बैक्टीरियल भूतल गतिशीलता assays के तैयार करना, इमेजिंग, और मात्रा का ठहराव

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Morales-Soto, N., Anyan, M. E., Mattingly, A. E., Madukoma, C. S., Harvey, C. W., Alber, M., Déziel, E., Kearns, D. B., Shrout, J. D. Preparation, Imaging, and Quantification of Bacterial Surface Motility Assays. J. Vis. Exp. (98), e52338, doi:10.3791/52338 (2015).

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Abstract

बैक्टीरियल सतह गतिशीलता, ऐसे रेंगनेवाले के रूप में, आमतौर पर विशिष्ट अगर की सांद्रता और मध्यम विकास में विशिष्ट पोषक तत्वों की कभी कभी शामिल किए जाने की जरूरत है कि थाली assays का उपयोग प्रयोगशाला में जांच की है। इस तरह स्पष्ट मीडिया और सतह के विकास की स्थिति की तैयारी बैक्टीरियल वृद्धि लेकिन पतली तरल फिल्मों के भीतर इन सतहों पर बैक्टीरिया के समन्वित गतिशीलता न सिर्फ अनुमति है कि अनुकूल परिस्थितियों प्रदान करने के लिए कार्य करता है। झुंड की थाली और अन्य सतह गतिशीलता थाली assays के reproducibility एक बड़ी चुनौती हो सकती है। विशेष रूप से केवल 0.4% की अगर पर्वतमाला -0.8% (WT / खंड), बहुत झुंड परख परिणाम को प्रभावित कर सकते प्रोटोकॉल या प्रयोगशाला वातावरण में मामूली बदलाव के भीतर गतिशीलता है कि प्रदर्शन में अधिक "समशीतोष्ण swarmers" के लिए। इन थाली assays के तरल ठोस हवा इंटरफेस में "wettability", या पानी की सामग्री, अक्सर नियंत्रित किया जा करने के लिए एक महत्वपूर्ण चर है। रेंगनेवाले आकलन करने में एक अतिरिक्त चुनौती ओ यों तो कैसे हैकिसी भी दो (या अधिक) के प्रयोगों के बीच bserved मतभेद। यहाँ तैयार करने और छवि झुंड assays के लिए विस्तार से एक बहुमुखी दो चरण प्रोटोकॉल हम। हम आमतौर पर झुंड परख मीडिया तैयारी और इन assays से डेटा की मात्रा का ठहराव के साथ जुड़े चुनौतियों नाकाम करने के लिए दिशा-निर्देशों में शामिल हैं। हम विशेष रूप से समय व्यतीत ऑप्टिकल इमेजिंग सक्षम करने के लिए हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP), luciferase (लक्स ओपेरोन) जैसे फ्लोरोसेंट या bioluminescent आनुवंशिक संवाददाताओं से व्यक्त कि बैक्टीरिया, या सेलुलर दाग का उपयोग कर हमारे विधि प्रदर्शित करता है। हम आगे ही प्रयोग में रेंगनेवाले प्रजातियों प्रतिस्पर्धा ट्रैक करने के लिए हमारे विधि की क्षमता को प्रदर्शित करता है।

Introduction

कई बैक्टीरिया आत्म प्रणोदन के विभिन्न साधनों का उपयोग सतहों पर चलते हैं। कुछ गतिशीलता phenotypes के अर्द्ध ठोस थाली परख रचना के साथ जुड़े तरल वातावरण से प्रभावित हैं कि थाली assays का उपयोग प्रयोगशाला में शोध किया जा सकता है। उपयोगी सतह गतिशीलता थाली assays के एक सबसेट आगे एक गैस चरण आम तौर पर कमरे में हवा को शामिल करना। स्थानीय पर्यावरण ठोस सतह, तरल पर्यावरण, और गैस वातावरण गुण: तदनुसार, किसी विशेष सतह गतिशीलता परख के परिणाम, तीन चरणों के इंटरफ़ेस से सावधान नियंत्रण की मांग।

इस तरह के एक तीन चरण परख में सबसे अधिक अध्ययन गतिशीलता मोड रेंगनेवाले के रूप में जाना जाता है। गतिशीलता रेंगनेवाले सतहों एक पर पतली तरल फिल्मों के माध्यम से अपने flagella द्वारा प्रेरित कर रहे हैं कि बैक्टीरियल कोशिकाओं के समन्वित समूह आंदोलन है। यह आमतौर पर 0.4% -0.8% से युक्त अर्द्ध ठोस थाली assays के (WT / खंड) का उपयोग प्रयोगशालाओं में अध्ययन किया है अगर एक। की सरणीमानव रोगज़नक़ों का पता लगाने और मानव मेजबान उपनिवेश स्थापित करने के लिए इस गतिशीलता व्यवहार शोषण। उदाहरण के लिए, प्राणी मिराबिलिस, मूत्रमार्ग को स्थानांतरित करने के लिए गतिशीलता रेंगनेवाले पहुंचने और मूत्राशय और गुर्दे दो बस्तियां उपयोग करता है। रेंगनेवाले गतिशीलता आम तौर पर गठन biofilm लिए एक अग्रदूत साबित कदम, कई मानव रोगज़नक़ों 3 में रोगजनन का प्रमुख कारण माना जाता है।

रेंगनेवाले फेनोटाइप बैक्टीरियल प्रजातियों के बीच अत्यधिक विविध है; प्रयोगात्मक सफलता और reproducibility दृढ़ता से इस तरह दूसरों को 3-5 के बीच में पोषक तत्वों की रचना, अगर प्रकार और संरचना, नसबंदी प्रोटोकॉल (जैसे, वाष्पदावी), अर्द्ध ठोस मीडिया इलाज, और परिवेश नमी (जैसे, मौसमी परिवर्तन), जैसे कारकों पर निर्भर हैं। सतह गतिशीलता प्रतिक्रियाओं की परिवर्तनशीलता इन अध्ययनों और महत्वपूर्ण प्रभाव मीडिया और लागू कर सकते हैं वातावरण में आई चुनौतियों पर जोर दिया। ऐसे स्यूडोमोनास के रूप में कुछ रेंगनेवाले प्रजातियों, रेंगनेवाले चुटकुला लिएमनाया फेनोटाइप और साथ झुंड विस्तार की दर काफी तीन अलग अलग होंगे, हालांकि ility, मीडिया रचनाओं की एक किस्म पर हो सकता है। संयुक्त, इन कारकों सतह गतिशीलता पढ़ाई बेहद चुनौतीपूर्ण बना सकते हैं। एक प्रयोगशाला के भीतर मौसमी परिवर्तनशीलता इन तीन चरण assays के प्रभावित कर सकते हैं: assays के सर्दियों के शुष्क हवा में गर्मियों की नम हवा में बेहतर और बदतर ढंग से काम कर सकते हैं। यहाँ हम सतह गतिशीलता थाली पढ़ाई जब प्रदर्शन सबसे उल्लेखनीय चुनौतियों में से कुछ को नाकाम करने के लिए सामान्य दिशा निर्देशों प्रस्तुत करते हैं।

कुछ सतह गतिशीलता के अध्ययन के लिए, विशिष्ट phenotypes के विकास के महान ब्याज की है। अधिकांश, लेकिन सभी नहीं, प्रकाशित अध्ययन पी के रेंगनेवाले जांच करने के लिए aeruginosa एक टीका केंद्र 3-9 से radiating tendrils या भग्न के गठन दिखा। पी के बीच मतभेद aeruginosa उपभेदों 5,8 प्रलेखित किया गया है, लेकिन उपस्थिति या tendrils के अभाव के बहुत specifi के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता हैसी मध्यम और प्रोटोकॉल इन झुंड गतिशीलता थाली assays के लिए इस्तेमाल किया। यहाँ हम पी के लिए ज़ुल्फ़ के गठन swarms को बढ़ावा देने के लिए कैसे पर विवरण शामिल aeruginosa। पी क्योंकि aeruginosa अभी कई रेंगनेवाले बैक्टीरिया की है, हम भी बेसिलस subtilis के रेंगनेवाले और Myxococcus ज़ेंथस की ग्लाइडिंग जांच करने के लिए हमारे विधि के लिए विवरण शामिल हैं। पी की तरह aeruginosa, बी पर वर्तमान शोध subtilis और एम ज़ेंथस शोधकर्ताओं के रूप में विषयों की एक सरणी sporulation, गतिशीलता, तनाव प्रतिक्रिया, और संक्रमणकालीन व्यवहार 1,10 के पहलुओं को विचार करने के लिए काम कर रहे हैं पर फैला होता है। रेंगनेवाले समूहों में इन कोशिकाओं के लिए विशिष्ट व्यवहार (एस) के पैटर्न और गतिशीलता यों के लिए एक आवश्यकता है।

भूतल गतिशीलता डाटा अधिग्रहण, विश्लेषण और व्याख्या बोझिल और गुणात्मक हो सकता है। हम क्षेत्र आकृति विज्ञान और एस झुंड के अलावा प्रदान करता है कि बैक्टीरियल swarms की विस्तृत स्थूल विश्लेषण के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित किया हैize (जैसे, व्यास), झुंड विस्तार दर और बैक्टीरियल या bioproduct घनत्व वितरण 7 के बारे में मात्रात्मक गतिशील जानकारी। इसके अलावा, इस विधि बैक्टीरियल बातचीत 8 के लिए एक व्यापक दृश्य प्राप्त करने के लिए उपलब्ध फ्लोरोसेंट प्रोटीन, luminescence, और रंगों का लाभ ले सकते हैं, साथ ही एक झुंड भीतर bioproducts के संश्लेषण (जैसे, पी aeruginosa 7,8 rhamnolipid) ट्रैक करने के लिए।

Protocol

1. झुंड परख मीडिया तैयारी और टीका 4,5,7,8,11

  1. मीडिया तैयारी
    नोट: नीचे वर्णित मध्यम रचना पी के लिए लागू है aeruginosa ज़ुल्फ़ गठन के अध्ययन करता है। पी के लिए 1 टेबल पर मीडिया विनिर्देशों कृपया देखें aeruginosa, बी subtilis, और एम ज़ेंथस सतह गतिशीलता assays के।
    1. एक चुंबकीय हलचल पट्टी के साथ सरगर्मी से फैब-माइनस की 200 मिलीलीटर (एनएच 4) 2 अतः 4 झुंड मध्यम (सामग्री तालिका), नोबल अगर की 0.9 ग्राम, और Casamino एसिड की 0.2 ग्राम (तालिका 1) मिलाएं। प्रयोगों के बीच स्थिरता में सुधार करने के लिए छोटे संस्करणों (100-300 मिलीलीटर) का प्रयोग करें।
    2. 22 मिनट, 121.1 डिग्री सेल्सियस के लोगों तक पहुंचाने के तापमान, और एक तेजी से उतारना विकल्प के एक जोखिम समय का उपयोग कर 200 मिलीलीटर अगर / मीडिया मिश्रण आटोक्लेव। आटोक्लेव सेटिंग्स उचित नसबंदी और अगर पिघलने की अनुमति है, लेकिन अगर caramelization कर पाएगा।
      नोट: नोबल अगर कारमेल होने का खतरा हैization; बैक्टीरियल गतिशीलता caramelized अगर पर बदल दिया है।
    3. नसबंदी चक्र को अंतिम रूप दिया गया है के तुरंत बाद, वाष्पीकरण द्वारा पानी की कमी को रोकने के लिए मीडिया की बोतल की टोपी बंद करें। हालांकि, तंग कैपिंग बोतल पर की तरह प्रभाव "सील वैक्यूम" एक पैदा कर सकता है कि ध्यान दें।
    4. कमरे के तापमान (आरटी) में सरगर्मी है, जबकि 50 डिग्री सेल्सियस के लिए मीडिया कूल और बाँझ 1.2 मीटर ग्लूकोज के 2 मिलीलीटर जोड़ें। वैकल्पिक रूप से, (अप करने के लिए 15 घंटा बाद में) का उपयोग करें, और संकेत के रूप में आगे बढ़ने के लिए तैयार है जब तक एक 60 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर या नहाने के पानी में मीडिया की जगह है। मीडिया में बुलबुले के गठन को रोकने के लिए, चुंबकीय हलचल पट्टी का उपयोग कर मिश्रण अच्छी तरह से; यहां तक ​​कि रेंगनेवाले रोकने जाएगा अगर की सतह पर बुलबुले।
      नोट: के रूप में दिखाया अन्य assays के लिए, इस कदम पर जरूरत के रूप में, इस तरह के अतिरिक्त पोषक तत्वों या रंगों के रूप में autoclaved नहीं किया जा सकता है कि गर्मी के प्रति संवेदनशील घटकों को जोड़ने (उदाहरण के लिए, 100 मिलीलीटर प्रति 8 μl Invitrogen Syto 63 डाई के अलावा छवि के लिए एम ज़ेंथस अगर पिघल representati मेंनीचे), परिणाम दिया है। कुछ रंगों के अलावा एक गैर-डाई नियंत्रण के खिलाफ जाँच की जानी चाहिए जो आधारभूत रेंगनेवाले व्यवहार को प्रभावित कर सकते हैं।
    5. एक प्रयोगशाला हुड में, विभाज्य 7.5 60 मिमी व्यास polystyrene पेट्री डिश प्रति बाँझ मीडिया के मिलीलीटर और एक परत में प्लेटों को बनाए रखने (खड़ी नहीं)। बड़ा रेंगनेवाले सतह, विभाज्य 100 मिमी व्यास पेट्री डिश प्रति मीडिया के 25 एमएल के लिए। यह भी एक क्षैतिज सतह पर बर्तन भरने के लिए महत्वपूर्ण है। सतह समतल किया जाता है अगर जाँच करने के लिए एक सांड की आंख के स्तर का प्रयोग करें।
      नोट: पी के लिए प्लेट प्रति एक विशिष्ट मीडिया मात्रा का उपयोग करते हुए aeruginosa assays के, स्थिरता और reproducibility में सुधार होगा। बी के लिए subtilis और एम विशिष्ट मात्रा aliquots के लिए तुलनीय ज़ेंथस assays के, हाथ डालने का कार्य पैदावार का परिणाम है।
  2. प्लेट इलाज
    1. छोटी प्लेट (60 मिमी) के लिए, 30 मिनट के लिए (पलकों के बिना यानी,) खुला हुड में (अर्द्ध ठोस और सूखी अतिरिक्त तरल करने के लिए सेट दोनों) पिघल अगर मध्यम इलाज करने के लिए अनुमति देते हैं। बड़ाप्लेट (100 मिमी) एक लंबे समय तक इलाज समय (चर्चा देखें) की आवश्यकता होती है।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, कुछ assays के कवर बेंच शीर्ष रातोंरात (20-24 घंटा) (यानी, पलकों पर) एक परत में (1 टेबल) पर इलाज करने के लिए प्लेटों की आवश्यकता हो सकती है। रेंगनेवाले दोनों अतिरिक्त और अपर्याप्त नमी के प्रति संवेदनशील है। किसी भी प्रयोगशाला की नमी, airflow के, और तापमान आप जीवाणु का इष्टतम रेंगनेवाले बढ़ावा देने के लिए इलाज थाली करने के लिए भिन्नता जरूरत हो सकती है।
    2. सुखाने की अवधि खत्म हो गया है के तुरंत बाद प्लेटों टीका लगाना। आगे उपयोग के लिए प्लेटों की दुकान नहीं है।
      1. 10 μl 0.50% का मिश्रण (खंड / खंड) हिगिंस निविड़ अंधकार काले भारत स्याही और बैक्टीरियल inoculum 11 के साथ एक परीक्षण प्लेट खोलना द्वारा "स्याही फैल परीक्षण" प्रदर्शन करना। स्याही / inoculum मिश्रण मीडिया की सतह पर (यानी छोटी बूंद फार्म बरकरार नहीं करता है) आसानी से फैलता है, तो मीडिया शुष्क करने के लिए अतिरिक्त समय की आवश्यकता होगी।
        नोट: नमी के लिए विशेष रूप से संवेदनशील हैं कि प्रजातियों (के लिए <उन्हें> उदाहरण के लिए, पी aeruginosa), प्लेटें पर्याप्त सूख रहे हैं, तो यह निर्धारित करने के लिए एक त्वरित "स्याही फैल परीक्षण" 11 प्रदर्शन करते हैं।
  3. झुंड परख टीका
    1. एक ताजा (<कमरे के तापमान पर छोड़ दिया है कि अगर 5 दिन पुराने) Lysogeny शोरबा (पौंड) थाली संस्कृति से एक अलग कॉलोनी के साथ शोरबा संस्कृति मीडिया (विवरण के लिए 1 टेबल देखें) के 6 मिलीलीटर टीका लगाना। 30 डिग्री सेल्सियस पर शोरबा संस्कृतियों रातोंरात (≤18 एचआर) सेते हैं या क्षैतिज मिलाते (240 आरपीएम) के साथ 37 डिग्री सेल्सियस।
    2. रातोंरात शोरबा संस्कृति के 1-5 μl के साथ, या "poking" से खोलना द्वारा झुंड प्लेटें टीका लगाना एक बाँझ दांत के साथ अगर लेने या तार टीका सुई।
      नोट: यह inoculum spattering की संभावना कम हो जाती है और झुंड सतह क्षेत्र के लिए अतिरिक्त नमी जोड़ने रोकता है क्योंकि हम बाद विधि पसंद करते हैं।
  4. झुंड परख ऊष्मायन
    1. सामान्य परख के लिए, 30 डिग्री पर झुंड परख प्लेटें सेतेसी या (बी subtilis के लिए या यहां तक कि 42 डिग्री सेल्सियस, 1 टेबल) 37 डिग्री सेल्सियस -यह जीवाणु विशिष्ट है। कि अधिक नमी ढक्कन, नहीं अगर पर संघनित ताकि ऊष्मायन के दौरान प्लेटें पलटना।
      नोट: तापमान phenotype के रूप में अच्छी तरह कैनेटीक्स को प्रभावित कर सकते हैं। पी के लिए aeruginosa swarms को 37 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन 30 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन की तुलना में तेजी से विकास और झुंड के विस्तार की ओर जाता है; हालांकि, इन swarms की आकृति विज्ञान अक्सर तापमान में इस बदलाव के साथ अलग है।
    2. समय चूक इमेजिंग के लिए, इमेजिंग स्टेशन (विवरण के लिए 1 टेबल देखें) में स्थानांतरित करने से पहले उचित तापमान पर झुंड प्लेटें सेते हैं।
      नोट: इस पूर्व इमेजिंग ऊष्मायन swarms को उनके विकास शुरू करने के लिए और या गतिशीलता रेंगनेवाले के लिए इष्टतम नहीं हो सकता है जो एक नए माहौल, के लिए ले जाया जा रहा है पहले स्थापित हो अनुमति देता है।

भूतल गतिशीलता Assays 7,8 2. Macroscopic इमेजिंग

<राजभाषा>
  • समय चूक इमेजिंग के लिए एक वाणिज्यिक vivo इमेजिंग स्टेशन के अंदर एक स्पष्ट इमेजिंग प्लेट पर पूर्व इमेजिंग ऊष्मायन अवधि जगह झुंड परख प्लेटों के बाद। छवि के लिए छह, 60 मिमी व्यास या चार, एक समय में 100 मिमी व्यास प्लेटें। कैमरा इमेजिंग विमान के नीचे से कब्जा छवियों के बाद से, ऑप्टिकल पथ 8 बाधित नहीं है कि इतनी प्लेटें पलटना। वैकल्पिक रूप से, प्रयोग की अवधि के लिए 30 डिग्री सेल्सियस या 37 डिग्री सेल्सियस (1 टेबल) पर सेते हैं, और प्लेट निर्धारित समय अंतराल पर इनक्यूबेटर से imaged किया जा हटा दें।
  • ईमानदार टीका मीडिया रखती है कि थाली समकक्ष के शीर्ष पर पेट्री डिश के lids रखें। इमेजिंग के दौरान अत्यधिक सुखाने को रोकने, और प्रयोग भर में नमी बनाए रखने के लिए एक और स्पष्ट ट्रे का उपयोग करते हुए पूरे सेट अप लगा देना करने के लिए पानी के साथ पेट्री डिश के lids भरें।
  • आईएम का उपयोग कर कमरे के तापमान पर आण्विक इमेजिंग का उपयोग (एमआई) सॉफ्टवेयर 12, चलाने परख (ओं)तालिका 2 में वर्णित सेटिंग्स उम्र बढ़ने की। समय चूक इमेजिंग के लिए, आवश्यक कदम और विशिष्टताओं के साथ एक प्रोटोकॉल की स्थापना की।
  • 3. डाटा प्रोसेसिंग और व्याख्या 7,8

    1. इमेज प्रोसेसिंग
      1. फ़ाइल> निर्यात या निर्यात एकाधिक> का चयन फ़ाइल (एस) के निर्यात करने के लिए और निर्यात स्थान: 16-बिट झगड़ा फ़ाइलों के रूप में बैच निर्यात छवियों के लिए मील का उपयोग करें सॉफ्टवेयर।
      2. एक एकल छवि को खोलने या एक समय चूक श्रृंखला आयात करने के लिए ImageJ का उपयोग करें:
        1. एक एकल छवि खोलें: फ़ाइल> ओपन
        2. आयात समय चूक छवि अनुक्रम: फ़ाइल> आयात अनुक्रम, और "संख्यानुसार क्रमबद्ध नाम" का चयन करें।
          1. बड़े समय चूक फ़ाइलों के लिए, उचित श्रेणियों (यानी, GFP, आरएफपी, आदि) में निर्यात छवियों ढेर "आयात अनुक्रम" विंडो में "आभासी स्टैक का प्रयोग करें" का चयन करें।
      3. यदि आवश्यक हो, 8-बिट फाइल करने के लिए 16-बिट फाइलों से छवियों को बदलने: छवि> प्रकार> 8 बिट
        नोट: कुछ ImageJ उपकरण 8-बिट छवियों की आवश्यकता होती है।
      4. एक छवि या समय चूक दृश्य के लिए तीव्रता संकेत उलटा होने की जरूरत है अगर निर्धारित करते हैं। (जैसे, fluorescently लेबल विकास) छवि में एक उज्ज्वल स्थान पर कर्सर रखें और ImageJ उपकरण पट्टी से संकेत तीव्रता "मान" ध्यान दें। फिर, थाली क्षेत्र के बाहर एक अंधेरे स्थान में कर्सर जगह है और संकेत तीव्रता ध्यान दें। अंधेरे स्थान के लिए संकेत तीव्रता उज्ज्वल स्थान के लिए तीव्रता से बड़ा है, तो छवि संकेत तीव्रता (substeps नीचे 1-2 का पालन करें) उलटा होने की जरूरत है।
        1. तीव्रता संकेतों उलटें: संपादित करें> उलटें
        2. छवि> देखने सारणी> उलटें lut के: खोज तालिका उलटें
      5. पृष्ठभूमि घटाना:> प्रक्रिया पृष्ठभूमि घटाना, और एक आधा एक छवि आयाम (की है कि एक पिक्सेल त्रिज्या के साथ एक "रोलिंग गेंद त्रिज्या" का उपयोग जैसे, एक 2000 एक्स 2000 पी के लिए 1000 पिक्सलixel छवि)।
      6. कृत्रिम रूप से एक छवि या समय चूक अनुक्रम का रंग: छवि> देखने सारणी, और सूची विकल्पों में से उपयुक्त रंग का चयन करें।
      7. दो या दो से अधिक चैनलों के साथ फिल्मों के लिए, विलय और पूर्व एक फिल्म (इमेज प्रोसेसिंग, चरण 8) के रूप में की बचत करने के लिए रंग संतुलन। खुला, एक साथ ImageJ में सभी छवि के ढेर छवियों को मर्ज करने के लिए, तो छवि> रंग> चैनल मर्ज का चयन करें, और एक रंग चैनल के लिए प्रत्येक ढेर आवंटित।
      8. > फ़ाइल के रूप में सहेजें, और इच्छित स्वरूप और विशिष्टताओं का चयन: AVI या QuickTime फिल्म के रूप में समय चूक अनुक्रम बचाओ।
    2. डेटा विश्लेषण
      1. बैक्टीरियल भूतल विकास क्षेत्र हासिल विस्तार दर यों
        1. ImageJ में ओपन छवि (ओं)
        2. से "सीधे" उपकरण के साथ एक परख थाली के बीच में एक लाइन ड्रा और इसकी लंबाई मापने, पिक्सल में थाली के व्यास की गणना करने के लिए: विश्लेषण> उपाय
        3. ImageJ में डिफ़ॉल्ट माप इकाई गड़बड़ी हैXel। पिछले चरण में प्राप्त पिक्सेल लंबाई से (एक 60 मिमी प्लेट के लिए उदाहरण के लिए, 60) परख थाली के व्यास विभाजित करके एक रूपांतरण कारक प्राप्त करते हैं।
        4. मिमी पिक्सेल से माप की इकाई को बदलें: छवि> गुण
          1. पिछले चरण में गणना रूपांतरण कारक के लिए "मिमी" के लिए "लंबाई की इकाई", और "पिक्सेल चौड़ाई", "पिक्सेल ऊंचाई", और "Voxel गहराई" बदलें। एकाधिक छवियों भर में इस रूपांतरण कारक बनाए रखने के लिए "ग्लोबल" बॉक्स का चयन करें।
            नोट: ImageJ बंद कर दिया और फिर से खोल, या एक छवि के दृश्य के क्षेत्र बदल गया है है (यानी, एक छवि एक से ज्यादा में तेजी से बढ़ी है), रूपांतरण कारक पुनर्गणना किया जाना चाहिए। वैकल्पिक रूप से, सभी पिक्सल में विश्लेषण करती है और फिर मिमी परिवर्तित करने के लिए करते हैं।
        5. हर फ्रेम के लिए, का पता लगाने और कहां का पता लगाने के लिए उपकरण पट्टी में "मुक्तहस्त चयन" उपकरण का उपयोग झुंड क्षेत्र को मापने> उपाय विश्लेषण: झुंड के tline और का उपयोग कर क्षेत्र को मापने। फ़ाइल> के रूप में सहेजें: यह माइक्रोसॉफ्ट एक्सेल या इसी तरह के कार्यक्रमों में आगे के विश्लेषण के लिए बचाया जा सकता है एक माप है कि लॉग उत्पन्न होगा
      2. बैक्टीरियल भूतल ग्रोथ तीव्रता हासिल भूतल वृद्धि दर यों
        1. पृष्ठभूमि (इमेज प्रोसेसिंग, चरण 5) घटाया जाता है एक बार, झुंड (डेटा विश्लेषण, चरण 1) की अधिकतम क्षेत्र का निर्धारण करने के अनुक्रम की अंतिम सीमा का उपयोग करें।
        2. बैक्टीरियल सतह विकास के चारों ओर एक बॉक्स आकर्षित करने के लिए उपकरण पट्टी से "ओवल" चयन उपकरण का प्रयोग करें।
        3. "ग्रे मूल्य मतलब"> सेट माप का विश्लेषण करें, और चुनें: का उपयोग कर बॉक्स में पिक्सल की तीव्रता माप का मतलब यह निर्धारित करें।
        4. विश्लेषण> उपाय: अनुक्रम का पहला फ्रेम पर करने के लिए जाना है, जबकि समय चूक अनुक्रम में प्रत्येक फ्रेम के लिए तीव्रता संकेत माप प्राप्त करने के लिए। इस एम आई में आगे के विश्लेषण के लिए बचाया जा सकता है एक माप है कि लॉग उत्पन्न होगाcrosoft एक्सेल या इसी तरह के कार्यक्रमों: फ़ाइल> के रूप में सहेजें
      3. पिछले अनुभाग (डेटा विश्लेषण, चरण 2) के लिए वैकल्पिक। सेटअप करने के लिए ImageJ मैक्रो प्लगइन का उपयोग करें और एक मैक्रो सतह विकास तीव्रता माप स्क्रिप्ट चलाएँ।
        1. सेटअप एक साथ कई फ्रेम का विश्लेषण करने के लिए एक स्वचालित माप स्क्रिप्ट: प्लगइन> नई> मैक्रो, और बॉक्स में प्रदान की स्क्रिप्ट (नीचे) पेस्ट और एक ImageJ मैक्रो पाठ फ़ाइल के रूप में बचाने के लिए: फ़ाइल> सहेजें, और "के अंतर्गत ImageJ आवेदन फ़ोल्डर को बचाने के मैक्रो को "।
          numberOfFrames = एन
          (i = 0; मैं numberOfFrames <; मैं ++) {
          ('उपाय') चलाते हैं;
          रन ('अगला स्लाइस [>]');
          }
          नोट: यहाँ चर "एन" तख्ते की एक अपरिभाषित संख्या के लिए है।
        2. पूर्व स्क्रिप्ट चलाने के लिए छवि अनुक्रम में तख्ते की संख्या को प्रतिबिंबित करने के लिए एक प्रयोग के लिए मैक्रो प्लगइन में "numberOfFrames" संपादित करें। का प्रयोग करें: प्लगइन> मैक्रो>संपादित करें, और प्रकार के अनुक्रम में फ्रेम की सही संख्या में और बचाने के लिए (फ़ाइल> सहेजें)।
        3. डेटा विश्लेषण-चरण 2 में substeps 1-3 पालन करें, और अनुक्रम का पहला फ्रेम पर है जबकि मैक्रो प्लगइन चलाने: प्लगइन> मैक्रो> चलाएँ। फ़ाइल> के रूप में सहेजें: यह माइक्रोसॉफ्ट एक्सेल या इसी तरह के कार्यक्रमों में आगे के विश्लेषण के लिए बचाया जा सकता है एक माप है कि लॉग उत्पन्न होगा

    Representative Results

    प्लेट तैयार करने में रूपांतर बहुत गतिशीलता रेंगनेवाले प्रभावित कर सकते हैं। पिघल अगर मध्यम के गिरने के बाद इलाज या सुखाने समय सतह गतिशीलता assays के लिए और समय पर बैक्टीरियल गतिशीलता पर पतली तरल फिल्म वर्तमान को प्रभावित करता है। पोषक तत्वों की संरचना में परिवर्तन भी कई बैक्टीरिया के लिए रेंगनेवाले प्रभावित करते हैं। चित्रा 1 ए भारत स्याही के प्रसार और बेसिलस subtilis का एक प्रारंभिक inoculum के प्रसार पर सुखाने के समय की एक छोटी अवधि के प्रभाव से पता चलता है 11। चित्रा 1 बी सुखाने समय और चित्रा 1C शो के प्रभाव से पता चलता है पी रेंगनेवाले द्वारा बाद में ज़ुल्फ़ विकास पर अमोनियम सल्फेट के प्रभाव [(एनएच 4) 2 अतः 4] aeruginosa 5।

    Quantifiable डेटा एकाधिक इमेजिंग रणनीतियों का उपयोग सतह गतिशीलता का समापन बिंदु छवियों से प्राप्त किया जा सकता है। दो आंकड़ा के लिए प्रतिनिधि सतह वृद्धि के परिणाम से पता चलता है बी subtilis रेंगनेवाले और उसके संबंधित bioluminescence छवि; और Myxococcus ज़ेंथस सतह विकास और SYTO के जुड़े लाल प्रतिदीप्ति छवि कोशिकाओं 64 से सना हुआ।

    सिर्फ निरीक्षण और अंत बिंदु परिणामों की इमेजिंग परे डाटा अधिग्रहण के विस्तार के 3 से 7 चित्रा। सतह से बढ़ बैक्टीरिया के लिए गतिशील व्यवहार (एस) के अध्ययन के लिए अनुमति देता है पी का एक उदाहरण से पता चलता है aeruginosa (GFP व्यक्त कोशिकाओं के लिए imaged) रेंगनेवाले और उसके संबंधित rhamnolipid उत्पादन पी के विस्तार की दर को दिखाने के लिए इन छवियों से डेटा का -इस मात्रा का ठहराव भी प्रदर्शित किया जाता है (नील लाल लिपिड दाग का उपयोग imaged) aeruginosa रेंगनेवाले। वीडियो 1 बी के एक समय चूक से पता चलता है subtilis रेंगनेवाले एक लक्स -expressing तनाव की luminescence का उपयोग imaged। वीडियो 2 8 पी का एक समय चूक से पता चलता है aeruginosa सैल्मोनेला एन्ट्रिका serovar ताकि (लाल व्यक्त लक्स)।

    चित्र 1
    चित्रा 1:। प्रभाव अगर सतह नमी पर (ए) अगर समय सुखाने की परख परिणाम को प्रभावित और बी के लिए inoculum के प्रसार कि सतह गतिशीलता परख तैयारी में कारकों के उदाहरण subtilis (रेफरी 8) पी पर, (बी) अगर समय सुखाने aeruginosa, और (सी) उपस्थिति या पी पर अमोनियम सल्फेट की अनुपस्थिति (अनुमति के साथ रेफरी 5 से पुनर्प्रकाशित) रेंगनेवाले aeruginosa रेंगनेवाले और ज़ुल्फ़ गठन।

    चित्र 2
    चित्रा 2: alternati(ए) के पी दिखा एक Bruker इमेजिंग स्टेशन (बाएं) एक कैमरे की ओर छवि से। साइड और Bruker छवि (दाएं) का उपयोग कर जीवाणुओं की इमेजिंग सतह विकास और गतिशीलता के लिए दृष्टिकोण ve aeruginosa व्यक्त GFP-imaged, हरी प्रतिदीप्ति सेटिंग्स का उपयोग (बी) बी SYTO के साथ दाग लक्स bioluminescence रिपोर्टर-imaged Luminescence सेटिंग्स का उपयोग कर, और (सी) एम ज़ेंथस व्यक्त subtilis लाल प्रतिदीप्ति द्वितीय सेटिंग्स का उपयोग कर 64-imaged। विवरण स्थापना के लिए 2 टेबल देखें।

    चित्र तीन
    चित्रा 3:। एक सतह गतिशीलता परख के गुणात्मक और मात्रात्मक विश्लेषण सेल घनत्व वितरण की (ए) के समय चूक विश्लेषण, rhamnolipid उत्पादन (नील लाल लिपिड दाग लाल प्रतिदीप्ति का उपयोग imagedमैं सेटिंग्स; एक पी की सेल घनत्व वितरण छवियों से विस्तार की दर के पैमाने बार = 15 मिमी), और (बी) मात्रा का ठहराव aeruginosa झुंड। (अनुमति के साथ रेफरी 6 से पुनर्प्रकाशित।)

    वीडियो 1। एक बी के समय चूक इमेजिंग subtilis झुंड। बी subtilis लक्स व्यक्त और luminescence सेटिंग्स का उपयोग कर दर्ज की गई। विवरण स्थापना के लिए 2 टेबल देखें।

    वीडियो 2। interspecies प्रतियोगिता समय चूक इमेजिंग द्वारा visualized। पी के swarms aeruginosa (हरी; GFP व्यक्त और हरी प्रतिदीप्ति सेटिंग्स का उपयोग कर दर्ज की गई) और एस enterica serovar ताकि (लाल; एक्सप्रेशंसलक्स गाना और) Luminescence सेटिंग्स का उपयोग कर दर्ज की गई। विवरण स्थापना के लिए 2 टेबल देखें। (रेफरी 7 से अनुमति के साथ पुनर्मुद्रण।)

    पी aeruginosa पी aeruginosa ज़ुल्फ़ गठन पढ़ाई बी subtilis एम ज़ेंथस
    रातों रात शोरबा संस्कृति मीडिया फैब प्लस 30 मिमी ग्लूकोज फैब प्लस 30 मिमी ग्लूकोज LB सीटीटी
    रातों रात शोरबा संस्कृति ऊष्मायन तापमान 37 डिग्री सेल्सियस 37 डिग्री सेल्सियस 37 डिग्री सेल्सियस 30 डिग्री सेल्सियस पर 30 घंटा
    झुंड मीडिया फैब फैब ऋण (एनएच 4) 2 अतः 4 2% (WT / खंड) पौंड सीटीटी
    झुंड मीडिया: अतिरिक्त घटकों 12 मिमी ग्लूकोज एक 10% (WT / खंड) CAA से, 12 मिमी ग्लूकोज एक N / A SYTO® 64 एक
    अग्रवाल प्रकार अग्रवाल, नोबल अग्रवाल, नोबल दानेदार अगर अग्रवाल, नोबल Affymetrix
    अग्रवाल एकाग्रता (WT / खंड) 0.45% 0.45% 0.60% 1.50%
    झुंड थाली आकार 60 मिमी 60 मिमी 100 मिमी 150 मिमी
    प्लेट प्रति मीडिया की मात्रा 7.5 मिलीलीटर 7.5 मिलीलीटर हाथ डाला हाथ डाला
    झुंड मीडिया सेटिंग / सुखाने विधि हूड; प्लेटों का पर्दाफाश हूड; प्लेटों का पर्दाफाश Benchtop; प्लेटों को कवर Benchtop; प्लेटों को कवर
    झुंड मीडिया सेटिंग / सुखाने समय 30 मिनट 30 मिनट रातों रात (20 -24 एचआर) रातों रात (20 -24 एचआर)
    झुंड परख ऊष्मायन तापमान 30 या 37 डिग्री सेल्सियस 30 डिग्री सेल्सियस 37 डिग्री सेल्सियस 30 डिग्री सेल्सियस
    समय चूक इमेजिंग के लिए ऊष्मायन कम से कम 4 घंटे के लिए 30 डिग्री सेल्सियस कम से कम 4 घंटे के लिए 30 डिग्री सेल्सियस 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस 12 घंटा के लिए आरटी
    समय चूक पर कब्जा लंबाई 24 घंटा 24 घंटा 10 घंटा 66 घंटा
    समय चूक सेटिंग एक फ्रेम / 10 मिनट एक फ्रेम / 10 मिनट एक फ्रेम / 6 मिनट एक फ्रेम / 10 मिनट
    एक वाष्पदावी के बाद जोड़ा गया।

    तालिका 1:। भूतल गतिशीलता परख तैयारी के लिए निर्दिष्टीकरण सतह शामिलपी के लिए गतिशीलता परख तैयारी विनिर्देशों aeruginosa, बी subtilis, और एम ज़ेंथस।

    संकेत हरी प्रतिदीप्ति लाल प्रतिदीप्ति मैं लाल प्रतिदीप्ति द्वितीय Luminescence
    प्रोटीन या डाई हरी प्रतिदीप्ति प्रोटीन (GFP) mCherry प्रोटीन या नील लाल rhamnolipid दाग SYTO® 64 लक्स ओपेरोन से luciferase
    उत्तेजना तरंगदैर्ध्य (एनएम) 480 ± 10 540 ± 10 590 ± 10 बंद
    उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य (एनएम) 535 ± 17.5 600 ± 17.5 670 ± 17.5 कोई फिल्टर नहीं
    एक्सपोजर समय (एसईसी) 30 60 60 240
    एफ रोक 4.0 4.0 2.5 1 1
    FOV (मिमी) 190 190 140 120
    फोकल हवाई जहाज़ (मिमी) 27.5 27.5 12.2 4
    Binning (पिक्सेल) कोई नहीं 2 एक्स 2 कोई नहीं 8 एक्स 8

    तालिका 2: इमेजिंग विशिष्टता लाल और हरे रंग प्रतिदीप्ति के लिए Bruker इमेजिंग स्टेशन विनिर्देशों, और बैक्टीरियल सतह विकास की luminescence इमेजिंग।।

    Discussion

    झुंड assays के ऐसे नमी और उपलब्ध पोषक तत्वों के रूप में पर्यावरणीय कारकों, के लिए अत्यधिक संवेदनशील होते हैं के रूप में एक प्रयोगशाला में प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य रेंगनेवाले हासिल करने, चुनौतीपूर्ण हो सकता है। एक सतह गतिशीलता थाली परख का सबसे महत्वपूर्ण पहलू अगर सतह पर नमी है। पहले टीका करने के लिए, झुंड मीडिया गतिशीलता 5 रेंगनेवाले को बाधित करने के रूप में सतह तरल भर में तैराकी से बैक्टीरियल कोशिकाओं को रोकने के लिए पर्याप्त सूखा, लेकिन ऐसा सूखा नहीं होना चाहिए। ऊष्मायन एक पर्याप्त आर्द्र वातावरण में जगह ले जाना चाहिए: बहुत ज्यादा नमी कृत्रिम या artifactual सतह प्रसार करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, जबकि बहुत कम नमी, ऊष्मायन के दौरान परख बाहर सुखाने में परिणाम कर सकते हैं। एक आर्द्रता नियंत्रित इनक्यूबेटर के हाथ में है, जब तक कि इनक्यूबेटर और प्रयोगशाला आर्द्रता नाटकीय रूप से भिन्न हो सकते हैं। नतीजतन, इनक्यूबेटर के भीतर एक अतिरिक्त पानी जलाशय, एक humidifier, या एक dehumidifier relat रखते हुए सुखाने या अधिक नमी के संचय पर रोकने के लिए आवश्यक हो सकता है80% के पास Ive आर्द्रता। मौसमी नमी परिवर्तन महत्वपूर्ण हैं, तो यह आदर्श नमी बनाए रखने के चुनौतीपूर्ण साबित हो सकता है। यदि यह मामला है, झुंड परख प्रोटोकॉल आर्द्रता में मौसमी बदलाव के लिए खाते में कुछ समायोजन की आवश्यकता होगी। हम झुंड मीडिया सुखाने समय संशोधित मौसमी आर्द्रता में परिवर्तन के लिए समायोजित करने के लिए सबसे आसान तरीका यह है कि मिल गया है। निरंतर नमी की निगरानी, ​​दोनों के अंदर और इनक्यूबेटर के बाहर की सिफारिश की है। इसके अलावा, यह शोधकर्ताओं ने इन assays के reproducibility प्रभावित कर सकता है उनके उपकरणों, इन्क्यूबेटरों, आदि तराजू, तापमान, मात्रा के रूप में मामूली त्रुटियों या मीडिया घटकों की मात्रा जांचना और मान्य की सिफारिश की है।

    यह भी परख में इस्तेमाल की थाली के आकार और प्रकार की थाली नमी प्रभावित है, और इस प्रकार रेंगनेवाले कर सकते हैं कि ध्यान दिया जाना चाहिए। वायुरोधी प्लेटें अधिक नमी है, इस प्रकार उत्साहजनक तैराकी गतिशीलता बंद वेंट नहीं है। इसके विपरीत, खुला का सामना करना पड़ा प्लेटें बहुत अधिक नमी से बचने के लिए अनुमति देते हैं। एक पेट्री डिशयह तरल का निर्माण रोकने के लिए पर्याप्त अतिरिक्त नमी बंद vents क्योंकि एक आदर्श वातावरण प्रदान करता है, लेकिन बाहर सुखाने से मीडिया को रोकने के लिए पर्याप्त नमी बरकरार रखती है। इस विधि को उच्च गुणवत्ता इमेजिंग के लिए अनुमति देता है कि एक सतह गतिशीलता परख प्रोटोकॉल का विवरण। अगर मीडिया के 7.5 मिलीलीटर के साथ भर रहे हैं इमेजिंग 60 मिमी व्यास व्यंजनों के लिए स्पष्ट अगर रखने के लिए। विस्तृत इमेजिंग की आवश्यकता नहीं है, तो 20 मिलीलीटर अप करने के लिए संस्करणों भी प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम दे सकता है।

    रेंगनेवाले गतिशीलता अगर सांद्रता की एक विस्तृत सरणी पर प्राप्त किया जा सकता है, रेंगनेवाले के लिए आवश्यक अगर की इष्टतम रेंज प्रजातियों पर निर्भर करता है। कुल मिलाकर, उच्चतर अगर सांद्रता गतिशीलता रेंगनेवाले रोकना, और फलस्वरूप आवश्यक समय एक छवि तैयार झुंड बढ़ जाती है निर्माण करने के लिए पी। , लेकिन हम इष्टतम रेंगनेवाले एक बहुत संकरा रेंज (0.4-0.5%) में होता है कि लगता है% 1 0.4-0.7 के बीच aeruginosa आम तौर पर अगर सांद्रता पर swarms। ऐसे बी के रूप में दूसरों को, subtilis और एस आंतों का1.5% अगर 10 पर एक 0.6% अगर में झुंड, और विब्रियो parahaemolyticus। आवश्यक अगर एकाग्रता भी अगर के प्रकार और ब्रांड द्वारा निर्धारित किया जाता है। उच्च शुद्धता agars, नोबल अगर पसंद है, दृढ़ता से पी में रेंगनेवाले बढ़ाने 13,14 अगर दानेदार अधिक aeruginosa और पसंद कर रहे हैं। हालांकि, अगर की इन शुद्ध संस्करण भी आटोक्लेव नसबंदी चक्र के दौरान caramelization से ग्रस्त हैं; साधन पर निर्भर करता है, एक छोटा / संशोधित नसबंदी अनुक्रम नोबल अगर का उपयोग कर झुंड मीडिया तैयार करने के लिए आवश्यक हो सकता है (शायद लंबे समय तक गर्मी प्रदर्शन को रोकने के निकास चक्र में परिवर्तन करने के लिए)।

    मीडिया रचना भी मनाया झुंड phenotype के तीन में एक भूमिका निभाता है। पी aeruginosa रेंगनेवाले गतिशीलता पढ़ाई आम तौर पर कम से कम पोषक तत्व मीडिया का उपयोग किया जाता है। हम फैब पसंद करते मध्यम 4,8 (सामग्री तालिका), लेकिन इस तरह के M9, पौंड, या इन आम मीडिया को मामूली बदलाव के रूप में अन्य मीडिया,सफलतापूर्वक 9,15,16 इस्तेमाल किया गया है। ज़ुल्फ़ गठन सबसे अच्छा कार्बन स्रोत और casamino एसिड (सीएए) के रूप में ग्लूकोज के साथ पूरक फैब कम से कम मध्यम पर हासिल की है, लेकिन एक अतिरिक्त नाइट्रोजन स्रोत (यानी, (एनएच 4) 2 अतः 4) 6,13 बिना। ज़ुल्फ़ गठन या आकृति विज्ञान के अध्ययन का मुख्य फोकस नहीं है, तो फैब कम से कम मध्यम (सामग्री तालिका, तालिका 1) विशिष्ट कार्बन स्रोतों और / या अतिरिक्त पोषक तत्वों के प्रभाव में विस्तार से अध्ययन किया जा सकता है, ताकि CAA से रहित सिफारिश की है। ऐसे बी के रूप में अन्य प्रजातियों, subtilis (यहाँ प्रस्तुत), पौंड और दानेदार अगर पर रेंगनेवाले में सक्षम बहुमुखी swarmers, कर रहे हैं। इन प्रजातियों में एक पूर्ण झुंड विकसित करने के लिए केवल ~ 10 घंटा की आवश्यकता होती है, आसानी से झुंड। इस व्रत रेंगनेवाले दर संभावित मुश्किल झुंड की प्रगति निम्नलिखित बनाता है, लेकिन हमारे प्रोटोकॉल बहुत संभव पर नज़र रखने के लिए इस तरह बना देता है। झुंड समय चूक इमेजिंग प्रदर्शन करने की क्षमता एक substan प्रदान करता हैTiAl विशेष रूप से इस तरह के शौकीन चावला swarmers से, झुंड डाटा अधिग्रहण में आसानी।

    हम निष्पादन और बैक्टीरियल सतह गतिशीलता अनुसंधान के reproducibility बढ़ाने के उद्देश्य से एक मजबूत, व्यापक, दो चरण प्रोटोकॉल और दिशा निर्देशों को लागू करने और मुख्य रूप से कशाभ की मध्यस्थता रेंगनेवाले जांच करने के लिए महत्वपूर्ण पहलुओं पर जोर दिया है। इस झुंड परख प्रोटोकॉल के भीतर और अनुसंधान समूहों के बीच अधिक से अधिक स्थिरता और reproducibility के लिए प्रदान करने के लिए मीडिया संरचना और सतह गतिशीलता प्लेटों की हैंडलिंग के महत्वपूर्ण पहलुओं का विवरण। यह अलग शोध अध्ययनों के बीच तुलना के आधार में सुधार होगा। इसके अलावा, प्रस्तुत दृष्टिकोण और प्रोटोकॉल जैसे कारकों अपने काम और उदाहरण के लिए, अगर में छोटे परिवर्तन को प्रभावित कैसे 4,5 रेंगनेवाले (संभव समाधान उपलब्ध कराने को प्रभावित पता है कि शोधकर्ताओं बनाकर पर्यावरण बदलाव के लिए रेंगनेवाले और सतह गतिशीलता पर शोध कम अतिसंवेदनशील बनाने के लिए साधन प्रदान करता है )। इसके अलावा, प्रोटोकॉल के लिए प्रदान कीपहले से unquantifiable थे कि बैक्टीरियल सतह विकास के कई विशेषताओं को मापने के लिए एक अवसर प्रदान करता है, रेंगनेवाले के macroscopic पहलुओं यों।

    हम इस प्रोटोकॉल के विकास में सभी सतह गतिशील बैक्टीरिया की जांच नहीं की है। जैसे, यह प्रोटोकॉल संशोधनों यहाँ प्रस्तुत नहीं प्रजातियों के लिए आवश्यक हो जाएगा कि उम्मीद है। इस प्रोटोकॉल की दक्षता में कार्यरत उपकरण और सामग्री के निहित सीमाओं के द्वारा ही सीमित है। तापमान नियंत्रण उपकरणों की सुविधा नहीं है क्योंकि उदाहरण के लिए, तापमान संबंधित अध्ययन, के रूप में अभी तक Bruker इमेजिंग स्टेशन के साथ संभव नहीं हैं। इसके अलावा, (rhamnolipids दाग ​​ऐसे नील लाल के रूप में) रंगों के उपयोग की गतिज और एकाग्रता सीमाओं 8 हो सकता है। इस तकनीक को दृढ़ता से प्रोसेसिंग और डिजिटल छवियों के विश्लेषण पर निर्भर करता है; डेटा विश्लेषण के सुधार स्वचालन (जैसे, अतिरिक्त मैक्रो ImageJ में स्क्रिप्ट समारोह का उपयोग) के विश्लेषण के लिए आवश्यक समय को कम करेगाऔर डेटा की उपयोगिता का विस्तार करें। अंत में, इमेजिंग प्रोटोकॉल की मजबूती की वजह से, भविष्य के अनुप्रयोगों पर्यावरण और रोगजनक बैक्टीरिया द्वारा उपनिवेश सतहों के लिए और अधिक प्रासंगिक हैं कि कम वर्दी विकास सतहों की जांच करने के लिए इस तकनीक के विस्तार के उद्देश्य होना चाहिए।

    Disclosures

    इस लेख के लिए प्रकाशन फीस आंशिक रूप से Bruker निगम द्वारा प्रायोजित किया गया था।

    Acknowledgments

    (; एमए और जेडीएस को R01GM100470 और 1R01GM095959-01A1) और एनआईएच अनुदान # UL1 TR000006 द्वारा वित्त पोषित में भाग इंडियाना नैदानिक ​​और translational विज्ञान संस्थान से एक कोर सुविधा अनुदान (; इस काम के लिए आंशिक समर्थन स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान द्वारा प्रदान किया गया था करने के लिए जेडीएस)।

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Reagentsa
    FAB Minimal Media: Prepare every ~4 weeks. Top to 1 L with nanopure H2O.
    (NH4)2SO4 Sigma A4418 2 g.
    Not used in P. aeruginosa tendril formation studies.
    Na2HPO4 x 7H2O Sigma-Aldrich S9390 9 g
    KH2PO Sigma P5655 3 g
    NaCl BDH BDH8014 3 g
    MgCl2 x 6H2O solution (198 g/L) Fisher Scientific M33 1 ml
    CaCl2 x 2H2O solution (14 g/L) Fisher Scientific C79 1 ml
    Trace metal solution (see below) n/a n/a 1 ml
    Trace Metal Solution: Top to 1 L with nanopure H2O. Maintain in a glass bottle, stirring and covered with foil.
    CaSO4 x 2H2O Sigma-Aldrich 255548 200 mg
    MnSO4 x H2O Sigma-Aldrich M7634 20 mg
    CuSO4 x 5H2O Fisher Scientific C493 20 mg
    ZnSO4 x 7H2O Sigma-Aldrich Z4750 20 mg
    CoSO4 x 7H2O Sigma-Aldrich C6768 10 mg
    NaMoO4 x 2H2O Sigma S6646 10 mg
    H3BO3 Fisher Scientific A74 5 mg
    FeSO4 x 7H2O Sigma-Aldrich F7002 200 mg
    CTT Media: Prepare as needed. Top to 100 ml with nanopure H2O.
    Tris-HCl, 1 M solution (adjust to pH 8.0) Amresco 0234 1 ml.
    Prepare a 1 M stock solution in nano pure H2O. Adjust pH to 8.0 and filter sterilize (0.2 μm pore).
    K2HPO4, 1 M solution (adjust to pH 7.6) Sigma-Aldrich P3786 0.1 ml.
    Prepare a 1 M stock solution in nano pure H2O. Adjust pH to 7.6 and filter sterilize (0.2 μm pore).
    MgSO4 solution Fisher Scientific M65 0.8 ml.
    Prepare a 1 M stock solution in nano pure H2O. Filter sterilize (0.2 μm pore).
    Casitone BD Diagnostics 225930 1 g
    Additional Reagents:
    LB Broth, Lennox BD Diagnostics 240230 2% (wt/vol)
    D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G5767 30 mM for overnight broth cultures; 12 mM for swarm media.
    Prepare a 1.2 M filter sterilized stock solution in nano pure H2O. Add to media after autoclaving.
    Casamino acids (CAA) Amresco J851 0.10% (wt/vol).
    Recommended for P. aeruginosa tendril formation studies. Add to media prior to autoclaving.
    Agar, Noble Sigma-Aldrich A5431 0.45% (wt/vol).
    Preferred Noble agar for P. aeruginosa surface motility studies. Add to media prior to autoclaving.
    Agar, Noble Affymetrix 10907 1.50% (wt/vol).
    Used in M. xanthus surface motility studies. Not recommended for P. aeruginosa motility studies. Add to media prior to autoclaving.
    Agar, Granulated Fisher Scientific BP1423 0.60% (wt/vol)
    Higgins Waterproof Black India Ink Higgins HIG44201 0.50% (vol/vol).
    Mix ink with inoculum to test swarm media surface moisture.
    SYTO® 64 Red Fluorescent Nucleic Acid Stain Invitrogen S-11346 Use 4 μl (for P. aeruginosa) or 8 μl (for M. xanthus) of SYTO® 64 per 100 ml of molten agar (added after autoclaving).
    Relevant Materials and Equipment
    Petri dish, sterile, 150 mm x 15 mm (Dia. x H) VWR 25384-326
    Petri dish, sterile, 100 mm x 15 mm (Dia. x H) VWR 25384-342
    Petri dish, sterile, 60 mm x 15 mm (Dia. x H) VWR 25384-092
    In-Vivo Xtream Bruker Use for the macroscopic imaging of surface motility studies. http://www.bruker.com/products/preclinical-imaging/opticalx-ray-imaging/in-vivo-xtreme/overview.html
    Bruker MI software Bruker http://www.bruker.com/fileadmin/user_upload/8-PDF-Docs/PreclinicalImaging/Brochures/MI-software-brochure.pdf
    ImageJ software NIH http://imagej.nih.gov/ij/
    aSee MSDS of reagents for handeling and disposal information.

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