Préparation, imagerie, et la quantification de la surface bactérienne motilité dosages

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Morales-Soto, N., Anyan, M. E., Mattingly, A. E., Madukoma, C. S., Harvey, C. W., Alber, M., Déziel, E., Kearns, D. B., Shrout, J. D. Preparation, Imaging, and Quantification of Bacterial Surface Motility Assays. J. Vis. Exp. (98), e52338, doi:10.3791/52338 (2015).

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Abstract

La motilité de surface bactériennes, telles que l'essaimage, est couramment examinée dans le laboratoire en utilisant des dosages de plaques qui nécessitent des concentrations spécifiques de gélose et parfois inclusion de nutriments spécifiques dans le milieu de croissance. La préparation de ces milieux explicites et les conditions de croissance de la surface sert à fournir les conditions favorables qui permettent la croissance bactérienne, mais pas seulement la motilité coordonnée de bactéries sur ces surfaces à l'intérieur films liquides minces. Reproductibilité de la plaque d'essaim et d'autres essais sur plaque de la motilité de surface peut être un défi majeur. Surtout pour les plus "swarmers tempérées" qui présentent la motilité seulement dans des plages de gélose de 0,4% -0,8% (poids / vol), de modifications mineures dans le protocole ou l'environnement de laboratoire peut grandement influencer les résultats d'analyse de l'essaim. "Mouillabilité", ou la teneur en eau à l'interface liquide-solide-air de ces essais sur plaque, est souvent une variable clé à contrôler. Un défi supplémentaire dans l'évaluation de l'essaimage est comment quantifier observed différences entre deux (ou plusieurs) des expériences. Ici, nous en détail un protocole polyvalent en deux phases pour préparer et analyses d'image essaim. Nous incluons des lignes directrices pour contourner les difficultés généralement associées à dosage essaim préparation des milieux et la quantification des données de ces essais. Nous démontrons spécifiquement notre méthode en utilisant des bactéries qui expriment journalistes génétiques fluorescentes ou bioluminescentes comme la protéine fluorescente verte (GFP), la luciférase (lux opéron), ou des taches cellulaires pour permettre l'imagerie optique time-lapse. Nous démontrons encore la capacité de notre méthode pour suivre les espèces essaimage concurrence dans la même expérience.

Introduction

De nombreuses bactéries se déplacent sur des surfaces en utilisant divers moyens d'auto-propulsion. Des phénotypes de motilité peuvent être recherchés dans le laboratoire en utilisant des dosages de plaques qui sont affectées par l'environnement liquide associé à la composition de dosage de plaque semi-solide. Un sous-ensemble de la surface utile essais sur plaque de motilité implique en outre un air en phase gazeuse, généralement chambre. En conséquence, le résultat de tout essai de motilité de surface particulier, exige un contrôle minutieux de l'interface de trois phases: la surface solide de l'environnement locale, de l'environnement, liquide et propriétés de l'environnement de gaz.

Le mode de motilité plus couramment étudié dans un tel essai triphasé est connue comme l'essaimage. Essaimage motilité est le mouvement coordonné de groupe de cellules bactériennes qui sont propulsés par leurs flagelles par des films minces sur des surfaces liquides 1. Il est généralement étudiée dans des laboratoires utilisant des dosages de plaques semi-solides contenant 0,4% -0,8% (poids / volume) d'agar 1. Un tableau deagents pathogènes humains exploitent cette motilité comportement d'explorer et de coloniser l'hôte humain. Par exemple, Proteus mirabilis utilise essaimage motilité se déplacer jusqu'à l'urètre, d'atteindre et de la colonisation de la vessie et les reins 2. Motilité essaimage est généralement considéré comme une étape de précurseur de la formation de biofilm, la principale cause de la pathogenèse dans de nombreux agents pathogènes humains 3.

Le phénotype essaimage est très varié parmi les espèces bactériennes; le succès et la reproductibilité expérimentale se appuient fortement sur ​​des facteurs tels que la composition en éléments nutritifs, le type et la composition de la gélose, le protocole de stérilisation (par exemple, autoclavage), semi-solide durcissement des médias, et de l'humidité ambiante (par exemple, les changements saisonniers), entre autres 3-5. La variabilité des réponses de la motilité de surface souligne les difficultés rencontrées dans ces études et les médias d'influence notable et environnement peuvent exercer. Pour certaines espèces, grouillant comme Pseudomonas, mot essaimageilité peut se produire sur une variété de compositions de presse, bien que le phénotype observé et accompagnant taux d'expansion de l'essaim peuvent varier grandement 3. Ensemble, ces facteurs peuvent faire des études de la motilité de surface extrêmement difficile. La variabilité saisonnière dans un laboratoire peut influencer ces essais en trois phases: tests peuvent mieux fonctionner dans l'air humide de l'été et pire dans l'air sec de l'hiver. Nous présentons ici des lignes directrices générales pour contourner certains des défis les plus remarquables lors de la réalisation des études de la plaque de la motilité de surface.

Pour certaines études de motilité de surface, le développement de phénotypes spécifiques est d'un grand intérêt. La plupart, mais pas tous, les études publiées à examiner essaimage de P. aeruginosa correspond à la formation de vrilles ou fractales rayonnant à partir d'un centre d'inoculation 9.3. Différences entre P. souches aeruginosa ont été documentés 5,8, mais une grande partie de la présence ou l'absence de vrilles peuvent être attribué au spécifimilieu de c et le protocole utilisés pour ces essais sur plaque essaim de la motilité. Ici, nous inclure des détails sur la façon de promouvoir essaims de vrille formation pour P. aeruginosa. Parce que P. aeruginosa est juste une des nombreuses bactéries essaimage, nous incluons aussi les détails de notre méthode pour examiner l'essaimage de Bacillus subtilis et de glisse des Myxococcus xanthus. Comme P. aeruginosa, la recherche actuelle sur B. subtilis et M. xanthus couvre un éventail de sujets que les chercheurs travaillent à discerner les aspects de la sporulation, la motilité, la réponse au stress, et le comportement transitoire 1,10. Il est nécessaire de quantifier les caractéristiques et la dynamique du comportement (s) spécifique de ces cellules dans des groupes essaimage.

acquisition de données de la motilité de surface, l'analyse et l'interprétation peut être lourd et qualitative. Nous avons élaboré un protocole pour l'analyse macroscopique détaillée des essaims bactériennes qui fournit en plus à essaimer zone morphologie et sIze (par exemple, de diamètre), des informations dynamiques quantitatives concernant le taux d'expansion de la nuée et de la distribution ou de la densité bactérienne de bioproduits 7. En outre, cette méthode peut profiter de protéines fluorescentes disponibles, la luminescence, et des colorants pour obtenir une vue complète des interactions bactériennes 8, ainsi que de suivre la synthèse des bioproduits (par exemple, P. aeruginosa rhamnolipide 7,8) dans un essaim.

Protocol

1. Swarm Assay médias Préparation et inoculation 4,5,7,8,11

  1. Préparation médias
    NOTE: La composition du milieu décrit ci-dessous est applicable à P. aeruginosa études de formation vrille. Se il vous plaît voir cahier des médias sur le tableau 1 pour P. aeruginosa, B. subtilis, et M. xanthus tests de motilité de surface.
    1. Mélanger 200 ml de FAB-moins (NH 4) 2 SO 4 moyennes essaim (Tableau Matériaux), 0,9 g d'agar Noble, et 0,2 g de casaminoacides (Tableau 1) par agitation avec un barreau d'agitation magnétique. Utilisez de petits volumes (100 à 300 ml) d'améliorer la cohérence entre les expériences.
    2. Autoclave le mélange 200 ml d'agar / media en utilisant un temps d'exposition de 22 min, la température d'exposition de 121,1 ° C, et une option d'évacuation rapide. Les réglages de l'autoclave permettront une bonne stérilisation et la fusion agar, mais éviter la caramélisation agar.
      REMARQUE: agar Noble est sujette à caramelsation; motilité bactérienne est modifiée sur gélose caramélisé.
    3. Immédiatement après le cycle de stérilisation a finalisé, fermer le bouchon de la bouteille de médias pour prévenir la perte d'eau par évaporation. Toutefois, notez que le plafonnement serré peut provoquer un «vide d'étanchéité« effet -comme sur la bouteille.
    4. On refroidit le support à 50 ° C tout en agitant à la température ambiante (RT) et ajouter 2 ml de 1,2 M de glucose stérile. Sinon, placez le support dans un incubateur ou un bain d'eau à 60 ° C jusqu'au moment de servir (jusqu'à 15 heures plus tard), et procéder comme indiqué. Pour éviter la formation de bulles dans les médias, bien mélanger à l'aide de la barre d'agitation magnétique; des bulles à la surface de l'agar empêchera même essaimage.
      NOTE: Pour les autres essais, ajouter à cette étape composants sensibles à la chaleur qui ne peuvent être passés à l'autoclave comme les éléments nutritifs ou des colorants supplémentaires, au besoin (par exemple, plus de 8 pi Invitrogen Syto 63 colorant par 100 ml de gélose fondue à l'image M. xanthus comme le montre dans Representative Résultats, ci-dessous). Ajout de certains colorants peut influer sur le comportement d'essaimage de base, qui doit être vérifiée par rapport à un témoin non colorant.
    5. Dans une hotte de laboratoire, aliquote 7,5 ml de milieu stérile par 60 mm de diamètre polystyrène boîte de Pétri et maintiennent les plaques en une seule couche (non empilées). Pour une plus grande surface de l'essaimage, aliquote de 25 ml de milieu par mm de diamètre boîte de 100 Petri. Il est important de remplir les plats sur une surface plane horizontale. Utilisez la hauteur des yeux d'un taureau pour vérifier si la surface est nivelée.
      NOTE: Pour P. dosages aeruginosa, en utilisant un volume de support spécifiques par plaque sera d'améliorer la cohérence et la reproductibilité. Pour B. subtilis et M. dosages xanthus, versant main donne des résultats comparables à des aliquotes de volume spécifiques.
  2. Plate durcissement
    1. Pour les petites plaques (60 mm), permet le milieu gélose fondu pour guérir (tous deux réglés sur semi-liquide-solide et sec excès) dans la hotte à découvert (ce est à dire, sans couvercle) pendant 30 min. Agrandirplaques (100 mm) nécessitent un temps de durcissement plus long (voir Discussion).
      REMARQUE: Sinon, certains tests peuvent nécessiter plaques de guérir sur le dessus du jour au lendemain de banc (20-24 h) couverte (c.-à-couvercles sur) en une seule couche (tableau 1). L'essaimage est sensible à la fois l'humidité excessive et inadéquate. L'humidité, la circulation d'air, et la température de tout laboratoire donné peuvent nécessiter une variation à la plaque de durcissement de promouvoir l'essaimage optimale de vous bactérie.
    2. Ensemencer immédiatement après la période de séchage est terminé. Ne pas stocker les plaques pour une utilisation ultérieure.
      1. Effectuer le «test de diffusion d'encre" en repérant une plaque d'essai avec un mélange de 10 pi de 0,50% (vol / vol) Higgins étanche encre de Chine noire et inoculum bactérien 11. Si le mélange encre / inoculum se propage facilement (ce est à dire ne conserve pas sous forme de gouttelettes) à la surface des médias, les médias auront besoin de temps supplémentaire pour sécher.
        NOTE: Pour les espèces qui sont particulièrement sensibles à l'humidité (<em> par exemple, P. aeruginosa), effectuer un «test de l'encre de propagation" rapide 11 pour déterminer si les plaques sont assez sec.
  3. Swarm Assay inoculation
    1. Inoculer 6 ml de milieux de culture de bouillon (voir le tableau 1 pour plus de détails) avec une colonie isolée à partir d'un (<5 jours si laissé à température ambiante) Lysogénie Broth (LB) la culture de la plaque frais. Incuber les bouillons de culture pendant une nuit (≤18 RH) à 30 ° C ou 37 ° C avec une agitation horizontale (240 rpm).
    2. Ensemencer essaim en repérant avec 1-5 pi de bouillon de culture pendant la nuit, ou en "poussant" la gélose avec une dent stérile ou une aiguille choisir fil de l'inoculation.
      REMARQUE: On préfère le dernier procédé, car elle diminue la probabilité de l'inoculum et les éclaboussures empêche ajouter de l'humidité supplémentaire à la zone de surface d'essaims.
  4. Swarm Assay Incubation
    1. Pour l'analyse générale, incuber les plaques de dosage d'essaims à 30 °C ou 37 ° C (ou même 42 ° C pendant B. subtilis; Tableau 1) -Il se agit d'une bactérie spécifique. Inverser les plaques pendant l'incubation de telle sorte que l'excès d'humidité se condense sur le couvercle, et non la gélose.
      REMARQUE: La température peut affecter le phénotype ainsi que la cinétique. Pour P. essaims aeruginosa, l'incubation à 37 ° C conduit à l'expansion de la croissance et plus rapide que essaim incubation à 30 ° C; toutefois, la morphologie de ces essaims diffère souvent avec ce changement de température.
    2. Pour l'imagerie time-lapse, incuber les plaques d'essaims à la température appropriée avant le transfert dans la station d'imagerie (voir le tableau 1 pour plus de détails).
      NOTE: Cette incubation pré-imagerie permet essaims commencent leur développement et se établir avant d'être déplacé à un nouvel environnement, qui peut ou peut ne pas être optimale pour l'essaimage motilité.

2. imagerie macroscopique de Surface motilité dosages 7,8

<ol>
  • Pour l'imagerie time-lapse, après les pré-imagerie dosage essaim période d'incubation lieu plaques sur une plaque d'imagerie clairement l'intérieur d'un in vivo station d'imagerie commerciale. Image jusqu'à six, 60 mm de diamètre ou quatre, plaques de 100 mm de diamètre à la fois. Etant donné que la caméra capte des images à partir de sous le plan de formation d'image, inverser les plaques de telle sorte que le trajet optique ne est pas obstrué 8. En variante, incuber à 30 ° C ou 37 ° C (Tableau 1) pour la durée de l'expérience, et enlever les plaques à imager de l'incubateur à intervalles de temps fixés.
  • Placer les couvercles des boîtes de Pétri en position verticale au-dessus de la contre-plaque qui contient le support inoculé. Remplissez les couvercles des boîtes de Pétri à l'eau pour empêcher une déshydratation excessive lors de l'imagerie, et joindre l'ensemble à l'aide d'un autre bac clair pour maintenir l'humidité tout au long de l'expérience.
  • En utilisant l'imagerie moléculaire (MI) 12 logiciels, test (s) de fonctionner à la température ambiante en utilisant l'imvieillissement de paramètres décrits dans le tableau 2. Pour l'imagerie time-lapse, mettre en place un protocole avec les étapes et les spécifications nécessaires.
  • 3. Traitement et interprétation des données 7,8

    1. Traitement d'image
      1. Utilisez le logiciel MI pour exporter des images par lots sous forme de fichiers TIFF 16 bits: Fichier> Exporter ou exporter plusieurs> Sélectionnez le fichier (s) d'exporter et de localisation de l'exportation.
      2. Utilisez ImageJ pour ouvrir une seule image ou importer une série time-lapse:
        1. Ouvrez une seule image: Fichier> Ouvrir
        2. Importer time-lapse séquence d'images: Fichier> Importer séquence, et sélectionnez "Trier les noms numériquement".
          1. Pour les fichiers de time-lapse grandes, sélectionnez «Utiliser pile virtuelle" dans la fenêtre "Importer séquence" d'empiler les images exportées en catégories appropriées (c.-à-GFP, RFP, etc.).
      3. Si nécessaire, changer les images à partir de fichiers 16 bits vers des fichiers 8 bits: Image> Type de> 8-bit
        NOTE: Certains outils de ImageJ exigent images 8-bits.
      4. Déterminer si le signal d'intensité pour une séquence d'images ou temporisation doit être inversée. Placez le curseur sur un point lumineux dans l'image (par exemple, la croissance marqué par fluorescence) et noter l'intensité du signal "Value" de la barre d'outils ImageJ. Ensuite, placez le curseur dans un endroit sombre à l'extérieur de la zone de plaque et noter l'intensité du signal. Si l'intensité du signal pour la tache sombre est plus grande que l'intensité de la tache lumineuse, l'intensité du signal d'image doit être inversée (suivre les sous-étapes 1-2 ci-dessous).
        1. Inverser les signaux d'intensité: Edition> Inverser
        2. Inversez la table de consultation: Image> Tableaux Lookup> Inverser LUT
      5. Soustraire l'arrière-plan: Processus> Soustraire fond, et d'utiliser un "rayon de Bille roulante" avec un rayon de pixel qui est une moitié d'une dimension d'image (par exemple, 1 000 pixels pour une p 2000 x 2000l'image Ixel).
      6. Colorer artificiellement une image ou time-lapse séquence: Image> Tableaux Lookup, et sélectionnez la couleur appropriée dans les options de la liste.
      7. Pour les films avec deux ou plusieurs canaux, de fusionner et d'équilibrer les couleurs avant d'enregistrer comme un film (traitement d'image, l'étape 8). Pour fusionner les images ensemble, ouvert tous les piles d'images dans ImageJ, puis sélectionnez Image> Couleur> Fusionner les couches, et attribuer à chaque pile à un canal de couleur.
      8. Enregistrer séquence time-lapse en AVI ou QuickTime: Fichier> Enregistrer sous et choisissez le format et les spécifications souhaitée.
    2. Analyse des données
      1. Acquisition bactérienne secteur de croissance de la surface pour quantifier Expansion Taux
        1. Ouvrir l'image (s) dans ImageJ
        2. Pour calculer le diamètre de la plaque en pixels, tracer une ligne à travers le centre d'une plaque d'essai avec l'outil "Straight" du et mesurer sa longueur: Analyse> Mesure
        3. L'unité de mesure par défaut dans ImageJ est le pixel. Obtenir un facteur de conversion en divisant le diamètre de la plaque de dosage (par exemple, 60 pour une plaque de 60 mm) par la longueur de pixel obtenu à l'étape précédente.
        4. Changer l'unité de mesure de pixel en mm: Image> Propriétés
          1. Changer le "Unité de longueur" à "mm", et le "Pixel Largeur", "Pixel Hauteur" et "Profondeur Voxel» pour le facteur de conversion calculé à l'étape précédente. Cochez la case "Global" de maintenir ce facteur de conversion sur plusieurs images.
            NOTE: Si ImageJ est fermé et rouvert, ou le champ de vision d'une image est modifiée (ce est à dire, une image est agrandie de plus qu'un autre), le facteur de conversion doit être recalculée. Sinon, effectuer toutes les analyses en pixels puis converti en mm.
        5. Pour chaque image, tracer et mesurer la superficie des essaims en utilisant l'outil "main levée Sélections» dans la barre d'outils pour tracer l'UOtline de l'essaim et de mesurer la surface à l'aide: Analyse> Mesure. Cela va générer un mesures journal qui peut être sauvegardée pour une analyse plus approfondie dans Microsoft Excel ou des programmes similaires: Fichier> Enregistrer sous
      2. Acquisition bactérienne Intensité de croissance de la surface pour quantifier Surface Taux de croissance
        1. Une fois le fond est soustraite (traitement d'image, étape 5), utiliser la dernière image de la séquence pour déterminer la superficie maximale d'essaim (analyse des données, étape 1).
        2. Utilisez l'outil de sélection "Oval" de la barre d'outils pour dessiner une zone autour de la croissance de la surface bactérienne.
        3. Définir la mesure d'intensité de pixels dans la boîte à l'aide signifie: Analyse> Définir les mesures et sélectionnez "moyenne valeur de gris".
        4. Pour obtenir des mesures de signaux d'intensité pour chaque image de la séquence time-lapse, tandis que sur la première image de la séquence aller à: Analyse> Mesure. Cela va générer un mesures journal qui peut être sauvegardée pour une analyse plus approfondie dans Microsoft Excel ou des programmes similaires: Fichier> Enregistrer sous
      3. Alternative à la section précédente (Analyse de données, étape 2). Utilisez le plugin ImageJ macros à installer et exécuter un script de mesure de l'intensité de la croissance de la surface Macros.
        1. Configuration d'un script de mesure automatisé pour analyser plusieurs images simultanément: Plugin> Nouveau> Macro et collez le script fourni (ci-dessous) dans la boîte et enregistrer sous un fichier texte ImageJ Macros: Fichier> Enregistrer et enregistrer dans le dossier de demande de ImageJ sous " macros ".
          numberOfFrames = N
          for (i = 0; i <numberOfFrames; i ++) {
          exécuter («mesure»);
          exécuter («Suivant Slice [>] ');
          }
          NOTE: Voici la variable "N" est pour un nombre indéfini de cadres.
        2. Modifier les "numberOfFrames" dans le plugin Macros pour chaque expérience afin de refléter le nombre d'images dans la séquence d'image avant d'exécuter le script. Utilisation: Plugin> Macros>Modifier et tapez le nombre correct d'images dans la séquence et enregistrer (Fichier> Enregistrer).
        3. Suivez sous-étapes 1-3 en Analyse des données Étape 2, et tandis que sur la première image de la séquence de fonctionner le plugin Macros: Plugin> Macros> Exécuter. Cela va générer un mesures journal qui peut être sauvegardée pour une analyse plus approfondie dans Microsoft Excel ou des programmes similaires: Fichier> Enregistrer sous

    Representative Results

    Variation en préparation de la plaque peut grandement influencer la motilité essaimage. Le durcissement ou le séchage après la coulée du milieu gélose fondu affecte la mince pellicule de liquide présent sur les dosages de la motilité de surface et la motilité des bactéries au cours du temps. Changements dans la composition des nutriments affectent également l'essaimage pour plusieurs bactéries. Figure 1A montre un effet à court terme de temps de séchage sur la diffusion de l'encre de Chine et la diffusion d'un inoculum initial de Bacillus subtilis 11. Figure 1B montre l'effet du temps de séchage et spectacles figure 1C les effets du sulfate d'ammonium [(NH 4) 2 SO 4] sur le développement de vrille ultérieure par essaimage P. 5 aeruginosa.

    Données chiffrables peuvent être obtenus à partir d'images de la motilité extrémité de la surface de formation d'image en utilisant des stratégies multiples. La figure 2 montre les résultats de la croissance de la surface de représentation pour B. subtilis essaimage et son image de bioluminescence associé; et la croissance de la surface de Myxococcus xanthus et l'image de fluorescence rouge associée de SYTO 64 cellules colorées.

    Expansion de l'acquisition de données au-delà de l'inspection et de l'imagerie des résultats de point final permet l'étude du comportement dynamique (s) pour la croissance des bactéries de surface. Figure 3 7 montre un exemple de P. aeruginosa essaimage (imagée pour les cellules exprimant la GFP) et sa production de rhamnolipide associé (imagée en utilisant du Nil Rouge lipides tache) -le quantification des données de ces images est également affichée pour montrer le taux de P. d'expansion aeruginosa essaimage. Vidéo 1 montre un time-lapse de B. subtilis essaimage imagé en utilisant une luminescence d'une souche dites-vous de lux. Vidéo 2 8 montre un time-lapse de P. aeruginosa Salmonella enterica sérotype Typhimurium (lux rouge exprimant) dans un essai essaim concurrentiel.

    Figure 1
    Figure 1: Exemples de facteurs dans la préparation du test de motilité de surface qui affectent le résultat essai Effet de (A) un temps de séchage de l'humidité sur agar-agar de surface et d'étalement de l'inoculum de B.. subtilis (réf 8), (B) le temps de séchage de gélose sur P. aeruginosa essaimage (tiré à part de Réf 5 avec permission), et (C) la présence ou l'absence de sulfate d'ammonium sur P. aeruginosa essaimage et la formation de vrille.

    Figure 2
    Figure 2: Alternative approches pour la croissance de la surface de formation d'image et la motilité des bactéries en utilisant une station d'imagerie Bruker. latéral image latérale d'un appareil photo (à gauche) et l'image par Bruker (à droite) montrant (A) P. aeruginosa exprimant la GFP-imagée en utilisant les paramètres fluorescence verte, (B) B. subtilis exprimant lux bioluminescence journaliste imagée en utilisant les paramètres de luminescence, et (c) M. xanthus colorées avec SYTO 64 imagées en utilisant les paramètres Rouge fluorescence II. Voir le tableau 2 pour les détails de configuration.

    Figure 3
    Figure 3:. L'analyse qualitative et quantitative d'un essai de motilité de surface (A) analyse time-lapse de distribution de la densité cellulaire, la production rhamnolipide (tache rouge Nil lipide imagée en utilisant la fluorescence rougeJe paramètres; barre d'échelle = 15 mm), et (B) quantification du taux à partir d'images de distribution de la densité des cellules d'une extension de P. essaim aeruginosa. (Tiré de 6 Réf avec permission.)

    Vidéo 1. d'imagerie time-lapse d'un B. subtilis essaim. B. subtilis exprimant lux et enregistré en utilisant les paramètres de luminescence. Voir le tableau 2 pour les détails de configuration.

    Vidéo 2. concurrence interspécifique visualisée par imagerie time-lapse. Des essaims de P. aeruginosa (vert; exprimant la GFP et enregistré en utilisant les paramètres fluorescence verte) et S. enterica sérotype Typhimurium (rouge; expreschanter lux et enregistré en utilisant les paramètres de luminescence). Voir le tableau 2 pour les détails de configuration. (Réimpression avec la permission de 7 Réf.)

    P. aeruginosa P. aeruginosa études de formation de vrille B. subtilis M. xanthus
    Bouillon nuit milieux de culture FAB plus 30 mM de glucose FAB plus 30 mM de glucose LB CTT
    Bouillon nuit la température d'incubation de la culture 37 ° C 37 ° C 37 ° C 30 h à 30 ° C
    médias Swarm FAB FAB moins (NH 4) 2 SO 4 2% (poids / volume) LB CTT
    médias Swarm: composants supplémentaires 12 mM de glucose a 10% (poids / volume) de CAA, 12 mM de glucose a n / a SYTO® 64 a
    Type Agar Agar, Noble Agar, Noble Agar granulé Agar, Noble Affymetrix
    Agar concentration (poids / volume) 0,45% 0,45% 0,60% 1,50%
    Taille de la plaque Swarm 60 mm 60 mm 100 mm 150 mm
    volume de médias par plaque 7,5 ml 7,5 ml Coulé à la main Coulé à la main
    réglage du support de Swarm / méthode de séchage Hotte; plaques découvert Hotte; plaques découvert Paillasse; plaques recouvertes Paillasse; plaques recouvertes
    réglage du support de Swarm / temps de séchage 30 min 30 min Nuit (20 -24 h) Nuit (20 -24 h)
    Swarm température dosage d'incubation 30 ou 37 ° C 30 ° C 37 ° C 30 ° C
    Incubation de déchéance imagerie en temps 30 ° C pendant au moins 4 heures 30 ° C pendant au moins 4 heures 37 ° C pendant 2 heures RT pendant 12 heures
    Time-lapse durée de capture 24 h 24 h 10 h 66 h
    Paramètre Time-lapse 1 image / 10 min 1 image / 10 min 1 image / 6 min 1 image / 10 min
    A ajoutée après l'autoclavage.

    Tableau 1:. Spécifications pour Surface motilité Assay préparation comprend surfaceanalyse de la motilité spécifications de préparation pour P. aeruginosa, B. subtilis, et M. xanthus.

    Signal Fluorescence Verte Red Fluorescence je Red Fluorescence II Luminescence
    Protéine ou colorant Vert Fluorescence Protein (GFP) protéines mCherry ou rouge Nil rhamnolipide tache SYTO® 64 Luciférase de lux opéron
    Excitation longueur d'onde (nm) 480 ± 10 540 ± 10 590 ± 10 De
    longueur d'onde d'émission (nm) 535 ± 17,5 600 ± 17,5 670 ± 17,5 Pas de filtre
    Temps d'exposition (s) 30 60 60 240
    arrêt f- 4.0 4.0 2,5 1.1
    FOV (mm) 190 190 140 120
    Plan focal (mm) 27,5 27,5 12,2 4
    Binning (pixels) Aucun 2 x 2 Aucun 8 x 8

    Tableau 2: Imagerie Spécification des spécifications de la station d'imagerie Bruker pour la fluorescence rouge et vert, et l'imagerie de luminescence de la croissance de la surface bactérienne..

    Discussion

    Atteindre essaimage reproductible dans un laboratoire peut être difficile, que des tests d'essaims sont très sensibles à des facteurs environnementaux, tels que l'humidité et les éléments nutritifs disponibles. L'aspect le plus critique d'un essai sur plaque de la motilité de surface est l'humidité sur la surface de la gélose. Avant l'inoculation, les médias d'essaims doivent être suffisamment sec pour empêcher les cellules bactériennes de la natation à travers le liquide de surface, mais pas si sec que pour inhiber la motilité 5 essaimage. L'incubation devrait avoir lieu dans un environnement suffisamment humide: trop peu d'humidité peut entraîner dans le dosage dessèchement pendant l'incubation, alors que trop d'humidité peut conduire à la diffusion de surface artificielle, soit un artéfact. Sauf un incubateur à humidité contrôlée est à portée de main, incubateur et laboratoire d'humidité peut varier considérablement. Par conséquent, un réservoir d'eau supplémentaire, un humidificateur, un déshumidificateur ou à l'intérieur de l'incubateur peuvent être nécessaires pour éviter un séchage excessif ou l'accumulation de l'excès d'humidité tout en maintenant la relative humidité près de 80%. Le maintien de ce taux d'humidité idéal peut se avérer difficile si des changements d'humidité saisonniers sont importants. Si ce est le cas, le protocole de dosage essaim exigera certains ajustements pour tenir compte des variations saisonnières de l'humidité. Nous avons trouvé que la modification du temps de séchage des médias essaim est la façon la plus simple pour ajuster les changements d'humidité saisonniers. Contrôle de l'humidité constante, à l'intérieur et à l'extérieur de l'incubateur, est recommandée. En outre, il est recommandé que les chercheurs calibrer et valider leurs instruments, des incubateurs, des échelles, etc. erreurs comme mineures dans la température, le volume ou quantités de composants de médias peuvent avoir un impact reproductibilité de ces essais.

    Il convient également de noter que le type et la taille de la plaque utilisée dans le dosage peuvent affecter plaque humidité, et donc l'essaimage. Plaques hermétique Ne pas évacuer l'excès d'humidité, ainsi piscine encourageants motilité. En revanche, les plaques ouvertes face permettent trop d'humidité de se échapper. Une boîte de Pétrifournit un environnement idéal car il évacue l'excès d'humidité assez large pour empêcher le liquide se accumuler, mais conserve suffisamment d'humidité pour empêcher les médias de se dessécher. Cette méthode détaille un protocole de dosage de la motilité de surface qui permet la formation d'image de haute qualité. Pour garder l'agar clair pour les plats imagerie 60 mm de diamètre sont remplis avec 7,5 ml de milieu agar. Si l'imagerie détaillée ne est pas nécessaire, le volume jusqu'à 20 ml peuvent également fournir des résultats reproductibles.

    Alors que la motilité essaimage peut être réalisé sur un large éventail de concentrations de gélose, la plage optimale d'agar requis pour essaimage dépend de l'espèce. Dans l'ensemble, les concentrations de gélose élevés inhibent la motilité essaimage, et par conséquent le temps nécessaire pour produire un essaim augmentations d'image prêt. P. aeruginosa grouille généralement sur ​​les concentrations de gélose entre 0,4-0,7% 1, mais nous constatons que l'essaimage optimale se produit dans une gamme beaucoup plus étroite (0,4 à 0,5% de). D'autres, comme B. subtilis et S. entériqueun essaim à 0,6% d'agar, et Vibrio parahaemolyticus à 1,5% d'agar 10. La concentration nécessaire agar est également déterminée par le type et la marque d'agar. Géloses de pureté plus élevée, comme l'agar Noble, améliorer fortement pullulent dans les P. aeruginosa et on préfère plus granulé agar 13,14. Toutefois, ces versions purifiées de gélose sont également plus susceptibles de caramélisation pendant le cycle de stérilisation en autoclave; en fonction de l'instrument, une séquence raccourci / modifiées de stérilisation (pour modifier éventuellement le cycle d'échappement pour éviter toute exposition prolongée à la chaleur) peut être nécessaire pour préparer les médias essaim utilisant agar Noble.

    Composition de médias jouent également un rôle dans l'essaim phénotype observé trois. P. aeruginosa études de motilité essaimage sont généralement effectuées à l'aide des milieux nutritifs minimaux. Nous préférons FAB moyenne 4,8 (tableau des matériaux), mais d'autres médias, tels que M9, LB, ou de légères variations à ces médias communs,ont été utilisés avec succès 9,15,16. Formation vrille est mieux réalisée sur FAB milieu minimum complété avec du glucose comme source de carbone et d'hydrolysat acide de caséine (CAA), mais sans source d'azote supplémentaire (ce est-(NH 4) 2 SO 4) 6,13. Si la formation de vrille ou la morphologie ne est pas l'objectif principal de l'étude, puis FAB milieu minimal (tableau Matériaux; Tableau 1) dépourvu de CAA est recommandé de sorte que les effets des sources de carbone spécifiques et / ou des nutriments supplémentaires peuvent être étudiés en détail. D'autres espèces, telles que B. subtilis (présenté ici), sont swarmers polyvalents, capables d'essaimage sur LB agar et granulé. Ces espèces pullulent facilement, nécessitant seulement ~ 10 h à développer un essaim plein. Ce taux essaimage rapide fait suite à la progression de l'essaim potentiellement difficile, mais notre protocole rend une telle suivi très faisable. La possibilité d'effectuer essaim imagerie time-lapse fournit un intérêt detiel facilité dans l'acquisition de données essaim, en particulier de ces swarmers avides.

    Nous introduisons un solide, complet, le protocole à deux phases et des lignes directrices visant à améliorer l'exécution et la reproductibilité de la recherche de la motilité de surface bactérienne et avons surtout mis l'accent sur les aspects important d'examiner essaimage flagellaire médiation. Ce protocole d'essai essaim détails des aspects importants de la composition et la manipulation des plaques de la motilité de surface médias à fournir une plus grande cohérence et la reproductibilité à l'intérieur et entre les groupes de recherche. Cela permettra d'améliorer la base de la comparaison entre les différentes études de recherche. En outre, l'approche présentée et le protocole fournit les moyens de faire des recherches sur l'essaimage et la surface motilité moins sensibles aux variations de l'environnement en faisant chercheurs conscients que ces facteurs influent sur ​​leur travail et fournir des solutions possibles (par exemple, comment de petits changements dans la gélose affectent essaimage 4,5 ). En outre, le protocole prévu pourquantifier aspects macroscopiques de l'essaimage, fournit l'occasion de mesurer de nombreux attributs de la croissance de la surface bactérienne qui étaient auparavant impossibles à quantifier.

    Nous ne avons pas examiné toutes les bactéries mobiles de surface dans le développement de ce protocole. En tant que tel, il est prévu que les modifications du protocole seront requis pour les espèces ne sont pas présentés ici. L'efficacité de ce protocole est restreint par les limites inhérentes de l'équipement et des matériaux employés. Par exemple, des études sur les températures ne sont pas encore possible avec la station de formation d'image Bruker, étant donné que la régulation de température ne est pas une fonction de l'équipement. En outre, l'utilisation de colorants (comme le rouge Nil pour colorer rhamnolipides) peut avoir des limitations cinétiques et de concentration 8. Cette technique repose fortement sur le traitement et l'analyse d'images numériques; amélioration de l'automatisation de l'analyse des données (par exemple, en utilisant des macros supplémentaires de la fonction de script dans ImageJ) permettrait de réduire le temps nécessaire pour l'analyseet d'élargir l'utilité des données. Enfin, en raison de la robustesse du protocole d'imagerie, les applications futures devraient viser à développer cette technique pour examiner les surfaces de croissance moins uniformes qui sont plus pertinents pour les surfaces colonisées par des bactéries de l'environnement et pathogènes.

    Disclosures

    Publication frais pour cet article ont été partiellement parrainés par Bruker Corporation.

    Acknowledgments

    Un soutien partiel pour ce travail a été fourni par l'Institut national de la santé (R01GM100470 et 1R01GM095959-01A1; à MA et JDS) et une subvention Core Facility de l'Institut des sciences clinique et translationnelle Indiana (financé en partie par le NIH subvention # TR000006 UL1; à JDS).

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Reagentsa
    FAB Minimal Media: Prepare every ~4 weeks. Top to 1 L with nanopure H2O.
    (NH4)2SO4 Sigma A4418 2 g.
    Not used in P. aeruginosa tendril formation studies.
    Na2HPO4 x 7H2O Sigma-Aldrich S9390 9 g
    KH2PO Sigma P5655 3 g
    NaCl BDH BDH8014 3 g
    MgCl2 x 6H2O solution (198 g/L) Fisher Scientific M33 1 ml
    CaCl2 x 2H2O solution (14 g/L) Fisher Scientific C79 1 ml
    Trace metal solution (see below) n/a n/a 1 ml
    Trace Metal Solution: Top to 1 L with nanopure H2O. Maintain in a glass bottle, stirring and covered with foil.
    CaSO4 x 2H2O Sigma-Aldrich 255548 200 mg
    MnSO4 x H2O Sigma-Aldrich M7634 20 mg
    CuSO4 x 5H2O Fisher Scientific C493 20 mg
    ZnSO4 x 7H2O Sigma-Aldrich Z4750 20 mg
    CoSO4 x 7H2O Sigma-Aldrich C6768 10 mg
    NaMoO4 x 2H2O Sigma S6646 10 mg
    H3BO3 Fisher Scientific A74 5 mg
    FeSO4 x 7H2O Sigma-Aldrich F7002 200 mg
    CTT Media: Prepare as needed. Top to 100 ml with nanopure H2O.
    Tris-HCl, 1 M solution (adjust to pH 8.0) Amresco 0234 1 ml.
    Prepare a 1 M stock solution in nano pure H2O. Adjust pH to 8.0 and filter sterilize (0.2 μm pore).
    K2HPO4, 1 M solution (adjust to pH 7.6) Sigma-Aldrich P3786 0.1 ml.
    Prepare a 1 M stock solution in nano pure H2O. Adjust pH to 7.6 and filter sterilize (0.2 μm pore).
    MgSO4 solution Fisher Scientific M65 0.8 ml.
    Prepare a 1 M stock solution in nano pure H2O. Filter sterilize (0.2 μm pore).
    Casitone BD Diagnostics 225930 1 g
    Additional Reagents:
    LB Broth, Lennox BD Diagnostics 240230 2% (wt/vol)
    D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G5767 30 mM for overnight broth cultures; 12 mM for swarm media.
    Prepare a 1.2 M filter sterilized stock solution in nano pure H2O. Add to media after autoclaving.
    Casamino acids (CAA) Amresco J851 0.10% (wt/vol).
    Recommended for P. aeruginosa tendril formation studies. Add to media prior to autoclaving.
    Agar, Noble Sigma-Aldrich A5431 0.45% (wt/vol).
    Preferred Noble agar for P. aeruginosa surface motility studies. Add to media prior to autoclaving.
    Agar, Noble Affymetrix 10907 1.50% (wt/vol).
    Used in M. xanthus surface motility studies. Not recommended for P. aeruginosa motility studies. Add to media prior to autoclaving.
    Agar, Granulated Fisher Scientific BP1423 0.60% (wt/vol)
    Higgins Waterproof Black India Ink Higgins HIG44201 0.50% (vol/vol).
    Mix ink with inoculum to test swarm media surface moisture.
    SYTO® 64 Red Fluorescent Nucleic Acid Stain Invitrogen S-11346 Use 4 μl (for P. aeruginosa) or 8 μl (for M. xanthus) of SYTO® 64 per 100 ml of molten agar (added after autoclaving).
    Relevant Materials and Equipment
    Petri dish, sterile, 150 mm x 15 mm (Dia. x H) VWR 25384-326
    Petri dish, sterile, 100 mm x 15 mm (Dia. x H) VWR 25384-342
    Petri dish, sterile, 60 mm x 15 mm (Dia. x H) VWR 25384-092
    In-Vivo Xtream Bruker Use for the macroscopic imaging of surface motility studies. http://www.bruker.com/products/preclinical-imaging/opticalx-ray-imaging/in-vivo-xtreme/overview.html
    Bruker MI software Bruker http://www.bruker.com/fileadmin/user_upload/8-PDF-Docs/PreclinicalImaging/Brochures/MI-software-brochure.pdf
    ImageJ software NIH http://imagej.nih.gov/ij/
    aSee MSDS of reagents for handeling and disposal information.

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    References

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