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Tetracistronic Minigenomes युक्त वायरस की तरह कणों के साथ जैव सुरक्षा स्तर 2 शर्तों के तहत Ebola वायरस के जीवन चक्र मॉडलिंग

Immunology and Infection
 

Summary

संक्रामक Ebola वायरस के साथ काम जैव सुरक्षा स्तर 4 प्रयोगशालाओं तक ही सीमित है. Tetracistronic minigenome युक्त कणों की तरह प्रतिकृति और प्रतिलेखन-सक्षम वायरस (trVLPs) हमें सुरक्षित Ebola वायरस घटकों पर विशेष रूप से निर्भर है, जैव सुरक्षा स्तर के तहत 2 शर्तों कई संक्रामक चक्र मॉडल के लिए अनुमति देता है कि एक जीवन चक्र मॉडलिंग सिस्टम का प्रतिनिधित्व करते हैं.

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Hoenen, T., Watt, A., Mora, A., Feldmann, H. Modeling The Lifecycle Of Ebola Virus Under Biosafety Level 2 Conditions With Virus-like Particles Containing Tetracistronic Minigenomes. J. Vis. Exp. (91), e52381, doi:10.3791/52381 (2014).

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Abstract

Ebola वायरस 90% के रूप में उच्च मामले मृत्यु दर के साथ, मानव और गैर मानव प्राइमेट में गंभीर रक्तस्रावी बुखार के कारण. इन वायरस के कारण रोग के लिए कोई मंजूरी दे दी टीके या विशिष्ट उपचार कर रहे हैं, और काफी इन वायरस पर शोध सीमित, जैव सुरक्षा स्तर को 4 प्रयोगशालाओं प्रतिबंधित है संक्रामक Ebola वायरस के साथ काम करते हैं. जीवनचक्र मॉडलिंग सिस्टम मॉडल जैव सुरक्षा स्तर 2 परिस्थितियों में वायरस के जीवन चक्र; हालांकि, हाल ही में जब तक ऐसी व्यवस्था वायरस के जीवन चक्र के व्यक्तिगत पहलुओं, या एक ही संक्रामक चक्र या तो सीमित किया गया है. Morphogenesis में शामिल Tetracistronic Ebola वायरस गैर कोडन क्षेत्रों, एक पत्रकार जीन से मिलकर जो minigenomes,, और तीन Ebola वायरस जीन, नवोदित, और प्रविष्टि (VP40, जीपी 1,2, और VP24), प्रतिकृति और प्रतिलेखन का उत्पादन किया जा सकता है इन minigenomes युक्त -competent वायरस की तरह कण (trVLPs). ये trVLPs लगातार कोशिकाओं Ebola व्यक्त संक्रमित कर सकते हैंहमें सुरक्षित रूप से जैव सुरक्षा स्तर 2 शर्तों के तहत कई संक्रामक चक्र मॉडल के लिए अनुमति जीनोम प्रतिकृति और प्रतिलेखन, के लिए जिम्मेदार वायरस प्रोटीन. महत्वपूर्ण बात है, इस सिस्टम के वायरल घटकों केवल (के रूप में है, उदाहरण के लिए, pseudotyped वायरस का उपयोग कर सिस्टम में मामले), और VP40, जीपी 1,2 और VP24 इस प्रणाली में overexpressed नहीं कर रहे हैं अन्य वायरस से Ebola वायरस से ली गई है और नहीं कर रहे हैं ,, morphogenesis अध्ययन कर इस तरह के जीनोम प्रतिकृति और प्रतिलेखन के रूप में वायरस के जीवन चक्र के अन्य पहलुओं को भी इस प्रणाली के साथ मॉडलिंग की जा सकती है, हालांकि नवोदित और प्रवेश के लिए यह आदर्श अनुकूल बना रही है. इसलिए, tetracistronic trVLP परख Ebola वायरस के लिए उपलब्ध सबसे व्यापक जीवन चक्र मॉडलिंग प्रणाली का प्रतिनिधित्व करता है, और भविष्य में Ebola वायरस की जीव विज्ञान की जांच में इस्तेमाल के लिए जबरदस्त क्षमता है. यहाँ, हम इस प्रणाली के उपयोग पर विस्तृत जानकारी, साथ ही पर अपेक्षित परिणाम प्रदान करते हैं.

Introduction

Ebola वायरस मानव प्रकोप 1 में 90% तक के मामले मृत्यु दर के साथ मनुष्य और गैर मानव प्राइमेट में एक गंभीर रक्तस्रावी बुखार की प्रेरणा का एजेंट हैं. (2,3 में समीक्षा) टीकों के साथ ही विशिष्ट उपचार के विकास में हाल के वर्षों में महत्वपूर्ण प्रगति हुई है, वहीं इन मानव उपयोग के लिए अनुमोदित नहीं कर रहे हैं. Ebola वायरस कणों के बारे में 1 माइक्रोन की लंबाई के साथ एक विशेषता धागे की तरह उपस्थिति और 96-98 एनएम 4 के एक व्यास है. एक nucleocapsid रूपों वायरल कणों की कोर और 7 ebolavirus जीन encodes जो 1) गैर खंडों एकल असहाय नकारात्मक भावना आरएनए जीनोम, चित्रा (1) जीनोम encapsidates, जो 2) nucleoprotein एनपी, 3 के होते हैं ) पोलीमर्स एल और इसके cofactor VP35 से मिलकर वायरल पोलीमरेज़ जटिल, और 4) ट्रांसक्रिप्शनल उत्प्रेरक VP30. इसके अलावा, यह हाल ही में प्रोटीन VP24 भी nucleocapsid साथ जुड़ा हुआ है कि दिखाया गया है4. nucleocapsid morphogenesis और virions की नवोदित के लिए जिम्मेदार है जो मैट्रिक्स प्रोटीन VP40, जो स्थित है में मैट्रिक्स अंतरिक्ष से घिरा हुआ है. वायरस कणों आगे छा, और विरिअन लगाव और प्रवेश के लिए जिम्मेदार है जो एकमात्र सतह प्रोटीन जीपी 1,2, कि लिफाफे में है एम्बेडेड रहे हैं.

संक्रामक Ebola वायरस के साथ काम दुनिया भर में कुछ सुविधाओं के लिए इस काम को प्रतिबंधित जो जैव सुरक्षा स्तर (बीएसएल) 4 शर्तों के तहत एक अधिकतम नियंत्रण प्रयोगशाला में प्रदर्शन किया जा रहा है. इन वायरस के जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए या BSL2 परिस्थितियों में उपन्यास चिकित्सा विज्ञान विकसित करने के क्रम में, शोधकर्ताओं Ebola वायरस प्रोटीन के संयोजक overexpression पर या तो भरोसा करते हैं, या संक्रामक Ebola वायरस के अभाव में साथ काम किया जा सकता है, जो दोनों के जीवन चक्र मॉडलिंग सिस्टम, पर. Ebola वायरस प्रोटीन के संयोजक अभिव्यक्ति या तो अभिव्यक्ति plasmids या वायरल वैक्टर से हासिल की है. इस रणनीति का एक विशेष मामला हैEbola वायरस के अलावा अन्य वायरस पर आधारित virions या वायरस की तरह कणों की पीढ़ी (सबसे अधिक रेट्रोवायरस या vesicular stomatitis वायरस) recombinantly की उपस्थिति में अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है जो pseudotyped कणों की पीढ़ी के लिए अग्रणी, जीपी 1,2 व्यक्त प्रवेश निरोधकों 5 के लिए filoviruses और स्क्रीन की प्रवेश प्रक्रिया. वैकल्पिक रूप से, अपने स्वयं के ग्लाइकोप्रोटीन के बजाय Ebola वायरस जीपी 1,2 एनकोड कि पुनः संयोजक वायरस (जैसे, vesicular stomatitis वायरस) जनित और जैव सुरक्षा स्तर 2 शर्तों 6 के तहत वायरस प्रवेश अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

जीवनचक्र मॉडलिंग सिस्टम शुरू में सीडीएनए से उत्पादन किया है और फिर दोहराया और ट्रांस में प्रदान Ebola वायरस प्रोटीन द्वारा लिखित रहे हैं जो छोटा Ebola वायरस जीनोम analogues (minigenomes), के उपयोग की विशेषता रिवर्स आनुवंशिकी सिस्टम के रूप हैं. Ebola वायरस के लिए पहले minigenome प्रणाली अधिक से अधिक 15 साल पहले 7 विकसित किया गया था, और तब से Ebola वायरस जीनोम प्रतिकृति और प्रतिलेखन (8,9 में समीक्षा) का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. इस प्रणाली में Ebola वायरस के जीनोम के टर्मिनल गैर कोडन क्षेत्रों से घिरे एक भी रिपोर्टर जीन से मिलकर monocistronic minigenome (T7 शाही सेना पोलीमरेज़ का उपयोग आमतौर पर प्रतिलेखन द्वारा) स्तनधारी कोशिकाओं में व्यक्त किया जाता है (चित्रा 1) (नेता और ट्रेलर कहा जाता है) एक साथ वायरल प्रोटीन एल, VP35, VP30 और एनपी साथ. minigenome एनपी द्वारा encapsidated, और फिर दोहराया और वायरस के जीवन चक्र (चित्रा 2) के इन दो पहलुओं को दर्शाता है कि रिपोर्टर गतिविधि के लिए अग्रणी नेता और ट्रेलर में स्थानीयकृत सीआईएस अभिनय संकेतों का उपयोग अन्य nucleocapsid प्रोटीन द्वारा लिखित है.

शास्त्रीय minigenome सिस्टम पर आधारित हैं, जो वायरस की तरह कण (trVLP) सिस्टम विकसित किया गया है वायरल जीवन चक्र, प्रतिलेखन और प्रतिकृति-सक्षम, के अतिरिक्त कदम मॉडल, लेकिन एक सुविधा के क्रम मेंअभिव्यक्ति plasmids 10,11 से अन्य वायरल प्रोटीन VP24, VP40 और जीपी 1,2 के dditional अभिव्यक्ति. VP40 की उपस्थिति उनकी सतह पर जीपी 1,2 सहन जो trVLPs के गठन की ओर जाता है, और अंदर पर एक minigenome युक्त nucleocapsid ले. ये trVLPs अनुभवहीन लक्ष्य कोशिकाओं trVLPs 11 के भीतर लक्ष्य कोशिकाओं में लाया minigenomes की प्रतिकृति और प्रतिलेखन की सुविधा के लिए या तो एल, VP35, VP30 और एनपी के लिए अभिव्यक्ति plasmids के साथ pretransfected किया गया है जो लक्ष्य कोशिकाओं, संक्रमित करने के लिए इस्तेमाल किया, या कर रहे हैं किया जा सकता है (यानी Ebola वायरस प्रोटीन की प्लाज्मिड संचालित अभिव्यक्ति) 10 बिना. यह उत्पादक कोशिकाओं, morphogenesis और trVLPs की नवोदित, लक्ष्य कोशिकाओं में उनके प्रवेश में minigenomes की प्रतिकृति को दर्शाता है जो लक्ष्य कोशिकाओं में रिपोर्टर गतिविधि में परिणाम है, और 1) pretransfected लक्ष्य कोशिकाओं के मामले में भी प्रतिकृति और माध्यमिक प्रतिलेखन (जीनोम वायरल प्रोटीन ठेस द्वारा यानी प्रतिलेखनuced) लक्ष्य कोशिकाओं में लक्ष्य कोशिकाओं में, या 2) भी अनुभवहीन लक्ष्य कोशिकाओं trVLPs भीतर लक्ष्य कोशिकाओं में लाया वायरल प्रोटीन) (चित्रा 3) द्वारा प्राथमिक प्रतिलेखन (यानी प्रतिलेखन के मामले में. ये प्रोटीन जीनोम प्रतिकृति की मजबूत नकारात्मक नियामकों होना दिखाया गया है, क्योंकि महत्वपूर्ण बात है, इन पद्धतियों ही, एक ही संक्रामक चक्र मॉडल, और VP24 और VP40 के मामले में विशेष रूप से समस्याग्रस्त है जो सभी वायरल प्रोटीन, की overexpression पर भरोसा करने के लिए इस्तेमाल किया गया है और प्रतिलेखन प्लास्मिड 12,13 से overexpressed जब. इसके अलावा, इन प्रणालियों में उत्पादित trVLP तैयारी संक्रामक trVLPs 14 के जैव रासायनिक विश्लेषण के लिए चुनौती खड़ी, गैर संक्रामक कणों की एक उच्च अनुपात में होते हैं.

इन समस्याओं को दूर करने के लिए, हमने हाल ही में एक पत्रकार जीन के अलावा, यह भी VP40, जीपी 1,2 और के लिए एन्कोडिंग जीन होता है कि, एक tetracistronic minigenome प्रणाली विकसित की हैVP24 (चित्रा 1). शास्त्रीय monocistronic minigenome प्रणाली के समान है, इस प्रणाली (चित्रा 4) 15 लक्ष्य कोशिकाओं को संक्रमित कर सकते हैं कि trVLPs का उत्पादन होता है. हालांकि, शास्त्रीय minigenome प्रणाली के विपरीत, VP40, जीपी 1,2, और VP24 बल्कि plasmids से overexpressed जा रहा से वायरल जीनोम प्रतिलेखन के बाद उत्पादन कर रहे हैं. नतीजतन, इन प्रोटीनों की कैनेटीक्स और अभिव्यक्ति के स्तर और अधिक बारीकी से वायरल जीवन चक्र के दौरान पाया उन नकल, और फलस्वरूप गैर संक्रामक trVLPs को संक्रामक का अनुपात इस प्रणाली 15 में लगभग 500 गुना बढ़ जाती है. इसके अलावा, इस प्रणाली का उपयोग करते हुए यह लगातार बीतने tetracistronic minigenome युक्त trVLPs, कई संक्रामक चक्र मॉडलिंग के लिए संभव था. जैसे, tetracistronic trVLPs वर्तमान BSL2 परिस्थितियों में Ebola वायरस जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए उपलब्ध सबसे व्यापक जीवन चक्र मॉडलिंग व्यवस्था कर रहे हैं. यहाँ, हम उपयोग ओ पर विस्तृत जानकारी प्रदानइस प्रणाली च, साथ ही अपेक्षित परिणाम पर.

Protocol

TrVLPs की प्रारंभिक उत्पादन के लिए उत्पादक कोशिकाओं की 1 तेज

  1. 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), 2 मिमी एल glutamine, और 1x कलम / strep के साथ उच्च ग्लूकोज Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) में 2 बोतल (75 सेमी में 293 कोशिकाओं सुसंस्कृत 80-90% मिला हुआ से DMEM10 मध्यम निकालें ). कोशिकाओं को बेदखल करने के लिए नहीं सावधान किया जा रहा है, 10 मिलीलीटर फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के साथ दो बार कोशिकाओं को धो लें, और कोशिकाओं को 2 मिलीलीटर trypsin-EDTA जोड़ें.
  2. एक माइक्रोस्कोप (लगभग 30 सेकंड) के तहत मनाया जब कोशिकाओं महत्वपूर्ण गोलाई दिखाने जब तक कमरे के तापमान पर कोशिकाओं को सेते हैं. फ्लास्क दोहन द्वारा कोशिकाओं बेदखल, और 8 मिलीग्राम DMEM10 जोड़ें. अच्छी तरह से धीरे से ऊपर pipetting द्वारा कोशिकाओं resuspend और नीचे खुर्दबीन के नीचे देखा जब एक एकल कोशिका निलंबन मनाया जाता है जब तक.
  3. एक स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग कोशिकाओं की गणना. DMEM10 में मिलीलीटर प्रति 2 एक्स 10 5 कोशिकाओं कोशिकाओं पतला. पिपेट प्रति अच्छी तरह से 6 अच्छी तरह प्लेटें (4 एक्स 10 में सेल निलंबन के 2 मिलीलीटरअच्छी तरह से प्रति 5 कोशिकाओं).
  4. 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर एक humidified टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में प्लेटें सेते हैं.

TrVLPs की प्रारंभिक उत्पादन के लिए उत्पादक कोशिकाओं के 2 अभिकर्मक

  1. 24 घंटा कोशिकाओं (प्रयोग समय के एक सिंहावलोकन के लिए 5 चित्रा देखें) बंटवारे के बाद, पिपेट प्लास्मिड डीएनए 15 फ़िल्टर्ड युक्तियों का उपयोग cryovial एक बाँझ 2 मिलीलीटर में (मात्रा के लिए 1 टेबल देखें). डीएनए के लिए अच्छी तरह से प्रति 100 μl OptiMEM जोड़ें. संक्षेप में मिश्रण भंवर और धीरे एक microfuge का उपयोग ट्यूबों नीचे स्पिन. कई कुओं समान plasmids के साथ ट्रांसफ़ेक्ट किया जा रहे हैं, कई कुओं के लिए एक mastermix बनाया जा सकता है.
  2. संक्षेप में उपयोग करने से पहले ट्रांजिट LT1 साथ शीशी भंवर. पतला डीएनए को अच्छी तरह से प्रति 7.5 μl ट्रांजिट LT1 जोड़ें. धीरे cryovial के ढक्कन में तरल एकत्र करने के लिए नहीं, देखभाल मिश्रण भंवर, और कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए सेते हैं.
  3. धीरे अभिकर्मक मिश्रणऊपर और नीचे pipetting द्वारा जटिल. Dropwise एक अच्छी तरह से अभिकर्मक परिसरों के 100 μl जोड़ें. आगे / पिछड़े थाली रॉक और पक्ष से अभिकर्मक परिसरों वितरित करने के लिए पक्ष की. इस रूप में थाली ज़ुल्फ़ मत अभिकर्मक परिसरों का प्रसार असमान कारण होगा.
  4. इनक्यूबेटर में कोशिकाओं लौटें.
  5. 24 घंटे के बाद, कोशिकाओं से सतह पर तैरनेवाला हटायें. 5% FBS, 2 मिमी एल glutamine, कोशिकाओं को 1x कलम / strep (DMEM5) के साथ 4 मिलीलीटर DMEM जोड़ें. यह कदम, पार संदूषण एक मुद्दा बन सकता है कुओं के कारण इस प्रणाली में trVLPs की आत्म amplifying प्रकृति को, अन्यथा (समान नमूने होते हैं, यह सोचते कुओं के सूखने के बिना एक समय में सामने 3 कुओं के लिए किया जा सकता है और इस चरण) एक समय में एक अच्छी तरह से किया जाना चाहिए.
  6. इनक्यूबेटर में कोशिकाओं लौटें.

लक्ष्य कोशिकाओं के 3 तैयारी

  1. एक के प्रति अच्छी तरह से 2 मिलीलीटर DMEM10 में 4 x 10 5 कोशिकाओं बोने, धारा 1 में वर्णित के रूप में 293 कोशिकाओं को विभाजित6 अच्छी तरह से थाली.
  2. लक्ष्य कोशिकाओं के बंटवारे के बाद 24 घंटे और संक्रमण से पहले 24 घंटा, डीएनए का उपयोग कर धारा 2 में वर्णित के रूप में transfect लक्ष्य कोशिकाओं तालिका 1 में मात्रा, और अच्छी तरह से प्रति 4.5 μl ट्रांजिट LT1.

उत्पादक कोशिकाओं के लक्ष्य कोशिकाओं और फसल की 4 संक्रमण

  1. 15 मिलीलीटर ट्यूब को उत्पादक कोशिकाओं से supernatants स्थानांतरण. निकालें और एक निर्वात नली का उपयोग कर किसी भी शेष सतह पर तैरनेवाला त्यागें. कोशिकाओं को 250 μl Glo lysis बफर जोड़ें.
  2. 800 XG और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र सतह पर तैरनेवाला सेलुलर मलबे के नमूने खाली करने के लिए.
  3. लक्ष्य कोशिकाओं की एक अच्छी तरह से सतह पर तैरनेवाला निकालें. ध्यान से धीरे पिपेट गति का उपयोग कोशिकाओं को लक्षित करने की मंजूरी दे दी निर्माता सेल सतह पर तैरनेवाला के 3 मिलीलीटर जोड़ें. सेल monolayer में खलल न डालें से बचने के लिए कोशिकाओं पर सीधे pipetting से बचें. यह कदम एक समय में एक अच्छी तरह से किया जा सकता है.
  4. सभी नमूनों पार किया गया है जबferred, लक्ष्य कोशिकाओं की trVLPs की अवसादन और संक्रमण की अनुमति के लिए इनक्यूबेटर के लिए लक्ष्य कोशिकाओं वापसी.
  5. Glo lysis बफर में कमरे के तापमान पर ऊष्मायन के 15 मिनट के बाद, 150 μl के लिए सेट एक micropipette का उपयोग lysis बफर में उत्पादक कोशिकाओं resuspend, और cryovial एक 2 मिलीलीटर में नमूना हस्तांतरण. धारा 6 में वर्णित के रूप में इस बिंदु पर, lysates -80 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर है, या सीधे मापा जा सकता है.
  6. संक्रमण के बाद 24 घंटा, लक्ष्य कोशिकाओं से सतह पर तैरनेवाला हटायें. कोशिकाओं को 4 मिलीलीटर DMEM5 प्रति अच्छी तरह से जोड़ें. यह कदम कुओं के कारण इस प्रणाली में trVLPs की आत्म amplifying प्रकृति को अन्यथा समान नमूने (होते हैं, पार संदूषण एक मुद्दा बन सकता है, एक समय में तीन कुओं के लिए किया जा सकता है, और इस कदम होना चाहिए एक समय में एक अच्छी तरह से किया).

एक एकल चक्र संक्रमण के लिए लक्ष्य कोशिकाओं के 5 हार्वेस्ट

  1. यदि केवल एक ही संक्रामक चक्र संक्रमण को दूर टी के बाद 72 घंटे में मूल्यांकन किया जाना चाहिएवह एक निर्वात नली का उपयोग कर लक्ष्य कोशिकाओं से सतह पर तैरनेवाला.
  2. उत्पादक कोशिकाओं के लिए धारा 4 में वर्णित के रूप में 250 μl Glo lysis बफर में कोशिकाओं फसल.

6 हार्वेस्ट लक्ष्य की कोशिकाओं और trVLPs की सतत Passaging

  1. TrVLPs लगातार passaged किया जाए तो वे लक्ष्य कोशिकाओं (चित्रा 5) के पहले सेट के संक्रमण के बाद संक्रमण 72 घंटे के लिए तैयार कर रहे हैं कि इतने धारा 3 में वर्णित के रूप में, लक्ष्य कोशिकाओं का एक नया सेट तैयार करते हैं.
  2. (उत्पादक कोशिकाओं की जगह में लक्ष्य कोशिकाओं के पहले सेट का उपयोग कर) की धारा 4 में वर्णित के रूप में लक्ष्य कोशिकाओं के नए सेट को संक्रमित.
  3. इन चरणों का हर 72 घंटा दोहराएँ.

रिपोर्टर गतिविधि के 7 विश्लेषण

  1. सेल lysates जमे हुए थे, तो कमरे के तापमान पर उन्हें पिघलना. नमूने माप करने से पहले कमरे के तापमान पर पहुँच गए हैं कि सुनिश्चित करें.
  2. Renilla Glo परख बफर (आदर्श जमे हुए मैं के लिए आवश्यक राशि (नमूना प्रति 40 μl) पिघलनाकमरे के तापमान पर n aliquots). बफर माप करने से पहले कमरे के तापमान पर पहुँच गया है कि यह सुनिश्चित करें.
  3. Renilla Glo अभिकर्मक प्राप्त करने के लिए Renilla Glo परख बफर Renilla Glo सब्सट्रेट के 1/100 वें मात्रा जोड़ें, और vortexing द्वारा मिश्रण. पिपेट एक सफेद 96 अच्छी तरह से थाली में Renilla Glo अभिकर्मक के 40 μl.
  4. Renilla-Glo अभिकर्मक के लिए नमूने के 40 μl जोड़ें. फिर, 10 मिनट रुको 1 सेकंड के एकीकरण के समय का उपयोग करते हुए एक luminometer में नमूनों को मापने.

Representative Results

अभिव्यक्ति plasmids Ebola वायरस nucleocapsid प्रोटीन एनपी, VP35, VP30, और एल, 72 घंटा (चित्रा 6 में आसानी से पता लगाने योग्य है कि एक tetracistronic minigenome और minigenome प्रतिकृति और प्रतिलेखन और रिपोर्टर गतिविधि में सहायक T7 पोलीमरेज़ परिणाम एन्कोडिंग के साथ 293 उत्पादक कोशिकाओं के अभिकर्मक ). महत्वपूर्ण बात है, मनाया संवाददाता गतिविधि (10 5.6 रिश्तेदार luminescence इकाइयों (RLU)) से अधिक है कि अभिव्यक्ति प्लाज्मिड एन्कोडिंग एल अधिक से अधिक 2 लॉग द्वारा अभिकर्मक (10 3 RLU) से छोड़ा गया था जिसमें एक नकारात्मक नियंत्रण की. यहां तक ​​कि एल के अभाव में मनाया गतिविधि का स्तर कम होने के कारण minigenome प्लाज्मिड में एक गुप्त प्रमोटर की संभावना है. उत्पादक कोशिकाओं की तुलना में जब निर्माता कोशिकाओं की सतह पर तैरनेवाला से trVLPs से संक्रमित लक्ष्य कोशिकाओं वास्तव में कुछ हद तक रिपोर्टर गतिविधि का स्तर बढ़ा शो, और मूल्यों पारित होने के आधार पर, 10 6 और 10 7 RLUs के बीच तक पहुँचने. इसके विपरीत, डब्ल्यूएल नियंत्रण उत्पादक कोशिकाओं की सतह पर तैरनेवाला लक्ष्य कोशिकाओं पर passaged है मुर्गी (एल सहित सभी nucleocapsid प्रोटीन व्यक्त), संवाददाता गतिविधि luminometer (लगभग 10 2 RLU) की पृष्ठभूमि शोर से अधिक नहीं है.

tetracistronic trVLP परख Ebola वायरस के जीवन चक्र का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, trVLPs साथ 293 कोशिकाओं के संक्रमण इन कोशिकाओं में ट्रांस में प्रदान किया जाना है जो इस तरह के टिम -1 के रूप में 16 लगाव कारकों की उपस्थिति पर निर्भर है. नतीजतन, एक tetracistronic trVLP परख में लगभग 100 गुना का लक्ष्य कोशिकाओं में रिपोर्टर गतिविधि में एक बूंद टिम -1 (चित्रा 7A) के अभाव में मनाया जाता है. वायरस के जीवन चक्र में विशिष्ट (वायरल या सेलुलर) प्रोटीन की भूमिका भी इस दृष्टिकोण के साथ एक साथ आरएनएआई प्रौद्योगिकी का उपयोग कर मूल्यांकन किया जा सकता. एक उदाहरण के रूप में, एल की केंद्रीय भूमिका में परिलक्षित करती है, के बारे में 100 गुना की रिपोर्टर गतिविधि में एक बूंद में नीचे विनियमन एल परिणामों की आरएनएआई की मध्यस्थताप्रतिकृति और प्रतिलेखन (चित्रा 7B) 7. इसके अलावा, यह सीधे वायरस के जीवन चक्र पर म्यूटेशन के प्रभाव का आकलन करने के लिए minigenome हेरफेर करने के लिए संभव है. Minigenome से VP24 अभिव्यक्ति शुरू कोडोन के तुरंत नीचे की ओर 3 रोक codons शुरू करने से समाप्त कर दिया है जब एक उदाहरण के रूप में, उत्पादक कोशिकाओं में रिपोर्टर गतिविधि नाटकीय रूप से बदल नहीं है; हालांकि, लक्ष्य कोशिकाओं में रिपोर्टर गतिविधि संक्रामक trVLPs (चित्रा 7C) 15 के उत्पादन में VP24 की एक भूमिका का संकेत है, एक मार्ग है, और दो ​​मार्ग के बाद 400 गुना के बाद के बारे में 20 गुना से कम है.

चित्रा 1
Ebola वायरस के जीनोम के साथ ही monocistronic और tetracistronic minigenomes की संख्या 1 संरचना. Ebola वायरस प्रोटीन के लिए क्षेत्रों कोडिंग, एनपी (लाल के रूप में दिखाया जाता हैVP35, VP30, और एल), पीला (VP40 और VP24) या नीले (जीपी 1,2) बक्से. गैर कोडन क्षेत्रों (NCRs) संकेत नेता और ट्रेलर क्षेत्रों के साथ हरे रंग में दिखाया गया है. सबस्क्रिप्ट वायरल एनसीआर कोडिंग क्षेत्रों में शामिल होने के लिए इस्तेमाल किया गया था, जो इंगित करता है. रिपोर्टर (निरसित) के लिए कोडिंग क्षेत्र बैंगनी में दिखाया गया है.

चित्रा 2
चित्रा 2 Monocistronic minigenome परख. प्रकोष्ठों Ebola वायरस nucleocapsid प्रोटीन के लिए अभिव्यक्ति plasmids (एनपी, VP35, VP30, एल), एक monocistronic minigenome (एमजी) और T7 पोलीमरेज़ साथ ट्रांसफ़ेक्ट हैं. minigenome शुरू में तो एनपी (ख) द्वारा encapsidated है जो वायरल जीनोम (vRNA), के रूप में एक ही ओरिएंटेशन में एक unencapsidated minigenome शाही सेना में T7 पोलीमरेज़ (एक) द्वारा लिखित है. इस vRNA एक पूरक minigenome शाही सेना के माध्यम से दोहराया है encapsidated (क्रेना) intermediate (ग), और उसके बाद संवाददाता प्रोटीन (ई) में अनुवाद कर रहे हैं कि रिपोर्टर mRNAs (घ) में लिखित.

चित्रा 3
एक monocistronic minigenome साथ चित्रा 3 trVLP परख. प्रकोष्ठों minigenome परख घटकों के लिए अभिव्यक्ति plasmids (Ebola वायरस nucleocapsid प्रोटीन एनपी, VP35, VP30, एल, एक monocistronic minigenome और T7 पोलीमरेज़) के साथ ही VP40, जीपी 1 के साथ ट्रांसफ़ेक्ट हैं , 2 और VP24. इस minigenome युक्त nucleocapsids (एफ) को शामिल कि trVLPs के गठन की ओर जाता है. या तो रिपोर्टर अभिव्यक्ति (ई), या अनुभवहीन के लिए अग्रणी प्रतिकृति और माध्यमिक प्रतिलेखन (घ) में जिसके परिणामस्वरूप, एनपी, VP35, VP30, और एल (ऊपर) के लिए अभिव्यक्ति plasmids के साथ pretransfected जो कर रहे हैं तो लक्ष्य कोशिकाओं को संक्रमित कर सकते हैं ये trVLPs (छ), मिनट के प्राथमिक प्रतिलेखन में जिसके परिणामस्वरूप लक्ष्य कोशिकाओं (नीचे),igenomes (ज), भी संवाददाता अभिव्यक्ति (ई) के लिए अग्रणी.

चित्रा 4
चित्रा एक tetracistronic minigenome साथ 4 trVLP परख. प्रकोष्ठों Ebola वायरस nucleocapsid प्रोटीन के लिए अभिव्यक्ति plasmids (एनपी, VP35, VP30, एल), एक tetracistronic minigenome (एमजी) और T7 पोलीमरेज़ साथ ट्रांसफ़ेक्ट हैं. प्रारंभिक प्रतिलेखन (एक), encapsidation (ख), जीनोम प्रतिकृति (ग) और प्रतिलेखन (घ) के रूप में भी अनुवाद (ई) एक monocistronic minigenome परख में के रूप में हो. हालांकि, संवाददाता mRNA के अलावा, mRNAs VP40 के लिए, जीपी 1,2 और VP24 भी trVLPs के गठन में जिसके परिणामस्वरूप, tetracistronic minigenome से लिखित रहे हैं (च). ये trVLPs nucleocapsid प्रोटीन एनपी, VP35, VP30 और एल, साथ ही सेलुलर Ebola वायरस के लिए अभिव्यक्ति plasmids के साथ pretransfected गया है कि लक्ष्य कोशिकाओं को संक्रमितलगाव कारक टिम -1, ताजा लक्ष्य कोशिकाओं को संक्रमित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि trVLPs के जीनोम प्रतिकृति और प्रतिलेखन, और उत्पादन में जिसके परिणामस्वरूप.

चित्रा 5
लगातार 3 मार्ग के लिए एक tetracistronic trVLP परख की चित्रा 5 समय. कोशिकाओं कोशिकाओं और trVLPs (एच) (i), मध्यम परिवर्तन (सी) और कटाई, (एस) कोशिकाओं बोने transfecting कोशिकाओं (टी), संक्रमित करने के लिए दिन हैं लगातार तीन मार्ग के लिए संकेत (तीर द्वारा संकेत).

चित्रा 6
एक tetracistronic trVLP परख में मनाया संवाददाता गतिविधि की चित्रा 6 विशिष्ट स्तर. एक tetracistronic trVLP परख protoc निम्नलिखित 5 मार्ग पर प्रदर्शन किया गया थाराजभाषा इस पांडुलिपि में उल्लिखित. एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में अभिव्यक्ति प्लाज्मिड एन्कोडिंग एल P0 उत्पादक कोशिकाओं के अभिकर्मक से (एल) छोड़ा गया था. P5 luminometer की पृष्ठभूमि शोर एक धराशायी लाइन के रूप में संकेत दिया है एल सहित सभी nucleocapsid प्रोटीन, के लिए अभिव्यक्ति plasmids के साथ ट्रांसफ़ेक्ट थे मार्ग में लक्ष्य कोशिकाओं P1. इसका मतलब है और 3 स्वतंत्र प्रयोगों से 4 जैविक प्रतिकृति का मानक विचलन दिखाए जाते हैं.

चित्रा 7
Tetracistronic trVLPs का उपयोग वायरल जीवन चक्र पर विभिन्न वायरल और सेलुलर कारकों के प्रभाव का आकलन चित्रा 7. टिम-1 एक लगाव कारक के रूप में (ए). TET से संक्रमित थे nucleocapsid प्रोटीन के लिए और साथ या (15 में वर्णित) टिम-1 के लिए एक प्लाज्मिड एन्कोडिंग बिना एन्कोडिंग अभिव्यक्ति plasmids के साथ pretransfected गया कि लक्ष्य कोशिकाओंracistronic trVLPs. P1 लक्ष्य कोशिकाओं में 72 घंटे के बाद संक्रमण संवाददाता गतिविधि निर्धारित किया गया था. इसका मतलब है और 4 स्वतंत्र प्रयोगों से 4 जैविक प्रतिकृति का मानक विचलन. (बी) के प्रभाव जीनोम प्रतिकृति और प्रतिलेखन पर एल के आरएनएआई पछाड़ना के दिखाए जाते हैं. के खिलाफ निर्देशित nucleocapsid घटकों के लिए अभिव्यक्ति plasmids के साथ pretransfected गया कि लक्ष्य कोशिकाओं, टिम -1 और miRNAs एल (एंटी एल) या (15 में वर्णित) एक असंबंधित प्रोटीन (विरोधी GFP) tetracistronic trVLPs से संक्रमित थे. P1 लक्ष्य कोशिकाओं में 72 घंटे के बाद संक्रमण संवाददाता गतिविधि निर्धारित किया गया था. इसका मतलब है और 2 स्वतंत्र प्रयोगों से 5 जैविक प्रतिकृति का मानक विचलन दिखाए जाते हैं. (सी) प्रभाव म्यूटेशन की trVLP संक्रामकता पर minigenome में. एक tetracistronic trVLP परख एक जंगली प्रकार minigenome (4cis-WT) या एक minigenome में या तो उपयोग किया गया था 3 रोक codons व्यक्त ओ खत्म, VP24 की शुरुआत कोडोन के तुरंत बाद शुरू किया गया था जोच इस प्रोटीन लेकिन P0, P1 और p2 में आदि लंबाई, न्यूक्लिक एसिड कम्पोजिशन, माध्यमिक संरचनाओं रिपोर्टर गतिविधि के संबंध में minigenome के लिए ही कम से कम परिवर्तन शुरू अभिकर्मक / संक्रमण के बाद 72 घंटा मापा गया था. इसका मतलब है और 3 स्वतंत्र प्रयोगों से 3 जैविक प्रतिकृति का मानक विचलन दिखाए जाते हैं.

उत्पादक कोशिकाओं (P0) लक्ष्य कोशिकाओं (P1 और अधिक)
pCAGGS एनपी 125 125
pCAGGS-VP35 125 125
pCAGGS-VP30 75 75
1000 1000
p4cis-vRNA-RLuc 250 -
pCAGGS-T7 250 -
pCAGGS-Tim1 - 250

तालिका 1 डीएनए अभिकर्मक के लिए बराबर है. निर्माता और लक्ष्य कोशिकाओं के अभिकर्मक के लिए आवश्यक प्रत्येक प्लाज्मिड की राशि 6 अच्छी तरह से थाली की अच्छी तरह से प्रति एनजी में दिखाया गया है. सभी plasmids वाट एट अल 15 में वर्णित हैं.

Discussion

इस पांडुलिपि में वर्णित tetracistronic trVLP परख कई संक्रामक चक्र पर Ebola वायरस के जीवन चक्र की मॉडलिंग की अनुमति देता है. महत्वपूर्ण बात है, इस प्रणाली में उत्पादित trVLPs साथ Ebola वायरस के जीनोम का लगभग 60% है और वायरल प्रतिकृति के लिए आवश्यक हैं जो nucleocapsid प्रोटीन एनपी, VP35, VP30, और एल, के लिए आनुवंशिक जानकारी शामिल नहीं है. बल्कि, ये प्रोटीन अभिव्यक्ति plasmids से ट्रांस में लक्ष्य कोशिकाओं में उपलब्ध कराया जाना है, और न उन प्रोटीनों के सभी 4 व्यक्त कोशिकाओं के किसी भी संक्रमण निष्फल है. महत्वपूर्ण बात है, filoviruses के लिए आनुवंशिक पुनर्संयोजन का कोई सबूत नहीं है, और tetracistronic minigenome और nucleocapsid प्रोटीन के लिए अभिव्यक्ति plasmids के बीच साझा नहीं मुताबिक़ क्षेत्रों रहे हैं. इसलिए, किसी भी व्यावहारिक सबूत न ही तो संभवतः में हो सकता है कि पैदा पूर्ण लंबाई Ebola वायरस जीनोम की संभावना के लिए प्रदान कर सकता है कि किसी भी सैद्धांतिक आधार न तो हैBSL2 परिस्थितियों में उपयोग के लिए इस प्रणाली को सुरक्षित बनाने संक्रामक Ebola वायरस का उत्पादन,.

दो महत्वपूर्ण trVLPs का उत्पादन यानी, प्रयोगात्मक शर्तों से प्रभावित हैं कि tetracistronic trVLP परख में कदम है, और इन trVLPs साथ लक्ष्य कोशिकाओं के संक्रमण होते हैं. TrVLPs का उत्पादन बारी में एक उच्च अभिकर्मक प्रभावकारिता पर निर्भर है जो minigenome प्रतिकृति और प्रतिलेखन, के उच्च स्तर पर निर्भर है. अभिकर्मक प्रभावकारिता आसानी एल के लिए अभिव्यक्ति प्लाज्मिड एन्कोडिंग EGFP एक प्लाज्मिड अभिव्यक्ति के लिए बातचीत की है जिसमें एक एल नियंत्रण, सहित द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है. इन शर्तों के तहत अभिकर्मक दरों में एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप 24 घंटे के बाद अभिकर्मक के साथ निरीक्षण से 50% से अधिक होना चाहिए. इसके अलावा, कोशिकाओं नाटकीय रूप से minigenome प्रतिकृति और प्रतिलेखन (अप्रकाशित डेटा) impairs हमारे अनुभव माइकोप्लाज्मा संदूषण में के बाद से, माइकोप्लाज्मा से मुक्त होना है. कारण उनके उच्च transfectability 293 CE के लिएLLS trVLP assays के लिए पसंद की सेल लाइन कर रहे हैं; हालांकि, इन कोशिकाओं Ebola वायरस 16 से संक्रमण के लिए (पूरी तरह से अपवर्तक नहीं यद्यपि) अपेक्षाकृत खराब अतिसंवेदनशील होते हैं. ऐसे टिम-1 के रूप में एक लगाव कारक की अभिव्यक्ति trVLPs साथ 293 कोशिकाओं के बारे में 100 गुना का संक्रमण को बढ़ाता है, और कई मार्ग पर इस प्रणाली की सफलता के लिए महत्वपूर्ण है.

Tetracistronic trVLPs अपने दम पर आत्म नकल नहीं कर रहे हैं, वे nucleocapsid प्रोटीन व्यक्त कि कोशिकाओं में आत्म नकल कर रहे हैं. जैसे, सावधानियों (minigenome में विभिन्न परिवर्तन के साथ जैसे,) विभिन्न trVLPs युक्त कुओं के बीच पार संदूषण से बचने के लिए किया जाना है. एक अधिक तकनीकी दृष्टि से, इस वजह से यह परख (लगभग 4 लॉग) में सकारात्मक और नकारात्मक संकेतों के बीच बड़ा अंतर करने के लिए, नमूने के बीच पार बात एक मुद्दा हो सकता luciferase गतिविधि को मापने जब; बहरहाल, यह आसानी से में प्रत्येक नमूने के बीच एक खाली अच्छी तरह से छोड़ने से बचा जा सकता हैLuciferase गतिविधि को मापने के लिए इस्तेमाल किया 96 अच्छी तरह से थाली.

Tetracistronic trVLPs के लिए संभव अनुप्रयोगों के एक भीड़ हैं. संक्रामक trVLPs संक्रामक filoviruses 14 के विशिष्ट धागे जैसी संरचना है, और filovirus कणों के रूप में एक ही वायरल घटक होते हैं, क्योंकि जाहिर है, वे filovirus कणों की प्रविष्टि का अध्ययन करने के लिए अच्छी तरह से अनुकूल हैं. मामला है pseudotyped virions या ऐसे जीपी 1,2 व्यक्त पुनः संयोजक vesicular stomatitis वायरस के रूप में रेट्रोवायरस जीपी 1,2 असर कणों, या पुनः संयोजक वायरस, वायरस की तरह कणों का उपयोग करते समय महत्वपूर्ण बात है, वे अन्य वायरस के घटक शामिल नहीं है . लगाव कारकों के लिए आवश्यकता इस प्रणाली में लक्ष्य कोशिकाओं के रूप में 293 कोशिकाओं का उपयोग करते समय, के लिए स्क्रीन करने के लिए शोषण किया है और इस तरह के लगाव कारकों की भूमिका की जांच की जा सकती है, जबकि इस तरह के जीनोम प्रतिकृति और प्रतिलेखन में शामिल लोगों के रूप में अन्य सेलुलर कारकों की भूमिका के साथ ही morphogenesis और कलीडिंग, आरएनएआई प्रौद्योगिकी का उपयोग कर जांच की जा सकती है. एक VP40, जीपी 1,2, और VP24 जबकि वायरल प्रतिलेखन के बाद व्यक्त कर रहे हैं कि मन में रखने के लिए है, हालांकि वायरस के जीवन चक्र पर वायरल प्रोटीन में परिवर्तन के प्रभाव का भी अध्ययन किया जा सकता है, अन्य वायरल प्रोटीन की अभिव्यक्ति अभिव्यक्ति से हासिल की है प्लास्मिड, कि इतना होने के कारण इन प्रोटीनों की overexpression के प्रभाव को ध्यान में रखा जाना है. इसके अलावा, केयर संवाददाता गतिविधि सीधे minigenome लंबाई 15 से प्रभावित है क्योंकि minigenome में म्यूटेशन काफी minigenome की लंबाई को बदल नहीं है कि लिया जाना चाहिए. Tetracistronic minigenomes वायरल जीन ले, और वायरल पोलीमरेज़ जटिल से दोहराया है कि वायरल जीनोम analogues हैं क्योंकि अंत में, यह भी BSL2 परिस्थितियों में म्यूटेशन के जवाब में इन जीनों के विकास का अध्ययन करने के लिए संभव होना चाहिए. आगे की पढ़ाई अब भी इस दिशा में जरूरत है, जबकि इस प्रकार, यह संभव होना चाहिए, उदाहरण के लिए, suboptimal शुरू करने कीminigenome और फिर बीतने trVLPs भीतर जीन में म्यूटेशन मानार्थ म्यूटेशन उभरने तक.

ध्यान में रखा जाना है कि tetracistronic trVLP परख की एक सीमा है कि यह मॉडल वायरस के जीवन चक्र के अधिकांश, लक्ष्य कोशिकाओं में प्राथमिक प्रतिलेखन लक्ष्य कोशिकाओं ट्रांस में nucleocapsid प्रोटीन व्यक्त करने के बाद से, इस प्रणाली से मॉडलिंग की नहीं है, जबकि तथ्य यह है कि trVLPs को दोहराने के लिए के लिए आदेश में. प्राथमिक ट्रांसक्रिप्शन का मूल्यांकन किया जाना है, तो यह भोले लक्ष्य कोशिकाओं 10 उपयोग करने के लिए संभव है; हालांकि, इस मामले में कोई जीनोम प्रतिकृति लक्ष्य कोशिकाओं में जगह लेता है, और आगे कोई संक्रामक trVLPs संक्रमण छोड़, उत्पादन कर रहे हैं. यह वास्तविक संक्रामक पुनः संयोजक Ebola वायरस में उन्हें बारी होगी जो minigenome में nucleocapsid प्रोटीन के लिए जीन, सहित से, पूरी तरह से आत्म नकल trVLPs प्रतिपादन के बिना दूर नहीं किया जा सकता है कि एक प्रमुख समस्या है. वास्तव में, Ebolluciferase या अन्य पत्रकारों को उत्पन्न किया गया है और आकलन और जीनोम प्रतिकृति और प्रतिलेखन 17,18 अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जा सकता व्यक्त एक वायरस; हालांकि, उनके उपयोग BSL4 प्रयोगशालाओं तक ही सीमित है. इसके अलावा, यह VP40, जीपी 1,2, और VP24 है, जबकि एक वायरल जीनोम एनालॉग से minigenome में अपनी स्थिति व्यक्त कर रहे हैं कि ध्यान में रखा जाना है (2, 3, और 4 वें ट्रांसक्रिप्शनल इकाई) के समान नहीं है एक दूसरे के लिए सम्मान के साथ उनकी पूर्ण अभिव्यक्ति के स्तर है, साथ ही उनके रिश्तेदार अभिव्यक्ति के स्तर को प्रभावित कर सकता है जो वायरल जीनोम में अपनी स्थिति (3, 4 वें, और 6 वें ट्रांसक्रिप्शनल इकाई),.

कुल मिलाकर, tetracistronic trVLP परख तारीख को उपलब्ध Ebola वायरस के लिए सबसे व्यापक जीवन चक्र मॉडलिंग प्रणाली का प्रतिनिधित्व करता है, और लगाव और एन के साथ ही, जीनोम प्रतिकृति और प्रतिलेखन, कण morphogenesis और नवोदित की मॉडलिंग की अनुमति देता हैकई संक्रामक चक्र से अधिक लक्ष्य कोशिकाओं में प्रयास करें. जैसे, यह BSL2 परिस्थितियों में Ebola वायरस की जीव विज्ञान की जांच में इस्तेमाल के लिए जबरदस्त क्षमता है.

Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषणा.

Acknowledgments

लेखकों बॉब फिशर (एल.वी., डीआईआर, NIAID, एनआईएच), बयान के रूप में काम कर चुके हैं, साथ ही ऑस्टिन Athman (RTB, डीआईआर, NIAID, एनआईएच) और मेगन मॉर्गन (DOHS, ओआरएस, आयुध डिपो, एनआईएच) के लिए करने के लिए बहुत आभारी हैं इस पांडुलिपि के साथ फिल्म बनाने के साथ उनकी मदद करते हैं. इसके अलावा, हम पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए एलीसन Groseth (एल.वी., डीआईआर, NIAID, एनआईएच) को धन्यवाद देना चाहूंगा. इस शोध एनआईएच, NIAID के अंदर का रिसर्च प्रोग्राम द्वारा समर्थित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
75 cm2 Cell culture flask Corning  430641
DMEM Sigma D6546 preheat to 37 °C prior to use
FBS Life Technologies 26140-079 heat inactivate 30 min @ 56 °C
L-Glutamine Life Technologies 25030-081 100x
Pen/strep Life Technologies 15070-063 100x
0.25% Trypsin-EDTA Life Technologies 25200-056
PBS 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2PO4, H2O add 1 L; autoclave and store at room temperature 
6-well Plates Costar 3516
Opti-MEM I Life Technologies 31985-070
Transit LT1 Mirus MIR 2300
Glo lysis buffer Promega E2661
Renilla Glo luciferase assay system Promega E2720
96-well Assay plate (white) Costar 3912
Modulus microplate luminometer Turner Microsystems 998-9300

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References

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