 ul des Lösungsmittels und weiter zu wirbeln.
    5. Für die Analyse nehmen 100 ul aus jeder Vertiefung und in einen 96-Lochplatte und auf einem Plattenlesegerät mit 570 nm und einer Referenzwellenlänge von 630 nm, 595 nm jedoch auch so lange akzeptabel, da Messwerte werden auf konsistente Einstellungen übernommen.
  3. Tiermodell der ALS
    1. Alle Tierversuchen entsprach National Institutes of Health Leitlinien und wurden von der Wake Forest University Animal Care und Verwenden Committee genehmigt. Brutpaare für SOD1G93A [B6SJL-TgN (SOD1-G93A) 1Gur] Maus-Modell wurden von The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) erhalten. Nicht-transgenen Wildtyp (WT) Frauen und Männer SOD1G93A [B6SJL-TgN (SOD1-G93A) 1Gur] wurden gezüchtet, um SOD1G93A Mäusen und nicht transgenen WT Geschwistern, die in den Experimenten verwendet wurden zu generieren.
    2. Führen Sie die Genotypisierung mit Standard Primer gegen mutierte SOD1 25.

2. Isolierung von Mitochondrien

HINWEIS: Es ist wichtig, schnell zu arbeiten und alles auf Eis zu halten während des gesamten Verfahrens.

  1. Vorbereitung der mitochondrialen Isolierungspuffer (MIB), Rückenmark Isolierungspuffer (SC MIB) und experimentellen Puffer (EB)
    1. Die folgenden Stammlösungen vorbereitet vor der Zeit für MIB und EB.
    2. Auffüllen auf 1 M Tris / MOPS durch Lösen 12,1 g Tris-Base in 70 ml H 2 O. In trockenen MOPS pH 7,4 erhalten. Stellen Sie die Lautstärke auf 100 ml endgültig. Filter zu sterilisieren und bei 4 ° C.
    3. Auffüllen auf 1 M Kphos durch Mischen von 80,2 ml der K 2 HPO 4 und 19,8 ml KH 2 PO 4. Lagerung bei Raumtemperatur.
    4. Make 0,2 M EGTA / Tris durch Zugabe von 3,8 g von EGTA zu 10 ml H 2 O. 1 M Tris / MOPS bis gelöst, ~ 30-40 ml. Passen Sie bis 50 ml, Sterilfilter und bei Raumtemperatur lagern. Man beachte, dass der pH-Wert wird ~ 6,7.
    5. Stellen Sie 1 M Glutamat, indem 10 ml1 M Lösung von Glutaminsäure. Filter zu sterilisieren und zu speichern 4 ° C.
    6. Auffüllen auf 1 M Malate, indem 10 ml einer 1 M Lösung von Äpfelsäure. Hinzufügen Tris / MOPS 50 mM. Filter zu sterilisieren und bei 4 ° C.
    7. Make MIB in einer Konzentration von 200 mM Saccharose, 10 mM Tris / MOPS, pH 7,4, und 1 mM EGTA / Tris. Filter zu sterilisieren und bei 4 ° C.
    8. Make SC MIB in einer Konzentration von 250 mM Saccharose, 20 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 10 mM KCl, 1,5 mM MgCl 2, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM DTT und Proteaseinhibitor-Cocktail.
    9. Make EB in einer Konzentration von 125 mM KCl, 10 mM Tris / MOPS, pH 7,4, 5 mM Glutamat, 2,5 mM Malat, 1 mM K-Phosphat, pH 7,4, und 10 mM EGTA / Tris. Filter zu sterilisieren und bei 4 ° C.
  2. Ausrüstung Vorbereitung vor der Ernten der Zellen.
    1. Spülen Sie ein kleines Glasgefäß und Homogenisierung Stößel dreimal mit sterilem Wasser und setzen auf Eis.
    2. Gather notwendigen Gegenstände wie ein Standard-Bohrmaschine, Zell scraPersonen, 1,5 ml, 15 ml und 50 ml-Röhrchen und Lösungen.
  3. Mitochondrien Isolation
    1. Kultivierten Zellen
      1. Für jeden Probentyp, verwenden Sie zwei T175-Flaschen von Zellen.
      2. Sicherzustellen, dass die Zelle in ~ 90% konfluent und Verwendung in Kontrollversuchen oder Platte und zu behandeln, wie oben in Schritt 1.2 beschrieben.
      3. Auf der Tischplatte, absaugen Medien und waschen Sie die anhaftenden Zellen zweimal mit 15 ml 1x PBS jeder Zeit.
      4. Saugt den Puffer und schaben Kolben die anhaftenden Zellen vom Boden des Kolbens zu entfernen.
      5. 15 ml 1x PBS in jeden Kolben, Wirbel, und übertragen auf einzelne 15 ml konische Röhrchen und auf Eis.
      6. Sobald Kratzen wird, Zentrifuge die Röhrchen für 5 Minuten bei 700 × g, 4 ° C durchgeführt unter Verwendung einer Tischzentrifuge mit einem Schwingbecher-Rotor.
      7. Aspirat Ständen und Resuspendieren jedes Pellet in 1 ml MIB.
      8. Kombinieren Sie beide Suspensionen und Transfer zu einem kleinen Glasgefäß zur Homogenisierung.
      9. Fügen MIBzu dem Behälter, bis Puffer erreicht die erste Zeile. Homogenisieren Zellen mit den Stößel auf einen Bohrer bei mittlerer Geschwindigkeit für drei Durchgänge verbunden ist. Sicherzustellen, dass der Behälter auf Eis während diesem Schritt nicht die Stößel über der Flüssigkeit zu entfernen und um eine konstante Geschwindigkeit mit kontinuierlichen Durchläufen zu verwenden.
      10. Übertragen der homogenisierten Lösung zu einem 50 ml konischen Röhrchen.
      11. Zeichnen Sie die Lösung in eine 3-ml-Spritze mit einer 18-Gauge-1 ½-Zoll-Nadel und vertreiben sie zurück in die konische Röhrchen auf Eis mit einer 27 G ½-Zoll-Nadel. Kümmern, um die Lösung an der Innenwand des Rohrs auszustoßen, um diese Kraft für Zellmembran Unterbrechungen zu nutzen.
      12. Wiederholen der Spritzenschritte für insgesamt fünfmal.
      13. Wird die Lösung in einem 15 ml konischen Röhrchen und zentrifugiere für 5 Minuten bei 600 × g, 4 ° C in einer Tischzentrifuge mit einem Schwingbecher-Rotor.
      14. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und verteilt auf drei 1,5-ml-Röhrchen.
        HINWEIS: Mitochondria sind in dem Überstand nach dieser ersten Niedergeschwindigkeits Spin, während Zellmembranen und aufgebrochene Zellen pelletiert werden.
      15. Zentrifugenröhrchen in einem Festwinkelrotor bei 10.000 × g, 4 ° C für 5 min.
      16. Saugen Sie die Überstände und kombinieren Sie die Pellets in 100 ul MIB und sofort auf Eis legen.
        HINWEIS: Mitochondrien sind im Pellet nach dieser Hochgeschwindigkeits-Spin. Mitochondrien werden in der Regel behalten ihre Membranpotential für ~ 2-3 Ionen Eis nach der Isolierung und stabilsten als konzentrierte Stammlösung in MIB.
    2. Mitochondrien isoliert von Mausgewebe
      1. Betäuben die Maus nach IACUC Protokoll. Legen Sie einen Verdampfer bei 5,0% auf die Anästhesie zu induzieren. Bestätigt, dass das Tier durch einen Mangel an Reflex Fuß Prise oder Blinkreflex betäubt, wenn das Auge nähert oder mit einem Wattestäbchen erschlossen. Halten Sie die Maus unter Narkose für den gesamten chirurgischen Eingriff, indem der Verdampfer zwischen 1,5% und 2,0%.
      2. Excise die Leber und des Rückenmarks von jedem Tier und Ort separat in eiskaltem 1x PBS - / -, um wegspülen kein Blut.
      3. Für die Leber, übertragen das Gewebe zu einer Wiegeschale auf Eis und hacken in feine Stücke mit einer frischen Rasierklinge für 1 min.
      4. Fügen Sie Gewebe und geeigneten Puffer (MIB für Leber oder SC MIB für das Rückenmark) von der Behälterpuffer bis die erste Zeile erreicht. Homogenisieren Gewebe mit dem Stößel mit der Hand für fünf Durchgängen. Sicherzustellen, dass der Behälter auf Eis während diesem Schritt nicht die Stößel über der Flüssigkeit zu entfernen und um eine konstante Geschwindigkeit mit kontinuierlichen Durchläufen zu verwenden.
      5. Übertragen Sie die Homogenate zu reinigen 15 ml Tuben.
      6. Zentrifugenröhrchen in einem Festwinkelrotor bei 750 × g, 4 ° C für 10 min.
      7. Speichern Sie die Überstände in saubere Rohre und legen Sie sie auf Eis.
        HINWEIS: Die Mitochondrien befinden sich im Überstand nach dieser ersten Niedergeschwindigkeits Spin, während Zellmembranen und aufgebrochene Zellen pelletiert werden.
      8. Re-suspendieren die Rückenmarks Pellets in 500 ul SC MIB.
      9. Re-homogenisieren je dreimal, nur Befüllen des Behälters zur Hälfte mit SC MIB diesmal.
      10. Übertragen Sie die neue Homogenat in ein frisches Röhrchen.
      11. Zentrifuge die in einem Festwinkelrotor bei 750 × g, 4 ° C für 10 min.
      12. Kombinieren dieser neuen Überstände, die mehr Mitochondrien enthalten, wobei der erste Überstand von jeder Probe.
      13. Zentrifugenröhrchen in einem Festwinkelrotor bei 10.000 × g, 4 ° C für 5 min.
      14. Saugen Sie die Überstände und Resuspendieren der Leber Pellets in 500 ul MIB und der Rückenmarks Pellets in 50 ul SC MIB und sofort auf Eis legen.
        HINWEIS: Mitochondrien sind im Pellet nach dieser Hochgeschwindigkeits-Spin. Mitochondrien werden in der Regel behalten ihre Membranpotential für ~ 2-3 Ionen Eis nach der Isolierung und stabilsten als konzentrierte Stammlösung in MIB.
      15. Durchführen einer Proteinkonzentration Assay, um die Konzentration von Mitochondrien in Lösung zu schätzen. Befolgen Sie die Anweisungens für die Verwendung eines kommerziellen Protein Assay Kit oder ähnliche Verfahren 26. Typische Konzentrationen von Mitochondrien sind: 2 T175-Flaschen Ausbeuten ~ 2 mg / ml, 1 Mausleber ~ 3-5 mg / ml und 1 Rückenmark der Maus ~ 1-3 mg / ml.
  4. Cytochrom-c-Assay mit einem F & E-Ratte / Maus Cytochrom c Quantikine ELISA Kit (aus dem Protokoll des Herstellers angepasst).
    1. Unmittelbar vor der Einrichtung der Reaktionen, verdünnte Mitochondrien zu 0,5 mg / ml Arbeitskonzentration mit EB und zu verteilen verdünnt Mitochondrien in 1,5-ml-Röhrchen für die Reaktionen (in der Regel 30 bis 50 & mgr; l der Mitochondrien pro Röhrchen).
    2. Fügen Sie entweder EB oder DMSO, bei 1% des Gesamtvolumens, dem verwässerten Mitochondrien und bebrüten die Reaktionen auf der Tischplatte für 7-10 min. Diese Reaktionen sind bei Raumtemperatur für bis zu 30 Minuten stabil ist, wenn ein längerer Zeitraum erforderlich ist.
    3. Pellet Mitochondrien durch Zentrifugation in einem Festwinkelrotor bei 10.000 × g, 4 ° C für 5 min und sorgfältigely trennen Sie den Überstand und legen Sie jeweils in einem separaten 1,5 ml-Röhrchen.
      HINWEIS: Die Schläuche können entweder bei -20 ° C für die spätere Analyse eingefroren oder sofort verwendet werden.
    4. Bestimmen Freisetzung von Cytochrom c durch ein Vergleichen der Konzentration an Cytochrom c im Pellet und der Überstand 27.
      1. Vorbereitung der Proben, die durch Solubilisierung der Pellets in dem ursprünglichen Volumen der Reaktion mit 0,5% TX-100 in 1 × PBS.
      2. Für jede Probe wurden 2 Vertiefungen Vorbereitung auf die ELISA-Platte, eines für die jetzt solubilisierten Pellets und einer für den Überstand aus der Reaktion durch Zugabe von 100 ul von Cytochrom c-Konjugat (verwenden gerade aus Flasche) plus 100 ul 0,5% Tx- 100 in 1x PBS, und dann alle der Pellets oder Überstandsprobe.
      3. Vortexen Sie vorsichtig die Platte eine niedrige Einstellung (Stufe 2-4) für 20 Sekunden zu mischen, abdecken und inkubieren für 1 h, 37 ° C.
      4. Anschließend waschen Sie die Platte viermal mit Waschpuffer nach dem HerAnweisungen Witwer. Entfernen Sie das überschüssige Lösung durch Antippen der Brunnen auf Papiertuch.
      5. Als Nächstes fügen Sie 150 ul von 1: 1 A + B Entwicklerlösung in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Platte für 20 bis 30 min im Dunkeln bei Raumtemperatur.
      6. Schließlich, fügen Sie 50 ul Stopplösung in jede Vertiefung geben und nehmen Absorptionswerte bei 540 nm mit einem Mikroplatten-Reader. Berechnen der Menge an Cytochrom c-Freisetzung durch den Vergleich der Menge an Cytochrom c in der Pellet vs. Stand für jede Reaktion.

3. Bewertung der Mitochondrien (Dys) Funktion

  1. Unmittelbar vor Reaktionen eingerichtet sind, zu verdünnen Mitochondrien zu 0,5 mg / ml Arbeitskonzentration mit EB und in 1,5 ml Röhrchen für Reaktionen gelegt (in der Regel 30 bis 50 & mgr; l der Mitochondrien pro Röhrchen verwendet wird).
  2. Mitochondriale Behandlungen
    1. In geeigneten Behandlungen (EB Kontrolle, 1 uM FCCP mit 50 nM Valinomycin gemischt, 10 uM Rotenon, 5 & mgr; M Oligomycin, 2 mM KCN oder 200 uM ADP, Endkonzentrationen) Reaktionen bei 1/10 trennen th des Gesamtvolumens des verdünnten Mitochondrien. Die Reaktionen auf der Bank oben inkubieren 7 min.
      HINWEIS: Vorsicht beim Umgang mit diesen Stoffen als versehentlicher Einnahme oder Absorption durch die Haut schädlich sein könnte entnommen werden.
    2. Verdünne TMRE, in sterilem Wasser in einer Arbeitskonzentration von 100 & mgr; M und bei -20 ° C gelagert, bis 2 & mgr; M und fügen ein Volumen gleich der mitochondrialen Reaktionsvolumen.
    3. Die Reaktionen auf der Bank oben inkubieren 7 min.
    4. Pellet Mitochondrien durch Zentrifugation in einem Festwinkelrotor bei 10.000 × g, 4 ° C für 5 min.
    5. Laden Sie die Hälfte der überstehenden Volumen jeder Probe auf eine 396-Well-Platte und lesen Fluoreszenz.
      HINWEIS: Anregungs- und Emissionswellenlängen des TMRE sollte nach den Anweisungen des Herstellers mit dem Volumen und Platte, die verwendet werden soll optimiert werdenAssays. Mit einem Standard-384-Well-schwarze Platte mit 25 ul von 1 uM TMRE (endgültige Reaktionskonzentration) das stärkste Signal erhalten wurde unter Verwendung von Anregungs- / Emissionswellenlängen   485 nm / 535 nm.
    6. Berechnen der Wand Differenz in der Fluoreszenz zwischen Kontrolle (EB) und jede Behandlung durch Dividieren der relativen Fluoreszenzwert (RFU) aus dem Plattenleser für die Versuchsprobe von der RFU von der Kontrollprobe erhalten.

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Representative Results

Behandlung von HEK-293T-Zellen, die mit 200 pg / ml TNF-α, 40 ng / ml IL1-β, und 75 ng / ml IFN-γ (* 3) für 24-48 h führt zu einer fort Mengen von Zelltod (1A ). Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde mit MTT-Assays untersucht und durchgängig zeigt, daß es ~ 10% ige Abnahme in der Lebensfähigkeit der Zellen bei 24 Stunden Behandlung und ~ 20% ige Abnahme bei 48 Stunden Behandlung. Zellen, die mit ähnlichen Konzentrationen (100 pg / ml TNF-α, 40 ng / ml IL1-β, und 75 ng / ml IFN-γ) zu ergeben ähnliche Zelltod Ergebnisse bei 48 Stunden, und die Behandlung mit einzelnen Cytokine behandelt zeigt, dass die Abnahme der Rentabilität ist auf kombi wirkt (Abbildung 1B). Die Lebensfähigkeit der Daten in 1B stellen den Mittelwert +/- Standardabweichung von 3 getrennten Versuchen laufen jeweils in dreifacher Ausfertigung und die Dichtheit der Fehlerbalken zeigen die Reproduzierbarkeit der Daten. Die Höhe der Zytokine in diesem Behandlungsprotokoll auf weitere elucidat eingestellt werdenE den Beitrag jedes Zytokin auf Zelltod und zusätzliche Cytokine oder andere Faktoren können ebenfalls enthalten sein, solange geeignete Kontrollen durchgeführt werden.

Isolierung von Mitochondrien aus Zellen und Gewebe wurde in der Literatur seit den 1940er 28,29 beschrieben. Die Voraussetzung für das Verfahren ist, Zellaufschluß, gefolgt von Differentialzentrifugation, wo rohe Mitochondrien sind dafür bekannt, bei ~ 10.000 x g pelletieren. Viele Protokolle, die isolierten Mitochondrien nutzen erfordern intakten Doppelmembranen, die ihre Membranpotential aufrecht erhalten kann, und daher ist es notwendig, die Integrität zu bewerten, wenn Trennung abgeschlossen ist. Während der Entwicklung der Mitochondrien Isolierungsprotokolls aus kultivierten HEK-Zellen wurde ein Cytochrom-c-Assay verwendet, um anzuzeigen, wenn intakte Mitochondrien wurden erhalten. Mit handelsüblichen Cytochrom-c-ELISA-Kits wurden Mitochondrien nach der Isolierung quantifiziert und in EB verdünnt und dann entweder EB oder DMSOhinzugefügt und die Reaktionen auf der Bank oben inkubiert. Dann wird durch Trennen von Mitochondrien aus umgebenden Überstand, der Analyse der Cytochrom-C-Gehalt der beiden Fraktionen wurde als Maß für das mitochondriale Membran Unversehrtheit verwendet; wenn die Mehrzahl von Cytochrom c in der Mitochondrien-Pellet zurückgehalten werden die Mitochondrien als intakt, während bei mehr als 15% des Cytochrom c wird in dem Überstand gefunden werden, dann Mitochondrien wurden als für funktionelle Untersuchungen ungeeignet. Wie in Tabelle 1 zu sehen ist, beschriebene Protokoll Ausbeute ~ 12% Freisetzung von Cytochrom C und ~ 15% bei isolierten Mitochondrien werden vorbehandelt mit DMSO. Ähnliche Ergebnisse wurden bisher für Mitochondrien aus anderen Zelllinien oder Tiergeweben 19,20,27 getrennt berichtet. Alternativ können Mitochondrien Integrität auch TMRE, die bei der Isolierung von Maus-Leber und Rückenmark Mitochondrien verwendet wurde beurteilt. Bei der ersten Isolierungsprotokoll entwickelndennt, Studien untersucht Mitochondrien aus Leber und Rückenmark von gesunden, normalen Mäusen Mitochondrien isoliert. Für jede Probe wurde ΔΨ durch Vergleich des Fluoreszenzsignals von EB zu denen mit FCCP + Valinomycin (Tabelle 2) inkubiert behandelten isolierten Mitochondrien ausgewertet. Ein Verhältnis der Fluoreszenz zwischen behandelten und unbehandelten Mitochondrien von> 1 wurde als Hinweis auf gesunder, intakter Mitochondrien verwendet.

Nach erfolgreicher Mitochondrien Isolierung Protokolle wurden entwickelt, Mitochondrien aus unbehandelten Kontrollzellen isoliert und * 3 Zytokin behandelten Zellen oder normale und SOD1 Mäusen untersucht. HEK Mitochondrien aus beiden Gruppen wurden mit verschiedenen Entkuppler und Inhibitoren und ΔΨ durch Änderungen TMRE Aufnahme gemessen behandelt. Die Falte Schied Steuer EB behandelten Mitochondrien Entkoppler / Inhibitor behandelten Mitochondrien zeigt einen Unterschied in der Stärke des ΔΨ zwischen den beiden Gruppen (repräsentative Daten und calnungen in Tabelle 3). Darüber hinaus wird die prozentuale Abnahme von unbehandelten Zellen zu * 3 behandelten Zellen bedeuten, dass die mitochondriale Gesundheit wurde von Zytokin-Therapien beeinflusst, übereinstimmende Zellviabilität (Abbildung 2). Bewertung der ΔΨ Stärke über TMRE Aufnahme mit Mitochondrien aus Leber und Rückenmark von vier Einzel normal, Kontroll-Mäusen isoliert im Vergleich zu vier ALS-Mäusen zeigen, dass Gewebe Gesundheit kann auch mit diesem Protokoll zu bewerten. Wie von fachen Unterschiede und prozentuale Abnahme der ΔΨ dargestellten Vergleich der EB-Behandlung und FCCP + Valinomycin-Behandlung von Mitochondrien aus Kontrolle und krankheits fortgeschritten Tiere unterscheiden sich signifikant (Tabelle 4, siehe auch Referenzen 13 und 14).

Figur 1
Abbildung 1: Der Zelltod induzierend durch * 3 Behandlung progressiv über die Zeit, und größer als bei einzelnen Cytokinbehandlungen. (A) HEK-293T-Zellen wurden für 24 oder 48 Stunden und Zelltod behandelt wurde unter Verwendung eines MTT-Assay gemessen. Werte wurden normalisiert, um die Kontrolle, unbehandelten Proben und Daten repräsentieren drei Messungen für n = 3, +/- Standardabweichung. (B) HEK-293T-Zellen wurden mit einzelnen Cytokine oder einem Cocktail (* 3) 48 h und Zelltod beurteilt behandelten über MTT-Test. Daten für n = 5 für jeden einzelnen Zytokins und n = 6 für * 3, +/- Standardabweichung.

Pellet (AU) Der Überstand (AU) % Freisetzung von Cytochrom c
0 0,818 0,115 12,6 ± 2,27
DMSO 0,793 0,142 15,3 ±; 2.23

Tabelle 1:. Retention von Cytochrom c in isolierten Mitochondrien aus gezüchteten Zellen Die Daten stellen den Mittelwert von n = 4, +/- Standardabweichung.

Leber 1 Leber 2 Rückenmark 1 Rückenmark 2
RFU EB 97.830 94.132 339.716 290.154
F / V 435.188 461.299 385.366 482.480
Verhältnis 4,45 4.9 1.13 1.66
EB = Versuchspuffer und F / V = ​​FCCP + Valinomycin.

Tabelle 2:. Measure of ΔΨ von Mitochondrien aus normalen Geweben der Maus isoliert Zwei getrennte Tiere wurden verwendet, um Leber und Rückenmark Mitochondrien im Tandem zu isolieren (zB Leber 1 und Rückenmark 1 sind aus dem gleichen Tier).

EB Oligo Fäulnis KCN ADP F / V
RFU 0 4844 12.507 12.734 9925 10.892 4844
* 3 6517 13.639 12.435 10.235 13.154 6517
Fache Differenz 0 N / A 2,58 2,63 2.05 2.25 2,65
* 3 N / A 2.09 1.91 1.57 2.02 2.18
% Rückgang 0 vs. * 3 18,94 27,41 23,35 10,24 17,67
EB = experimentellen Puffer; Oligo = Oligomycin; rot = Rotenon; KCN = Kaliumcyanid, und F / V = ​​FCCP + Valinomycin.

Tabelle 3: Raw Daten und Berechnungen von Zelle cultur isoliert Mitochondrien Experimente.

Abbildung 2
Abbildung 2: Die Mitochondrien isoliert von Cytokin-behandelten Zellen wurden Membranpotential verringert. Prozentuale Abnahme des ΔΨ für 0 vs. * 3 für jede Behandlung im Vergleich zur Kontrolle, wie in der Tabelle 2 berechnet. Die Daten stellen Durchschnittswerte von doppelten Reaktionen für n = 3 (Oligomycin, Rotenon und FCCP / Valinomycin) oder n = 2 ( KCN und ADP) +/- Standardabweichung. * = Statistisch signifikante p-Werte basierend auf facher Unterschied Berechnungen; p = 0,03, 0,01 und 0,05 für Oligomycin, Rotenon und FCCP / Valinomycin sind.

Rückenmark Leber
Falten Difference Steuerung 1,54 ± 0,48 3,20 ± 1,56
SOD1 1,10 ± 0,30 3,12 ± 1,75
% Rückgang 28,1 2,48
p-Wert 0,03 0.41

Tabelle 4: Die Mitochondrien isoliert vom Rückenmark von SOD1 Mäusen haben Membranpotential verringert, wie durch FCCP + Valinomycin Daten beurteilt stellen den Durchschnitt von 4 Tieren pro Gruppe..

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Discussion

Behandlung von HEK-293T-Zellen, die mit rekombinanten Cytokinen verursacht moderate Mengen von Zelltod über 48 h (Figur 1). Die Menge an Zelltod, der durch TNF-alpha-Behandlung induziert wird, ist ähnlich wie die zuvor beschriebenen Studien 30 und die Lebensfähigkeit der Zellen sinkt nach gleichzeitiger Verabreichung von mehreren Cytokinen, die größer als summativen Mengen mit jedem Cytokin allein ist auch im Einklang mit der Literatur 31,32. Die Möglichkeit, die Mengen und Arten von Zytokin-Behandlungen sowie Vergleich der Cocktails bis hin zu einzelnen Zytokine anzupassen machen dieses Zellkulturmodell attraktiv für die Untersuchung der spezifischen Auswirkungen der Zytokin-Exposition auf die Nierenzellen. Weiterhin sind die Ergebnisse sehr reproduzierbar und leicht erreicht werden (Abbildung 2). Überlegungen im Auge zu behalten sind auf den Zusammenfluss der Zellen. Zum Beispiel werden Zellen bei 100% Konfluenz behandelt nicht so gut auf den gleichen Konzentrationen von Cytokinen, wenn sie bei 70-80% con behandeltEinfluss. Weiterhin sollte die Anzahl der Kanäle die Zellen durchlaufen haben verfolgt werden, wie Zellantwort könnte beeinflusst mit in Kultur zu lange (mehr als 8-12 Wochen seit Auftauen) gewesen sein. Während die Behandlung von kultivierten Zellen mit Cytokinen verringerte die Lebensfähigkeit der Zellen und anschließend mitochondrialen Gesundheit, ist es keineswegs ein Modell für Sepsis per se. Jedoch wird die Verwendung eines klinisch relevantes Modell, wie mit primären Nierenzellen von Mäusen und / oder Behandlung mit natürlich sezernierten Zytokine aus stimulierten Zellen THP1 33 isoliert, ist eine natürliche Erweiterung der vorliegenden Arbeit. Angesichts der Lücke im Verständnis von Nierenversagen bei Sepsis, wie Zellkulturmodellen und Bewertung der Mitochondrien konnten erste Einblicke in die Mechanismen sowie eine vorläufige Plattform für die Prüfung der Wirksamkeit von pharmazeutischen Verbindungen als vorbeugende oder Intervention Behandlungen bieten.

Mitochondrien aus kultivierten Zellen oder tierischen Geweben isoliertleisten in der Lage, schnell zu bewerten die Auswirkungen der Zellbehandlungen oder Fortschreiten der Krankheit auf die mitochondriale Gesundheit. Die Isolierung und Auswertung Protokolle technisch nicht anspruchsvollen durchzuführen und kann leicht zur Verwendung mit anderen Zelllinien oder Primärgewebe modifiziert werden. Die MIB und EB für jeden Probentyp verwendet werden, sind gute Ausgangs Rezepte, die bei Bedarf angepasst werden kann, ob eine bestimmte Zelle oder Gewebetyp hat unterschiedliche Anforderungen. Beispielsweise ist die Zugabe von Fettsäure-freies BSA normalerweise zur Verwendung mit Neuronen notwendig, da mit dem Rückenmark Protokoll 15,34 enthalten. Der Zellaufschluss Verfahren kann auch unter Verwendung von mehr Spritze Vertreibung oder Ändern griff Homogenisierung statt unter Verwendung eines Bohrers oder umgekehrt verändert werden. Weiterhin neu Homogenisierung des ersten Zentrifugationspellet wie im Rückenmark Mitochondrien Verfahren durchgeführt, kann es notwendig sein, um eine zufriedenstellende Menge an Mitochondrien erhalten. Ein guter Indikator, dass ein Isolierungsprotokoll erzeugt tragfähige mitochondria ist die Verwendung von Cytochrom c ELISA. Dieser Test ist eine schnelle und einfache Alternative zum Western-Blot-Analyse der Freisetzung von Cytochrom c und ist auch eine nützliche Beurteilung der Freisetzung von Cytochrom c nach der Behandlung der Mitochondrien mit Peptiden oder anderen Verbindungen 19,27. Alternativ kann TMRE während die Entwicklung von Protokollen verwendet werden, aber es ist wichtig, die Mitochondrien aus einer Probe, die bekanntermaßen gesund getrennt auszuwerten. Wenn ferner das Isolieren Mitochondrien aus Mausgeweben, die nicht routinemäßig in der Literatur beschrieben sind, Lebermitochondrien kann als positive Kontrolle zu dienen als auch verwendet, um eine Grundlinie festgelegt. Zum Beispiel, wie in diesem Protokoll, Leber von jedem Tier, sowohl während der Entwicklung von Protokollen sowie Experimente wurden herausgeschnitten und für Mitochondrien isoliert verwendet. Eine weitere Überlegung für eine Zubereitung ist die Menge an Mitochondrien am Ende des Isolierungsverfahrens erhalten. Wenn die Konzentration der Mitochondrien ist 1 mg / ml oder weniger, dannUntersuchungsergebnisse unzuverlässig (unveröffentlichte Beobachtungen VDGM) beweisen. Entweder die Menge an Ausgangsmaterial, MIB Rezept oder der Störungsmethode sollte, bevor er nach funktionelle Assays optimieren. Sobald eine erfolgreiche Isolierung Protokoll erreicht wird, können die Mitochondrien auch in anderen Assays, wie Gesamt ATP und ATP-Gehalt 13,14 Generation verwendet werden.

Die hier beschriebene Mitochondrien-Funktion Protokoll ermöglicht zur indirekten Messung der mitochondrialen Aufnahme des potential Sensing Farbstoff TMRE mit einem Standard-Fluoreszenz-Plattenlesegerät. Nach Mitochondrien wurden isoliert und die entsprechenden Chemikalien zugesetzt werden, werden sie mit TMRE inkubiert und dann pelletiert. Durch Behandlung ganzer Zellen oder Tiere und Isolieren Mitochondrien vor der Bewertung ΔΨ, Verwechselung Variablen wie multiresistenten Transport oder ATP Flusses vermieden. Die Menge an Fluoreszenz im Überstand wird dann mit dem Verständnis, dass die gesündere die Mitochondrien untersuchtdesto stärker ist ihre ΔΨ und damit die Aufnahme von TMRE. Als Ergebnis sollte die Menge der Fluoreszenz im Überstand weniger gesünder Mitochondrien und ungesunde Mitochondrien sein. Indem ein EB-einzige Behandlung, die fachen Unterschied der Fluoreszenz zwischen dieser Steuerung und entkoppelt Mitochondrien kann berechnet werden. Eine weitere wichtige Steuerungs mit jedem Satz von Reaktionen laufen ist TMRE allein. Das Ergebnis dieser Kontrolle stellt eine maximal mögliche Fluoreszenzmesswert. Da die TMRE hinzugefügt Reaktionen frisch verdünnten besteht inhärente Variabilität. Zum Beispiel wurden TMRE geschützt Ablesungen von ~ 20.000, 25.000 und 30.000 zu verschiedenen Zeiten während der Protokollentwicklung erreicht. Wenn die TMRE geschützten Signals viel größer als jede der behandelten Proben Mitochondrien und / oder bei Behandlung Mitochondrien sind nicht signifikant verschieden von unbehandelt, dann wird die Isolierung von Mitochondrien gekoppelt war wahrscheinlich nicht erfolgreich. Die Abnahme des ΔΨ durch ein Verhältnis erhaltenen MessWenn nach diesem Protokoll ist ähnlich wie die zuvor ausgewiesenen Beträge für die Steuerung, gesunde Zellen 2,35. Vergleich ΔΨ Veränderungen von Mitochondrien aus Steuer isoliert, unbehandelt HEK-293T-Zellen und * 3 Zytokin behandelten Zellen zeigten, dass die im MTT-Assays beobachtet verringerte Lebensfähigkeit der Zellen übersetzt verringert Mitochondrien-Funktion. Das Plattenlesegerät Assay konnte leicht mit Mitochondrien aus einer beliebigen Quelle isoliert und zur Krankheitsmodellen wie ALS untersuchen verwendet werden, wie hier gezeigt, 13,14.

Mehrere Studien haben die Mitochondrien-spezifischen Fluoreszenzfarbstoffen verwendet werden, um MOMP, die bei der Entstehung dieser Plattenleser Assay wichtig waren zu erkennen. Aber diese Studien entweder ganze Zellen, um Verbindungen zu blockieren Bild oder induzieren MOMP 35,36, erforschen neue ΔΨ Erkundung Farbstoffe 2 oder identifizieren andere Formate wie Durchflusszytometrie auf einem Mikrochip 37. Dieses Protokoll ist einzigartig, da es ad beschreibtETAILLIERTE Verfahren zu isolieren und zu verwenden Mitochondrien, schnell mit den Auswirkungen von Ganzzell-Behandlung durch die Reaktion auf bekannte ΔΨ verändernde Verbindungen. Dieses Protokoll verwendet eine Vielzahl von Entkopplern und Inhibitoren und zeigt, dass jeder von ihnen wäre geeignet zur Beurteilung mitochondrialen Gesundheit. Auch wenn sich dieser bestimmte Untersuchung konzentriert sich auf die mitochondriale Änderungen aufgrund zellulärer Stress oder progressive zelluläre Dysfunktion, könnte das Protokoll auch verwendet werden, um Änderungen in der mitochondrialen Stoffwechsel durch die Verwendung von spezifischen Verbindungen und / oder den Zusatz von Elektronen-Quellen wie Succinat und NADH erforschen .

Wichtige Überlegungen bei der Durchführung der isolierten Mitochondrien Beurteilung gehören die Konsistenz in der Behandlung Volumen, halten die Mitochondrien in MIB und sie verdünnt in EB unmittelbar vor die Behandlungen gehen zu eingerichtet werden, und mit Mitochondrien innerhalb von 3 Stunden der Isolation, um sicherzustellen, ihre ΔΨ noch beibehalten wird. DieWahl TMRE über anderen Mitochondrien-spezifischen Fluoreszenzfarbstoffen, wie JC-1 ist auf die Fähigkeit, kleine Konzentrationen und der Einfachheit der Analyse Fluoreszenz unter Verwendung nur einer Wellenlänge zu verwenden. Dieses Verfahren könnte in ähnlicher Weise unter Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie oder Durchflusszytometrie 2,38 37, jedoch ist die Verwendung eines Plattenlesegerätes benötigt weniger Zeit und weniger Optimierungs 35 durchgeführt werden. Darüber hinaus ist dieses Protokoll viel weniger technisch anspruchsvoll, schneller durchzuführen und leichter reproduzierbar als Vergleich zur Verwendung einer Clark-Elektrode 22 (Del Gaizo Moore, unveröffentlichte Beobachtungen). Titrieren Mengen jedes mitochondrialen Behandlung kann einen weiteren Einblick in die mitochondriale Funktion und Optimierung der Konzentrationen bereitzustellen durchgeführt werden sollte. Das Gesamtvolumen der mitochondrialen Reaktionen können eingestellt werden, um die Menge der Probe während der Trennung sowie der Anzahl der erforderlichen Behandlungsreaktionen erhalten Hotel. Wenn möglich, einer Pauschale von 50 μ; L verwendet; jedoch weniger als 20 & mgr; l der Mitochondrien produziert zuverlässige Ergebnisse.

Während ΔΨ korreliert mit Sauerstoffverbrauch legte die Assay misst nicht direkt die Sauerstoffaufnahme. Während fluoreszierende Sauerstofferfassungssonde wie MitoExpress entwickelt worden, vermutlich, um einige der Stürze der Verwendung einer Clark-Elektrode zitierten zu vermeiden, ist der Preis pro Reaktion und die Anforderung von größeren Mengen an Mitochondrien pro Assay limitierende. Daher ist die Verwendung von TMRE und klassische ΔΨ Entkuppler oder Inhibitoren hat mehrere Vorteile. Auch Batch Analyse mehrerer Proben oder mehrere Behandlungen / Probe, Reproduzierbarkeit, niedrigere Anfangsmaterialbedarf und / oder geringere Menge an isolierten Mitochondrien pro Reaktion erforderlich machen dieses Protokoll attraktiv.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
L-glutamic acid Sigma G1251 Can use the potassium salt instead.
malic acid Sigma M8304 Can use the potassium salt instead.
KH2PO4 Sigma P0662
K2HPO4 Sigma P3786
EGTA Sigma E3889
Trisma base Sigma T6066
MOPS Sigma M3183
CCCP Sigma C2920 Dilute down to 100 μM as a working stock in ethanol and store at -20 °C.
Valinomycin Sigma V0627 Make in DMSO and use as a 5 μM working stock. Store at -20 °C.
sucrose Fisher S5-500
KCN Mallinckrodt 6379 Make a concentrated stock in ethanol and then dilute with water 
rotenone Sigma R8875 Highly toxic. Made in ethanol.
oligomycin Sigma O4876 Highly toxic. Made in ethanol.
ADP Sigma A2754
TMRE Sigma 8717-25mg Dilute 100 μM stock with EB immediatley before use.
DMEM Gibco 11965-084 1x regular (high glucose).
Pen/Strep Invitrogen 15140-155
L-glutamine Fisher SH3002101 Store aliquots at -20 °C
FBS Lonza 14-501F US origin, premium quality. Heat inactivate and store aliquots at -20 °C.
Trypsin-EDTA Sigma T4049
DMSO SIgma D2650
Protien Assay Dye (5x) Bio-Rad 500-0006 Any protein assay can substitute.
BSA Fisher BP1600-100 Make 2 mg/ml stock in water for protein assay.
MTT powder Sigma M2128 Filter sterlize 5 mg/ml stock made in PBS. Store aliquots at -20 °C; store at 4 °C for up to 1 week.
Tergitol solution (NP-40) Sigma NP40S
Recombinant Human IL-1B Gibco PCH08014 Once opened store aliquots at -20 °C
Recombinant Human TNF-alpha Gibco PHC3015L
Recombinant Human IFN-gamma Gibco PHC4031
Dulbeccos PBS (-/-) Sigma D8537 Make sure it is without Mg2+ and Ca2+ ions.
Cytochrom c ELISA kit R&D systems DTC0 Human for HEK-293T cells. 

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References

  1. Madeira, V. M. Overview of mitochondrial bioenergetics. Methods In Molecular Biology. 810, 1-6 (2012).
  2. Sakamuru, S., et al. Application of a homogenous membrane potential assay to assess mitochondrial function. Physiological Genomics. 44, 495-503 (2012).
  3. Clayton, D. A. Structure and function of the mitochondrial genome. Journal Of Inherited Metabolic Disease. 15, 439-447 (1992).
  4. Schatz, G. The protein import system of mitochondria. The Journal of Biological Chemistry. 271, 31763-31766 (1996).
  5. Mayer, A., Neupert, W., Lill, R. Mitochondrial protein import: reversible binding of the presequence at the trans side of the outer membrane drives partial translocation and unfolding. Cell. 80, 127-137 (1995).
  6. Green, D. R., Kroemer, G. The pathophysiology of mitochondrial cell death. Science. 305, 626-629 (2004).
  7. Shamas-Din, A., Kale, J., Leber, B., Andrews, D. W. Mechanisms of action of Bcl-2 family proteins. Cold Spring Harbor Perspectives In Biology. 5, a008714 (2013).
  8. Hardwick, J. M., Youle, R. J. SnapShot: BCL-2 proteins. Cell. 138, 404 (2009).
  9. Zoratti, M., Szabo, I. The mitochondrial permeability transition. Biochimica et Biophysica Acta. 1241, 139-176 (1995).
  10. Wu, C. C., Bratton, S. B. Regulation of the intrinsic apoptosis pathway by reactive oxygen species. Antioxidants & Redox Signaling. 19, 546-558 (2013).
  11. Kuwana, T., et al. BH3 domains of BH3-only proteins differentially regulate Bax-mediated mitochondrial membrane permeabilization both directly and indirectly. Molecular Cell. 17, 525-535 (2005).
  12. Joshi, D. C., Bakowska, J. C. Determination of mitochondrial membrane potential and reactive oxygen species in live rat cortical neurons. Journal Of Visualized Experiments. (2011).
  13. Vinsant, S., et al. Characterization of early pathogenesis in the SOD1(G93A) mouse model of ALS: part I, background and methods. Brain and Behavior. 3, 335-350 (2013).
  14. Vinsant, S., et al. Characterization of early pathogenesis in the SOD1(G93A) mouse model of ALS: part II, results and discussion. Brain and Behavior. 3, 431-457 (2013).
  15. Rajapakse, N., Shimizu, K., Payne, M., Busija, D. Isolation and characterization of intact mitochondria from neonatal rat brain. Brain research. Brain Research Protocols. 8, 176-183 (2001).
  16. Schmitt, S., et al. A semi-automated method for isolating functionally intact mitochondria from cultured cells and tissue biopsies. Analytical Biochemistry. 443, 66-74 (2013).
  17. Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts. Nature Protocols. 2, 287-295 (2007).
  18. Debatin, K. M., Poncet, D., Kroemer, G. Chemotherapy: targeting the mitochondrial cell death pathway. Oncogene. 21, 8786-8803 (2002).
  19. Del Gaizo Moore, V., et al. Chronic lymphocytic leukemia requires BCL2 to sequester prodeath BIM, explaining sensitivity to BCL2 antagonist ABT-737. The Journal of Clinical Investigation. 117, 112-121 (2007).
  20. Del Gaizo Moore, V., Schlis, K. D., Sallan, S. E., Armstrong, S. A., Letai, A. BCL-2 dependence and ABT-737 sensitivity in acute lymphoblastic leukemia. Blood. 111, 2300-2309 (2008).
  21. Li, N., et al. Mitochondrial complex I inhibitor rotenone induces apoptosis through enhancing mitochondrial reactive oxygen species production. The Journal of Biological Chemistry. 278, 8516-8525 (2003).
  22. Hynes, J., et al. Investigation of drug-induced mitochondrial toxicity using fluorescence-based oxygen-sensitive probes. Toxicological Sciences : An Official Journal Of The Society of Toxicology. 92, 186-200 (2006).
  23. Papkovsky, D. B. Methods in optical oxygen sensing: protocols and critical analyses. Methods in enzymology. 381, 715-735 (2004).
  24. Galluzzi, L., et al. Methods for the assessment of mitochondrial membrane permeabilization in apoptosis. Apoptosis : An International Journal On Programmed Cell Death. 12, 803-813 (2007).
  25. Gurney, M. E., et al. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation. Science. 264, 1772-1775 (1994).
  26. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry. 150, 76-85 (1985).
  27. Certo, M., et al. Mitochondria primed by death signals determine cellular addiction to antiapoptotic BCL-2 family members. Cancer Cell. 9, 351-365 (2006).
  28. Hogeboom, G. H., Schneider, W. C., Pallade, G. E. Cytochemical studies of mammalian tissues; isolation of intact mitochondria from rat liver; some biochemical properties of mitochondria and submicroscopic particulate material. The Journal Of Biological Chemistry. 172, 619-635 (1948).
  29. Hogeboom, G. H., Claude, A., Hotch-Kiss, R. D. The distribution of cytochrome oxidase and succinoxidase in the cytoplasm of the mammalian liver cell. The Journal of Biological Chemistry. 165, 615-629 (1946).
  30. Marques-Fernandez, F., et al. TNFalpha induces survival through the FLIP-L-dependent activation of the MAPK/ERK pathway. Cell Death & Disease. 4, e493 (2013).
  31. Chao, C. C., Hu, S., Ehrlich, L., Peterson, P. K. Interleukin-1 and tumor necrosis factor-alpha synergistically mediate neurotoxicity: involvement of nitric oxide and of N-methyl-D-aspartate receptors. Brain, Behavior, And Immunity. 9, 355-365 (1995).
  32. Downen, M., Amaral, T. D., Hua, L. L., Zhao, M. L., Lee, S. C. Neuronal death in cytokine-activated primary human brain cell culture: role of tumor necrosis factor-alpha. Glia. 28, 114-127 (1999).
  33. Schildberger, A., Rossmanith, E., Weber, V., Falkenhagen, D. Monitoring of endothelial cell activation in experimental sepsis with a two-step cell culture model. Innate Immunity. 16, 278-287 (2010).
  34. Brown, M. R., et al. Nitrogen disruption of synaptoneurosomes: an alternative method to isolate brain mitochondria. Journal Of Neuroscience Methods. 137, 299-303 (2004).
  35. Wong, A., Cortopassi, G. A. High-throughput measurement of mitochondrial membrane potential in a neural cell line using a fluorescence plate reader. Biochemical and Biophysical Research Communications. 298, 750-754 (2002).
  36. Blattner, J. R., He, L., Lemasters, J. J. Screening assays for the mitochondrial permeability transition using a fluorescence multiwell plate reader. Analytical Biochemistry. 295, 220-226 (2001).
  37. Kataoka, M., Fukura, Y., Shinohara, Y., Baba, Y. Analysis of mitochondrial membrane potential in the cells by microchip flow cytometry. Electrophoresis. 26, 3025-3031 (2005).
  38. Del Gaizo Moore, V., Payne, R. M. Transactivator of transcription fusion protein transduction causes membrane inversion. The Journal of Biological Chemistry. 279, 32541-32544 (2004).

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