TIRFM und pH-sensitive GFP-Sonden an Neurotransmitter-Vesikel-Dynamics Werten in SH-SY5Y Neuroblastomzellen: Cell Imaging und Datenanalyse

Neuroscience

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Daniele, F., Di Cairano, E. S., Moretti, S., Piccoli, G., Perego, C. TIRFM and pH-sensitive GFP-probes to Evaluate Neurotransmitter Vesicle Dynamics in SH-SY5Y Neuroblastoma Cells: Cell Imaging and Data Analysis. J. Vis. Exp. (95), e52267, doi:10.3791/52267 (2015).

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Abstract

Synaptischen Vesikeln frei Neurotransmitter an chemischen Synapsen durch einen dynamischen Zyklus der Fusion und den Abruf. Überwachung synaptische Aktivität in Echtzeit und sezieren die verschiedenen Schritte von exo-Endozytose auf Einzel Vesikel Ebene sind entscheidend für das Verständnis der synaptischen Funktionen in Gesundheit und Krankheit.

Genetisch kodierte pH-sensitive Sonden direkt an synaptischen Vesikeln und Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (TIRFM) gezielte bieten die räumlich-zeitliche Auflösung erforderlich sind, um Vesikel Dynamik zu folgen. Das abklingende Feld durch interne Totalreflexion erzeugt wird, kann nur Fluorophore in einer dünnen Schicht (<150 nm) über der Glasdeckel an dem Zellen anhaften platziert erregen, genau dort, wo die Verfahren der exo-Endozytose erfolgt. Die entstandenen Bilder mit hohem Kontrast sind ideal geeignet für Vesikel Tracking und quantitative Analyse von Fusions Veranstaltungen.

In diesem Protokoll, SH-SY5Y menschlichen neuroblastoma Zellen werden als ein wertvolles Modell für die Untersuchung der Neurotransmitterfreisetzung an der Single-Vesikel Ebene durch TIRFM aufgrund ihrer flachen Oberfläche und der Gegenwart verteilt Vesikel vorgeschlagen. Die Verfahren zum Züchten von SH-SY5Y als adhärente Zellen und zur Transfektion von ihnen synapto-pHluorin vorgesehen sind, sowie als ein Verfahren, TIRFM und Bildgebung auszuführen. Schließlich wurde eine Strategie mit dem Ziel, zu wählen, zu zählen und zu analysieren Fusion Ereignissen an Ganzzell-und Single-Vesikel Ebenen dargestellt.

Um das Bildgebungsverfahren und Datenanalyse-Ansatz zu validieren, die Dynamik des pHluorin-markierten Vesikel unter Ruhe analysiert und stimuliert (depolarisierenden Kaliumkonzentrationen) Bedingungen. Membrandepolarisation erhöht die Frequenz der Fusionsereignisse und verursacht eine parallele Erhöhung des Nettofluoreszenzsignals im ganzen Zelle aufgezeichnet. Single-Vesikel Analyse zeigt Modifikationen Fusionsereignis Verhalten (erhöhte Spitzenhöhe und Breite). Diese Daten legen nahe thbei Kalium-Depolarisation nicht nur induziert eine massive Freisetzung von Neurotransmittern, sondern auch verändert den Mechanismus der Fusion von Vesikeln und Recycling.

Mit dem geeigneten fluoreszierenden Sonde kann diese Technik in verschiedenen Zellsystemen eingesetzt werden, um die Mechanismen der konstitutiven und stimulierte Sekretion sezieren.

Introduction

Chemische synaptische Übertragung zwischen Neuronen ist ein Hauptmechanismus der Kommunikation im Nervensystem. Es beruht auf der Freisetzung von Neurotransmittern durch einen dynamischen Zyklus Vesikelfusion Auslagern in der präsynaptischen Seite. Viele der Proteine ​​in Vesikel Dynamik beteiligt identifiziert worden sind; jedoch ihre spezifischen Beitrag zum Phänomen bleibt zu klären 1.

Unser Verständnis teilweise durch die Tatsache, dass die am häufigsten verwendeten Assays zur exo / Endozytose nicht immer am besten geeignet beschränkt. Mehrere Studien zu Vesikelfusion bezogenen und Dynamik setzen auf elektrophysiologischen Techniken. Diese Technik sorgt für eine optimale zeitliche Auflösung und ist ausgezeichnet für die Untersuchung der anfänglichen Fusion von Bläschen an der Plasmamembran aber nicht erkennen viele der molekularen Mechanismen, die präsynaptischen Funktion unterstützen. Elektronenmikroskopie, auf der anderen Seite stellt die feinste morphological Beschreibung jeder einzelnen Schritt, aber der dynamische Aspekt der Veranstaltung können nicht erfasst werden, weil Proben müssen, um fest zu analysieren werden.

Das Aufkommen von neuen optischen Aufzeichnungstechniken 2,3, in Kombination mit den Fortschritten in Fluoreszenzmolekularsonden Entwicklung 4-6, ermöglicht die Visualisierung der Exozytose Prozessen in lebenden Zellen, wodurch ein neues Maß an Informationen über die synaptische Struktur und Funktion.

Erste Studien genutzt aktivitätsabhängigen Styrylfarbstoffe (FM1-43 und verwandte organische Farbstoffe) 7,8. State-of-the-Art-bildgebenden Verfahren eingesetzt werden pH-sensitive Varianten des Green Fluorescent Protein (GFP) (pHluorin) zu Lumen Vesikel Proteine ​​9 angebunden. Diese Sonden werden in der Regel aus, wenn in den Vesikeln aufgrund der geringen luminale pH vorliegenden geschaltet. Nach der Fusion mit der Plasmamembran, die Vesikelinnenraum zur neutralen Extrazellularraum der pH Einstrahlung abrupt, entlastet den Protonenabhängige Abschrecken pHluorin und das Fluoreszenzsignal schnell angezeigt. Da die Änderung in pHluorin schneller ist als die Fusionsereignis, durch Messen der Fluoreszenz zunimmt, kann Vesikelfusion mit der Membran gemessen und analysiert werden. Da Oberflächen pHluorin-markierte Moleküle Endozytose werden, danach kehrt das Fluoreszenzsignal auf Basisniveau, also das gleiche Konstrukt kann auch Vesikel Recycling 9 Überwachung verwendet werden.

Während die Vesikel-markierten pH-Sensor sorgt für die Visualisierung nur dieser Vesikel, die wirklich verschmelzen mit der Plasmamembran wird Bildgebung mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung benötigt, um im Detail zu beschreiben die Schritte in den exo / endozytischen Prozesse. Die optische Technik, die die notwendigen räumlichen und zeitlichen Auflösung bietet, ist Totalreflexions-Fluoreszenzmikroskopie (TIRFM), eine Anwendung der Fluoreszenzmikroskopie 10.

"> Totalreflexion an der Grenzfläche zwischen dem Glasdeckglas und der Probe. Wenn der Lichtpfad des Glasdeckglas mit einem Einfallswinkel größer als der kritische Winkel erreicht auftritt, wird das Erregungslicht nicht in die Probe übertragen, aber ist vollständig zurückreflektiert wird. Unter diesen Bedingungen wird ein evaneszentes Licht-Wellenformen an der Grenzfläche und breitet sich in dem Medium mit geringer optischer Dichte (der Probe). Da die Intensität des abklingenden Feldes nimmt exponentiell mit dem Abstand von der Schnittstelle (mit einer Eindringtiefe von etwa 100 nm) nur die Fluorophore in unmittelbarer Nähe vom Deckglas angeregt werden, während diejenigen, die weiter vom Rand entfernt liegen nicht. In Zellen, die mit GFP-Konstrukten transfiziert, entspricht diese Tiefe, um Proteine ​​auf der Plasmamembran exprimiert oder vesikuläre Strukturen nähert sie. Als Fluorophore im Zellinneren nicht erregt werden, wird die Hintergrundfluoreszenz minimiert, und ein Bild mit einem sehr hohen Signal / Hintergrund-Ratteio 11 gebildet.

Mehrere Eigenschaften machen TIRFM die Technik der Wahl für die Überwachung von Vesikeln Dynamik. Die perfekten Kontrast und die hohe Signal-zu-Rausch-Verhältnis ermöglicht die Detektion von sehr niedrigen Signalen, die aus einzelnen Vesikeln. Chipbasierte Bildaufnahme in jedem Frame bietet die zeitliche Auflösung erforderlich sind, um hochdynamische Prozesse zu erkennen. Schließlich ist die minimale Exposition von Zellen gegen Licht an jedem anderen Flugzeug in der Probe reduziert stark Phototoxizität und ermöglicht langlebige Zeitrafferaufnahme 12.

Datenanalyse bleibt die größte Herausforderung und entscheidender Aspekt dieser Technik. Der einfachste Weg, Vesikelfusion überwachen ist die Ansammlung von fluoreszenten Reporter-Proteine ​​auf der Zelloberfläche zu messen, über die Zeit 13. Als Fusions erhöht, Nettofluoreszenzsignal steigt auch. Allerdings kann diese Methode den Prozess zu unterschätzen, insbesondere in großen Zellen und in Ruhebedingungen,weil Endozytose und Bleichen Prozesse versetzt den Anstieg in der Fluoreszenzintensität aufgrund von Bläschen Exocytose. Ein alternatives Verfahren besteht darin, jede einzelne Fusionsereignis 14 zu folgen. Dieses letztere Verfahren ist sehr empfindlich und kann wichtige Informationen über den Fusionsmechanismen offenbaren. Es erfordert jedoch die manuelle Auswahl der einzelnen Ereignisse, weil vollständig automatisierte Verfahren, um Vesikel zu verfolgen und die Fluktuation der Fluoreszenzsignale zu registrieren sind nicht immer verfügbar. Die Beobachtung der Vesikel Dynamik erfordert Sampling-Zellen mit einer hohen Frequenz. Dies erzeugt eine große Menge von Daten, die kaum manuell analysiert werden kann.

Der Vorschlag der vorliegenden Arbeit ist es, die TIRFM bildgebendes Verfahren zur Überwachung der basale und stimulierte Freisetzung von Neurotransmittern in der SH-5YSY Neuroblastom-Zelllinie zu optimieren und zu beschreiben, Schritt-für-Schritt wird eine im Labor entwickelt Verfahren, um Daten zu analysieren, sowohl bei Ganzzell-und Single-Vesikel Ebenen.

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Protocol

1. Zellkultur und Transfektion

  1. SH-SY5Y-Zellkultur
    HINWEIS: Die Versuche wurden durchgeführt unter Verwendung der humanen Neuroblastom-SH-SY5Y (ATCC # CRL-2266) 15. SH-SY5Y-Zellen zu wachsen als eine Mischung von Floating-Cluster und adhärenten Zellen. Folgen Sie den Anweisungen im Protokoll (Zelldichte, Teilungsverhältnis, etc.) Berichtet, dass Zellen, die fest mit Glasabdeckung, die entscheidend für TIRFM ist angebracht wachsen.
    1. Vor dem Start unter laminaren Strömungs Biosicherheit, Kosmetik die gelegene Volumen sterilen Phosphatpuffer Kochsalzlösung (PBS) und Kulturmedium.
      1. Make 50 ml PBS mit Konzentrationen von 150 mM NaCl, 24 mM Phosphatpuffer, pH 7,4. Faltenfilter filtrieren.
      2. Make 50 ml Zellmedium von Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit hohem Glucose, 10% hitzeinaktiviertes fötales Rinderserum (FBS), Penicillin (100 U / ml), Streptomycin (100 ug / ml), L-Glutamin ( 2 mM) undNatriumpyruvat (1 mM). Faltenfilter filtrieren.
    2. Komplett ausbauen Wachstumsmedium und waschen Sie die Zellen mit 3 ml PBS.
    3. Inkubieren Zellen mit 2 ml 0,05% Trypsin-Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) (6 cm Petrischale) für 5 min bei 37 ° C, 5% CO 2 und nehmen Zellen mittels Pipette.
    4. Inaktivierung von Trypsin durch Zugabe von 2 ml DMEM und sammle die Zellen durch Zentrifugation bei 300 × g für 5 min.
    5. Entfernen Sie den Überstand, 1 ml DMEM zum Pellet pipettieren und die Lösung auf und ab, um genügend Zellen in eine Einzelzellsuspension zu zerstreuen.
    6. Splitten 1: 4 in einem neuen 6 cm Durchmesser Petrischale mit 3 ml Komplettmedium. Aufrechterhaltung von Zellen in Kultur in 6 cm Durchmesser Petrischalen bei 37 ° C in einem 5% CO 2 -Inkubator. Subkultur einmal pro Woche oder wenn sie 80 abgedeckt - 90% der Fläche.
  2. SH-SY5Y Zellen Beschichtung für die Bildgebung
    1. Für TIRFM Experimenten PlatteZellen auf Glasabdeckungen. Beschäftigen Glasabdeckungen mit 0,17 ± 0,005 mm Dicke und einer 1,5255 ± 0,00015 Brechungsindex. Bevor Sie beginnen, bereiten Sie die Deckgläser wie folgt:
      1. Saubere Glasabdeckungen mit 90% Ethanol, O / N.
      2. Gründlich sie in destilliertem Wasser (drei Änderungen destilliertes Wasser). Chemische Glasabdeckungen in einem Trockenschrank.
      3. Platz erstreckt sich in Petrischalen aus Glas und sterilisieren im vorgeheizten Backofen bei 200 ° C für 3 Stunden.
    2. Der Tag vor der Transfektion, legen jedes Deckglas in einem 3,5 cm Petrischale, 1 ml Kulturmedium und bei 37 ° C in einem 5% CO 2 Inkubator.
    3. Trypsinieren Zellen wie in den Schritten 1.1.3 beschrieben - 1.1.5 Aussetzung des Zellpellets in 1 ml Vollmedium und zu zählen. Berechnen Sie das richtige Volumen der Zellsuspension in zu jeder Petrischale hinzufügen, um 3 x 10 5 Zellen / Vertiefung. Optimale Bedingungen für Zellwachstum und effiziente Transfektion wird diese Dichte erforderlich. Bei 37 ° Cin einer 5% CO 2 -Inkubator O / N.
  3. SH-SY5Ytransfection von Polyethylenimin (PEI)
    ANMERKUNG: Um synaptischen Vesikeln Dynamik visualisieren pCB6-Vektor, der synapto-pHluorin verwendet. Die synapto-pHluorin durch Fusion im Leseraster mit einem pH-empfindlichen Variante des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) 16 und der Vesikelmembran Synaptobrevin 2. Das Konstrukt wurde ausgiebig verwendet, um synaptische Vesikel Eigenschaften innerhalb Neuronen 9 untersuchen erzeugt.
    1. Vor dem Beginn der Transfektion machen 10 ml der folgenden Lösungen. Bewahren Sie die Lösungen maximale als 1 Monat.
      1. Machen Sie eine 150 mM NaCl-Lösung. Einstellen auf pH 5,5 mit 0,01 N HCl.
      2. Machen Sie eine PEI-Lösung bei 10% Polyethylenimin (PEI, 25 kDa linear) in 150 mM NaCl-Lösung. Der pH der Lösung steigt auf 8,8. Einstellen des pH auf 7,8 mit 0,01 N HCl.
    2. 24 h nach der Beschichtung, entfernen Sie das Medium und erfrischen mit 1,5 mlVollmedium. Halten der Zellen bei 37 ° C in einem 5% CO 2 -Inkubator.
    3. Unter laminaren Strömungs Biosicherheit Schrank in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, werden 3 ug Plasmid-DNA zu 25 & mgr; l von 150 mM NaCl-Lösung und 100 ul der PEI-Lösung pro 3,5 cm-Petrischale.
    4. Vortex für 10 sec, dann Inkubieren der DNA / PEI-Mischung für 30 min bei RT.
    5. Die DNA / PEI Mischung Vorsichtig in die Petrischale mit Deckgläser mit den Zellen und schütteln, um das Reagenz gleichmäßig verteilt in der Petrischale.
    6. Nach 4 Stunden ändern das Medium und Inkubation der Zellen O / N bei 37 ° C in einem 5% CO 2 Inkubator. Führen Imaging Experimente 24-48 h nach der Transfektion.

2. Cell Imaging von Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (TIRFM)

  1. Imaging-Setup
    1. Führen TIRF Bilderzeugung mit der in Figur 1 beschriebenen Aufbau. Es umfasst eine motorisierte invertiertenMikroskop (Figur 1, Einschub A), die Laserquelle (Figur 1, Einschub B) und der TIRF-Schieber (Figur 1, Einschub C). Erreichen Sie TIRFM Beleuchtung durch eine hohe numerische Apertur (NA 1,45 Alpha Plan-Fluar) 100X Öl, Immersionsobjektiv.
    2. Für TIRFM Beleuchtung, verwenden ein mit mehreren Leitungen (458/488/514 nm) 100 mW Argonionenlaser. Verwendung eines Monomode-Faser, führen das linear polarisierte Laserlicht in den Strahlengang, über den TIRF-Schieber. Legen Sie die TIRF-Schieber in die Leuchtfeldblendenebene des reflektierten Lichtstrahlengang.
      1. Für Weitfeldbeleuchtung, schließen Sie das Mikroskop mit einer herkömmlichen Quecksilber-Kurzbogenlampe HBO weißes Licht. Eine polarisationserhaltende Doppelprisma in dem Schieber sichert die gleichzeitige Kombination TIRF Beleuchtung und weißem Licht.
    3. Filtern Sie das Laserlicht mit einem Anregungsfilter (Bandbreite 488/10 nm) auf einer Filterscheibe, in den Laserpfad eingeführt montiert. Beschäftigeneine hohe Geschwindigkeit, softwaregesteuerte, Auslöser, um eine schnelle Regelung der Laserbeleuchtung ermöglichen. Für pHluorin Analyse, montieren ein Bandpass 525/50 nm Emissionsfilter. Digitalbilder (512 x 512 Bildpunkte) auf einer gekühlten Schnelle CCD-Kamera mit der Bild ProPlus Software.
  2. Das Erreichen TIRF-Beleuchtung (Bild 2)
    1. Schalten Sie den Laser, der Computer, die Kamera, das Filterrad und die Shutter-Controller; Dann warten Sie 20 Minuten vor dem Start des Experiments als die Laser benötigen, um sich aufzuwärmen und zu stabilisieren.
    2. Vor Bildgebung, machen die günstigen Volumen der folgenden Lösungen.
      1. Make 50 ml Krebs (KRH) Lösung bei 125 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,2 mM MgSO 4, 1,2 mM KH 2 PO 4, 25 mM 4- (2-Hydroxyethyl) piperazin-1-ethansulfonsäure (HEPES) (gepuffert pH 7,4), 2 mM CaCl 2, und 6 mM Glucose.
      2. Make 10 ml KCl-KRH-Lösung (pH 7,4) bei 80 mM NaCl, 50 mM KCl, 1,2 mM MgSO 4, 1,2 mM KH 2 PO 4, 25 mM HEPES (pH 7,4 gepuffert), 2 mM CaCl 2, und 6 mM Glucose.
    3. Glasabdeckung mit transfizierten Zellen und setzen Sie sie in das entsprechende Imaging-Kammer. Setzen Sie die Kammer und fügen Sie 500 ul von KRH-Lösung in der Mitte des Glases.
    4. Öl hinzufügen über das Ziel. Legen Sie die Imaging-Kammer auf der Bühne des Mikroskops und positionieren Sie das Ziel unter dem Deckglas. Positionieren Sie die Schutzabdeckung über der Probe.
    5. Im Epifluoreszenz-Modus, den Schwerpunkt auf das Deckglas (obere Oberfläche), und wählen Sie transfizierten Zellen in der Kammer Zentrums. Markieren Sie die Zellen, deren Fluoreszenzsignal eindeutig mit einer Belichtungszeit von unter 80 ms aufgezeichnet.
    6. Unter Software-Steuerung, um TIRF-Beleuchtung schaltet in den Live-Modus.
    7. Um die TIRF-Konfiguration eingestellt, überprüfen Sie die Position des Strahls, der aus dem Objektiv austritt, auf der Probenabdeckung (2B). Wenn der Strahl in der Mitte des T positionierter Objektivlinse (2A, links), ist ein Ort in der Mitte des TIRF Probenabdeckung sichtbar (2B, links) und die Zelle in Epifluoreszenz-Modus abgebildet (mehrere Fokusebenen, hohe Hintergrundfluoreszenz, 2C, links) .
    8. Um den Grenzwinkel zu erreichen, bewegen Sie den fokussierten Punkt in Y-Richtung (vorwärts oder rückwärts; 2B, Mitte) mit dem Winkel Einstellschraube am TIRF-Schieber (Abbildung 1C). Wenn der Strahl konvergiert auf der Probenebene in einem Winkel größer als dem kritischen Winkel (2A, rechts), der Punkt verschwindet, und eine gerade, dünne, konzentriert Linie zeigt sich in der Mitte der Probenabdeckung (2B, rechts).
    9. Zur Feinabstimmung der TIRF Winkels verwenden Sie den Zellprobe (2C). Beobachten der Fluoreszenzbild auf dem Video, in diesem Stadium, ist ein Epifluoreszenz ähnliches Bild immer noch sichtbar. Sanft, bewegen Sie die Schraube bis TIRF conBedingung erzielt: nur eine optische Ebene der Zelle im Fokus ist (dh der Plasmamembran in Kontakt mit dem Deckglas), führt dies zu einem flachen Bild mit hohem Kontrast (2C, rechts).
  3. Probenabbildung
    1. Stellen Sie den Single-Channel-Zeitraffer-Experiment. Zur Minimierung Bleichen, erfassen Sie das Bild mit niedrigen Belichtungszeit und hoher Verstärkung. Entsprechende Belichtungszeiten zwischen 40 bis 80 ms. Erwerben Sie Bilder mit einem 1 - 2 Hz Abtastfrequenz. Vesikel Kinetik besser gewürdigt Abtastung mit höherer Frequenz (10 Hz) sein. Die regelmäßige Zeit der Beobachtung ist in der Regel 2 min.
    2. Fügen Sie 500 ul von KRH-Lösung und Rekordzellen in TIRFM Modus. Dies ist der Ruhezustand. Speichern Sie die Zeit aufeinander folgenden Bildern.
    3. Konzentrieren Sie sich auf der gleichen Zelle und Rekord unter den gleichen Bedingungen von ruhenden (Laserleistung, Belichtungszeit, Rahmennummer). Nach fünf Bilder, fügen Sie 500 ul von KCl-KRH-Lösung und halten KCl in der Kammer.Dies ist der stimulierte Zustand; speichern Sie die Zeit aufeinander folgenden Bildern.

3. Bildanalyse und Datenverarbeitung

ANMERKUNG: Um Bilder zu analysieren, haben Makros im Labor entwickelt wurde, die auf bestehenden Funktionen der Bildanalyse-Software; ähnliche Makros sind online verfügbar (URL in der Tabelle der Materialien und Geräte zur Verfügung gestellt).

  1. Die Fluoreszenzintensität quantifiziert
    1. Verwenden Sie ein "Sequence Fluoreszenzintensität" Makro für Fluoreszenzintensität Quantifizierung in einer Region of Interest (ROI) des Bildes, im Laufe des Films.
    2. Öffnen Sie die zeitlich aufeinanderfolgenden Bildern. Zum Makro-Menü und wählen Sie "Sequence Fluoreszenzintensität. Im Fenster "Analyse" wird "wählen Sie den ROI".
    3. Wählen Sie eine der Auswahlwerkzeuge im Menü, um die ROI erstellen. Platzieren 3 ROIs in Bereichen der Zellmembran ohne Flecken (Hintergrund ROI). Beschäftigen this "Hintergrund ROI", um das Bleichen zu bewerten und die Schwelle für die Fusion Ereignisanalyse (3A) eingestellt.
  2. Photobleichen Korrektur und Schwellenwertbestimmung (3B)
    1. Um das Ausbleichen zu bewerten, öffnen Sie die Fluoreszenzintensität Reihen "Hintergrund ROIs" (Abbildung 3Ba). Normalisieren der Fluoreszenzintensitätswerte in jedem Rahmen in die Ausgangsintensitätswert (F0) (F / F0) (Abbildung 3Bb). Der Mittelwert der Werte.
    2. Markieren Sie die Durchschnittswerte und erstellen Sie ein Liniendiagramm mit den Diagrammmenüoptionen.
    3. Aus der Datenanalyse-Menü wählen Sie "Trendlinie", um den Plot-Analyse Dialog zu öffnen. Wählen Sie die Art der Regression. Stellen Sie "exponentiellen" Regression. Wählen Sie dann "Display Gleichung auf Diagramm". Im Grafik-Fenster, erscheint das Exponentialgleichung und die Parameterwerte werden automatisch zugewiesen, (Abbildung 3Bc
    4. Anwenden des exponentiellen Korrektur der Intensitätswerte in jedem Rahmen wie folgt:
      Fn (korrigiert) = Fn / exp (n * a)
      Fn = experimentellen Fluoreszenzintensität gemessen am Rahmen n; n = Anzahl der Rahmen; a = Bleichfaktor (Konstante der Rate der Intensitätsverlust durch Photobleaching zum Ausdruck bringen;   Abbildung 3Bd).
    5. Um den Grenzwert einzustellen, öffnen Sie eine normierte und korrigiert "Hintergrund ROI", Berechnung der durchschnittlichen Fluoreszenzsignal und dessen Standardabweichung (SD). Der Mittelwert plus 3 SD stellt die Schwelle (Abbildung 3BE). Verwenden Sie diese Schwelle für die Datenanalyse.
  3. Auswahl der Fusionsereignisse mit einem halbautomatischen Verfahren
    1. Öffnen Sie die zeitlich aufeinanderfolgenden Bildern mit Bildanalyse-Software. Tragen Sie eine Gauß-Filter auf den aktiven Bildsequenz.
    2. Analysieren Sie Bilder mit der "Zählen von Objekten" oder ein Makro, das die Auswahl erlaubteines Objekts, dessen Bildpunkte haben mittlere Fluoreszenz-Intensität in einem definierten Bereich. Stellen Sie die Intensität Bereich manuell mit Hilfe der Schwellenwertfunktion (gehen Sie auf die Bar-Menü, zu setzen Maßnahme → Schwelle den Bereich von Interesse hervorheben). Eine angemessene Schwelle von 30% gegenüber dem lokalen fluoreszierenden Hintergrundsignal.
    3. Anwenden eines Makros "Filter-Objekte", um nur die Objekte, die die folgenden Kriterien aus:
      1. Bewerben Bereiche Option (min und max einschließlich) für Aspekt. Aspekt berichtet das Verhältnis zwischen der Hauptachse und der Nebenachse der Ellipse entspricht dem Objekt. Aspect ist immer ≥1. Angemessene Werte min = 1, max = 3.
      2. Bewerben Bereiche für Durchmesser. Durchmesser zeigt die durchschnittliche Länge der Durchmesser gemessen bei zwei Grad-Intervallen Verbinden von zwei Konturpunkte und durch den Schwerpunkt des Gegenstandes. Stellen Sie den Bereich in Pixel (oder um, wenn mit einem kalibrierten System).
      3. Definieren Sie die optimale Reichweite in preliminary Experimente: Wählen Sie manuell die Punkte von Interesse und messen ihrem Durchmesser mit dem Grundstück Profilfunktion.
    4. Wählen Sie "Anzeigeobjekte": ausgewählte Objekte werden dem TIRFM Bild (4B) überlagert erscheinen.
    5. Umfassen in der Analyse nur die Punkte, die eine kurze (1-3 Frames) zeigen transiente Erhöhung der Fluoreszenzintensität, unmittelbar gefolgt von einem deutlichen Verlust des Signals (transient spots) gefolgt. Beschäftigen die Kreisauswahl um eine ROI etwa ein Punktdurchmesser radial um die ausgewählten Vesikel / Spots (experimentell ROIs) erstellen. Führen Sie diesen Schritt manuell.
    6. Mit den ausgewählten ROIs, die Berechnung der durchschnittlichen Fluoreszenzintensität jeder ROI innerhalb des Films.
  4. Datenanalyse (3C-D)
    1. Exportieren Sie den Zeitverlauf der Fluoreszenzänderungen in jedem "experimentellen ROI" in eine Tabellenkalkulation gemessen; (Abbildung 3DA). Normalisieren der Intensitätswert in jedem Rahmen in die Ausgangsfluoreszenzintensität (F / F0), (Abbildung 3dB).
    2. Anwenden des exponentiellen Korrektur der Intensitätswerte in jedem Rahmen, wie in Schritt 3.2.4 (Fig 3Dc) berichtet.
    3. Um die Gesamtzahl der Fusionsereignisse (Peak-Zahl), die Zeit jedes Fusion auftritt (Peakbreite) und die Amplitude der Fluoreszenz-Peak (Spitzenhöhe und AUC) berechnet gelten logische Funktionen mit Tabellenkalkulation oder Mathematik-Pakete. Ein Beispiel für eine Fusion Ereignisanalyse mit logischen Formeln ist in Abbildung 3Dd und 3De wiesen.
    4. Angenommen, die Zunahme der Fluoreszenzintensität der den Schwellenwert (durchschnittliche Hintergrundfluoreszenzintensität ± 3SD) als Vesikelfusion an die Plasmamembran und die resultierende Spitzen als Fusionsereignis.
    5. Berechnen der Peakbreite als Differenz zwischen dem letzten und dem ersten X-Wert jedes Peaks. Multiplizieren Sie diesen Wert für 1 / (Sampling-Frequenz). Betrachten Sie diesen Wert einist die Zeit der Fusion von Vesikeln und Haftung an der Plasmamembran vor Vesikel Wieder Versauerung und Recycling (Abbildung 3Dd).
    6. Berechnen der Gesamtzell-AUC als eine Summe von Werten über dem Schwellenwert. Betrachten Sie diesen Wert als Nettofluoreszenzänderung während der Aufnahmezeit aufgrund der spontanen (Urlaub) oder hervorgerufen (stimuliert) synaptische Aktivität.
    7. Berechnen der Peakhöhe als die Differenz zwischen der maximalen y-Wert jeder Spitze und dem Schwellenwert. Betrachten Sie diesen Wert als Hinweis auf die Fusionstyp (Einzel vs. gleichzeitige / fortlauf Fusion oder transiente vs. Vollfusion).

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Representative Results

Die beschriebenen TIRF Bildgebung und Datenanalyse-Verfahren sollen die Vesikel Dynamik in zellulären Systemen zu studieren. Diese Technik kann verwendet werden, um die Auswirkungen von Signalmolekülen und Medikamente auf Fusionsereignisse und Neurotransmitter-Vesikel Dynamik 17 zu bestimmen. Mit GFP-markierten Plasmamembranproteinen hat die TIRFM Analyse eingesetzt worden, um die konstitutive Handel mit GFP-markierten Glutamattransporter in Gliazellen und Epithelzellen 18,19 charakterisieren.

Um das Bildgebungsverfahren und Datenanalyse-Strategie berichtet validieren, werden Fusionsereignisse unter basalen aufgezeichnet und stimulierten Bedingungen (Kalium-induzierte Depolarisation), in SH-SY5Y Neuroblastomzellen mit synapto-pHluorin transfiziert. (Video 1, 2, jeweils). Zwei verschiedene Analysen durchgeführt: whole-cell (Abbildung 4) und Einzelbläschen Analysen (Abbildung 5).

Ganzzellanalyse meanahmen die Gesamtzahl der Fusionsereignisse in die Zelle und die resultierende Nettofluoreszenzänderungen durch Stimulation induzierte. In Abbildung 4 sind synapto-pHluorin transfizierten Zellen unter Ruhe aufgezeichnet und stimulierten Bedingungen (KCl-Stimulation), wobei dasselbe Versuchsprotokoll (Belichtung, Laserleistung, etc.). 4A zeigt, daß synapto-pHluorin akkumuliert in Fluoreszenz puncta auf die Streu Zellmembran. Wie in der Literatur beschrieben ist, ist auch ein schwaches Fluoreszenzsignal an der Plasmamembran 9 vorhanden sind; Dieses Signal ist nützlich, um Zellen zu identifizieren, die abgebildet werden. In 4B sind Flecken von der in der Papier (Abschnitt 3.3) beschriebenen automatischen Verfahren ausgewählt werden, um die TIRFM Bild in 4A. 4C berichtet lagert zeigt die normierten Fluoreszenzintensitätsprofile von ausgewählten Stellen unter Ruhebedingungen. Diese Profile zeigen die Anwesenheit von einzelnen Peaks mit ähnlicher Fluoreszenz intichte, die während der Aufzeichnung kommen zu unterschiedlichen Zeitpunkten und wahrscheinlich entsprechen Vesikel, die gelegentlich zu verschmelzen mit der Membran. 4D zeigt die Wirkungen von KCl-Stimulation. Wie erwartet, Depolarisation mit 25 mM KCl löst eine sofortige Antwort und mehrere sehr helle Leuchtstoff puncta an der Zellmembran erscheint (Video 2). Diese puncta entsprechen dem 'leicht lösbare "Pool von unterhalb der Plasmamembran vorhanden synaptischen Vesikeln. Die Zeitverlaufsanalyse von Fluoreszenzänderungen in Übereinstimmung mit einzelnen Spots gemessen zeigt das Vorhandensein von Spitzen, der variable Fluoreszenzintensität, die plötzlich nach dem Aufbringen der sekretorischen Stimulus (4D und 4F) angezeigt. Ergebnisse der Gesamtzellanalysen während der Zeit der Aufzeichnung werden in 4E-H gemeldet. KCl-Stimulation bewirkt eine rasche deutliche Steigerung der Anzahl der Fusionsereignisse (2,5 fache Erhöhung gegenüber Ruhebedingungen) (4E-F) und der resultierenden Fluoreszenzintensitätsänderungen (9,3 fache Erhöhung gegenüber Ruhebedingungen) (4G-H), was anzeigt, massiven Freisetzung von Neurotransmittern.

Einzel-Peak-Analyse erlaubt die Charakterisierung von Einzelfusionsereignisse (Abbildung 5). 5A zeigt die sequentielle Bilder einer repräsentativen "experimentellen ROI" unter Ruhebedingungen aufgezeichnet. Die besonderen Highlights einer synapto-pHluorin beschriftet Vesikel, die mit der Membran unter der TIRF-Zone verbindet. Nach zwei Frames, das Fluoreszenzsignal verschwindet, was wahrscheinlich ist, Vesikel Abruf und Wieder Versauerung. Die normalisierte Fluoreszenzprofil von dem interessierenden Bereich (5B) misst eine Erhöhung des Fluoreszenzsignals in Entsprechung zu der Stelle Aussehen im TIRF-Zone. Umgekehrt gibt die Fluoreszenz zu Basisniveau nach Ort Verschwinden (Einzelpeakdurchschnittliche Breite 1,91 ± 0,32 sec; durchschnittliche Peakhöhe 0,042 ± 0,005 normalisierte Fluoreszenzintensität). 5C und 5D zeigen die aufeinanderfolgenden Bildern einer "experimentellen ROI" unter KCl Anregung aufgenommen und die entsprechenden normierten Fluoreszenzintensität Profil. Beachten Sie die Erhöhung der Bewegung der Vesikel in die und aus der TIRF-Zone nach der KCl-Depolarisation.

40 Fusionsereignisse werden ausgewählt und in Ruhe analysiert und stimulierten Bedingungen. Es werden folgende Parameter gemessen: durchschnittliche Spitzen AUC, Spitzenbreite und -höhe. Peakbreite gibt die Zeit der Fusion von Vesikeln, Befestigung und Endozytose vor Wieder Versauerung und Recycling, 5G. Spitzenhöhe misst Veränderungen der Fluoreszenzintensität durch Vesikelfusion, 5F induziert. Veränderungen dieser Parameter weisen auf verschiedene Exozytose Mechanismen. Einzel-Peak-Analyse zeigt, dass KCl-Depolarisation ändert dieModus Vesikelfusion zur Plasmamembran. Tatsächlich erhöht die durchschnittliche Peakfläche (3,8 ± 0,2 fache Erhöhung gegenüber Ruhebedingungen, P <0,01 von gepaarten t-Test, 5E), Peakhöhe (2,75 ± 0,03 fachen Anstieg, P <0,01 von gepaarten t-Test, Abb 5F) und Breite (2,6 ± 0,5 fache Erhöhung, P <0,05 von gepaarten t-Test. 5G) unter stimulierten Bedingungen nachgewiesen. Mehrere Erklärungen für diesen Ergebnissen in Betracht gezogen werden. Eine Möglichkeit ist, dass KCl-Depolarisation verursacht die gleichzeitige und / oder sequentielle Fusion von Vesikeln in einem eingeschränkten Bereich der Zellen. Eine andere Erklärung ist, dass starke Depolarisation begünstigt Vollfusion gegenüber transienten Fusion. Unter basalen Bedingungen ist der vorherrschende Mechanismus eine transiente Fusions: ein Fusionsporenformen, den pH in dem Vesikel zu, und das Fluoreszenzsignal wird angezeigt, aber die Poren sofort schließt, so dass eine schnelle Wieder Ansäuerung und Recycling. Unterstimulierten Bedingungen, das Vesikel vollständig verschmilzt mit der Plasmamembran, der Peakhöhe und Breite Anstieg als Rückeroberung der Membranvesikel Komponenten wieder Versauerung und Recycling können einen längeren Zeitraum erfordern. Ein ähnliches Ergebnis wurde vor kurzem gewonnen Analyse synaptischer ähnlichen microvesicle Exozytose in endokrinen β-Zellen 20.

Figur 1
Abbildung 1. TIRF-Mikroskop einrichten. Schematische Darstellung und Bild (kleines Bild) des TIRF-Mikroskop-System. Die Einrichtung umfasst die Axio Observer Z1 motorisierte inversen Mikroskop (A), mit mehreren Leitungen 100 mW Argon-Ionen-Laser (B) und eine TIRF-Schieber (C). Das Laserlicht (grüne Linie) und Weißlicht (gelbe Linie) gezeigt. Die Zellen werden mit einem 100 × Ölimmersionsobjektiv abgebildet. Digitale Bilder werden auf einer gekühlten RetigaSRV Schnelle CCD Kamera erfasst. Die refLektor Modul, die Emission (488/10 nm) und die Anregung (Bandpass 525/50 nm) Filter, der Kollimator (L1) und die Konzentration (L2) Objektiv angegeben sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

Abbildung 2
Abbildung 2. Anreise TIRFM Konfiguration. (A) Schematische Darstellung der Comic-Ziel, das Deckglas, die Probe und die Position des Laserstrahls (blaue Linie). Left fährt der Anregungsstrahl direkt durch das Deckglas-Probe-Schnittstelle . Die Probe angeregt wird, wie in Epifluoreszenz-Modus. Center, den Anregungsstrahl bildet mit der Probe ein Einfallswinkel kleiner als der kritische Winkel ist, leuchtet das Licht die Probe in einem variablen Winkel. Rechts, einen incid bildet der Anregungsstrahlent Winkel größer als der Grenzwinkel der Licht abgeschlossen wird zurückreflektiert in die Objektivlinse und ein evaneszentes Feld breitet sich in der Probe. (B) Karikatur, die die Stichprobe einbezogenen und die Position des Anregungsstrahl (blauer Kreis), zeigt sich, dass von dem Ziel, während des Übergangs von Epifluoreszenz (links) in Richtung TIRF-Beleuchtung (rechts). (C) Epifluoreszenz (links) und TIRFM (rechts) Bild für synapto-pHluorin Fluoreszenz in einem Live-SH-SY5Y-Zellen. Maßstab:. 10 & mgr; m Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

Figur 3
Abbildung 3: Datenverarbeitung und Analyse. (A) TIRFM Bild synapto-pHluorin Fluoreszenz in einem Live-SH-SY5Y Zelle. Das grüne Quadrat zeigt eine repräsentative "Hintergrund ROI". Maßstabsbalken 10 um. (B) Vorgeschlagene Workflow für die Hintergrund ROI. Von oben nach unten:.... Ein Zeitverlauf der Fluoreszenzintensität Änderungen im Hintergrund ROI gemessen; b Normalisierung der Fluoreszenzänderungen in die Ausgangsfluoreszenzwert (F / F0), c Anwendung der exponentielle Regression; d Korrektur für Bleichen, e. Schwelle Bewertung (transparent graue Quadrat). (C) TIRFM Bild synapto-pHluorin Fluoreszenz in einem Live-SH-SY5Y Zellen. Das weiße Quadrat zeigt eine repräsentative "experimentellen ROI". Maßstabsbalken 10 um. (D) Vorgeschlagene Workflow für experimentelle ROI. Von oben nach unten:. A. Zeitverlauf der Fluoreszenzintensitätsänderungen; b Daten Normierung auf die ursprüngliche Fluoreszenzwert (F / F0), c. Korrektur;. de Anwendung von logischen Funktionen zu erkennen Peaknummer, AUC, Breite und Höhe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

4
Abbildung 4. Ganzzellanalyse. (A) TIRFM Bild synapto-pHluorin Fluoreszenz in einem Live-SH-SY5Y Zellen. Die Zellen werden unter Ruhe aufgezeichnet und stimuliert (25 mM KCl-Anwendung) Bedingungen (bei 1 Hz abgetastet). Maßstab: 10 um. (B) Flecken durch die automatische Verfahren identifiziert werden auf der TIRFM Bild gezeigt überlagert (grüne Farbe). (C) Der normalisierte Fluoreszenzintensitätsprofile (F / F0) von Flecken durch die automatische Prozedur der gesamten Zelle unter Ruhebedingungen ausgewählt. (D) Normalized Fluoreszenzintensitätsprofile (F / F0) an ausgewählten Stellen unter stimulierten Bedingungen. Die Bar über die Stränge gibt an KCl-Anwendung. (EH) Zahl der Veranstaltungen und Fluoreszenzintensität Veränderungen in der gesamten Zelle unter Ruhe (blau) und stimuliert (rot) Bedingungen aufgenommen. (E) von Histogrammen, die die Gesamtanzahl von Fusionsereignissen in der Zelle aufgezeichnet. (F) Die zeitliche Verteilung der Fusionsereignisse. (G) Histogramme repräsentieren Veränderungen pHluorin Fluoreszenzintensität in der whole-cell (Gesamt-AUC) erfolgt. (H) Kurven, die die kumulative pHluorin Fluoreszenzintensität als Funktion der Zeit. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

Abbildung 5
(A) SH-SY5Y-Zellen, synapto-pHluorin sind bei 1 Hz unter Ruhebedingungen abgebildet. Vertreter TIRFM aufeinander folgenden Bildern (alle 2 Sek) eines ROI, die eine synapto-pHluorin markierten Vesikel. ROI = 40 x 35 Pixel. (B) Der normalisierte Fluoreszenzprofil (F / F0) des in A gezeigten ROI. Der schwarze Stern zeigt ein Fusionsereignis, die Schwellenlinie gezeigt. (C) Das gleiche Zelle unter stimulierten Bedingungen (25 mM KCl) aufgenommen werden repräsentative TIRFM sequentielle Bilder einer ROI dargestellt. KCl Antrag vom gelben Stern gekennzeichnet. (D) Die normalisierte Fluoreszenzprofil der in C gezeigt Region unterstreicht die Ankunft (in) und das Verschwinden (out) von Vesikeln. Schwarz Sternchen zeigen Fusionsereignisse wird die Schwellenlinie gezeigt. (EG), Eigenschaften von Single-Vesikel Veranstaltungen unter Ruhe (blauer Balken) aufgezeichnet und stimuliert ( roter Balken) Bedingungen. n = 40 Fusionsereignisse. (E) links, Peakfläche (AUC) von hellblau angezeigt, rechts, Histogramme der durchschnittliche Peakflächen; ** P <0,01. (F) links, Peakhöhe (h) ist durch einen Doppelpfeil angedeutet, in der Mitte, Histogramme der durchschnittlichen Peakhöhe; ** P <0.01; rechts, Peakhöhe gibt den Schmelzmechanismus. Der Stern in der Karikatur zeigt synapto-pHluorin. (G) links, Peakbreite ist durch einen Doppelpfeil angedeutet, in der Mitte, Histogramme der mittlere Spitzenbreite; * P <0,05, rechts, gibt die Peakbreite, die Zeit Vesikel Exocytose Befestigung und Endozytose. Das Sterne-Farbe ist grün, wenn die synapto-pHluorin Fluoreszenz sichtbar und grau, wenn es abgeschaltet ist. Ist Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

ent "> Video 1. SH-SY5Y-Zellen, synapto-pHluorin sind unter Ruhebedingungen (bei ​​1 Hz abgetastet) aufgezeichnet. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen.

Video 2. SH-SY5Y-Zellen, synapto-pHluorin unter stimulierten Bedingungen (bei ​​1 Hz abgetastet) aufgezeichnet. KCl Perfusion angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen.

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Discussion

Dieser Beitrag stellt ein Protokoll für Bild und analysieren Vesikel Dynamik in sezernierenden Zellen, unter Verwendung von fluoreszierenden cDNA-kodierten Vektoren und TIRFM. Schlüsselelemente für eine erfolgreiche Bildgebung durch TIRFM sind die Auswahl des Zellmodell und Zelltransfektion mit genetisch codierte optische Anzeigen von Vesikel-Freisetzung und Recycling.

TIRFM ist ideal für wachsende Zellen haft auf eine Glasabdeckung und ausreichend eben, um eine stabile Darstellung von Membranen und Fusionsereignisse erlauben geeignet. Vesikel sollte idealerweise in der Zelle verteilt werden, so dass ihre Menschenhandel, Fusion und Endozytose können abgebildet und bei Single-Vesikel-Ebene quantifiziert werden. Leider haben Neuronen diese Kriterien nicht erfüllen: sie haben unregelmäßige Formen, Neuriten, die häufig übereinander kreuzen, und Vesikel-Fusion ist vorwiegend in kleinen Regionen (aktiven Zonen) konzentriert. In diesen Regionen ist sehr schwierig, Vesikel Dynamik TIRFM in Primärkulturen von Neuronen zu untersuchen.

21,22 unterschieden werden. Zellen sind so flach, um eine stabile Darstellung von Membranen und Fusionsereignisse in TIRFM Modus ermöglichen (insbesondere im Zellkörper) und Vesikel relativ verteilt. Schließlich können die Zellen einfach mit Plasmid, das GFP-markierten Proteine ​​oder pH-sensitive Protein-Tags mit verschiedenen Transfektionsreagenzien transfiziert werden. In diesem Protokoll PEI wurde zur Transfektiondie Zellen. Dieses Reagenz ist die Grundlage der meisten kommerziell verfügbaren Transfektionsagenzien und wirkt als sehr kostengünstig Transfektionsvektor allein. Eine Effizienz der Transfektion 20% wird unter Verwendung der oben berichteten Protokoll, das ausreichend für Single-Cell-Imaging ist zu erwarten.

Während die Verfügbarkeit der verschiedenen Transfektionsreagenzien und Verfahren macht Transfektion fast ein Standard-Verfahren in SH-SY5Y und auch in primären neuronalen Kulturen, muss darauf bei der Aufnahme, Analyse und Interpretation von Daten TIRFM genommen werden. TIRFM erleichtert die Sammlung von Informationen über die Prozesse, die an oder nahe der Membran in lebenden Zellen auftreten, und ermöglicht die Analyse der einzelnen molekularen Ereignisse durch Erkennung von Veränderungen in der Fluoreszenzsignal von markierten Proteinen, die in oder aus der abklingenden eingereicht bewegen abgeleitet. Es können jedoch mehrere Faktoren, die Fluoreszenzsignale in dieser Zone zu ändern, ohne notwendigerweise exo / endozytischen Ereignisse, und dies muss zu nehmenn berücksichtigt bei der Aufzeichnung und Analyse von Daten. Darunter befinden sich morphologische Veränderungen in der Zelle, besonders für das Flugzeug im Fokus unter den abklingenden Feldes und Fluorophor Modifikationen während der Aufnahme.

Morphologische Veränderungen

Die hohe Auflösung des TIRF-Technik beruht auf der Anregung der Fluorophore innerhalb des abklingenden Feldes, mit der Tiefe von 100 nm von der Glasschnittstelle 11. Dies ist eine sehr dünne Zone und unmerklich morphologische Änderungen sollen die Zellebene im Fokus ändern. Dies gilt insbesondere für Neuronen und Zellen, die verschiedene Prozesse darstellen, und zeigen eine starke Kräuselungen. Bei diesen Zellen ist die Membranfläche in Kontakt mit dem Deckglas während der Aufzeichnung unregelmäßig und schnell ändern kann, wodurch fehlerhafte Auswertung der Exocytose. Aus diesem Grund ist es wichtig, wenn möglich, um die zelluläre Modell der Untersuchung ausgewählt. Um Zell moveme begrenzennts kann nützlich zur Beschichtung von Glasdeckeln mit extrazellulären Matrixproteinen oder Poly-L-Lysin ist. Allerdings muss man bedenken, dass diese Substrate kann das Zellverhalten und Vesikel Dynamik ändern zu halten.

Andere mögliche Quellen von morphologischen Veränderungen während der Aufnahme sind Zellstimulation, Zugabe von Lösungen, und Temperaturänderungen. Impulse in der Lage, massiven Vesikel Release (dh KCl-Depolarisation) induzieren häufig zu Zellschrumpfung, die offensichtlich modifiziert das Zelloberfläche unter der TIRF-Zone. Es ist daher wichtig, die Art, Konzentration und Einwirkzeit des Stimulus in Vorversuchen genau auszuwählen.

Die einfache Einführung von Lösungen in das Bad mit einer Pipette, unabhängig von der Zusammensetzung, kann eine Modifikation der Zellmorphologie durch Scherbelastung verursachen. Um dieses Artefakt zu beheben ergänzen Medium vorzugsweise unter Verwendung eines Perfusionssystems, möglicherweise mit einer Vakuumpumpe verbunden ist, um Lärm zu reduzieren.

Fluorophor

Änderung der Fluoreszenzsignale kann auch bei der Aufzeichnung durch Änderung des Fluorophors. Das wichtigste ist Bleichen 23. Photobleichen der photoneninduzierten Zerfall eines Fluorophors. Es führt im allgemeinen zu einem dauerhaften Verlust der Fluoreszenz und Dimmen der beobachteten Probe über die Zeit. In TIRFM Fluorophore nur auf den Ursprung des evaneszenten Feldes geschlossen kann gebleicht werden und GFP-markierten Membranproteinen gebleicht, da sie in diesem Bereich befinden. Die Verhinderung des Verblassens von Fluoreszenzemissionsintensität ist sehr wichtig, um qualitativ hochwertige Bilder zu erhalten, erforderlich für die quantitative Fluoreszenzmikroskopie. Mit einem vernünftige Annäherung für ein gegebenes Molekül in einer konstanten Umgebung, hängt Bleichen auf die Zeit und den Zyklus der Einwirkung der Erregerquelle. In vielen Fällen folgt Bleichen einen einfachen exponentiellen Abfall-Funktion, die ihre Bewertung und ihre Korrektur erleichtert, indem Steuer Aufnahmen 23 macht. Verschiedene Korrekturformeln / Makros sind online verfügbar (siehe Tabelle von Materialien und Ausrüstungen); im Protokoll eine einfache exponential Funktion verwendet.

Es gibt mehrere Strategien zur Überwindung Bleichen. Eine gute Strategie ist die Photobleichung an der Quelle, beispielsweise um zu verhindern, unter Verwendung von Fluorophoren mit hoher Photostabilität. Leider jetzt, die Wahl der DNA-kodierten Proben ist noch begrenzt. , Die Photonenenergie des Eingangslichts und die Häufigkeit der Probenahme in diesem Fall Aktivitätsverlust durch Photobleaching können während der Bildübernahme minimiert werden verursacht, die Optimierung der Zeitspanne von Belichtung.

Bei der Verwendung von pH-empfindlichen Sonden ist eine weitere Quelle für Fluorophor Modifikation während der Aufzeichnung der pH-Verschiebung in dem Medium. Das Flüssigkeitsvolumen der Aufnahmekammer ist in der Regel sehr niedrig und Medikamentenapplikation kann Zell-Aktivität und den Stoffwechsel des pH des Mediums, insbesondere im kleinen Volumen zwischen der Zelle und der Oberfläche des Deckglases zu modifizieren. Dies wiederum ändert die pHluorin Fluoreszenzsignal, wodurch über / unter-Schätzung der Vesikel Wiederleasen. Zum Beispiel können starke Reizungen an einer calciumabhängigen Ansäuerung des Cytosols führen und gespiegelten Alkalisierung in den extrazellulären Raum, wodurch eine übertriebene Erhöhung des Fluoreszenzsignals 24.

Um dieses Problem zu vermeiden, verwenden Sie immer gepufferten Lösungen und möglichen pH-Änderungen, die der festgelegten Protokoll eingeführt, in Vorversuchen zu überwachen. Für eine genauere Schätzung der evozierten Vesikel-Freisetzung, bei der Analyse von Daten, die Überwachung der Fluoreszenz-Signal in einem Bereich der Zelloberfläche ohne Fusionsereignisse, und verwenden Sie Änderungen des Fluoreszenzsignals in dieser Region als Anpassungsfaktor.

Zusammenfassend wurde ein Verfahren zum Überwachen und Analysieren Vesikelfusion und Dynamik beschrieben. Diese Technik kann in verschiedenen Zelltypen (Neuronen und endokrinen Zellen) verwendet, um sichtbar zu machen und zu sezieren die verschiedenen Schritte des exo / Endozytose werden, um die Rolle der Proteine ​​und ihrer pathogeni enthüllenc-Mutanten in der Regulation der Vesikel Dynamik und die Wirkmechanismen von Medikamenten, die konstitutive und Exozytose aufzudecken.

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Acknowledgments

Die Autoren bedanken sich bei der Università degli Studi di Milano für die Unterstützung von Eliana Di Cairano (Post-Doktorandenstipendium) und Stefania Moretti (Promotionsstipendium) bestätigen. Diese Arbeit wurde von der University Research Program PUR zu CP unterstützt

Wir möchten Prof. Jeremy M. Henley, School of Biochemistry, University of Bristol, Großbritannien, danke ich für das pHluorin bauen und Dr. Francesco Dotti für die Unterstützung bei der Datenanalyse und Silvia Marsicano für die technische Unterstützung.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Axio Observer Z1 Zeiss 491912-9850-000 inverted microscope
Multiline Argon Laser Lasos 77 Lasos 00000-1312-752 multi-line (458/488/514 nm), 100 mW argon-ion laser
Laser TIRF slider Zeiss 423681-9901-000
100X Objective Zeiss 421190-9900-000 Oil, NA 1.45 Alpha-Plan
CCD Camera RetigaSRV Fast 1394 QImaging
LAMBDA 10-3 optical filter changer with SmartShutter Sutter Instrument Company
Software
Image ProPlus 6.3 Software Media Cybernetics spot selection, ROI selection, fluorescence intensity determination
Excel Microsoft photobleaching correction, whole-cell and single-vesicle analyses
GraphPad Prism 4.00 GraphPad Software, Inc. statistical analysis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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