Die Mesenteriallymphknoten Duct Cannulated Rattenmodell: Anwendung auf die Bewertung der Darm Lymphatische Drug Transport

Immunology and Infection

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Trevaskis, N. L., Hu, L., Caliph, S. M., Han, S., Porter, C. J. The Mesenteric Lymph Duct Cannulated Rat Model: Application to the Assessment of Intestinal Lymphatic Drug Transport. J. Vis. Exp. (97), e52389, doi:10.3791/52389 (2015).

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Abstract

Die Darm Lymphsystem spielt eine Schlüsselrolle in den Flüssigkeitstransport, Lipidabsorption und Immunfunktion. Lymph fließt direkt aus dem Dünndarm über eine Reihe von Lymphgefäßen und Knoten, die an der oberen Mesenteriallymphknoten Kanal konvergieren. Kanülierung der Mesenteriallymphknoten Kanal ermöglicht somit die Sammlung von Mesenteriallymphknoten aus dem Darm fließt. Mesenteriallymphknoten aus einer Zellfraktion von Immunzellen (99% Lymphozyten), wässrige Fraktion (Flüssigkeit, Peptide und Proteine, wie Zytokinen und Darmhormone) und Lipoproteinfraktion (Lipide, lipophile Moleküle und apo-Proteine). Die Mesenteriallymphknoten Kanal Kanülierung Modell kann daher verwendet, um die Konzentration und die Geschwindigkeit der Beförderung einer Reihe von Faktoren aus dem Darm über das lymphatische System zu messen. Änderungen dieser Faktoren in Reaktion auf verschiedene Herausforderungen (zB Diäten, Antigene, Medikamente) und bei Krankheiten (zB entzündliche Darmerkrankung, HIV, Diabetes) kann auch be bestimmt. Ein Bereich des expandierenden Interesse ist die Rolle des lymphatischen Transport bei der Absorption von oral verabreichtem lipophile Arzneimittel und Prodrugs, die mit Darmlipidaufnahmewege zuzuordnen. Hier beschreiben wir im Detail eine Mesenteriallymphknoten Kanal kanülierten Ratten-Modell, die Bewertung der Geschwindigkeit und Ausmaß der Lipid- und Wirkstofftransport über das lymphatische System ermöglicht mehrere Stunden nach einer Darm Lieferung. Das Verfahren ist leicht an die Messung von anderen Parametern in der Lymphe. Wir bieten ausführliche Beschreibungen der Schwierigkeiten, die bei der Festlegung dieser komplexen chirurgischen Verfahren auftreten können, sowie repräsentative Daten aus fehlgeschlagenen und erfolgreichen Experimenten Anleitung zur experimentellen Erfolg zu bestätigen und die erhaltenen Daten zu interpretieren ist.

Introduction

Lymph fließt aus dem Dünndarm über eine unidirektionale Prozess, die zu einem Einzel Lacteals die innerhalb jeder Dünndarmzotten 1 enthalten sind, stammt. Lacteals sind relativ durchlässig für Flüssigkeit, Makromoleküle und Zellen und Lymphbildung damit beginnt mit der Eingabe von diesen Faktoren Lacteals. Der anfängliche Lymphe in den Chylusgefässe fließt anschließend aus dem Darm über ein Netz von lymphatischen Mikrogefäße, Sammeln (afferenten) Lymphgefäße, eine Reihe von Mesenteriallymphknoten und letztlich den postKnoten (efferenten) Lymphgefäße. Innerhalb der Knoten geht Lymphe durch eine Reihe von Markhöhlen, wo Austausch mit Knoten resident Immunzellen sowie Material in die Knoten aus dem Blut stattfindet. Alle Lymphe aus dem Dünndarm fließt schließlich konvergiert in den ableitenden überlegen Mesenteriallymphknoten Kanal und anschließend die Cisterna chyli. Die Cisterna chyli speichert auch Lymphdrainage die Schwanz peripheren Geweben, intestinal, Leber- und Lendenwirbelsäule und schließt sich dem Brust Lymphe Kanal zusammen mit Lymphe aus dem Mediastinum und Schädel Teile des Körpers. Der thorakale Lymphe Kanal mündet Lymphknoten direkt in das venöse System an der Verbindungsstelle der linken Vena jugularis und subclavia. Das hier beschriebene Protokoll, das die Sammlung von Lymphe aus der überlegenen Mesenteriallymphknoten Kanal ermöglicht direkt, erleichtert so die Analyse der verschiedenen Faktoren im Transit direkt aus dem Darm in die systemische (allgemein) Kreislauf über die Darm Lymphsystem.

Die wichtigsten physiologischen Funktionen der Darm lymphatische System zugeordnet sind, um eine Fluidgleichgewicht aufrechtzuerhalten, um Lipid und lipophilen Molekülabsorption zu erleichtern und die entsprechende Immunantworten 1 zu ermöglichen. Tumorzellen und Viren über die Darm Lymphgefäße 2-4 und wichtigsten Änderungen in den Lymphgefäßen treten in mehreren Entzündungs- und Stoffwechselerkrankungen 5-7 propagieren auch. Könnennulation der Mesenteriallymphknoten Kanal zu sammeln Lymphe in das Mesenterium ermöglicht eine Analyse der Hauptfluidströmung über die Darm Lymphgefäße sowie die Quantifizierung der Konzentration und der Transportgeschwindigkeit von verschiedenen Zellen und Moleküle. Änderungen in der Konzentration oder Transit dieser Faktoren in Reaktion auf verschiedene Herausforderungen (zB Diäten, Antigene, Medikamente) und in Krankheitsmodellen (zB Colitis, HIV, Diabetes) beurteilt werden kann. Während es unmöglich, jede lymph Komponente, die analysiert und verglichen werden können, hier ausführlich beschrieben ist, Mesenteriallymphknoten vereinfachend aus wässrigen, Lipid- und zellulären Phasen. Interessierenden Komponenten in der wässrigen Phase umfassen Peptide und Proteine, wie Antigene oder Tolerogene 8, Immunbotenstoffen wie Zytokinen und Mastzellmediatoren 9 und metabolische Mediatoren wie Inkretine 10. Die Zellfraktion des post-Knoten Mesenteriallymphknoten besteht fast vollständig (über 99%) der lymphocytes 11. Verschiedene Immunzellen (dendritische Zellen, Mastzellen, etc.) geben Sie die Vor-Knoten mesenterialen Lymphgefäße, bleiben aber innerhalb des Knotens 12. Wenn die Zellen in afferenten Lymphknoten von Interesse sind, ist es möglich, diese Zellen durch Entfernen des Mesenteriallymphknoten sammeln Knoten einige Tage vor der Kanülierung der Mesenteriallymphknoten Kanal 12. Auf diese Weise wird die zu- und abführenden Lymphbahnen direkt verbunden sind und die Lymphzellen in afferenten Lymphe passieren direkt in den Mesenteriallymphknoten Kanal. Die Transit-und Phänotyp der verschiedenen Immunzellen, die durch die Darm Lymphgefäße können so überprüft werden. Vielleicht die häufigste Ursache für das Sammeln Mesenteriallymphknoten bisher zitierten, jedoch ist die Darmverarbeitung, Absorption und den Transport von Nahrungslipiden und lipophile Moleküle 10 zu studieren.

Nach Einnahme werden die Nahrungslipiden verdaut (beispielsweise aus Triglyceriden zu Fettsäuren und Monoglyceride, phospholipid Fettsäuren und Lysophospholipid und Cholesterinester zu Fettsäure und Cholesterin, etc.) und aus dem Darmlumen in kleine Mizellen und vesikuläre Strukturen durch die Zugabe von Amphiphilen von Gallen dispergiert (Phospholipide, Cholesterin und Gallensalze) und die Wirkung von Pankreasenzyme 10,13. Von hier aus werden sie in Enterozyten absorbiert. Ein Teil der absorbierten Komponenten werden erneut veresterte Triglyceride, Phospholipide und Cholesterinester in der absorptionsfähigen Zellen (Enterozyten) zu bilden. Diese Wieder verestert Lipide werden aus einer Kombination von exogen aufgenommen Lipidkomponenten und endogene Lipidkomponenten aus dem sezernierten Gallen, Schleimhautlipidpools oder intestinalen Blutversorgung 13 zusammengesetzt. Von hier werden die veresterten Lipide entweder innerhalb Enterozyten gespeichert oder in Darm Lipoproteine ​​(Chylomikronen, Lipoproteinen sehr niedriger Dichte (VLDL)), zusammen mit verschiedenen Apoproteine ​​und andere lipophile Moleküle (gebaut 10,13. Nach dem Austritt aus Enterozyten Lipoproteine ​​sind spezifisch aus dem Darm in den systemischen Kreislauf über den mesenterischen Lymphsystem transportiert, da die Darm Lacteals durchlässiger sind, ihre Eingabe über das Darm Blutkapillaren. Ein Anteil der absorbierten Lipidkomponenten sind ebenfalls aus dem Darm in die Blutkreislauf über die Blutkapillaren und Pfortader als einzelne, nicht-Lipoprotein-assoziierten transportiert Moleküle 14. Im Allgemeinen ist jedoch die Pfortader Transportweg nur ein wichtiger Akteur bei der Aufnahme von kurz- und mittelfristigen Kettenlänge Lipiden.

Die Sammlung von Mesenteriallymphknoten ermöglicht somit die Bewertung der Transport von Lipoproteinen und zugehörige Komponenten (Lipide, lipophile Moleküle, apo-Proteine) aus dem Darm. Die Lipoproteine ​​können quantifiziert werden und dadurch mit dem Vorteil, dass Mesenteriallymphknoten Lipoproteine, sind im allgemeinen in einer nascenT-Zustand, da sie nicht ausführlich durch systemische Enzyme, wie Lipoproteinlipase 15 modifiziert. Während die Mesenteriallymphknoten kanülierte Ratten-Modell hat vielleicht historisch am besten unter zur Analyse von Lipid / Lipoprotein-Transport aus dem Darm beschrieben, ist ein Bereich der expandierenden Interesse die Rolle von Lymphgefäßen in den Transport von lipophilen Arzneimitteln, Prodrugs und andere Xenobiotika 13,16 das ist der Schwerpunkt des hier beschriebenen Modells. Lipophile Medikamente (im allgemeinen solche mit log P> 5 und Löslichkeit in langkettigen Triglycerid> 50 mg / g, obwohl Ausnahmen offensichtlich sind) 17,18, Prodrugs 19 und anderen Fremdstoffen 13,16 kann der Zugriff auf die Darm Lymphgefäße entweder passiv oder gewinnen aktiv die Integration in Darm-Lipoprotein Transportwege 19.

Die Ratte Mesenteriallymphknoten Kanülierung Technik hat somit viele Anwendungen. Bollmann et al. Beschriebenen ersten einen technique die Mesenteriallymphknoten Kanal in Ratten 1948 20 kanülieren. Seitdem wurde eine Vielzahl von Variationen des Modells beschrieben. So kann beispielsweise auftreten, wenn die Sammlung Ratte ist mit verschiedenen Anästhetika 21,22 betäubt oder im bewussten Zustand zurückgehalten, während 15 oder frei beweglichen 23,24. (- 5 ml / h in der Regel 0) 25 Ratten unterschiedliche Rehydratationslösungen und andere Substanzen, wie Lipide und Arzneimittelformulierungen mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten in den Magen, Darm oder parenteral verabreicht werden. In einigen Studien wurde die thorakale Lymphe Kanal anstatt Mesenteriallymphknoten Kanal Kanüle eingeführt, um den Transport vom Darm über die Lymphbahnen zu schätzen, obwohl dies Transit aus dem Dünndarm überschätzen, in Abhängigkeit von der Faktor von Interesse, da die Brust Lymphe Kanal empfängt auch Lymphe anderer Regionen 22,26. Lymph Kanülierung Modelle wurden auch in einigen anderen Spezies einschließlich Mäusen 15,27, Mini pi beschriebengs 12, Schafe 28,29, Schweine und Hunde 30 31. Allerdings ist der Rattenmodell der am weitesten und konsistent zitiert. Detaillierte Protokolle für die Kanülierung der Mesenteriallymphknoten Kanal gefolgt von Sammlung von Lymphe in bewusster 25 oder 22 narkotisierten Ratten und Mäusen 15,27 vorher veröffentlicht worden und der interessierte Leser wird auf diese Protokolle gerichtet. Dieses Protokoll ist die erste, die Technik in eine visualisierte Format zeigen.

Die Lymphe kanülierten Ratten-Modell hat Vorteile gegenüber größeren Tiermodellen in Bezug auf die Kosten, die Leichtigkeit der Operation und ethische Erwägungen. Im Vergleich zum Maus-Modell, ist Mesenteriallymphknoten Kanülierung Chirurgie auch einfacher in der Ratte, obwohl die Maus-Modell ermöglicht genauere Untersuchungen in transgenen Tieren 27. Dennoch gibt es einige Einschränkungen des Rattenmodells, insbesondere mit Unterschieden in der Physiologie assoziiert werden können und die extrapolatIon zu anderen präklinischen und klinischen Situationen. Zum Beispiel bei der Ratte Gallenfluss konstant und unabhängig von der Nahrungsaufnahme während in höheren Arten Essen ist oder Lipide zu stimulieren Gallenfluss 32. Dies schafft Herausforderungen für den Erhalt Vertreter vor und nach dem Essen-Umgebungen in der Ratte, das, was in größeren Arten und Menschen gesehen zu reflektieren. Für den Wirkstofftransport Studien, können die größeren Arten auch bei der Beurteilung Lymphtransports nach der Verabreichung von realistischen menschlichen Dosis bildet 25 vorzuziehen. In einer aktuellen Studie wurden Lipidtransport im Mesenteriallymphknoten gefunden über Artgrenzen (Maus, Ratte, Hund) nach Verabreichung einer äquivalenten Masse und Art der Lipid, das ein gewisses Vertrauen in die Extrapolation Lipidtransport von Daten über Arten 27 liefert vergleichbar sein. Doch der Transport eines Modells lipophiles Arzneimittel, Halofantrin, in der Reihenfolge der Tiergröße (dh Hund> Ratte> Maus) eingestuft. Ein Skalierungsfaktor kann somit ex erforderlichtrapolate lymphatischen Medikamententransportdaten von der Ratte auf andere Arten.

Eine Beschränkung der Lymphe Kanülierung Modelle im Allgemeinen ist, dass passive Lymphe Sammlung direkt von einer lymphatischen Kanal kann Lymphfluss und Transport ändern, da Lymphgefäße arbeiten gegen ein Druckgefälle, die geändert wird, wenn das Schiff eine Kanüle 33. Die Lymphe Kanülierung Modell kann auch schwierig sein, in Laboratorien, die nicht vertraut mit der Technik sind zu etablieren. Alternative Modelle wurden somit beschrieben worden. Zum Beispiel kann die Durchfuhr von Faktoren über den Darm lymphatischen Systems, wie Lipoproteine ​​und lipophile Moleküle, wurde indirekt über die Sammlung von Blut untersucht. Ein solches Modell beinhaltet den Vergleich Blutkonzentrationen von Lipiden und / oder Drogen nach oraler Verabreichung in der Anwesenheit und Abwesenheit von Inhibitoren (zB Colchicin, Pluronic L81, Cycloheximid) von Darm Lipoprotein-Produktion, die Lymphtransports 34 zu blockieren. Ein Vorteilvon Modellen, die Lymphtransports quantifizieren indirekt über Entnahme von Blutproben ist, dass es ermöglicht eine Bewertung der Lymphtransports beim Menschen als invasive Chirurgie ist nicht erforderlich 35. Inhibitoren der Lymphtransports sind jedoch nicht spezifisch, und Faktoren, die durch die Lymphgefäße transportiert werden verdünnt und in den systemischen Kreislauf, die eine solche Beurteilung erschwert modifiziert. In vitro-Alternativen sind ebenfalls beschrieben worden. Beispielsweise wurden Caco-2-Zellkulturen oder isolierte Enterozyten verwendet worden, um genauer zu untersuchen die intestinale Sekretion von Molekülen, die Lymphgefäße 36-38 einzugeben. Eine fortschrittliche In-vitro-Modell, das eher dem menschlichen Darm-Mikroumgebung ist auch kürzlich beschrieben 39. In diesem Modell wird eine lymphatische endotheliale Zellschicht co-kultiviert mit Caco-2-Zellen, die eine detaillierte Analyse der Übergang von Stoffen aus dem Darm in das Lymphsystem zu können. Jedoch in vitro Zellsystemen fehlt Wechselstrom und übertragen also die Zusammenschaltung mit einem Darmlumen und die zugrunde liegenden Blut-und lymphatischen Gefäßversorgung. In einem alternativen Ansatz Kassis et al. Wurde ein Dual-Channel (High-Speed-Hellfeld-Video und Fluoreszenz) in situ-Bildgebungssystem, das quantitative Vergleiche zwischen Gefäßkontraktion, den Lymphfluss und fluoreszierende Lipidkonzentrationen in mesenterialen Lymphgefäße 33 ermöglicht. Ein Vorteil dieses Modells gegenüber dem oben erwähnten in-vitro-Systemen ist, dass es ermöglicht, eine genaue Überwachung des Durchgangs von Immunzellen durch die Lymphgefäße. Absolute Messung von Massen Lipid (oder Drogen) Transport sind jedoch noch nicht mit bildgebenden Verfahren fest In vitro. Und in silico Ansätze speziell vorherzusagen das Ausmaß der lipophilen Wirkstofftransport über die Darm Lymphgefäße wurden ebenfalls veröffentlicht 40-42. Zum Beispiel kann die ex vivo-Affinität von mehreren compounds für Plasma Chylomikronen erwies sich recht gut mit ihren lymphatischen Transport in vivo 41 korrelieren. Anschließend etablierte eine dieselbe Gruppe in silico-Modell der Drogenaffinität für Chylomikronen basierend auf mehreren physikalisch-chemischen Eigenschaften 40 vorherzusagen. Holm et al. Darüber hinaus ein in silico-Modell relativ komplex komplett zu prognostizieren lymphatischen Transport lipophiler Verbindungen auf der Basis der molekularen Deskriptoren 42. Diese Modelle können einen sinnvollen Ansatz, um das Ausmaß des lymphatischen Transport von unbekannten Drogen vorherzusagen ist. Validierung der Modelle mit einer breiten Palette von Medikamenten und in verschiedenen Labors werden jedoch aufgefordert werden, ihre Genauigkeit und Reproduzierbarkeit zu bestätigen.

Kanülierung der Mesenteriallymphknoten Kanal bleibt somit das einzige Mittel, um den Inhalt der Lymphdrainage des Dünndarms und der Transitgeschwindigkeit des komplexen Reihe von Faktoren (Zellen, Proteine ​​direkt zu untersuchen,Peptide, Lipide, Arzneimittel) in der Lymphe bei einer in vivo-Situation. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Kanülierung der Mesenteriallymphknoten Kanal und Halsschlagader, die die Sammlung von Mesenteriallymphknoten und systemischen Blut von narkotisierten Ratten ermöglicht. Repräsentative Daten zeigen, wie das Modell verwendet, um Lipid- und Arzneistofftransport aus dem Darm über die mesenterischen Lymphsystem zu untersuchen. Dies wird durch eine Erörterung der Schwierigkeiten, die bei der Festlegung des Modells sowie Informationen zur Fehlerbehebung auftreten können, gefolgt. Einmal etabliert das Modell ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um Darm-lymphatischen Transport zu untersuchen.

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Protocol

Die in dieser Handschrift beschriebenen Untersuchungen wurden von der örtlichen Tierethikkommission genehmigt und wurden in Übereinstimmung mit dem australischen und neuseeländischen Rat für die Pflege der Tiere in der Forschung und Lehre Leitlinien. Vor dem Beginn einer Tierverfahren, sicherzustellen, dass die entsprechende Genehmigung durch die lokale Institution / Organisation erhalten. Wie bei allen Tierarztpraxen, sicherzustellen, dass die Operation durch entsprechend geschultes Personal unter aseptischen Bedingungen und Anästhetika, Analgetika und Antibiotika verabreicht werden, wenn erforderlich, um eine ethische und erfolgreich gestalten zu gewährleisten, durchgeführt.

1. Vorbereitungen am Tag vor dem chirurgischen Eingriff

  1. Schnell sich die Ratte in der Nacht vor der Operation, wenn erforderlich. Sicherstellen, dass die Ratte hat freien Zugang zu Wasser.
  2. Bereiten Sie die Lösungen, um die Ratten verabreicht werden.
    1. Bereiten Sie eine Rehydrationslösung wie sterile Kochsalzlösung oder Ringer-Lösung.
    2. Bereiten Sie einästhetische Lösungen nach Bedarf. Die in den hier beschriebenen Experimenten verwendeten Narkose bestand aus "Cocktail 1", hergestellt durch Kombinieren von 1,9 ml Ketamin 100 mg / ml, 0,5 ml Xylazin 100 mg / ml, 0,2 ml Acepromazin 10 mg / ml und 2,5 ml Kochsalzlösung und " Cocktail 2 ", die aus 1 ml Ketamin 100 mg / ml und 0,1 ml Acepromazin 10 mg / ml. HINWEIS: Inhalierte Isofluran oder Sevofluran bevorzugt, da es eine chirurgische Anästhesieebene für einen längeren Zeitraum bereitzustellen.
    3. Gegebenenfalls Herstellung einer Formulierung, die das Medikament in beispielsweise eine Lipidemulsion. Führen entsprechende Stabilitätsstudien, um die Stabilität der Formulierung über den Zeitraum der Speicherung und Verwaltung zu gewährleisten.
      HINWEIS: Die genaue Art der Formulierung und zu verabreichende Arzneimittel wird mit jeder Studie als Ziel der lymphatischen Arzneimitteltransportstudien unterschiedlich ist meist, die Effizienz der lymphatischen Arzneimitteltransport in Abhängigkeit von der Formulierung und Drogenbehörden bewertenstr erten.
      1. Das in den repräsentativen Experimenten in Figur 4 und 5 hier verwendete Formulierung wird hergestellt, wie zuvor beschrieben 43. Kurz gesagt, übernehmen 14 C Ölsäure (2-5 uCi) und Halofantrin (200 ug) in 40 mg Ölsäure vor der Dispersion in 5,6 ml einer wßrigen Phase, bestehend aus 5 mM Natriumtaurocholat in phosphatgepufferter Salzlösung (pH 6,9).
      2. Für Formulierungen, die 2-Monoolein, fügen 7,1 mg 2-Monoolein zusammen mit anderen Komponenten, zu der wässrigen Phase bei der gleichen Zeit wie die Ölsäure enthaltenden Phase Halofantrin. Bereiten Sie die Formulierungen, die 2-Monoolein unmittelbar vor der Verabreichung an der Ratte, wie 2-Monoolein ist relativ instabil und isomerisiert zu 1-Monoolein.
      3. Anschließend Emulgieren der Formulierungen durch Ultraschall für 2 Minuten bei RT.
        HINWEIS: Wie zuvor beschrieben 43 worden ist, überwacht die Stabilität der Formulierungen durch i) Besichtigung des emulsion unter polarisiertem Licht zu, daß die Emulsion nicht abgetrennten Phase, ii) die Partikelgrößenanalyse unmittelbar nach der Herstellung und nach der Dosierung mit dynamischer Lichtstreuung, um einen Hinweis auf etwaige Phasenänderungen und / oder Trennung liefern zu gewährleisten, und iii) Analyse von Halofantrin Konzentrationen mit ein validiertes HPLC-Test.
  3. Bereiten Antikoagulans-Lösung, die 10 mg / ml EDTA in sterilem Wasser oder 10 IU / ml Heparin in Kochsalzlösung in die Lymphe Kanüle zu spülen. Auch bereiten Antikoagulans enthaltende Lösung von 2,5 bis 10 IU / ml Heparin in Kochsalzlösung, um die Halsschlagader Kanüle zu spülen.
  4. Bereiten Sie die Polyethylenkanüle zur Einführung in den Mesenteriallymphknoten Kanal (0,8 mm OD, 0,5 mm ID), Karotis (0,96 mm Außendurchmesser, 0,58 mm ID und 0,8 mm OD, 0,5 mm ID) und des Duodenums (0,96 mm Außendurchmesser, 0,58 mm ID )
    1. Schneiden die Kanülen in der gewünschten Länge (in der Regel 25 bis 30 cm für die Halsschlagader und Zwölffingerdarmkanüle und 10 bis 15 cm für die Lymphe cannula) und legen Sie eine Abschrägung an der Spitze der Kanülen mit einem sterilen chirurgischen Klinge (siehe Abbildung 1).
      HINWEIS: Dies erhöht die Einfachheit der Kanüle Einsetzen und verringert die Häufigkeit von Kanüle Blockade nach Einsetzen.
    2. Legen Sie eine J-Form Ankerpunkt in der intraduodenalen Kanüle von looping einen kleinen Teil der Kanüle auf sich selbst zurück, Erhitzen mit einem Feuerzeug oder Heizplatte und dann Zuschneiden (siehe Abbildung 1).
  5. Bringen Sie die Lymphe Kanüle zu einer 25 G-Nadel und Spritze, die ein Antigerinnungslösung (in Schritt 1.3) hergestellt. Füllen Sie die Lymphe Kanüle mit der Antikoagulans-Lösung und lassen Sie die Lösung in die Kanüle O / N, um die Inzidenz der Gerinnselbildung in der Lymphe Kanüle während Lymphe Sammlung zu reduzieren.
  6. Bereiten Rohre für Lymph- und Blutmusterkollektion. Pre-wiegen Lymphe Sammelröhrchen, Label Rohre für Lymph- und Blutprobensammlung und fügen Antikoagulans-Lösung. Ausreichend Antikoagulans solut20 IU / ml Heparin in der gesammelten Lymphe oder Blut - Ionen in einer Endkonzentration von 1 mg / ml EDTA in sterilem Wasser oder 10 zu erreichen.

2. Vorbereitungen Unmittelbar vor Beginn des chirurgischen Eingriffs

  1. Überprüfen Sie alle Kanülen durch Spülen mit steriler Kochsalzlösung oder gerinnungshemmenden Lösung, um sicherzustellen, dass sie Patent.
  2. Bereiten Sie die Ratte für den chirurgischen Eingriff.
    HINWEIS: Die Mesenteriallymphknoten Kanal ist bei Ratten, die gegessen haben, oder wurde eine Dosis von Öl verabreicht wie der Mesenteriallymphknoten milchig und undurchsichtig mit einem höheren Fettbelastung besser sichtbar. Einige Betreiber, vor allem diejenigen, die mit der Operation, daher fällt es leichter, die Mesenteriallymphknoten Kanal kanülieren bei Ratten mit einem Öl vordosierten (etwa 0,1 bis 1 ml) wie Oliven- oder Sojaöl 0,5 bis 2 Stunden vor Beginn der Operation . Allerdings wirkt Vordosierung Öl das lymphatische Transport von Lipiden, lipophilen Arzneimitteln und anderen Faktoren in der Lymphe, dass es möglicherweise nicht ideal vor Dosis Ölje nach Versuchsziel.
    1. Anesthetize die Ratte in der gesamten Operation und Probenerfassungszeitraum.
      1. So starten Sie die Anästhesie als subkutane Injektion von 1,5 ml / kg Cocktail I (aus Schritt 1.2.2) in eine Hautfalte auf der Rückseite des Halses Ratten mit einer 1 ml Spritze zu einer 25 G Nadel. Pflegen Sie die Narkose durch intraperitoneale Injektion von 0,44 ml / kg Cocktail 2 (aus Schritt 1.2.2) ungefähr jede Stunde, je nach Bedarf, mit einer 1 ml Spritze zu einer 25 G Nadel.
      2. Vor Beginn der Operation zu gewährleisten, dass die Tiefe der Anästhesie durch Beobachtung der Atemfrequenz, Whisker Bewegung, Muskeltonus und Reaktionen auf Reize wie Einklemmen des Fußes aus. Verwalten Sie zusätzliche Anästhesie erforderlich.
    2. Rasieren Sie das Fell von den chirurgischen Regionen, die auf die rechte Seite des Bauches für Lymphe und Zwölffingerdarm Kanülen sind, und den Hals und linken Schlüsselbein Region für Halsschlagader Kanületion.
    3. Reinigen Sie die OP-Regionen unter aseptischen Bedingungen mit Povidin-Jodlösung oder Chlorhexidin-Lösung und eine 70% Ethanol-Peeling. Wiederholen Sie diesen Vorgang 3-mal für jede Region, endet mit einem Abschlusspflege mit 70% Ethanol.
  3. Legen Sie das Tier in Rücken recumbence auf einem leeren Blatt über eine beheizte Operationsfeld (37 ° C).

3. Kanülierung der Mesenteriallymphknoten Duct

  1. Legen Sie das Tier mit seiner rechten Seite mit Blick auf den Bediener. Führen die Operation mit oder ohne die Hilfe eines Operationsmikroskops nach Bedarf.
  2. Öffnen Sie die obere Schicht der Bauchmuskelwand mit einem 4 cm langer Schnitt, der sich von der Mittellinie (Schwertfortsatz) auf der rechten Flanke ca. 2 cm unterhalb des Brustkorbs (Rippenbogen) mit einer sterilen Skalpellklinge (siehe 2B).
  3. Öffnen der restlichen Schichten der Bauchmuskelwand 4-5 mm lateral zur Mittellinie, um die rechte Flanke mit einem kleinen Paarvon chirurgische Scheren (siehe 2B).
  4. Fahren Sie den Dünndarm unter der linken Bauchmuskel Wand und halten Sie ihn mit 2-3 Stück steriler Gaze mit physiologischer Kochsalzlösung gesättigt.
  5. Überbrückung der Ratte über eine 10 ml-Kunststoffspritze horizontal unter dem Rücken der Ratte auf dem Niveau der rechten Niere zur Visualisierung der Mesenteriallymphknoten Kanal erleichtern platziert.
  6. Finde die überlegene Mesenteriallymphknoten Kanal: ein Gefäß ungefähr 0,5-1 mm im Durchmesser, die senkrecht zu der rechten Niere und unmittelbar rostral und parallel zu der mesenterialen Arterie (pulsierend dunkelrot Blutgefß, siehe Figur 2C).
    HINWEIS: Bei nicht-fastenden oder öl vordosiert Ratten der Behälter ist weiß, undurchsichtig und leichter zu visualisieren als im nüchternen Ratten, bei denen es ganz durchscheinend.
  7. Untersuchen Sie den Bereich unmittelbar kaudal der großen Superior Mesenteriallymphknoten Kanal und der A. mesenterica, um festzustellen, ob ein zweites, kleineres Zubehör Lymphe Kanalvorhanden. Falls vorhanden, blockieren den Fluss der Lymphe durch die Leitung durch Durchtrennen der Leitung und Verschließen mit Sekundenkleber oder Binden einer Naht um den Kanal, um sicherzustellen, dass das gesamte Volumen der Lymphe aus dem Darm strömt, von der übergeordneten Mesenteriallymphknoten Kanal gesammelt.
  8. Übergeben Sie ein Paar von geraden Pinzette durch die peri-Nierenfett Bett am unteren Rand der rechten Niere und durch die Bindegewebsschichten unmittelbar unterhalb der Vena Cava, in einer Richtung parallel mit der überlegenen Mesenteriallymphknoten Kanal.
  9. Mit der Spitze der Zange greifen Sie in die Lymphe Kanüle und ziehen Sie es durch die peri-Nierenfett-Bett mit einem Ende unmittelbar neben der Mesenteriallymphknoten Kanal und der andere von dem Tier auf der Ebene der rechten Niere exteriorisiert.
  10. Isolieren Sie die Mesenteriallymphknoten Kanal aus übereinander liegenden Schichten von Binde- und Fettgewebe stumpf. Achten Sie darauf, gewaltsam öffnen oder beschädigen die Lymphe Kanal.
  11. Nach der Trennung von Lymphe Kanal, einen kleinen hole in der Lymphe Kanal entweder mit Mikro-Schere, die scharfe Spitze der Pinzette Juwelier oder eine 25 G Nadel. Achten Sie darauf, den Behälter vollständig zu durchtrennen.
  12. Sicherzustellen, dass die Lymphe Kanüle vollständig mit Antikoagulans-Lösung (mit einer Spritze und 25 G Nadel) ohne Luftspalte gefüllt. Legen Sie die Lymphe Kanüle etwa 2-4 mm in der Mesenteriallymphknoten Kanal über das kleine Loch mit Hilfe einer kleinen Zange.
  13. Beachten Sie die Lymphe Kanüle für ein paar Minuten. Beobachten einer allmählichen Strömungs intestinaler Lymphe vom freien Sammel Ende der Kanüle, wenn die Kanülierung erfolgreich ist. Wenn die Kanülierung nicht erfolgreich ist, wiederholen Sie die Schritte 3,8 bis 3,12.
  14. Wenn die Kanülierung erfolgreich ist, sichern Sie die Kanüle, indem Sie einen kleinen Tropfen Kleber Tier über dem Eingang Loch in die Lymphe Kanal. Darauf achten, dass das Schiff über die Anwendung von Übertierhaft verschließen.
  15. In Erwartung der Tierhaft gesetzt, Beobachve den Fluss der Lymphe für mehrere Minuten, um sicherzustellen, dass das Kanülisier-Verfahren erfolgreich war. Sobald bestimmte der Erfolg der Kanüleneinführung, entfernen Sie die Gaze-Stücke, die in der Bauchhöhle sorgfältig platziert wurden und legen den Dünndarm in seine ursprüngliche Position.
  16. Legen Sie eine Lymphe Collection Tube mitsamt Antikoagulans (siehe Schritt 1.6) am Ende der Kanüle, die frei fließende Lymphe sammeln.
  17. Als nächstes kanülieren das Duodenum zur Infusion Rehydratationslösungen und / oder Formulierungen.

4. Kanülierung des Zwölffingerdarm

  1. Bringen Sie den Duodenum Kanüle an einer Spritze (beispielsweise 10 ml) mit der Rehydratationslösung gefüllt.
  2. Identifizieren Sie das Duodenum als leuchtend rosa (mit mehr Blutgefäße) Abschnitt des Dünndarms, die auf leicht nach unten ziehen zeigt den Magen.
  3. Einen kleinen Einstichloch im Duodenum etwa 2 cm unterhalb der Verbindungsstelle des Magens und des Zwölffingerdarms (dem Pylorus) mitein steriles 23 G-Nadel.
  4. Legen Sie die J förmigen Haken des Zwölffingerdarm-Kanüle durch die Einstichloch. Befestigen Sie mit einem Tropfen Sekundenkleber.
  5. Beginnen Hydratation der Ratte durch Anbringen der Kanüle an der Spritze in der Rehydratisierung einer Infusionspumpe geladen ist. Nach der Literatur Rehydratisierung Raten reichen von 0,5 bis 3 ml / h 15,25.
  6. Nach Abschluss der Lymphe und Zwölffingerdarm Kanülierung, schließen Sie den Schnitt in der Bauchmuskelwand mit Nähten. Dann schließen die Hauteinschnitt durch Aufbringen einiger Tropfen Gewebekleber (Cyanacrylat) an der Seite des Einschnitts und Kneifen der Haut auf beiden Seiten des Einschnitts miteinander.

5. Kanülierung der Halsschlagader

Die Arteria carotis Kanülierung kann vor oder nach der Kanülierung der Mesenteriallymphknoten Kanal durchgeführt werden. Einige Netzbetreiber es vorziehen, die Halsschlagader vor der Kanülierung die Lymphe Kanal so po zu reduzieren kanülierentenziell verdrängen die Lymphe Kanüle beim Bewegen des Tieres.

  1. Eine Markierung an der Halsschlagader Kanüle 2,5 cm von der Kegelspitze, um den Abschnitt des Schlauchs zu identifizieren, um in die Arterie ein. Schließen Sie das andere Ende der Kanüle (dh ohne Fase) zu einem 23 oder 25 G-Nadel an einer Spritze mit Antikoagulans-Lösung gefüllt befestigt und füllen Sie die Kanüle mit der Antikoagulans-Lösung dafür, dass kein Luftspalt vorhanden sind.
  2. Um Kanülierung zu erleichtern, setzen Sie den narkotisierten Ratten in Rückenlage mit gestrecktem Hals und Kopf in Richtung des Bedieners. Beachten Sie, dass einige Betreiber bevorzugen, diese Technik mit Schwanz der Ratte in Richtung des Bedieners durchzuführen.
  3. Zeigen mit 1 - 1,5 cm Längsschnitt durch die Hautschicht über der linken Seite der Luftröhre in der Sagittalebene.
  4. Präparieren Sie mit stumpfer Spitze Pinzette, die zugrunde liegenden gepaart Nackenmuskulatur Setzen Sie das Unterhautbindegewebe.
  5. Fahren Sie die Nackenmuskulatur to zeigen die linke Halsschlagader (~ 1 cm unter der Hautoberfläche und pulsierende befindet). Reinigen Sie den darüber liegenden Bindegewebe von der Arterie stumpf.
  6. Isolieren Sie ein ~ 1 cm Abschnitt der Arterie vorsichtig mit stumpfen Pinzette Gewebe, kümmert sich nicht um die angrenzenden Vagusnerv Bahn beschädigen. Führen Sie dies durch Öffnen und Schließen der stumpfen Spitze Pinzette vertikal entlang beiden Seiten der Arterie, um sie aus dem umgebenden Gewebe und Vagusnerv zu befreien.
  7. Mit feiner Spitze Pinzette, Gewinde zwei Seidenfäden unterhalb der Halsschlagader und legen Sie sie an jedem Ende der isolierten Arteria Abschnitt. Binden Sie die Naht am nächsten an den Betreiber und am weitesten von Herz und Schlüsselbein (3A) der Ratte.
  8. Verstopfen den Blutfluss durch die Arterie, indem ein Paar von geraden feinen Spitze Pinzette unterhalb der Arterie (3B).
  9. Mit den feinen Spitze Iris Schere, legen Sie einen kleinen Schnitt an der Oberseite der Arterie (etwa 1/3 dernach unten von der Oberseite der isolierten Fläche). Spülen Sie jede vergossene Blut auf der Oberfläche der Arterie mit heparinisierter Kochsalzlösung und wischen Sie mit Baumwollspitzen.
  10. Setzen Sie die Spitze der Kanüle in die Arterie mit einem Paar gebogener Spitze Pinzette. Einmal eingesetzt, entfernen Sie die gerade feine Spitze Pinzette Verschließen des Blutflusses und vorab die Kanüle 2,5 cm in die Arterie mit zwei Paar Zangen, ein, um die Kanüle in der Arterie zu halten, um Blut aus undichten zurück und die andere, um die Kanüle stecken stoppen.
  11. Verwenden Sie einen kleinen Arterienklemme, die Kanüle in der Arterie zu halten und entfernen Sie die gerade feine Spitze Pinzette, die unterhalb der Arterie in Schritt 5.8 in Verkehr gebracht wurden, um den Blutfluss zu verschließen.
  12. Bestätigen der Durchgängigkeit der Kanüle durch Injizieren Antikoagulans-Lösung in die Kanüle und Zurückziehen einer kleinen Menge an Blut (3C). Dann spülen Sie die Kanüle mit Antikoagulanslösung und verschließen Sie das Ende mit dem Flamme eines Feuerzeugs oder eine Kanüle Stecker.
  13. Binden Sie the Kanüle an Ort und Stelle mit den beiden Fäden unter der Arterie in Schritt 5.8 platziert.
  14. Entfernen Sie die Arterienklemme und befestigen Sie eine dritte Naht um die Arterie und Kanüle. Schließen Sie den Ausschnitt mit Fäden gewickelt.

6. Post-OP-Periode und Formulierung Infusion

  1. Fahren Sie mit dem Ratten unter Anästhesie und auf der beheizten Unterlage zu halten.
  2. Rehydrieren der Ratte über eine Infusion Rehydratationslösung ins Duodenum für mindestens 0,5 Stunden nach Abschluß der Kanülen. Beachten Sie den Lymphfluss Zinssenkung (~ 0,1 bis 0,5 ml / h) in der ersten Zeit nach der Kanülierung und bald zu einem stetigen Ausgangswert zu erhöhen (von 0,4 bis 2,5 ml / h, je nach Rehydrierung Rate).
  3. Nach der Erholungsphase, ziehen lassen die Formulierung von Interesse (die Lipide enthalten, Medikamente, etc.) in das Duodenum über die Kanüle. Optional können eine Infusionspumpe, um die Strömungsrate von Formulierung zu regulieren. HINWEIS: Die hier beschriebene Protokoll die Tiere bleiben ANAESthetised in der gesamten Operation und Lymphe Erfassungszeitraum und unter Narkose, so dass zusätzliche Analgesie nicht erforderlich euthanasiert. Wenn das Protokoll geändert und Tiere werden dann aktiviert werden, damit das Bewusstsein wiedererlangen angemessene Analgesie und postoperative Pflege erforderlich.
  4. Bei Beendigung der Infusion Formulierung weiterhin die Ratte mit einer Rate von 1,5-3 ml / h bei normaler Kochsalzlösung in den Zwölffingerdarm zu rehydrieren, um Austrocknung zu verhindern.
  5. Halten Sie die Ratte auf dem 37 ° C aufgeheizt chirurgische Pad aus der Blase über leicht nach unten Druck auf den Unterleib zu halten, um Temperatur zu halten (wie in Schritt 2.3), Express Urin nach Bedarf und erneut Augensalbe jede Stunde (gemäß Schritt 2.2. 3). Regelmäßige Körperpositionsänderungen werden empfohlen, wenn das Tier das Bewusstsein nach dem Eingriff wieder zu erlangen.

7. Sammlung von Lymphe und Blutproben zu Lipid and Drug Absorption Beurteilen

  1. Sammeln Lymphe kontinuierlich inRöhrchen Antikoagulans. Rohre ändern bei den erforderlichen Zeitabständen (zB stündlich).
  2. Sammeln von Blutproben zu festgelegten Zeitpunkten.
    1. Verstopfen den Blutfluss durch die Kanüle durch Biegen der Kanüle zurück ungefähr 2 cm von dem abgedichteten Ende. Entsiegeln der Kanüle durch Abschneiden des abgedichteten Endes oder Entfernen der Kanüle Stecker.
    2. Verwenden Sie eine leere Spritze, zurückzutreten heparinisierten Kochsalzlösung aus der Kanüle, bis Blut die gesamte Kanüle füllt.
    3. Mit einer neuen leeren Spritze und ziehen Sie die gewünschten Blutvolumen und in ein Röhrchen mit Antikoagulans.
    4. Mit der ersten Spritze, ersetzen Sie das Blut vor der Probenahme ergriffen, um unnötigen Blutverlust zu verringern. Vor der Injektion Flick die Spritze und halten es aufrecht, um sicherzustellen, dass keine Luftblasen geben Sie die Kanüle.
    5. Unter Verwendung einer Spritze zu ersetzen das Blutvolumen der Ratte mit Anti-Koagulans-Lösung entfernt. Stellen Sie sicher, dass keine Restblut ist in der Kanüle sichtbar als ein verbleib kann gerinnenund blockieren die Kanüle.
    6. Biegen Sie die Kanüle etwa 2 cm aus dem unverschlossenen Ende um den Blutfluss zu blockieren und entfernen Sie die Spritze. Mit der Flamme eines Feuerzeugs oder eine Kanüle Stecker, verschließen Sie die Kanüle.
  3. Beim Abschluss von Blut und Lymphe Sammlung aus der Ratte, einschläfern die Ratte durch intraperitoneale Verabreichung von> 100 mg / kg Natriumpentobarbiton.
  4. Bestimmen Sie den Lymphfluss Rate durch Messen der Masse der Lymphe während jeder Zeitperiode gesammelt.
  5. Messen der Konzentration von Arzneimittel und Lipid in Lymphe und Blut unter Verwendung von beispielsweise HPLC, HPLC-MS oder mit kommerziellen Kits zur Lipid- und Arzneimittelabsorptionseffizienz zu bewerten.
  6. Berechnen Massentransport der Arzneistoff und Lipide in die Lymphe aus dem Produkt aus der gemessenen Konzentrationen und Volumen der Lymphknoten gesammelt.

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Representative Results

Die Ergebnisse eines repräsentativen Experiments, das kumulierte Ausmaß und Geschwindigkeit der Lipid- und Arzneistofftransport über das Lymphsystem folgenden Intestinallieferung Verwendung der Mesenteriallymphknoten Kanülierung Modell zur Quantifizierung sind in Abbildung 4 und 5 gezeigt. In diesem Experiment wurden 200 ug des Modells lipophilen und 7,1 mg 2-Monoolein in 5,6 ml 5 mM Natriumtaurocholat in Phosphat-gepufferte verteilt - Drogen Halofantrin wurde in den Zwölffingerdarm von Ratten über 2 h in einer Formulierung, die 40 mg Ölsäure (5 & mgr; Ci 14 C-Ölsäure 2 Jahre) verabreicht Kochsalzlösung pH 6,9. Folgende Formulierung Verabreichung wurden die Ratten mit einer Rate von 2,8 ml / h bei normaler Kochsalzlösung in den Zwölffingerdarm infundiert rehydratisiert. Lymphe wurde kontinuierlich in Röhrchen für 10 h geändert wurde jede Stunde gesammelt. Die Formulierung wurde hergestellt, und das Experiment durchgeführt wird, gemäß einem vorher für eine Formulierung, die alle die gleiche compon beschriebenen ProtokollEltern, außer es nicht sind 2-Monoolein 43.

Wie in Figur 4 gezeigt ist, in diesen experimentellen Bedingungen die mittlere Lymph- Flussrate für erfolgreich kanülierte Ratten lag zwischen 0,4 bis 1,3 ml / hr. In einigen Ratten war der Lymphfluss Rate in der ersten 1 etwas niedriger - 3 Stunden nach Kanülierung und dann erhöht. Dies wird allgemein folgende Lymphe Kanülierung gesehen. Auch in Abbildung 4 dargestellt ist der Lymphfluss Rate für eine nicht erfolgreiche Versuch. In diesem Fall bleibt die Strömungsgeschwindigkeit wesentlich niedriger als die in den erfolgreichen Experimente ganzen Erfassungszeitraum gesehen. In ähnlicher Weise wird der kumulierte lymphatischen Transport von Triglycerid und Halofantrin war in dem erfolglosen Versuch (5A und B) wesentlich geringer. Die mittlere kumulative Halofantrin Transport in der erfolgreichen Gruppe betrug 15,1% der Dosis betrug die kumulative Triglycerid-Transport 61 mg über 10 h und der Anteil der verabreichten radiolabelled exogenen Lipiddosis in Lymphe transportiert 54% (5C). Diese Werte sind nicht signifikant unterschiedlich zu der vorher für eine ähnliche Formulierung, die die gleichen Komponenten mit Ausnahme der Abwesenheit von 2-Monoolein 43 (Tabelle 1) enthalten angesehen. Dies deutet darauf hin, daß Formulierungen, die Fettsäuren in der Abwesenheit von einer Quelle von Monoglycerid ähnliche Lipid- und Wirkstofftransport in die Lymphe solche, die Monoglycerid auch unterstützen. Dieses Ergebnis wird bei der Erläuterung beschrieben.

5D zeigt repräsentative Daten für die Geschwindigkeit der Halofantrin und Triglycerid-Transport in der Lymphe im Laufe der Zeit nach der Verabreichung. Die Transportgeschwindigkeit sowohl Triglycerid und Drogen in Lymphe Gipfel ein paar Stunden nach der Lipid and Drug Administration und dann auf das Ausgangsniveau zurück. Wie es typisch in intestinalen lymphatischen Lipid- und Wirkstofftransportexperimente, die Geschwindigkeit der Arzneimittel transport in der Lymphe während jeder Zeitperiode, die für die Spiegel Triglycerid Transport als Arzneimittel gesehen in der Lymphe in Assoziation mit den Triglycerid-reichen Lipoproteinen transportiert.

Figur 1
Abbildung 1 Schematische Darstellung der Form der abgeschrägten Spitze einer Arteria carotis oder Lymphe Kanüle, und der J-förmigen abgeschrägten Spitze eines Duodenalkanüle.

Abbildung 2
Figur 2 Fotografien von (A) das Abdomen in Vorbereitung rasiert, um die Lymphe Kanal kanülieren, (B) die Bauchmuskelwand geöffnet mit einem 4 cm lange Inzision, die sich von der Mittellinie auf der rechten Seite auf die Lymphe Kanal zuzugreifen, und (C ) die überlegene Mesenteriallymphknoten Kanal (in gelber Kreis) senkrecht zur rechten Niere. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

Figur 3
Abbildung 3. Fotografien von (A) der Halsschlagader mit zwei Seidenfäden mit der am nächsten an den Betreiber abgebunden, (B) der Halsschlagader getrennt und die Durchblutung mit einem Paar gerader feine Spitze Pinzette unter der Arterie verschlossen isoliert, und (C) eine Halsschlagader mit Kanüle an Ort und Stelle und die Durchgängigkeit durch Zurückziehen eine kleine Menge Blut überprüft. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

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Abbildung 4. Repräsentative Daten für Mesenteriallymphknoten Flussrate (& mgr; l / h) über die Zeit. Die Ratten wurden eine Formulierung, die 200 ug Halofantrin, 40 mg Ölsäure (mit 2 & mgr; Ci 14 C-Ölsäure) und 7,1 mg 2-Monoolein in 5.6 verabreicht ml 5 mM Natriumtaurocholat in phosphatgepufferter Salzlösung (pH 6,9) 0-2 Stunden. Die gezeigten Daten sind der Mittelwert ± SEM für n = 3 erfolgreiche Experimente (geschlossene Kreise, ●) und n = 1 losen Ausgang (offene Dreiecke, Δ).

Abbildung 5
Abbildung 5. Repräsentative Daten für die Lipid-und Drogentransport in Mesenteriallymphknoten. Kumulative Transport von (A) der Modellarznei Halofantrin (Hf% Dosis), (B) Triglycerid (TG, mg) und (C) exogener Fettsäure (% dose) und die Transportrate (D) TG (mg / h) und Hf (% Dosis / h) in Mesenteriallymphknoten über die Zeit nach der Verabreichung einer Formulierung, die 200 ug Halofantrin, 40 mg Ölsäure (mit 2 & mgr; Ci 14 C-Ölsäure) und 7,1 mg 2-Monoolein in 5,6 ml 5 mM Natriumtaurocholat in phosphatgepufferter Salzlösung (pH 6,9) 0-2 Stunden. Die gezeigten Daten sind der Mittelwert ± SEM für n = 4 erfolgreiche Experimente (geschlossene Kreise, ●) und n = 1 losen Ausgang (offene Dreiecke, Δ). Exogene Fettsäuretransport wurde in der erfolglosen Experiment gemessen, sondern ist in der Regel in der fehlgeschlagenen Experimenten gering. Daten für das erfolglose Versuch von Teil D der Übersichtlichkeit halber weggelassen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

Ohne monoolein Mit 2-monolein
Bedeuten SEM Bedeuten SEM
Halofantrin (% Dosis) 15.1 0.8 15 1.6
Triglyceride (mg) 67 4 61 6
Gesamt-Fettsäure (umol) 261 16 248 23
Exogene Ölsäure (umol) 82 5 65 6
Endogene Fettsäure (umol) 180 17 183 28

Tabelle 1. Vergleich der kumulativen lymphatischen Transportdaten über 10 Stunden nach der Verabreichung von 200 ug Halofantrin zur Lymphe Kanal kanülierten Ratten in Formulierungen mit 40 mg Ölsäure mesenterialen (mit deg 1 & mgr; Ci 14 C-Ölsäure) in 5 mM Natriumtaurocholat ohne und mit 7,1 mg 2-Monoolein. Daten, emulgiert in phosphatgepufferter Salzlösung (pH 6,9) repräsentieren den Mittelwert ± SEM für n = 4 Ratten. Keine statistisch signifikanten Unterschiede zwischen den 2 Gruppen gesehen.

a aus der Gruppe mit 2-Monoolein ist dies nicht ein genaues Maß der endogenen Fettsäure Verkehr als Ölsäure, um die 2-Monoolein Gerüst gebunden ist nicht in der gemessenen exogene Oleinsäure Transport in Lymphe entfielen dosiert.

b Die Daten für Halofantrin und Gesamtfettsäuretransport in der Gruppe dosiert ohne 2-Monoolein wurde zuvor in Figur 5 der Referenz 43 veröffentlicht und wird hier in Tabellenform wiedergegeben.

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Discussion

Die Ratte Mesenteriallymphknoten Kanülierung Modell ermöglicht eine direkte Quantifizierung der Konzentration und Geschwindigkeit des Transports von verschiedenen Zellen und Molekülen (wie Lipide und Drogen) aus dem Darm in die Lymphe und die Änderungen an diesen, die als Reaktion auftreten, um von verschiedenen Substanzen in Frage (Ernährung Antigen, Drogen, Formulierungen etc.) 10,27 und Krankheiten (Krebs, Viren, Colitis, Insulinresistenz, etc.) 5-7. Die in Lymphknoten gesammelt Komponenten können auch weitere in weiteren Experimenten verwendet werden. Zum Beispiel können die Zellen kultiviert werden, 44, Lipoproteine ​​fraktioniert und Lymphe oder dessen Komponenten, wie beispielsweise Lipoproteine ​​oder Zellen, mit Markierungen, einschließlich Medikamenten, radioaktiven Markierungen und fluoreszierenden Sonden geladen. Diese können dann in Empfängertiere reinfundiert werden, um mehr direkt bewerten ihre Funktion, den Stoffwechsel-Clearance und / oder Gewebe Disposition Muster 45-47. Die Ratte Lymphe Kanülierung Modell hat mehrere Vorteile gegenüber dem OTHer in vitro, in situ, in silico und in vivo-Modelle, die in der Einleitung beschrieben wurden. Am wichtigsten ist, Kanülierung die einzige Methode, die den direkten Zugriff auf das gesamte Volumen der Komponenten in Lymphflüssigkeit ermöglicht. Wenn sie in den Händen eines erfahrenen Bedienungsperson durchgeführt das Modell ist robust, reproduzierbar und experimentellen Erfolgsrate von> 80% erreicht werden kann. Jedoch kann die chirurgische Technik im Voraus schwer zu beherrschen, insbesondere in einem Labor, das nicht mit der Technik vertraut sind.

Mehrere Schritte sind entscheidend für den Erfolg der Mesenteriallymphknoten Kanülierung Modell. Die erste ist die richtige Auswahl der chirurgischen Instrumente und Kanülentyp und Vorbereitung. Unser Labor verwendet PE Kanülen mit den Abmessungen 0,8 x ID OD 0,5 mm. Aber auch andere Labors Erfolg mit PVC Kanülen der gleichen Dimension 15 erlebt. Abschrägen der Spitze der Kanüle und vorge Einweichen in einem Antikoagulans hilft auch zu verhindern,Okklusion, und die Bildung von Blutgerinnseln innerhalb der Kanüle Zuschießfunktion (Schritt 3.13). Der erste Schritt des chirurgischen Eingriffs, die einige Betreiber besonders kritisch finden kümmert sich um die Schichten der Binde- und Fettgewebe über die Lymphe Kanal (Schritt 3.10) reinigen. Dies hilft, das Einführen der Kanüle zwischen dem Gewebe und Lymphe Kanal statt in die Lymphe Kanal zu vermeiden. Jedoch ist dieser Reinigungsschritt schwierig, da die Lymphe Kanal ist zerbrechlich und leicht zu beschädigen. Für manche sind diese Stufe und die Einführung der Kanüle am erfolgreichsten mit Hilfe eines Operationsmikroskops abgeschlossen obwohl anderen ist ein Mikroskop ist nicht notwendig. Beim Einsetzen der Kanüle in die Leitung die Richtung und die Tiefe der Einführung relativ zu der abgeschrägten Spitze erfordert einige Aufmerksamkeit, um die Kanüle durch die Gefäßwand (Schritt 3.12) okkludiert verhindern. Jeder Operator neigt dazu, ihre eigenen individuellen Vorlieben zu finden. Ebenfalls wichtig ist die Vermeidung der Bildung von Luftblasen innerhalb des cannula beim Einführen als Luftspalte gelten Gegendruck für den freien Fluss der Lymphe (Schritt 3.12). Schließlich sollte die Anwendung von Tier Klebstoff auf die Kanüle zu befestigen unter dem Einführungspunkt in die Leitung als Klebstoff direkt auf die Oberseite des Kanals angeordnet sein, kann der Behälter zu kollabieren und zu verschließen, die Kanülenspitze (Schritt 3.14) verursachen.

Der einfachste erste Orientierungshilfe, ob eine Operation erfolgreich ist, ist die Durchflussmenge der Lymphe. Nachdem die Kanüle an Ort Lymphe beginnt üblicherweise in der ersten 30 min langsam zu fließen, und dann erhöht. Typischerweise Flußraten für erfolgreiche Kanülierungen bei Ratten> 250 g sind> 0,1 ml / h in der ersten Stunde und dann auf> 0,4 ml / h in einem stabilen Zustand zu erhöhen, wie in Figur 4 gezeigt ist. Obwohl natürlich je nach dem variieren, . Versuchsbedingung In Bezug auf die Fehlersuche, wenn kein Lymphe durch die Kanüle oder der Durchflussmenge fließt niedrig ist dies, weil sein:

    Die Kanüle wurde nicht richtig in den Kanal eingeführt
  1. die Kanüle in dem Kanal, sondern von der Seite der Behälterwand eingeschlossene
  2. die Kanüle in dem Kanal, sondern durch einen Klebstoff an der falschen Position eingesetzt okkludiert
  3. die Kanüle in dem Kanal und eine Luftblase in der Kanüle ist die Verlangsamung der Strömungs
  4. ein Gerinnsel in der Kanüle gebildet

Eine sorgfältige Überprüfung ergeben, in der Regel die zugrunde liegende Faktor. Wenn der Bediener glaubt, dass die Kanüle nicht korrekt in der ersten Stelle platziert (dh, Lymphe wurde nie fließt), dann Wiedereinsetzen notwendig ist. Wenn die Kanüle scheint an der richtigen Stelle ist, dann der erste Faktor, um zu überprüfen, ob eine Luftblase oder ein Gerinnsel vorhanden ist. Luftblasen werden in der Regel durch die Kanüle als Lymphe fließt und vorübergehend langsamen Fluss übergeben. Manchmal ist es möglich, Luftblasen oder Gerinnsel durch Zurückziehen an der Kanüle mit einem 25 G-Nadel befestigt zu entfernen, beispielsweise eine 1-ml-Spritze. Wenn es keine Luftblase oder ein Gerinnsel kann es nützlich sein, zu versuchen Neupositionierens der Ratte und / oder Drehen oder Ziehen der Kanüle geringfügig. Dies kann manchmal die Kanüle auszurichten, so dass sie nicht gegen die Gefäßwand blockiert. Gelegentlich Entfernen der Kleber oder mit geringen Bewegung der Kanüle ermöglicht die Lymphe wieder auch fließen. Wenn alle Stricke reißen die Kanüle muss wieder eingesetzt werden. Nach unserer Erfahrung Experimente sind weniger erfolgreich, wenn die Kanüle nicht korrekt beim ersten Versuch eingesetzt. Jedoch ist chirurgischen Rettungs möglich. Eine weitere Komplikation, die auftreten kann, ist schwierig in der Kanülierung durch anatomische Abweichung zwischen Ratten. Zum Beispiel wird in einem ungünstigen Richtung gelangt die Mesenteriallymphknoten Kanal gelegentlich oder es ist ein Zubehör Lymphe Kanal auf der gegenüberliegenden Seite der Arteria mesenterica superior zum größeren Mesenteriallymphknoten Kanal. In Experimenten, die Sammlung des gesamten Volumens der Lymphe aus dem Dünndarm fließt erfordern (wie es der Fallbei der Beurteilung der Gesamtlipid und Drogentransport aus dem Darm über die Lymphgefäße), muss das Zubehör Lymphe Kanal zu verschließe so dass alle Lymphe der überlegenen Lymphe Kanal geleitet werden. Dies ist schwierig zu erreichen, sondern kann durch das Binden eines Nahtmaterials um das Zubehörkanal oder Durchtrennen des Zubehörkanal und verschließt sie mit Tierkleber (Schritt 3.6) versucht werden. Die Anwesenheit eines Zubehör Lymphe Kanal ist einer der Hauptfaktoren, die in der experimentellen Fehler in lymphatischen Arzneimitteltransport Experimenten führt. Wenn das Zubehör Behälter nicht vollständig verschlossen sind Lymphfluss und Lipid- und Wirkstofftransport deutlich niedriger als erwartet.

In der hier vorgestellten Protokoll bleibt das Tier während des gesamten Erhebungszeitraum narkotisierten Lymphe. Die narkotisierten Ratten-Modell (statt unten beschrieben bewussten Modellen) erhöht experimentellen Durchsatz als die Chirurgie und Experiment kann über eine nicht mehrere Tage und chirurgischen Erfolg r durchgeführt werdenaß größer als es einfacher ist, Kanüle, die Durchgängigkeit bei immobilisierten Tieren aufrechtzuerhalten. Anästhesie kann theoretisch verringern Magenentleerung, Darmlipid Verarbeitung und Lymphfluss und Transport. Nach unserer Erfahrung jedoch lymphatischen Lipid- und Wirkstofftransport sind ähnlich in narkotisierten Ratten verabreicht das Medikament direkt in den Zwölffingerdarm (auf Bypass Magenentleerung) innerhalb vorverdaut und vordispergiert Fahrzeuge (zB Fettsäure und Monoglycerid micellaren Systemen mit Tensiden verteilt ) im Vergleich zu Ratten bei Bewußtsein in äquivalenter Triglycerid 21,23,27 verabreicht das Arzneimittel über eine orale Sonde in den Magen. In der Tat haben die meisten Darm lymphatischen Arzneimitteltransport Experimente in unserem Labor in den letzten 10 Jahren in der narkotisierten Modell aufgrund des höheren Durchsatzes, die erreicht werden kann, durchgeführt. In diesen Experimenten haben wir häufig in Formulierungen mit Fettsäure (beispielsweise Ölsäure) und Tensid 43 verabreichten Medikamenten.Fettsäuren in Triglyceriden, bevor sie in Darm Lymphe Lipoproteine ​​Einarbeitung synthetisiert und dies erfordert die Quelle der Komponenten, um die Glyceringerüst von Triglycerid (dh 2-Monoglycerid oder Glycerin-3-phosphat) zu bilden. Dies legt nahe, dass die Verabreichung von Fettsäuren in Abwesenheit eines Glycerinquelle kann mit reduzierter Lymphtransports führen. Verabreichung von Fettsäure, jedoch ermöglicht die direkte Berechnung des Beitrags der exogenen verabreicht Fettsäure und endogenen Lipide lymphatische Lipid- und Arzneistofftransport 43. Außerdem ist 2-Monoglycerid teuer und im allgemeinen instabil, da es leicht isomerisiert 1-Monoglycerid, das Glycerin in das Darmlumen verdaut. In den Studien, die hier berichtet wir zeigen ferner, dass lymphatische Lipid- und Arzneistofftransport entspricht nach der Verabreichung des Modellarzneimittels Halofantrin mit einer Fettsäure (beispielsweise Ölsäure) und Tensid (Gallensäurensalz) Formulierung entweder in dem prEsence oder Abwesenheit des Glycerinquelle 2-Monoolein (Tabelle 1). Endogenen Quellen von Glycerin somit ausreichend erscheinen, um äquivalente Lymphströmung und Lipid- und Arzneistofftransport nach der Verabreichung dieser Modellwirkstoff mit Fettsäuren (beispielsweise Oleinsäure) in Abwesenheit eines Glycerinquelle unterstützt. Das schafft Vertrauen, dass Vertreter Lymphtransports Daten kann mit einfachen Fettsäure Formulierungen erhältlich.

Die narkotisierten Modell leicht zu einer bewussten Modell erweitert, wenn erforderlich. In den bewussten Modelle können Formulierungen direkt in den Magen eine Sonde oder in den Zwölffingerdarm oder intravenös infundiert werden können direkte Vergleiche zu pharmakokinetischen Studien bei nicht-Lymphe kanülierten wachen Tieren und die Ergebnisse durchgeführt, können mehrere physiologisch relevant angesehen werden kann. Die längeren Zeitraum in wachen Tieren erlaubt hat auch den Vorteil, dass die Sammlung von voll pharmakokinetischen Profile für drug-Konzentrationen im Blut, während bei narkotisierten Versuchs sind Blutprofilen oft unvollständig, vor allem für lange Halbwertszeit Drogen. Wie oben beschrieben, jedoch ist die Erfolgsquote für bewusste Lymphe kanülierten Studien unteren und Experimente nehmen mehr Zeit in Anspruch. Es gibt zwei Arten der bewussten Lymphe Kanülierung Modelle in der Literatur beschrieben. In bewußt zurückhalt Modelle 15, im Anschluss an die Lymphe Kanülierung Operation wird das Tier einfach an seinem vorderen gedreht und in einer geeigneten Rückhalteeinrichtung für den Rest des Experiments mit der Lymphe Kanüle lagert und in ein Sammelrohr eingesetzt platziert. Das Tier wird dann wieder zu Bewusstsein und erholen sich von der Operation O / N. Die Erfolgsrate mit diesem Modell ist sehr gut in der Hand von erfahrenem Personal, aber es schwierig, Ethik Freiheit zu erhalten, um Tiere für den längeren Zeitraum für die Lymphe Einzug erforderlichen zurückhalten kann. Ein alternatives Modell ist, wo die Lymphe gesammeltvon bewussten und sich frei bewegenden Ratten. Dieses Modell wurde bisher 25 beschrieben worden. In diesem Modell langen Kanülen in den Mesenteriallymphknoten Kanal, Zwölffingerdarm und Halsschlagader eingesetzt. Die Kanülen werden dann unter der Haut getunnelt, an der Rückseite des Nackens nach außen geführt und durch ein Schwenksystem angeordnet. Die Ratte wird in einem Kabelbaum zur Schwenk befestigt und erlaubt das Bewusstsein wiedererlangen und von der chirurgischen Prozedur O / N erholen platziert. Das Tier hat Freizügigkeit in einem metabolischen Käfig und Lymphe und Blutproben aus den Kanülen außerhalb des Käfigs externalisiert gesammelt werden.

Mesenteriallymphknoten Kanülierung vor das einzige Werkzeug, das die direkte Auswertung der Lymphe Komponenten in ihrer Entstehungszustand ermöglicht. Lymph Kanülen wird am häufigsten bei Ratten beschrieben, wie die Operation ist weniger komplex als kleinere und große Tiere, das Modell kostengünstiger als große Tiere und Ergebnisse maßen vergleichbar über Artgrenzen 27 angezeigt. Die Ratte-Modusl kann geändert werden, je nach Bedarf und der experimentellen Erfolgsquote ist hoch in den Händen von erfahrenem Personal. Das Modell kann auch in Verbindung mit anderen in vitro oder in vivo Studien gekoppelt werden, um zu untersuchen, im Detail, den Metabolismus oder die Funktion der Darm Lymphe Komponenten. Einmal etabliert die Mesenteriallymphknoten kanülierte Ratten-Modell ist daher ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Konzentration, den Transport, die Funktion und Metabolismus von verschiedenen Parametern, die direkt aus dem Darm passieren, um dem lymphatischen System (und in vielen Fällen fließt schließlich in den systemischen Kreislauf) zu bewerten.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sterile saline Baxter healthcare AHB 1307 Any brand can be used. Example here is Baxter 100 ml saline bags, box of 50
70 % ethanol in water Any Any brand can be used
Chlorhexidine gluconate solution (Microshield 4) Livingstone International JJ60243L Any brand can be used. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search
=JJ60243L
Betadine solution Livingstone International BU0510 Any brand can be used. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search
=BU0510
Ilium Ketamil (Ketamine 100 mg/ml) PROVET VICTORIA  KETA I 1 http://www.provet.com.au/
Ilium Xylazil (Xylazine 100 mg/ml) PROVET VICTORIA  TRO-3828 http://www.provet.com.au/
ACP 10 Injection (Acepromazine 10 mg/ml) PROVET VICTORIA  VTG-DACP010020 http://www.provet.com.au/
Sodium pentobarbitone PROVET VICTORIA  24529 Any brand can be used. Example here is Lethabarb® 325 mg/ml sodium pentobarbitone, Virbac Animal Health. http://www.provet.com.au
Heparin (35000I.U. in 35 mL) Sigma Pharmaceuticals 337220 http://sigmaco.com.au/
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) disodium salt dihydrate Sigma-Aldrich E1644 Any brand can be used. Example here is disodium salt of EDTA from Sigma. 
Polyethylene (PE) cannula o.d. 0.96 mm x i.d. 0.58 mm Microtube extensions PE8050 Any brand can be used. Example here is PE tubing 0.96 x0.58 mm, 30 m
Polyethylene (PE) cannula o.d. 0.8 mm x i.d. 0.5 mm Microtube extensions PE9658 Any brand can be used. Example here is PE tubing 0.8 x0.5 mm, 30 m
Ruler Any Any brand can be used
Markers Any Any brand can be used
Cigarette lighter Any Any brand can be used
Veterinary adhesive Any Any brand can be used
23 gauge needles Livingstone International DN23GX0.75LV Any brand can be used. Example here is Livingstone Disposable Needle, Sterile, 23GX0.75inch, 100/BOX. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=
6&search=DN23GX0.75LV
25 gauge needles Livingstone International DN25GX1.0LV Any brand can be used. Example here is Livingstone Disposable Needle, Sterile, 25GX1.0inch, 100/BOX. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search=
DN25GX1.0LV
1 ml syringe Livingstone International T3SS01TA Any brand can be used. Example here is Terumo syringe 1 ml Slip Tuberculin 100/Box. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search
=T3SS01TA
10 ml syringe Livingstone International T3SS10SA Any brand can be used. Example here is Terumo syringe 10 ml Slip 100/Box. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search
=T3SS10SA
Gauze swabs Livingstone International GSC075 Any brand can be used and cut to required size. Example here is gauze swabs cotton filled 7.5x7.5 cm, 8 ply. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search
=GSC075
Cotton buds Livingstone International CTAST075DP Any brand can be used. Example here is Livingstone cotton applicator plastic double tipped. 75MM. 100/PK. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search
=CTAST075DP
Heating pad Ratek WT1 Any brand that keeps temperature at 37C can be used. Example here is Ratek warming tray.
Surgical light Harvard Apparatus 72-0215 with 72-0267 Any brand can be used. Example here is Harvard apparatus V-Lux 1000 Cold Light Source with Bifurcated Gooseneck Light Guide, Black, 4.7 mm fiber diameter (each arm). http://www.harvardapparatus.com/webapp/wcs/stores/servlet/product_11051_10001_50601_
-1_HAI_ProductDetail and  http://www.harvardapparatus.com/webapp/wcs/stores/servlet/product_11051_10001_35487_
-1_HAI_ProductDetail___
Surgical microscope Zeiss 495005-0014-000 Any brand can be used. Example here is Zeiss Stereomicroscope Stemi 2000-C with Stand S Double Spot and KL 300 LED. https://www.micro-shop.zeiss.com/?l=en&p=us&f=e&i=10143
Silk suture Livingstone International DTSK163019F4 Any brand can be used. Example here is  

3/8 Circle Reverse Cut Silk Suture 3/0 Thread 19mm. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search
=DTSK163019F4
Scalpel blades Fine Science Tools (FST) 10020-00 Any brand can be used. Example here is FST Scalpel Blade #20. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=191
Scalpel handle Fine Science Tools (FST) 10004-13 Any brand can be used. Example here is FST Scalpel Handle #4. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=298&CategoryId=51
1 x Small surgical scissors Fine Science Tools (FST) 14060-09 Any brand can be used. Example here is FST Fine Scissors, 9 cm with 21 mm cutting edge, sharp, straight. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=40&CategoryId=17
2 x Forceps with serrated curved tip Fine Science Tools (FST) 11001-13 Any brand can be used. Example here is FST 13 cm standard pattern forceps with curved 2.8x1.4 mm tip. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=405&CategoryId=32
1 x Iridectomy scissors Fine Science Tools (FST) 15000-08 Any brand can be used. Example here is FST Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge, Straight. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=17&CategoryId=16 
1 x Forceps with straight serated tip Fine Science Tools (FST) 11650-10 Any brand can be used. Example here is FST Graefe 10 cm straight with serrated 1 x 0.99 mm tip. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=390&CategoryId=32
1 x Forceps with smooth sharp straight fine tip Fine Science Tools (FST) 11251-10 Any brand can be used. Example here is FST Dumont #5 forceps straight 11cm with 0.08 x 0.04mm tip. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=335&CategoryId=29
1 x Forceps with smooth fine curved forceps Fine Science Tools (FST) 11063-07 Any brand can be used. Example here is FST Delicate Forceps 9 cm with smooth 0.4 x 0.3mm tip. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=360
2 x Hemostats Fine Science Tools (FST) 13010-12 Any brand can be used. Not all operators use the hemostats. Example is FST 12 cm Micro-Mosquito Hemostats with 20 mm length x 1.3 mm width serrated, straight tip. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=377&CategoryId=33
1 x Suture needle holder Fine Science Tools (FST) 12001-13 Any brand can be used. Example here is FST 13cm Hasley Needle Holder with 16 mm length x 1.9 mm width tip. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=254&CategoryId=70
1 x Artery clamp Fine Science Tools (FST) 18050-28 Any brand can be used. Example here is FST Bulldog Serrefines straight, 28 mm long, 9x1.6 mm jaw dimension with medium clamp press. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=270&CategoryId=82
Oleic acid Sigma Aldrich O1008 When required, any brand can be used. Example here is 99% pure oleic acid. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/o1008?lang=en&region=AU
14C-oleic acid Perkin  NEC317050UC  Any brand can be used. Example here is Oleic Acid, [1-14C]-, 50µCi (1.85MBq). http://www.perkinelmer.com/Catalog/Product/ID/NEC317050UC
Sodium taurocholate Sigma Aldrich T4009 Any brand can be used. Example here is taurocholic acid sodium salt hydrate ≥95% (TLC) . http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t4009?lang=en&region=AU
Halofantrine Glaxo Smith Kline Halofantrine was kindly provided as a gift from Glaxo Smith Kline
Sodium phosphate monobasic Sigma Aldrich 71507 Any brand can be used. Example here is sodium phosphate monobasic monohydrate, BioXtra, for molecular biology, >99.5%. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/71643?lang=en&region=AU
Sodium phosphate dibasic Sigma Aldrich 71643 Any brand can be used. Example here is sodium phosphate dibasic dihydrate, BioUltra, for molecular biology, >99%. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/71507?lang=en&region=AU

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