TIRFM et GFP-sondes sensibles au pH pour l'évaluation des vésicules de neurotransmetteur Dynamics dans les cellules SH-SY5Y neuroblastome: imagerie cellulaire et analyse des données

Neuroscience

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Daniele, F., Di Cairano, E. S., Moretti, S., Piccoli, G., Perego, C. TIRFM and pH-sensitive GFP-probes to Evaluate Neurotransmitter Vesicle Dynamics in SH-SY5Y Neuroblastoma Cells: Cell Imaging and Data Analysis. J. Vis. Exp. (95), e52267, doi:10.3791/52267 (2015).

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Abstract

Les vésicules synaptiques libèrent des neurotransmetteurs au niveau des synapses chimiques à travers un cycle dynamique de la fusion et la récupération. Suivi de l'activité synaptique en temps réel et disséquer les différentes étapes de exo-endocytose au niveau d'une seule vésicule sont cruciales pour comprendre les fonctions synaptiques dans la santé et la maladie.

Génétiquement codés sondes sensibles au pH visant directement les vésicules synaptiques et réflexion interne totale microscopie de fluorescence (TIRFM) fournissent la résolution spatio-temporelle nécessaire de suivre la dynamique de vésicules. Le champ évanescent généré par réflexion interne totale ne peut exciter des fluorophores placés dans une couche mince (<150 nm) au-dessus du couvercle de verre sur lequel les cellules adhèrent, exactement là où les processus de exo-endocytose ont lieu. Les images à contraste élevé qui en résultent sont parfaitement adaptés pour des vésicules suivi et l'analyse quantitative des événements de fusion.

Dans ce protocole, SH-SY5Y n humainecellules euroblastoma sont proposées comme un modèle précieux pour étudier la libération de neurotransmetteurs au niveau d'une seule vésicule par TIRFM, en raison de leur surface plane et la présence de vésicules dispersées. Les méthodes pour la culture de SH-SY5Y comme cellules adhérentes et pour leur transfection avec synapto-pHluorin sont fournis, ainsi que la technique pour effectuer l'imagerie et TIRFM. Enfin, une stratégie visant à sélectionner, compter et analyser les événements de fusion au niveau des cellules entières et unique vésicules est présenté.

Pour valider la procédure d'imagerie et l'analyse des données approche, la dynamique de vésicules pHluorin-marqués sont analysés en vertu de repos et stimulés (dépolarisants concentrations de potassium) conditions. Dépolarisation membranaire augmente la fréquence des événements de fusion et provoque une augmentation parallèle du signal de fluorescence nette enregistrée dans la cellule ensemble. Analyse d'un seul vésicules révèle modifications de comportement fusion-événement (hauteur accrue de pointe et la largeur). Ces données suggèrent eà la dépolarisation de potassium non seulement induit une libération de neurotransmetteurs massive, mais modifie également le mécanisme de la fusion des vésicules et le recyclage.

Avec la sonde fluorescente approprié, cette technique peut être utilisée dans différents systèmes cellulaires pour disséquer les mécanismes de sécrétion constitutive et stimulée.

Introduction

La transmission synaptique chimique entre les neurones est un mécanisme majeur de la communication dans le système nerveux. Elle se appuie sur la libération de neurotransmetteurs par un cycle dynamique de la fusion des vésicules et la récupération sur le site présynaptique. Un grand nombre de protéines impliquées dans la dynamique des vésicules ont été identifiés; Toutefois, leur contribution spécifique au phénomène reste à préciser une.

Notre compréhension est en partie limitée par le fait que les tests les plus largement utilisés pour exo / endocytose ne sont pas toujours les plus appropriées. Plusieurs études relatives à la fusion des vésicules et la dynamique reposent sur des techniques électrophysiologiques. Cette technique fournit une résolution temporelle optimale et est excellent pour enquêter sur la fusion initiale des vésicules à la membrane plasmique, mais est incapable de détecter la plupart des événements moléculaires sous-jacents qui soutiennent la fonction présynaptique. La microscopie électronique, de l'autre côté, fournit le meilleur morphological description de chaque étape singulière, mais l'aspect dynamique de l'événement ne peut pas être capturé, parce que les échantillons doivent être fixés de façon à être analysé.

L'avènement de nouvelles techniques d'enregistrement optique 2,3, en combinaison avec les progrès de la fluorescence des sondes moléculaires développement 4-6, permet la visualisation des processus d'exocytose dans les cellules vivantes, fournissant ainsi de nouveaux niveaux d'information sur la structure et la fonction synaptique.

Les premières études exploitées colorants dépendants de l'activité styryliques (FM1-43 et colorants organiques connexes) 7,8. State-of-the-art techniques d'imagerie utilisent des variantes sensibles au pH de la protéine fluorescente verte (GFP) (pHluorin) attaché à vésicules luminal protéines neuf. Ces sondes sont normalement désactivés lorsqu'ils sont présents dans les vésicules en raison du faible pH luminal. Après la fusion avec la membrane plasmatique, l'intérieur des vésicules est exposée à l'espace extracellulaire neutre, le pH brusquement augmente, soulage la trempe de protons dépend de pHluorin et le signal fluorescent apparaît rapidement. Comme la variation de pHluorin est plus rapide que l'événement de fusion, en contrôlant la fluorescence augmente, la fusion des vésicules avec la membrane peut être mesurée et analysée. Étant donné que les molécules d'pHluorin surface sont marqués endocytose, le signal de fluorescence retourne ensuite au niveau de base, par conséquent la même construction peut également être utilisée pour contrôler le recyclage des vésicules 9.

Bien que le capteur de pH des vésicules à marquage assure uniquement la visualisation de ces vésicules qui fusionnent vraiment avec la membrane plasmique, l'imagerie à résolution spatiale et temporelle élevée est nécessaire de décrire en détail les étapes intervenant dans les processus d'endocytose exo /. La technique optique qui fournit la résolution spatio-temporelle est nécessaire microscopie de réflexion totale interne de fluorescence (TIRFM), une demande de 10 microscopie à fluorescence.

"> La réflexion interne totale se produit à l'interface entre le verre lamelle et l'échantillon. Lorsque le trajet de la lumière atteint la lamelle de avec un angle d'incidence supérieur à l'angle critique, la lumière d'excitation ne est pas transmise dans l'échantillon, mais est complètement réfléchie. Dans ces conditions, un évanescentes formes d'onde de la lumière à l'interface et se propage dans le milieu avec moins de densité optique (l'échantillon). Comme l'intensité du champ évanescent décroît exponentiellement avec la distance de l'interface (avec une profondeur de pénétration environ 100 nm) que les fluorophores à proximité la plus proche de la lamelle couvre-objet peut être excité, tandis que ceux plus éloignés de la limite sont pas. Dans les cellules transfectées avec GFP-assemblage, cette profondeur correspond à des protéines exprimés sur la membrane plasmique ou dans des structures vésiculaires approcher. Comme fluorophores dans l'intérieur de la cellule ne peuvent pas être excités, la fluorescence de fond est minimisée, et une image avec un signal très élevé / fond ratio est formée 11.

Plusieurs caractéristiques font TIRFM la technique de choix pour la surveillance de la dynamique des vésicules. Le contraste parfait et le rapport signal-bruit ratio élevé permettent la détection de très faibles signaux découlant de vésicules simples. acquisition d'image à base de puce dans chaque trame fournit la résolution temporelle nécessaire pour détecter des processus hautement dynamiques. Enfin, l'exposition minimal de cellules à la lumière à tout autre plan dans l'échantillon réduit fortement phototoxicité et permet l'enregistrement longue durée time-lapse 12.

L'analyse des données reste l'aspect le plus difficile et crucial de cette technique. La façon la plus simple de contrôler la fusion des vésicules est de mesurer l'accumulation de protéines fluorescentes reporter à la surface de la cellule, au fil du temps 13. Comme fusion augmente, le signal de fluorescence augmente ainsi nettes. Cependant, cette méthode peut sous-estimer le processus, en particulier dans les grandes cellules et dans des conditions de repos,parce que les processus d'endocytose et photoblanchiment compensé l'augmentation de l'intensité de fluorescence due à la vésicule exocytose. Une autre méthode consiste à suivre chaque événement de fusion unique 14. Cette dernière méthode est très sensible et peut révéler des détails importants sur les mécanismes de fusion. Cependant, il nécessite la sélection manuelle des événements uniques, parce que les procédures à suivre complètement automatisés vésicules et d'enregistrer la fluctuation de leurs signaux fluorescents sont pas toujours disponibles. L'observation de la dynamique des vésicules nécessite cellules d'échantillonnage à haute fréquence. Cela génère une grande quantité de données qui peuvent difficilement être analysée manuellement.

La proposition de ce document est d'optimiser la technique d'imagerie de TIRFM de surveillance de la base et la libération de neurotransmetteurs stimulée dans la lignée de cellules de neuroblastome SH-5YSY, et de décrire, étape par étape, une procédure développée dans le laboratoire pour analyser les données, à la fois à des niveaux de cellules entières et unique vésicules.

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Protocol

1. Culture cellulaire et transfection

  1. Culture de cellules SH-SY5Y
    REMARQUE: Les expériences ont été effectuées en utilisant le neuroblastome humain SH SY5Y (ATCC # CRL-2266) 15. SH-SY5Y grandir comme un mélange de grappes flottantes et les cellules adhérentes. Suivez les instructions figurant dans le protocole (de densité cellulaire, rapport de division, etc.) D'avoir des cellules qui se développent fermement attachés à couvercle en verre, qui est crucial pour TIRFM.
    1. Avant de commencer, sous le poste de sécurité microbiologique à flux laminaire, de porter le volume opportun de solution de phosphate stérile de solution saline tamponnée (PBS) et un milieu de culture.
      1. Ajouter 50 ml de PBS à la concentration de 150 mM de NaCl, 24 mM de tampon phosphate, pH 7,4. Filtrer la solution.
      2. Ajouter 50 ml de milieu cellulaire à partir du milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) avec haute teneur en glucose, 10% de sérum bovin foetal inactivé par la chaleur (FBS), de la pénicilline (100 U / ml), streptomycine (100 ug / ml), L-glutamine ( 2 mM), etpyruvate de sodium (1 mM). Filtrer la solution.
    2. Éliminer le milieu de croissance complet et laver les cellules avec 3 ml de PBS.
    3. Incuber les cellules avec 2 ml de 0,05% de trypsine-acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) (par boîte de Petri de 6 cm) pendant 5 min à 37 ° C, 5% CO 2 et détacher les cellules en utilisant une pipette.
    4. Inactiver la trypsine en ajoutant 2 ml de DMEM, et de recueillir les cellules par centrifugation à 300 g pendant 5 min.
    5. Eliminer le surnageant, ajouter 1 ml de DMEM à la pastille et pipeter la solution de haut en bas suffisamment pour disperser les cellules dans une suspension cellulaire unique.
    6. Diviser les 1: 4 dans une nouvelle boîte de diamètre de 6 cm de Pétri contenant 3 ml de milieu complet. Maintenir les cellules en culture dans des boîtes de Pétri de diamètre 6 cm, à 37 ° C dans un incubateur à CO2 à 5%. Sous-culture une fois par semaine ou quand ils ont couvert 80 - 90% de la superficie de la surface.
  2. SH-SY5Y placage pour l'imagerie de cellules
    1. Pour les expériences de TIRFM, plaquecellules sur les couvercles de verre. Employer verre couvre de 0,17 ± 0,005 mm d'épaisseur et un indice de réfraction 1,5255 ± 0,00015. Avant de commencer, préparer les lamelles de verre comme suit:
      1. Nettoyez le verre couvre de 90% d'éthanol, O / N.
      2. Rincez-les soigneusement à l'eau distillée (trois changements d'eau distillée). Verre couvre sec dans un four de séchage.
      3. Lieu couvre en verre boîtes de Pétri et stériliser dans un four préchauffé à 200 ° C pendant 3 heures.
    2. Le jour avant la transfection, placer chaque lamelle dans un plat 3,5 cm Petri, ajouter 1 ml de milieu de culture et incuber à 37 ° C dans un incubateur à CO2 de 5%.
    3. Trypsiniser cellules comme décrit dans les étapes 1.1.3 - 1.1.5, suspendre le culot cellulaire dans 1 ml de milieu complet et compter. Calculer le volume correct de la suspension cellulaire à ajouter à chaque boîte de Petri pour obtenir 3 x 10 5 cellules / puits. Cette densité est nécessaire pour une croissance cellulaire optimale et une transfection efficace. Incuber à 37 ° Cen 5% de CO 2 incubateur O / N.
  3. SH-SY5Ytransfection par polyéthylènimine (PEI)
    REMARQUE: Pour visualiser les vésicules synaptiques dynamique, vecteur pCB6 contenant synapto-pHluorin a été utilisé. Le synapto-pHluorin a été générée par fusion dans le cadre d'une variante sensible au pH de la protéine fluorescente verte (GFP) 16 et la protéine de membrane vésiculaire synaptobrévine 2. La construction a été largement utilisé pour étudier les propriétés des vésicules synaptiques dans les neurones 9.
    1. Avant de commencer la transfection, faire 10 ml des solutions suivantes. Conserver les solutions que maximale que 1 mois.
      1. Faire une solution 150 mM de NaCl. Ajuster le pH à 5,5 avec du HCl 0,01.
      2. Faire une solution de PEI à 10% de polyéthylènimine (PEI; 25 kDa linéaire) en solution 150 mM de NaCl. Le pH de la solution se élève à 8,8. Ajuster le pH à 7,8 avec du HCl 0,01.
    2. 24 heures après l'étalement, éliminer le milieu et rafraîchir avec 1,5 ml demilieu complet. Maintenir les cellules à 37 ° C, dans un incubateur à CO2 à 5%.
    3. Sous l'enceinte de sécurité biologique à flux laminaire, dans un tube à microcentrifugation de 1,5 ml, ajouter 3 pg d'ADN de plasmide à 25 ul d'une solution 150 mM de NaCl et 100 ul de solution de PEI 3,5 cm par boîte de Pétri.
    4. Vortex pendant 10 secondes, puis incuber le mélange ADN / PEI pendant 30 min à température ambiante.
    5. Ajouter délicatement le mélange ADN / PEI à la boîte de Petri contenant des lamelles avec des cellules et secouez doucement pour répartir équitablement le réactif dans la boîte de Pétri.
    6. Après 4 h changer le milieu et on incube les cellules O / N à 37 ° C dans un incubateur à CO2 à 5%. Réaliser des expériences d'imagerie 24-48 heures après transfection.

2. imagerie cellulaire par réflexion interne totale microscopie de fluorescence (TIRFM)

  1. Imagerie set-up
    1. Effectuer imagerie de la FRBR avec le set-up décrit à la figure 1. Il comprend un moteur inversémicroscope (Figure 1, encart A), la source laser (figure 1, encadré B) et la TIRF-coulisseau (Figure 1, encart C). Atteindre l'illumination TIRFM à travers une ouverture numérique élevée (NA 1,45 Alpha Plan-Fluar) d'huile 100X, objectif à immersion.
    2. Pour l'éclairage de TIRFM, employer un multi-ligne (458/488/514 nm) 100 mW laser argon-ion. Utilisation d'une fibre en mode mono, introduire la lumière laser polarisée linéairement dans le trajet du faisceau, par l'intermédiaire du coulisseau TIRF. Insérez le curseur TIRF dans le plan de la membrane champ lumineux de la trajectoire du faisceau de lumière réfléchie.
      1. Pour l'éclairage à grand champ, connectez le microscope à un HBO lumière blanche de la lampe au mercure à court d'arc classique. Un double prisme à maintien de polarisation dans le coulisseau assure la combinaison simultanée de TIRF illumination et la lumière blanche.
    3. On filtre la lumière laser avec un filtre d'excitation (largeur bande de 488/10 nm) monté sur une roue de filtre, introduit dans le trajet du laser. Employerune vitesse élevée, l'obturateur commandé par logiciel, afin de permettre un contrôle rapide de l'illumination laser. Pour l'analyse pHluorin, monter un passe-bande 525/50 nm filtre d'émission. Capturez des images numériques (512 x 512 pixels) sur une caméra CCD rapide refroidi avec l'image ProPlus logiciel.
  2. La réalisation de l'éclairage de la FRBR (Figure 2)
    1. Tourner sur les lasers, l'ordinateur, l'appareil photo, la roue de filtre, et les contrôleurs d'obturation; puis, attendez 20 minutes avant de commencer l'expérience que les lasers ont besoin pour se réchauffer et se stabiliser.
    2. Avant imagerie, rendre le volume opportun des solutions suivantes.
      1. Ajouter 50 ml de Krebs (KRH) solution à 125 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 1,2 mM MgSO4, 1,2 mM de KH 2 PO 4, 25 mM de l'acide 4- (2-hydroxyéthyl) pipérazine-1-éthanesulfonique (HEPES) (tamponnée à pH 7,4), 2 mM de CaCl2 et 6 mM de glucose.
      2. Ajouter 10 ml de solution KRH-KCl (pH 7,4) à 80 mM de NaCl, 50 mM de KCl, 1,2 mM MgSO4, 1,2 mM de KH 2 PO 4, 25 mM de HEPES (tamponnée à pH 7,4), 2 mM de CaCl2 et 6 mM de glucose.
    3. Retirer le couvercle en verre avec des cellules transfectées et l'insérer dans la chambre d'imagerie approprié. Monter la chambre et ajouter 500 ul de solution KRH dans le centre de la vitre.
    4. Ajouter l'huile sur l'objectif. Placer la chambre d'imagerie sur la platine du microscope et la position de l'objectif sous la lamelle couvre-objet en verre. Positionner le couvercle sécuritaire sur l'échantillon.
    5. En mode épifluorescence, se concentrer sur la lamelle (surface supérieure) et choisissez cellules transfectées placés dans le centre de la chambre. Sélectionnez les cellules dont le signal fluorescent peut être clairement enregistrée en utilisant un temps d'exposition inférieure à 80 ms.
    6. Sous le contrôle du logiciel, passer à l'éclairage FRBR en mode direct.
    7. Pour définir la configuration de la FRBR, vérifier la position de la poutre qui émerge de l'objectif, sur la couverture de l'échantillon (figure 2B). Lorsque le faisceau est positionné dans le centre de til objectif (figure 2A, à gauche), un endroit est visible au centre de la couverture de l'échantillon de la FRBR (figure 2B, à gauche) et la cellule est imagé en mode épifluorescence (plusieurs avions de discussion, une forte fluorescence de fond; la figure 2C, gauche) .
    8. Pour atteindre l'angle critique, déplacer le point focalisé dans la direction Y (avant ou arrière; Figure 2B, centre) en utilisant l'angle vis de réglage sur le curseur de la FRBR (figure 1C). Lorsque le faisceau converge sur le plan de l'échantillon à un angle supérieur à l'angle critique (figure 2A, à droite), le spot disparaît et une droite, mince ligne axé est évident dans le milieu de la couverture de l'échantillon (figure 2B, à droite).
    9. Pour affiner l'angle FRBR utiliser l'échantillon de cellules (figure 2C). Regarder l'image de fluorescence sur la vidéo, à ce stade, une image à épifluorescence-like est encore visible. Doucement, déplacer la vis jusqu'à la FRBR concondition est atteint: un seul plan optique de la cellule est au point (ce est à dire, la membrane plasmique en contact avec la lamelle), il en résulte une image plate avec un contraste élevé (figure 2C, à droite).
  3. imagerie de l'échantillon
    1. Réglez l'expérience time-lapse à canal unique. Pour minimiser photoblanchiment, capturer l'image en utilisant à faible temps d'exposition et gain élevé. Temps d'exposition appropriées sont entre 40 à 80 msec. Acquérir des images à 1-2 Hz fréquence d'échantillonnage. cinétique de vésicules échantillonnage peuvent être mieux appréciée à plus haute fréquence (10 Hz). Le temps d'observation régulière est généralement de 2 min.
    2. Ajouter 500 pi de cellules de solutions et d'enregistrer KRH en mode TIRFM. Ce est la condition de repos. Enregistrez les images séquentielles de temps.
    3. Concentrez-vous sur la même cellule et enregistrer dans les mêmes conditions de repos (de puissance laser, exposition de temps, le numéro de châssis). Après cinq cadres, ajouter 500 pi de solution KCl-KRH et de garder KCl dans la chambre.Ce est la condition stimulée; enregistrer les images séquentielles de temps.

3. Analyse de l'image et de traitement des données

REMARQUE: Pour analyser les images, les macros ont été développées dans le laboratoire, basée sur des fonctions existantes du logiciel d'analyse d'image; macros similaires sont disponibles en ligne (URL fournie dans le tableau des matériaux et équipements).

  1. quantification de l'intensité de fluorescence
    1. Utiliser une macro "Séquence d'intensité de fluorescence" pour la quantification de l'intensité de fluorescence dans une région d'intérêt (ROI) de l'image, au cours de la séquence.
    2. Ouvrir les images séquentielles dans le temps. Allez dans le menu macro et sélectionnez «Séquence intensité de fluorescence. Dans la fenêtre "Analyse de apparaît" sélectionner le ROI ".
    3. Choisissez l'un des outils de sélection dans le menu pour créer le ROI. Placez 3 Rois dans les régions de la membrane cellulaire sans taches (fond ROI). Employer this "background ROI" pour évaluer le photoblanchiment et de fixer le seuil pour l'analyse des événements de fusion (figure 3A).
  2. Photobleaching correction et la détermination de seuil (figure 3B)
    1. Pour évaluer le photoblanchiment, ouvrir les lignes de fluorescence d'intensité "de fond", ROI (Figure 3ba). Normaliser les valeurs d'intensité de fluorescence dans chaque trame à la valeur d'intensité initiale (F0) (F / F0) (figure 3Bb). La moyenne des valeurs.
    2. Mettez en surbrillance les données moyennes et de créer un terrain de ligne en utilisant les options de menu de graphique.
    3. Dans le menu d'analyse de données, sélectionnez "Trendline" pour ouvrir la boîte de dialogue d'analyse de la parcelle. Sélectionnez le type de régression. Réglez la régression "exponentielle". Ensuite, sélectionnez "équation d'affichage sur le tableau". Dans la fenêtre graphique, l'équation exponentielle apparaît et les valeurs des paramètres sont automatiquement attribué, (Figure 3bc
    4. Appliquer la correction exponentielle pour les valeurs d'intensité dans chaque trame comme suit:
      Fn (corrigé) = Fn / exp (-n * a)
      Fn = expérimentale intensité de fluorescence mesurée à la trame n; n = le nombre de trames; a = facteur de blanchiment (constante exprimant le taux de perte d'intensité en raison de photoblanchiment;   Figure 3BD).
    5. Pour définir le seuil, ouvrir un "background ROI" normalisée et corrigée, calculer le signal de fluorescence moyenne et son écart type (SD). La valeur moyenne plus 3 SD représente le seuil (Figure 3BE). Utilisez ce seuil pour l'analyse des données.
  3. La sélection des événements de fusion en utilisant une procédure semi-automatique
    1. Ouvrir les images séquentielles dans le temps avec le logiciel d'analyse d'image. Application d'un filtre gaussien à la séquence d'image active.
    2. Analyser les images à l'aide de la fonction "compter des objets" ou une macro qui permet la sélectiond'un objet dont les pixels ont une intensité de fluorescence moyenne dans une plage définie. Réglez l'intensité gamme manuellement, en utilisant la fonction de seuil (aller à la barre de menu, réglez le seuil de mesure → pour sélectionner la zone d'intérêt). Un seuil adéquat est de 30% sur le signal de fond fluorescent locale.
    3. Appliquer une macro "Filtres objets" pour sélectionner uniquement les objets répondant aux critères suivants:
      1. Appliquer l'option gammes (min et max inclus) pour l'aspect. Aspect indique le rapport entre le grand axe et le petit axe de l'ellipse équivalente à l'objet. Aspect est toujours ≥1. Les valeurs adéquates sont min = 1, max = 3.
      2. Appliquer gammes de diamètre. Diamètre rapporte la longueur moyenne des diamètres mesurés à intervalles de deux degrés joignant deux points de contour et passant par le centre de gravité de l'objet. Définissez la plage de pixels (ou en pm, si vous utilisez un système calibré).
      3. Définir la gamme optimale dans preliminexpériences aires: sélectionner manuellement les points d'intérêt, puis de mesurer leur diamètre en utilisant la fonction de profil de la parcelle.
    4. Sélectionnez «objets d'affichage": objets sélectionnés apparaîtront superposée à l'image de TIRFM (figure 4B).
    5. Inclure dans l'analyse que les taches qui montrent une courte durée (de une à trois cadres) augmentation transitoire de l'intensité de fluorescence, immédiatement suivie d'une perte marquée de signaux transitoires (taches). Employer la sélection circulaire pour créer un retour sur investissement de diamètre environ une place radialement autour des vésicules / spots sélectionnés (ROI expérimental). Effectuez cette étape manuellement.
    6. Avec les ROI sélectionné, calculer l'intensité de fluorescence moyenne de chaque ROI au cours du film.
  4. L'analyse des données (figure 3C-D)
    1. Exporter le décours temporel de l'évolution de fluorescence mesurés dans chaque "ROI expérimentale» dans un tableur; (Figure 3da). Normaliser la valeur d'intensité dans chaque trame à l'intensité de fluorescence initiale (F / F0), (figure 3dB).
    2. Appliquer la correction exponentielle pour les valeurs d'intensité dans chaque trame comme indiqué à l'étape 3.2.4 (Figure 3Dc).
    3. Pour calculer le nombre total d'événements de fusion (nombre crête), le temps que chaque fusion se produit (largeur de pic) et l'amplitude du pic fluorescent (hauteur de pic et l'ASC) appliquer des fonctions logiques en utilisant des tableurs ou mathématiques. Un exemple d'analyse d'événement de fusion en utilisant des formules logiques est rapporté dans la Figure 3DD et 3De.
    4. Supposons que l'augmentation de l'intensité de fluorescence supérieure au seuil (intensité moyenne de fluorescence de fond ± 3SD) comme la fusion des vésicules à la membrane plasmique et le pic résultant comme un événement de fusion.
    5. Calculer la largeur du pic en tant que différence entre la dernière et la première valeur x de chaque pic. Multipliez cette valeur pour 1 / (fréquence d'échantillonnage). Considérez cette valeur uns Le temps de fusion des vésicules et l'adhérence à la membrane plasmique vésiculaire avant ré-acidification et recyclage (Figure 3DD).
    6. Calculer la CUA cellule entière comme une somme de valeurs sur le seuil. Considérer cette valeur comme la variation nette fluorescente pendant la durée d'enregistrement en raison de la spontanée (repos) ou évoquée (stimulé) l'activité synaptique.
    7. Calculer la hauteur de pic comme la différence entre la valeur y de chaque pic maximal et le seuil. Considérer cette valeur comme indicative du type de fusion (un ou de fusion séquentielle / simultanée ou transitoire vs pleine fusion).

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Representative Results

Les procédures de la FRBR imagerie et analyse des données décrites sont conçus pour étudier la dynamique des vésicules dans les systèmes cellulaires. Cette technique peut être utilisée pour déterminer les effets de molécules de signalisation et des médicaments sur les événements de fusion et de la dynamique des vésicules 17 neurotransmetteur. Utilisation de protéines de membrane de plasma GFP étiqueté, l'analyse de la TIRFM a été utilisée pour caractériser le trafic constitutive de transporteurs de glutamate GFP étiqueté dans des cellules gliales et des cellules épithéliales 18,19.

Pour valider la stratégie de procédure d'imagerie et l'analyse des données déclarées, les événements de fusion sont enregistrées des conditions basales et stimulées (dépolarisation induite potassium), dans les cellules de neuroblastome SH-SY5Y transfectées avec synapto-pHluorin. (VIDEO 1, 2, respectivement). Deux analyses différentes sont effectuées: cellules entières (figure 4) et des analyses simples vésicule (figure 5).

Analyse de cellules entières measures le nombre total d'événements de fusion dans la cellule et les changements de fluorescence nets résultant induites par stimulation. Sur la figure 4, les cellules transfectées synapto-pHluorin sont enregistrées sous repos et stimulées conditions (KCl stimulation), en utilisant le même protocole expérimental (temps d'exposition, la puissance du laser, etc.). La figure 4A montre que synapto-pHluorin accumule dans puncta fluorescent dispersé sur la membrane cellulaire. Comme décrit dans la littérature, un signal fluorescent léger est également présent à la membrane plasmique 9; ce signal est utile pour identifier les cellules à imager. Sur la figure 4B, les points sélectionnés par la procédure automatique est décrit dans le document (section 3.3) sont superposées à l'image de TIRFM indiqué dans la figure 4A. La figure 4C montre les profils d'intensité de fluorescence normalisé de points sélectionnés dans des conditions de repos. Ces profils révèlent la présence de pics individuels de fluorescente similaire intensité qui sortent à différents moments au cours de l'enregistrement et probablement correspondent à des vésicules qui fusionnent avec la membrane de temps en temps. La figure 4D montre les effets de stimulation de KCl. Comme prévu, la dépolarisation avec KCl 25 mM provoque une réponse rapide et plusieurs puncta fluorescentes très brillants apparaissent à la membrane cellulaire (Vidéo 2). Ces puncta correspondent à la piscine «facilement libérable» des vésicules synaptiques présents sous la membrane plasmique. L'analyse en fonction du temps des changements de fluorescence, mesurés en correspondance des points individuels indique la présence de pics, de l'intensité de fluorescence variable qui apparaît brusquement après l'application du stimulus de sécrétion (Figure 4D et 4F). Résultats de l'analyse de cellules entières au cours de l'heure d'enregistrement sont indiqués sur la figure 4E-H. KCl stimulation provoque une augmentation rapide marquée dans le nombre d'événements de fusion (2,5 fois de hausse par rapport à des conditions de repos) (Figure 4E-F) et dans les changements d'intensité de fluorescence résultant (9,3 fois plus au cours des conditions de repos) (figure 4G-H), indiquant ainsi la libération de neurotransmetteurs massif.

Analyse à l'unité de pointe permet la caractérisation des événements de fusion unique (figure 5). La figure 5A montre la séquence images d'un "retour sur investissement expérimentale" mandataire inscrit dans des conditions de repos. Le particulier met en évidence un synapto-pHluorin étiqueté vésicules qui fusionne avec la membrane sous la zone de la FRBR. Après deux cadres, le signal fluorescent disparaît, indiquant la récupération de la vésicule probable et ré-acidification. Le profil de fluorescence normalisée de la région d'intérêt (figure 5B) mesure une augmentation du signal fluorescent en correspondance de l'apparition de place dans la zone de la FRBR. Inversement, la fluorescence retourne à niveau basal après place disparition (seul piclargeur 1,91 ± 0,32 sec moyenne; pic de hauteur moyenne 0,042 ± 0,005 intensité de fluorescence normalisée). Figure 5C et 5D montrent les images séquentielles d'une «ROI expérimental" enregistré sous KCl stimulation et le profile d'intensité de fluorescence normalisé correspondant. Noter l'augmentation de la circulation des vésicules dans et hors de la zone de TIRF après la dépolarisation de KCl.

40 événements de fusion sont sélectionnés et analysés dans des conditions de repos et stimulées. Les paramètres suivants sont mesurés: AUC de crête moyenne, la largeur et la hauteur de pic. Largeur de pic indique le moment de la fusion des vésicules, l'attachement et l'endocytose avant de re-acidification et le recyclage, la figure 5G. La hauteur du pic mesure les variations d'intensité de fluorescence induites par la fusion des vésicules, la figure 5F. Les variations de ces paramètres sont révélateurs de mécanismes d'exocytose différents. Analyse unique pic révèle que la dépolarisation de KCl modifie lale mode de la fusion des vésicules à la membrane plasmique. En effet, l'augmentation de la surface du pic moyen (3,8 ± 0,2 pli augmentation par rapport à des conditions de repos, P <0,01 par un test t apparié, figure 5E), la hauteur du pic (2,75 ± 0,03 pli augmentation, P <0,01 par test t apparié, figure 5F) et la largeur (2,6 ± 0,5 fois plus, P <0,05 par test t apparié. Figure 5G) sont détectées dans des conditions stimulées. Plusieurs explications peuvent être envisagées pour ces résultats. Une possibilité est que la dépolarisation de KCl provoque la fusion simultanée et / ou séquentielle de vésicules dans une région limitée des cellules. Une autre explication est que la forte dépolarisation favorise la fusion complète contre la fusion transitoire. Dans des conditions basales, le mécanisme dominant est une fusion transitoire: une fusion des formes de pores, le pH de la vésicule et l'augmentation du signal fluorescent apparaît, mais le pore se ferme immédiatement, permettant ainsi ré-acidification et de recyclage rapide. Sousconditions stimulées, la vésicule fusionne totalement avec la membrane plasmique, la hauteur du pic et l'augmentation de largeur que la récupération de la membrane des composants vésiculaires, ré-acidification et de recyclage peuvent nécessiter une plus longue période. Un résultat similaire a été obtenu récemment l'analyse synaptique comme microvésicule exocytose dans les cellules β-endocriniens 20.

Figure 1
Figure 1. FRBR microscope mis en place. Vue schématique et de l'image (en médaillon) du système de microscope FRBR. La mise en place comprend l'motorisé microscope inversé Axio Observer Z1 (A), un multi-ligne 100 mW laser Argon-ion (B) et un FRBR-curseur (C). La lumière laser (ligne verte) et la lumière blanche (ligne jaune) sont présentés. Les cellules sont imagées par un objectif d'immersion 100 × d'huile. Les images numériques sont capturées sur une caméra CCD refroidie RetigaSRV Rapide. L'arbitreModule lecteur, l'émission (488/10 nm) et l'excitation (passe-bande 525/50 nm) filtres, le collimateur (L1) et en se concentrant (L2) lentille sont indiqués. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2. Obtenir configuration TIRFM. (A) bande dessinée schématique illustrant l'objectif, la lamelle, l'échantillon et la position du faisceau laser (ligne bleue). Gauche, le faisceau d'excitation parcourt directement via l'interface lamelle-échantillon . L'échantillon est excité comme en mode épifluorescence. Center, les formes de faisceau d'excitation avec l'échantillon un angle d'incidence inférieur à l'angle critique, la lumière illumine l'échantillon à un angle variable. A droite, le faisceau d'excitation forme une incident angle supérieur à l'angle critique, la lumière réfléchie est terminée dans la lentille d'objectif, et un champ évanescent se propage dans l'échantillon. (B) Caricature montrant la couverture de l'échantillon et la position du faisceau d'excitation (cercle bleu), qui émerge de l'objectif, lors du passage de épifluorescence (gauche) vers la FRBR éclairage (à droite). (C) épifluorescence (à gauche) et TIRFM (à droite) des images de synapto-pHluorin fluorescence dans une cellule vivante SH-SY5Y. Barre d'échelle:. 10 pm Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3. de traitement et analyse des données. (A) image TIRFM de synapto-pHluorin fluorescence dans un live SH-SY5Y cellulaire. Le carré vert indique un représentant "background ROI". La barre d'échelle 10 um. (B) de flux de travail proposé pour le fond ROI. De haut en bas:.... Bien sûr, un temps de changements d'intensité de fluorescence mesurées dans les ROI de fond; b normalisation des changements de fluorescence à la valeur de fluorescence initiale (F / F0); c application de la régression exponentielle; d correction de photoblanchiment, e. évaluation de seuil (carré gris transparent). (C) l'image de TIRFM synapto-pHluorin fluorescence dans une cellule vivante SH-SY5Y. Le carré blanc indique un "ROI expérimentale« représentant. La barre d'échelle 10 um. (D) flux de travail proposé pour ROI expérimentale. De haut en bas:.. Une évolution dans le temps des changements d'intensité de fluorescence; b normalisation des données à la valeur initiale de la fluorescence (F / F0); c. photoblanchiment;. de l'application de fonctions logiques pour détecter nombre de pointe, la CUA, la largeur et la hauteur. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4. Analyse de cellule entière. (A) de l'image de TIRFM synapto pHluorin-fluorescence dans une cellule vivante SH-SY5Y. Les cellules sont enregistrés en vertu de repos et stimulés (25 mM KCl) l'application des conditions (échantillonnés à 1 Hz). Barre d'échelle: 10 um. (B) points identifiés par la procédure automatique sont affichés en surimpression (couleur verte) sur l'image de TIRFM. (C) des profils normalisés d'intensité de fluorescence (F / F0) de points sélectionnés par la procédure automatique dans l'ensemble de la cellule dans des conditions de repos. (D) Normalized profils d'intensité de fluorescence (F / F0) de points sélectionnés dans des conditions stimulées. La barre au cours des traces indique l'application de KCl. (EH) Nombre d'événements et les changements d'intensité de fluorescence enregistrées dans la cellule entière en vertu de repos (bleu) et stimulées (rouge) conditions. (E) des histogrammes indiquant le nombre total d'événements de fusion enregistrées dans la cellule. (F) La répartition temporelle des événements de fusion. (G) histogrammes représentant des changements dans pHluorin intensité de fluorescence se produisant dans la cellule entière (Total AUC). (H) Courbes montrant les changements d'intensité de fluorescence cumulatifs pHluorin en fonction du temps. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5
(A) SH-SY5Y exprimant synapto-pHluorin sont imagés à 1 Hz, dans des conditions de repos. Images séquentielles de TIRFM Représentant (toutes les 2 sec) d'un ROI montrant une synapto-pHluorin étiquetés vésicule. ROI = 40 x 35 pixels. (B) le profil de fluorescence normalisée (F / F0) du ROI montré dans A. L'astérisque noir indique un événement de fusion, la ligne de seuil se affiche. (C) Le même cellule est enregistrée dans les conditions stimulées (25 mM KCl), TIRFM représentant images séquentielles d'une ROI sont présentés. KCl demande est indiquée par l'astérisque jaune. (D) le profil de fluorescence normalisée de la région représentée sur C met en évidence l'arrivée (en) et la disparition (out) de vésicules. Astérisques noirs indiquent les événements de fusion, la ligne de seuil est disponible. (EG) propriétés des événements uniques vésicule enregistrées en vertu de repos (barre bleue) et stimulées ( bar) conditions rouges. n = 40 événements de fusion. (E) Gauche, aire de pic (AUC) est indiqué par la lumière bleue, à droite, histogrammes des domaines de pointe moyenne; ** P <0,01. (F) gauche, la hauteur du pic (h) est indiqué par une double flèche; centre, histogrammes de la hauteur moyenne de pointe; ** P <0,01; à droite, la hauteur du pic spécifie le mécanisme de fusion. La star de la bande dessinée indique synapto-pHluorin. (G) gauche, largeur de pic est indiquée par une flèche double; centre, histogrammes de la largeur moyenne de pointe; * P <0,05; à droite, la largeur de pic indique la durée de la vésicule exocytose, l'attachement et l'endocytose. La couleur étoiles est vert lorsque la fluorescence synapto-pHluorin est visible et gris quand il est éteint. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

ent "> Vidéo 1. cellules SH-SY5Y exprimant synapto-pHluorin sont enregistrées dans des conditions de repos (échantillonnés à 1 Hz). Se il vous plaît cliquer ici pour voir cette vidéo.

Vidéo 2. SH-SY5Y exprimant synapto-pHluorin sont enregistrées dans des conditions stimulées (échantillonnés à 1 Hz). KCl perfusion est indiqué. Se il vous plaît cliquer ici pour voir cette vidéo.

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Discussion

Cet article présente un protocole à l'image et à analyser la dynamique des vésicules dans les cellules sécrétant, utilisant des vecteurs et TIRFM ADNc codé fluorescentes. Les éléments clés de l'imagerie par TIRFM succès sont la sélection du modèle cellulaire et transfection de cellules avec des indicateurs optiques génétiquement codés de la libération des vésicules et le recyclage.

TIRFM est idéal pour la croissance des cellules adhérentes à un couvercle de verre plat et suffisamment stable pour permettre la visualisation des membranes et des événements de fusion. Vésicules devrait idéalement être dispersé dans la cellule de sorte que leur trafic, la fusion et l'endocytose peuvent être visualisés et quantifiés au niveau d'une seule vésicule. Malheureusement, les neurones ne répondent pas à ces critères: ils ont des formes irrégulières, neurites qui traversent fréquemment sur l'autre, et les vésicules fusion est prédominante concentré dans les petites régions (zones actives). Pour ces régions est très difficile d'étudier la dynamique des vésicules par TIRFM dans des cultures primaires de neurones.

21,22. Les cellules sont suffisamment planes pour permettre la visualisation stable des membranes et des événements de fusion en mode TIRFM (en particulier dans le corps de la cellule) et des vésicules sont relativement dispersés. Enfin, les cellules peuvent être facilement transfectées avec plasmide codant pour les protéines GFP-étiquetée ou des étiquettes de protéines sensibles au pH en utilisant différents réactifs de transfection. Dans ce protocole, PEI a été utilisé pour transfecterles cellules. Ce réactif constitue la base de la plupart des agents de transfection disponibles dans le commerce et agit comme un vecteur très rentable transfection seul. Un rendement de 20% de la transfection est prévu en utilisant le protocole indiqué ci-dessus qui est approprié pour l'imagerie de cellules individuelles.

Bien que la disponibilité des différents réactifs et procédures transfection fait transfection presque une procédure standard dans SH-SY5Y et même dans des cultures de neurones primaires, les soins doivent être prises lors de l'enregistrement, l'analyse et l'interprétation des données de TIRFM. TIRFM facilite la collecte d'informations concernant les processus qui se produisent dans ou près de la membrane dans les cellules vivantes, et permet d'analyser les événements moléculaires individuelles grâce à la détection de changements dans le signal fluorescent provenant de protéines marquées qui se déplacent dans ou sur le évanescente produite. Cependant, plusieurs facteurs peuvent modifier les signaux fluorescents dans cette zone, sans nécessairement impliquer exo / endocytose événements, et cela doit être prendren en considération lors de l'enregistrement et l'analyse des données. Parmi ceux-ci sont des changements morphologiques dans la cellule, notamment celles concernant le plan mis au point sous les modifications de terrain et fluorophores évanescentes pendant l'enregistrement.

Les changements morphologiques

La haute résolution de la technique TIRF repose sur l'excitation des fluorophores dans le champ évanescent, de la profondeur de 100 nm depuis l'interface 11 de verre. Ce est une zone très mince et imperceptibles modifications morphologiques sont censés changer le plan de la cellule au point. Cela vaut particulièrement pour les neurones et les cellules qui présentent plusieurs processus et présentent froissement prononcée. Dans ces cellules, la zone de membrane en contact avec la lamelle pendant l'enregistrement est irrégulière et peut changer rapidement, provoquant ainsi une évaluation inexacte de l'exocytose. Pour cette raison, chaque fois que possible, il est important de sélectionner le modèle cellulaire d'enquête. Pour limiter moveme cellulairents peuvent être utiles pour le revêtement de verre couvre-avec des protéines de la matrice extracellulaire ou la poly-L-lysine. Cependant, il faut garder à l'esprit que ces substrats peuvent modifier le comportement des cellules et vésicules dynamique.

D'autres sources possibles de modifications morphologiques pendant l'enregistrement sont la stimulation des cellules, l'addition de solutions, et les changements de température. Stimuli capables d'induire vésicules massif de presse (ce est à dire, la dépolarisation de KCl) souvent provoquer un rétrécissement de la cellule qui modifie évidemment la surface de la cellule sous la zone de la FRBR. Il est donc important de choisir avec précision le temps de la stimulation dans des expériences préliminaires type, la concentration et l'application.

La simple introduction de solutions dans le bain avec une pipette, indépendamment de la composition, peut entraîner une modification de la morphologie des cellules par cisaillement. Pour résoudre cet objet, ajouter du milieu de préférence en utilisant un système de perfusion, éventuellement relié à une pompe à vide pour réduire le bruit.

Fluorophore

Modification de signaux fluorescents peut aussi être due à la modification du fluorophore pendant l'enregistrement. Le plus important est Photobleaching 23. Photoblanchiment est la décomposition induite par des photons d'un fluorophore. Il provoque généralement une perte permanente de la fluorescence et la variation de l'échantillon observé au fil du temps. Dans TIRFM, ne fluorophores fermée à l'origine du champ évanescent peuvent être décolorées et les protéines membranaires GFP-tagged sont décolorées parce qu'ils résident dans ce domaine. La prévention de la décoloration de l'intensité d'émission de fluorescence est très important d'obtenir des images de haute qualité, et obligatoire pour la microscopie quantitative de fluorescence. Avec une approximation raisonnable, pour une molécule donnée dans un environnement constant, photoblanchiment dépend de la durée et le cycle d'exposition à la source d'excitation. Dans de nombreux cas, photoblanchiment suit une fonction de décroissance exponentielle simple, ce qui rend son évaluation et sa correction plus facile en effectuant des enregistrements de contrôle 23. Différentes formules de correction / macros sont disponibles en ligne (voir le tableau des matériaux et équipements); dans le protocole une exponenti simplesal fonction a été utilisé.

Il ya plusieurs stratégies pour surmonter photoblanchiment. Une bonne stratégie consiste à éviter photoblanchiment à la source, par exemple, en utilisant des fluorophores avec photostabilité élevée. Malheureusement, en ce moment, le choix de sondes d'ADN codé est encore limitée. Dans ce cas, la perte d'activité causée par photoblanchiment peut être minimisée lors de l'acquisition d'images, l'optimisation des laps de temps d'exposition de lumière, l'énergie des photons de la lumière d'entrée et la fréquence d'échantillonnage.

Lors de l'utilisation des sondes sensibles au pH, une source supplémentaire de modification de fluorophore lors de l'enregistrement est le changement de pH dans le milieu. Le volume de liquide de la chambre d'enregistrement est généralement très faible et l'application de la drogue, l'activité et le métabolisme cellulaire peut modifier le pH du milieu, en particulier dans le petit volume entre la cellule et la surface de la lamelle. Ce à son tour, modifie le signal fluorescent pHluorin, causant ainsi sur / sous-estimation de la vésicule relouer. Par exemple, des stimulations fortes peuvent conduire à une acidification dépendante du calcium du cytosol et alcalinisation en miroir dans l'espace extracellulaire, résultant ainsi en une augmentation exagérée du signal fluorescent 24.

Pour éviter ce problème, utilisez toujours des solutions tamponnées et surveiller les modifications de pH possibles introduits par le protocole établi, dans des expériences préliminaires. Pour obtenir une estimation plus précise de la libération des vésicules évoqué, l'analyse des données, surveiller le signal de fluorescence dans une région de la surface de la cellule sans événements de fusion, et en utilisant des modifications du signal de fluorescence à l'intérieur de cette région en tant que facteur d'ajustement.

En conclusion, un procédé de surveillance et d'analyse de la dynamique et la fusion des vésicules a été décrite. Cette technique peut être utilisée dans différents types de cellules (neurones et cellules endocrines) pour visualiser et disséquer les différentes étapes du exo / endocytose, pour révéler le rôle des protéines et leur pathogenimutants de c dans la régulation de la dynamique de vésicules et de découvrir les mécanismes d'action des médicaments ciblant exocytose constitutive et régulée.

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Acknowledgments

Les auteurs tiennent à remercier l'Università degli Studi di Milano pour le soutien aux Eliana Di Cairano (post-doctorat) et Stefania Moretti (Ph.D. bourse). Ce travail a été soutenu par le Programme de recherche de l'Université PUR CP

Nous tenons à remercier le professeur Jeremy M. Henley, École de biochimie, Université de Bristol, Royaume-Uni, pour la pHluorin construire et le Dr Francesco Dotti d'assistance dans l'analyse de données, et Silvia Marsicano pour l'assistance technique.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Axio Observer Z1 Zeiss 491912-9850-000 inverted microscope
Multiline Argon Laser Lasos 77 Lasos 00000-1312-752 multi-line (458/488/514 nm), 100 mW argon-ion laser
Laser TIRF slider Zeiss 423681-9901-000
100X Objective Zeiss 421190-9900-000 Oil, NA 1.45 Alpha-Plan
CCD Camera RetigaSRV Fast 1394 QImaging
LAMBDA 10-3 optical filter changer with SmartShutter Sutter Instrument Company
Software
Image ProPlus 6.3 Software Media Cybernetics spot selection, ROI selection, fluorescence intensity determination
Excel Microsoft photobleaching correction, whole-cell and single-vesicle analyses
GraphPad Prism 4.00 GraphPad Software, Inc. statistical analysis

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