Mesenteric лимфатический проток канюлированного крысиной модели: Приложение к оценке кишечных лимфатической транспорта лекарства

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Trevaskis, N. L., Hu, L., Caliph, S. M., Han, S., Porter, C. J. The Mesenteric Lymph Duct Cannulated Rat Model: Application to the Assessment of Intestinal Lymphatic Drug Transport. J. Vis. Exp. (97), e52389, doi:10.3791/52389 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Кишечного лимфатическая система играет ключевую роль в жидкости транспорта, поглощения липидов и иммунной функции. Лимфатические течет непосредственно из тонкой кишки с помощью серии лимфатических сосудов и узлов, которые сходятся на верхней брыжеечной лимфатический проток. Канюли в мезентериального лимфатического протока, таким образом, обеспечивает сбор брыжеечных лимфатических течет из кишечника. Брыжеечных лимфатических состоит из клеточной фракции иммунокомпетентных клеток (99% лимфоцитов), водной фракции (жидкости, пептидов и белков, таких как цитокины и гормоны кишечника) и фракции липопротеинов (липидов, липофильных молекул и апо-белков). Таким образом, брыжеечных лимфатических протоков катетеризации модель может быть использована для измерения концентрации и скорости переноса ряда факторов из кишечника через лимфатическую систему. Изменение этих факторов в ответ на различные вызовы (например, диеты, антигены, лекарственные средства), и при болезни (например, воспалительное заболевание кишечника, ВИЧ, диабет) также может бе определяется. Площадь расширяется интерес представляет роль лимфатической транспорта в поглощении перорально липофильных лекарственных средств и пролекарства, которые связывают с кишечными путей поглощения липидов. Здесь мы опишем в деталях, брыжеечных лимфатических протоков канюлированного крысах, которые позволяет оценить скорость и степень липидного и транспорта лекарства через лимфатическую систему в течение нескольких часов, после кишечной доставки. Способ может быть легко адаптирован к измерению других параметров в лимфе. Мы предоставляем подробные описания трудностей, которые могут возникнуть при создании этой сложной хирургический метод, а также репрезентативные данные из неудачных и успешных экспериментов, чтобы обеспечить инструкцию о том, чтобы подтвердить экспериментально успех и интерпретировать полученные данные.

Introduction

Лимфатические течет из тонкого кишечника с помощью однонаправленного процесса, происходящего в отдельных млечными, которые содержатся в каждом маленьком кишечных ворсинок 1. Млечными относительно проницаемой для жидкости, макромолекул, клеток и образование лимфы, таким образом, начинается с момента вступления этих факторов в млечными. Начальное лимфатических в млечными затем течет из кишечника через сеть лимфатических микрососудов, сбора (афферентной) лимфатических сосудов, серия брыжеечных лимфатических узлов и в конечном счете после узловой (эфферентных) лимфатических сосудов. В узлах, лимфатических проходит через серию мозговых синусов, где обмен происходит с иммунными клетками-резидентами узла, а также материала, поступающих в узел из крови. Все лимфатических течет из тонкой кишки в конечном итоге сходится в эфферентных превосходит брыжеечных лимфатических протоков и впоследствии цистерны chyli. Цистерны chyli также собирает лимфодренажный хвостового периферических тканей, IntestИнал, печени и поясничного отделов и присоединяется к грудной лимфатический проток вместе с лимфой из средостения и черепных частях тела. Грудной лимфатический проток впадает лимфатическую непосредственно в венозную систему на стыке левой внутренней яремной и подключичной вен. Протокол, описанный здесь, который позволяет сбора лимфы непосредственно из верхней брыжеечной лимфатический проток, таким образом, облегчает анализ различных факторов, проходящих прямо из кишечника в системной (общей) циркуляции через лимфатическую систему кишечника.

Основные физиологические функции, возложенные на желудочно-кишечном лимфатической системы для поддержания баланса жидкости, чтобы облегчить липидов и поглощение липофильный молекул, и, чтобы включить соответствующие иммунные реакции 1. Опухолевые клетки и вирусы распространяются с помощью кишечной лимфатической системы 2-4 и ключевые изменения происходят в лимфатических в ряде воспалительных и метаболических патологий 5-7. Можетnulation брыжеечных лимфатический проток, чтобы собрать лимфы в брыжейки позволяет анализ объемного потока жидкости через кишечную лимфатические сосуды, а также количественное определение уровня концентрации и транспортной различных клеток и молекул. Изменения в концентрации или транзита этих факторов в ответ на различные вызовы (например, диеты, антигены, лекарственные средства) и в моделях болезни (например, колит, ВИЧ, диабет), также может быть оценено. Несмотря на то, что невозможно подробно описать каждый лимфы компонент, который может быть проанализированы и сравнены здесь, брыжеечных лимфатических упрощенно состоит из водного, липидов и клеточных фаз. Компоненты интерес в водной фазе, включают пептиды и белки, такие как антигены или tolerogens 8, иммунных мессенджеров, таких как цитокинов и медиаторов тучных клеток 9 и метаболических медиаторов, таких как инкретинов 10. Клеточный часть пост-узловой брыжеечных лимфатических состоит почти полностью (более 99%) lymphocytES 11. Различные иммунные клетки (дендритные клетки, тучные клетки, и т.д.) ввести предварительно узловые брыжейки лимфатические но остаются в пределах узла 12. Если клетки в афферентной лимфы представляют интерес, можно собрать эти клетки с помощью удаления брыжеечных лимфатических узлов за несколько дней до катетеризации брыжеечной лимфатический проток 12. Таким образом, афферентные и эфферентные лимфатические протоки непосредственно связаны и лимфатических клеток в афферентных лимфатических проходить непосредственно в мезентериального лимфатического протока. Транзита и фенотип различных иммунных клеток, проходящих через кишечные лимфатические сосуды может быть, таким образом исследованы. Возможно, наиболее распространенной причиной привел для сбора брыжеечных лимфатических до настоящего времени, однако, заключается в изучении кишечной обработки, абсорбцию и транспорт пищевых липидов и липофильных молекул 10.

После приема, пищевые жиры перевариваются (например, из триглицерида с жирных кислот и моноглицерида, phospholipid с жирными кислотами и lysophospholipid и сложного эфира холестерина в жирной кислоты и холестерин, и т.д.) и диспергированные в просвете кишечника на мелкие мицеллы и везикулярных структур с помощью добавлением амфифильных из желчи (фосфолипиды, холестерин и соли желчных кислот) и действие ферменты поджелудочной железы 10,13. Отсюда они всасываются в энтероцитов. Доля поглощенных компонентов повторно этерифицируют с образованием триглицеридов, фосфолипидов и эфиров холестерина в пределах поглощающих клеток (энтероцитов). Эти переэтерификацией липиды собраны из комбинации экзогенно внутрь липидных компонентов и эндогенных липидных компонентов из секретируемого желчи, слизистой оболочки липидных бассейнов или кишечной кровоснабжения 13. Отсюда этерифицированные липиды либо храниться в энтероцитов или собраны в кишечных липопротеинов (хиломикроны, липопротеинов очень низкой плотности (VLDL)) вместе с различными апопротеинов и других липофильных молекул ( 10,13. После выхода из энтероцитов, липопротеины специально транспортируется из кишечника в системный кровоток через лимфатическую систему брыжеечной как кишечные млечными более проницаемыми для их ввода кишечной чем кровеносных капилляров. Доля поглощенных липидных компонентов также транспортируется из кишечника в системный кровоток через кровеносные капилляры и воротной вены, как отдельная система, не липопротеина связанных молекул 14. В целом, однако, воротной вены транспортного маршрута только играть важную роль в поглощении коротких и средней длины цепи липидов.

Сбор брыжеечных лимфатических таким образом, позволяет производить оценку транспортировки липопротеинов и связанных с ними компонентов (липидов, липофильных молекул, апо-белков) из кишечника. В липопротеины могут быть количественно и характеризуется тем преимуществом, что брыжеечные лимфатические липопротеины, в общем, в nascenт состояние, так как они не были широко изменен системных ферментов, таких как липазы липопротеинов 15. Несмотря на то, брыжеечных лимфатических модель канюлируют крыса, возможно, исторически наиболее широко описаны для анализа липидов / липопротеинов транспорта в кишечнике, площадь расширяется интерес представляет роль лимфатической системы в транспорте липофильных лекарственных средств, пролекарства и других ксенобиотиков 13,16 что акцент в модели, описанной здесь. Липофильных лекарственных средств (как правило, те, с журнала P> 5 и растворимости в долгосрочной триглицерида> 50 мг / г, хотя исключения являются очевидными) 17,18 пролекарства 19 и другие ксенобиотики 13,16 могут получить доступ к кишечной лимфатической системы или пассивно или активно интегрируется в кишечная липопротеинов транспортных путей 19.

Таким образом, крысы брыжеечной лимфатических техники катетеризации имеет множество применений. Bollman и др. Впервые описал TechniqUE в иглу брыжеечных лимфатический проток у крыс в 1948 году 20. Так были описаны то количество вариаций на модели. Например, коллекция может произойти, когда крыса анестезии с различными анестетиками 21,22, или в сознательном состоянии, пока сдерживается 15 или свободно перемещаться 23,24. Крысы могут быть введены различные регидратации растворы и другие вещества, такие как липиды и лекарственных форм с различными скоростями в желудок, кишечник или парентерально (обычно 0 - 5 мл / ч) 25. В некоторых исследованиях грудной лимфатический проток, а не брыжеечных лимфатических канал канюли, чтобы оценить транспорт из кишечника через лимфатические сосуды, хотя это может переоценить транзит из тонкой кишки, в зависимости от коэффициента интерес, так как грудной лимфатический проток также получает лимфу от друга Регионы 22,26. Лимфатические модели катетеризации также были описаны в ряде других видов, включая мышей 15,27, мини-пиGS 12, овец 28,29, свиньи 30 и собаки 31. Тем не менее, модель крысы является наиболее широко и последовательно привел. Подробные протоколы для катетеризации брыжеечной лимфатический проток, с последующим сбором лимфы в сознательном 25 или наркоза 22 крыс и мышей 15,27 были опубликованы ранее, и заинтересованный читатель относится к этим протоколам. Этот протокол является первым, чтобы продемонстрировать технику в визуализируется формате.

Лимфатических канюлируют крысах имеет преимущества перед более крупных моделей животных с точки зрения расходов, легкость операции и этических соображений. По сравнению с мышиной модели, брыжеечных лимфатических катетеризации операции также легче у крыс, хотя модель мыши дает более подробные исследования в трансгенных животных 27. Тем не менее, есть некоторые ограничения модели крыс, особенно те, которые связаны с различиями в физиологии, что предел extrapolatионов к другим доклинических и клинических ситуациях. Например, в потоке крыс желчного постоянна и не зависит от приема пищи, тогда как в более высокой пищи или липидов видов стимулировать выделение желчи 32. Это создает проблемы для получения репрезентативных до и после приема пищи среды у крыс, которые отражают то, что видел в более крупных видов и человека. Для исследований доставки лекарств, более крупные виды также могут быть предпочтительными при оценке лимфатической транспорта после введения реалистичного человека лекарственных форм 25. В недавнем исследовании, липидов ставки переноса в брыжеечных лимфатических оказались сопоставимы у разных видов (мыши, крысы, собаки) после введения эквивалентной массы и типа липидов, который обеспечивает некоторую уверенность в экстраполяции транспорта липидов данных разных видов 27. Тем не менее, транспортировка модели липофильный лекарственный препарат, Галофантрин, попавшая в порядке размера животного (например, собака> крыса> мыши). Коэффициент масштабирования может быть, таким образом требуется эксtrapolate лимфатические препарат транспортные данные крысы с другими видами.

Ограничение моделей лимфатических катетеризации, в общем, является то, что пассивное лимфатических коллекции непосредственно из лимфатического протока может изменить лимфы и транспортировки, так как лимфатические сосуды работать против градиента давления, который изменен после того, как сосуд через канюлю 33. Лимфатических катетеризация модель также может быть трудно установить в лабораториях, которые не знакомы с техникой. Альтернативные модели, таким образом, были описаны. Например, транзит факторов через лимфатическую систему кишечника, таких как липопротеины и липофильных молекул, был изучен с помощью косвенного сбора крови. Одной из таких моделей включает сравнение концентрации в крови липидов и / или лекарственных средств после перорального, в присутствии и в отсутствие ингибиторов (например, колхицин, Pluronic L81, циклогексимид) кишечной производства липопротеинов, которые блокируют лимфатической транспорта 34. Преимуществомоделей, которые количественно лимфатической транспорта косвенно через сбора образцов крови является то, что она позволяет некоторую оценку лимфатической транспорта как у человека, инвазивная хирургия не требуется 35. Тем не менее, ингибиторы транспорта лимфатической не являются специфическими и факторы, которые транспортируются через лимфатические сосуды разбавляют и модифицированы в системный кровоток, что затрудняет таких оценок. В пробирке альтернативы также были описаны. Например, Caco-2 клеток или изолированных энтероцитов культуры были использованы для изучения более подробно кишечного секрецию молекул, которые входят в лимфатических 36-38. Продвинутая модель в пробирке, что является более представительным кишечного микроокружения человека также недавно был описан 39. В этой модели лимфатической эндотелиальной слой клеток совместно культивируют с Caco-2 клеток, которые обеспечивает более детальный анализ переноса веществ из кишечника в лимфатическую систему. Тем не менее, в ВИТРО клеточные системы не хватает перетока и передать то есть взаимосвязь с просвета кишечника и основного крови и лимфатической кровоснабжения. В альтернативном подходе, Кассис и др. Установлено, двухканальный (высокоскоростной светлого поля видео и флуоресценции) в системе формирования месте, что позволяет количественные сравнения между судном сжатия, лимфы и люминесцентные концентрации липидов в мезентериальных лимфатических сосудов 33. Преимущество этой модели над вышеупомянутый в пробирке системы является то, что он обеспечивает точное отслеживание прохождения иммунных клеток через лимфатические сосуды. Абсолютные измерения массового липидов (или препарата) транспортом, однако, еще не создана с использованием методов визуализации. В пробирке и в кремнии подходы к специально предсказать степень липофильного транспорта наркотиков с помощью кишечной лимфатической системы также были опубликованы 40-42. Например, экс виво сродство с несколькимиompounds для плазменных хиломикронов коррелирует достаточно хорошо с их лимфатической транспорта в естественных условиях 41. Впоследствии та же группа создана в силикомарганца модели для прогнозирования наркотиков сродство к хиломикронов, основанных на нескольких физико-химических свойств 40. Холм и др. Также установили относительно сложным в силикомарганца модели, чтобы предсказать, напрямую лимфатической транспорта липофильных соединений на основе молекулярных дескрипторов 42. Эти модели могут обеспечить полезный подход для прогнозирования степени лимфатической транспорта неизвестных препаратов. Валидация моделей с широким диапазоном наркотиков и между различными лабораториями, однако, требуется, чтобы подтвердить их точность и воспроизводимость.

Катетеризация брыжеечной лимфатический проток, таким образом, остается единственное средство непосредственно ознакомиться с содержимым лимфодренажный тонкую кишку, и транзитной ставке в сложный комплекс факторов (клеток, белков,пептиды, липиды, лекарственные препараты) в лимфе в в естественных условиях ситуации. В этом мы описываем протокол для катетеризации брыжеечных лимфатических протоков и сонной артерии, что позволяет сбора брыжеечных лимфатических и системной крови из анестезированных крыс. Типичные данные показывают, как модель может быть использован для изучения липидов и транспорта лекарства из кишечника через лимфатическую систему брыжеечной. Это последовало обсуждение трудностей, которые могут возникнуть при создании модели и руководство по устранению неисправностей. После создания модели является мощным инструментом исследования кишечника лимфатической транспорта.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Исследования, описанные в этой рукописи были утверждены местным комитетом по этике животных и были проведены в соответствии с Австралии и Новой Зеландии Совет по уходу за животными в руководящих научных исследований и преподавания. Перед началом любой процедуры животное, убедитесь, что надлежащее разрешение достигается за счет местного учреждения / организации. Как и во всех хирургических операций на животных, убедитесь, что операция проводится специально обученным операторам, в асептических условиях и что анестетики, анальгетики и антибиотики вводят, когда требуется обеспечить этическую и успешный исход.

1. Подготовка день до хирургической процедуры

  1. Быстрое крысы ночь до операции, если требуется. Убедитесь, что крыса имеет свободный доступ к воде.
  2. Приготовления растворов для введения крысе.
    1. Готовят раствор регидратации, такие как стерильный физиологический раствор или раствор Рингера.
    2. Подготовкаэстетические решения по мере необходимости. Анестетик используют в экспериментах, описанных здесь, состоит из "коктейль" 1 получают смешиванием 1,9 мл кетамина 100 мг / мл, 0,5 мл ксилазина 100 мг / мл, 0,2 мл ацепромазин 10 мг / мл и 2,5 мл физиологического раствора и " Коктейль 2 ", состоящий из 1 мл кетамина 100 мг / мл и 0,1 мл ацепромазин 10 мг / мл. Примечание: Ингаляционный изофлуран или севофлурана может быть предпочтительным, поскольку это может обеспечить хирургического плоскости анестезии в течение более длительного периода времени.
    3. При желании приготовить композицию, содержащую лекарственное средство, например, липидной эмульсии. Выполните соответствующие исследования стабильности для обеспечения стабильности композиции в течение срока хранения и управления.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Истинная природа разработке и препарата для введения будет изменяться в зависимости от каждого исследования в целях лимфатических препарат транспортных исследований чаще всего для оценки эффективности лимфатической транспорта наркотиков в зависимости от рецептуры и наркотиков Administered.
      1. Препарат используют в представительных экспериментов на фиг.4 и 5, получают здесь, как описано выше 43. Вкратце, включают 14 C олеиновой кислоты (2-5 мкКи) и Галофантрин (200 мкг) в 40 мг олеиновой кислоты до дисперсии в 5,6 мл водной фазы, состоящей из 5 мМ таурохолата натри в фосфатном буферном физиологическом растворе (рН 6,9).
      2. Для композиций, содержащих 2-моноолеина, добавить 7,1 мг 2-моноолеина вместе с другими компонентами, в водной фазе, в то же время, что и олеиновой кислоты фазы, содержащей Галофантрин. Подготовка препаратов, содержащих 2-моноолеина непосредственно перед введением в крысы, как 2-моноолеин относительно нестабильными и изомеризуется 1-моноолеина.
      3. Впоследствии эмульсию композиций ультразвуком в течение 2 мин при комнатной температуре.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Как было описано ранее 43, контролировать стабильность составов по I) визуальный осмотр EMULSion в поляризованном свете, чтобы гарантировать, что эмульсия не фазу отделяли, II) анализ размеров частиц сразу после приготовления и после дозирования с использованием динамического рассеяния света, чтобы обеспечить индикацию любых фазовых изменений и / или разделения, и в) анализ концентраций Галофантрин использованием подтверждено ВЭЖХ.
  3. Подготовка антикоагулянта раствора, содержащего 10 мг / мл ЭДТА в стерильной воде или 10 МЕ / мл гепарина в солевом растворе для промывки лимфы канюли. Также подготовьте анти-коагулянта раствор, содержащий 2,5 - 10 МЕ / мл гепарина в солевом растворе, чтобы избавиться канюли сонной артерии.
  4. Подготовка полиэтиленовых канюль для введения в брыжеечной лимфатический проток (0,8 мм OD, 0,5 мм внутренний диаметр), сонной артерии (0,96 мм OD, 0,58 мм ID или 0,8 мм OD, 0,5 мм внутренний диаметр) и двенадцатиперстной кишки (0,96 мм OD, 0,58 мм ID )
    1. Разрежьте канюли до требуемой длины (обычно 25 - 30 см для сонной артерии и двенадцатиперстной канюли и 10 - 15 см для лимфатической Каннула) и поместить скос на кончике канюли с использованием стерильного хирургического ножа (рисунок 1).
      Примечание: Это повышает удобство введения канюли и снижает частоту канюли блокировки после введения.
    2. Поставьте J формы опорную точку в интрадуоденального канюли с помощью цикла малую часть канюли обратно на себя, нагревая его с легкой или горячей пластины, а затем раскрой (рис 1).
  5. Прикрепите лимфы канюли 25 G иглы и шприца, содержащего решение анти-коагулянта (полученного на стадии 1.3). Заполните лимфы канюли с анти-раствора коагулянта и оставить решение в канюли O / N, чтобы уменьшить частоту образования тромба в лимфатических канюли во время лимфатического коллекции.
  6. Подготовка трубы для лимфы и образец крови коллекции. Pre-весят трубы лимфы сбора, этикетки трубы для лимфы и образец крови коллекции и добавить антикоагулянт решение. Добавьте достаточное количество антикоагулянта Solutиона для достижения конечной концентрации 1 мг / мл EDTA в стерильной воде или 10 - 20 МЕ / мл гепарина в собранной лимфы или крови.

2. Подготовка перед его началом хирургической процедуры

  1. Проверьте все канюли с помощью промывки стерильным физиологическим раствором или анти-раствора коагулянта для того, чтобы они патент.
  2. Подготовка крысу для хирургической процедуры.
    ПРИМЕЧАНИЕ: брыжеечных лимфатических протоков виднее у крыс, которые ели или вводили дозу масла в качестве брыжеечной лимфатических становится молочно-непрозрачным с высокой липидной нагрузки. Некоторые операторы, особенно тех, кто новичок в хирургии, поэтому легче иглу брыжеечных лимфатический проток, когда крысы предварительно вводили масла (около 0,1 - 1 мл), такие как оливковое или соевое масло 0,5 - 2 ч до начала операции , Тем не менее, предварительно дозирования масла влияет на лимфатическую транспорта липидов, липофильных лекарственных средств и других факторов, в лимфе, так что он не может быть идеальным, чтобы перед введением дозы маслав зависимости от цели эксперимента.
    1. Обезболить крысу всей операции и периода выборки сбора.
      1. Например, инициировать анестезии с помощью подкожной инъекции 1,5 мл / кг коктейль I (с шага 1.2.2) в складки кожи на задней части шеи крыс с использованием 1 мл шприц, присоединенный к игле 25 г. Поддержание анестезии с помощью внутрибрюшинной инъекции 0,44 мл / кг коктейль 2 (из стадии 1.2.2) примерно каждый час в соответствии с требованиями, с использованием 1 мл шприц, присоединенный к игле 25 г.
      2. Перед началом операции убедитесь, что глубина анестезии достаточна, наблюдая частоту дыхания, движение усов, мышечный тонус и ответов на стимулы, такие как защемления стопы. Администрирование дополнительных анестезии по мере необходимости.
    2. Бритье мех от хирургических регионах, в том числе на правую сторону живота для лимфы и двенадцатиперстной кишки катетеризации и шею и левой ключицы регион для канюли сонной артерииния.
    3. Очистите хирургических регионы асептических помощью повидин-раствор йода или раствором хлоргексидина и 70% этанола скраб. Повторите это упражнение 3 раза для каждой области, заканчивая окончательной чистки с 70% этанола.
  3. Место животное в спинной отдохновение на чистом листе выше хирургического площадку с подогревом (37 ° C).

3. катетеризации брыжеечных лимфатический проток

  1. Место животное с его правой стороны, обращенной к оператору. Выполните операцию с помощью или без помощи хирургического микроскопа, как это требуется.
  2. Откройте верхний слой брюшной мышцы стене прямо 4 см разрез, проходящий от средней линии (xyphoid процесса) на правый фланг около 2 см ниже грудной клетки (маржи реберной) с помощью стерильного скальпеля лезвие (рис 2б).
  3. Откройте оставшиеся слои брюшной мышцы стенки от 4 - 5 мм латеральнее средней линии на правый фланг с мелкой паройхирургических ножниц (рис 2б).
  4. Уберите тонкий кишечник под левой брюшной мышцы стены и держать его на месте с помощью 2 - 3 части стерильной марли, насыщенные нормального физиологического раствора.
  5. Мост крысу за 10 мл пластмассовый шприц расположен горизонтально под спину крысы на уровне правой почки, чтобы облегчить визуализацию брыжеечной лимфатический проток.
  6. Расположить брыжеечной лимфатический проток: сосуд приблизительно 0,5 - 1 мм в диаметре, которое перпендикулярно правой почки и сразу ростральной и параллельно брыжеечной артерии (пульсирующего темно-красном кровеносного сосуда, см фиг.2с).
    Примечание: В не голодавших или нефть предварительно дозированных крыс судно белый, непрозрачной и легче визуализировать, чем у голодных крыс, у которых это вполне прозрачным.
  7. Осмотрите область сразу хвостовой с большим брыжеечной лимфатический проток и брыжеечной артерии, чтобы определить, во-вторых, меньше аксессуар лимфатических протоковприсутствует. Если присутствует, блокировать поток лимфы через канал путем разделения канала и окклюзии суперклеем, или связывание шов вокруг канала, чтобы гарантировать, что весь объем лимфы, оттекающей от кишечника собирают из верхней брыжеечной лимфатический проток.
  8. Проход пара прямых щипцов через пери-почечной жировой слой на нижнем крае правой почки, и через слои соединительной ткани непосредственно под полой вены, в направлении, параллельном верхней брыжеечной лимфатический проток.
  9. Использование кончик пинцетом завладеть лимфатической канюли и извлеките его через пери-за почечной жировая постели с одним концом в непосредственной близости от брыжейки лимфатический проток и другие exteriorised от животного на уровне правой почки.
  10. Изолировать брыжеечных лимфатических протока с вышележащих слоев соединительной и жировой ткани тупым. Будьте осторожны, не прокалывать и не повредить лимфатический проток.
  11. После выделения лимфатический проток, сделать небольшой холе в лимфатический проток либо с микро-ножницы, острым наконечником щипцов ювелирного или иглы 25 G. Будьте осторожны, не полностью разорвать сосуд.
  12. Убедитесь, что лимфа канюли полностью заполнен анти-коагулянта раствора (с помощью шприца и 25 г иглы) без воздушных зазоров. Вставка лимфатических канюли приблизительно 2 - 4 мм внутрь от мезентериального лимфатического протока через небольшое отверстие с помощью небольшого пинцета.
  13. Соблюдайте лимфы канюли в течение нескольких минут. Заметим, постепенное поток лимфы кишечника от свободного конца собирающей канюли, если катетеризации успешно. Если катетеризация не удалась, повторите шаги 3,8 - 3,12.
  14. Если катетеризации успешно, обеспечить канюлю, поместив небольшую каплю ветеринарной клея на входное отверстие в лимфатический проток. Будьте осторожны, не закупоривать сосуд с помощью приложения избыточного ветеринарной клея.
  15. Несмотря на то, ждет ветеринарная клей, чтобы установить, obserве поток лимфы в течение нескольких минут, чтобы гарантировать, что эта процедура была успешной катетеризации. После того, как уверены в успехе катетеризации, удалить марлевые куски, которые были размещены в брюшной полости тщательно и поместите тонкую кишку в исходное положение.
  16. Поместите лимфатических пробирку, содержащую антикоагулянт (см шаг 1,6) в конце канюли, чтобы собрать свободно текучего лимфу.
  17. Далее, иглу в двенадцатиперстную кишку для инфузии регидратации растворов и / или составов.

4. катетеризация двенадцатиперстной кишки

  1. Приложить канюли в двенадцатиперстную кишку с помощью шприца (например, 10 мл), заполненной раствором регидратации.
  2. Определить в двенадцатиперстную кишку, как ярко-розового (с более кровеносных сосудов) части тонкой кишки, который при нежной вниз, потянув показывает желудок.
  3. Сделайте небольшое отверстие прокола в двенадцатиперстной кишке около 2 см ниже стыке желудка и двенадцатиперстной кишки (привратника), используястерильный 23 G иглы.
  4. Вставьте J образный закрепленный конец двенадцатиперстной кишки канюли через отверстие прокола. Безопасный в месте с каплей цианакрилатного клея.
  5. Начать гидратации крысы путем присоединения канюли к регидратации шприца, загруженной в инфузионного насоса. По данным литературы ставки регидратации в диапазоне от 0,5 - 3 мл / ч 15,25.
  6. После завершения лимфы и двенадцатиперстной кишки катетеризации, закрыть разрез в брюшной мышечной стенке с швами. Затем закройте разрез кожи с применением несколько капель ткани клеем (цианакрилатного) вдоль боковой разрез и зажимая кожу на обеих сторонах надреза вместе.

5. катетеризации сонной артерии

Катетеризации сонной артерии может быть выполнена до или после катетеризации брыжеечной лимфатический проток. Некоторые операторы предпочитают вводить иглу в сонную артерию до cannulating в лимфатический проток так, чтобы уменьшить POtentially выбивании лимфы канюли при перемещении животного.

  1. Поставьте отметку на канюли сонной артерии 2,5 см от конической оконечности определить часть трубы вставить в артерии. Подключите другой конец канюли (т.е. без фаски) к 23 или 25 G иглой в шприц с анти-коагулянта раствора и заполнения канюли с анти-коагулянта решение убедившись, что нет воздушных зазоров нет.
  2. Для облегчения катетеризации, место наркозом крыса в спинной лежачее положение с шеей растягивается и головы указывая в сторону оператора. Обратите внимание, что некоторые операторы предпочитают выполнять эту технику с хвоста крысы, указывая в сторону оператора.
  3. Поместите 1 - 1,5 см продольный разрез через слой кожи выше в левой части трахеи в сагиттальной плоскости.
  4. Проанализируйте подкожной соединительной ткани, используя тупым кончиком пинцет, чтобы разоблачить основные парные мышцы шеи.
  5. Уберите мышц шеи тO показать левую сонную артерию (расположенный ~ 1 см ниже поверхности кожи и пульсации). Очистите лежащего соединительной ткани с артерии тупым.
  6. Изолировать ~ 1 см раздел артерии тщательно с использованием тупых щипцы ткани, стараясь не повредить прилегающие блуждающего нерва трек нерва. Выполните это путем открытия и закрытия тупым кончиком пинцета вертикально по обе стороны артерии, чтобы освободить ее от окружающей ткани и блуждающего нерва.
  7. Использование тонких наконечников щипцов, нити два шелковых швов под сонной артерии и поместить их в конце каждого раздела изолированной артерии. Галстук шва ближе к оператору и дальше всего от крыс сердца и ключицы (рис 3а).
  8. Окклюзии кровотока через артерии, поместив пару прямых тонкий наконечник щипцов под артерии (фиг.3В).
  9. Использование тонких ножниц наконечник радужной оболочки глаза, положите небольшой надрез на верхней поверхности артерии (около 1/3 извниз от верхней части изолированной области). Подавить любое пролитой крови на поверхности артерии с гепаринизированной физиологического раствора и осторожно протрите, используя ватные палочки.
  10. Вставьте кончик канюли в артерию с парой изогнутых наконечников щипцов. После введения, удаления прямой тонкий наконечник щипцов окклюзии кровотока и продвигать канюлю 2,5 см в артерию с помощью двух пар щипцов, один держать канюлю внутри артерии, чтобы остановить кровь от утечки обратно, а другой, чтобы вставить канюли.
  11. Используйте зажим небольшой артерии провести канюли внутри артерии и удалить прямые тонкий наконечник щипцов, которые были размещены ниже артерии в шаге от 5,8 до окклюзии кровотока.
  12. Подтверждение проходимости канюли путем введения антикоагулянта раствора в канюлю и отступая небольшое количество крови (фиг.3С). Затем промойте канюли с антикоагулянтами раствора и уплотнения конец с помощью пламени зажигалки или канюли пробку.
  13. Свяжите йе канюли в месте с двумя швами, помещенных под артерии в шаге 5.8.
  14. Снимите зажим артерии и закрепите третий шов вокруг артерии и канюли. Закройте шею раны со швами.

6. послеоперационном периоде и формулирование Настой

  1. Продолжать поддерживать крысу под наркозом и нагретой подушки.
  2. Увлажняет крысу через вливание раствора регидратации в двенадцатиперстную кишку, по меньшей мере, 0,5 ч после завершения в cannulations. Обратите внимание на уменьшение расхода лимфы (~ 0,1 - 0,5 мл / ч) в течение первоначального периода после пункции и вскоре увеличится до постоянной линией (0,4 - 2,5 мл / ч в зависимости от скорости регидратации).
  3. После периода восстановления, настоять формулировку интерес (содержащий липиды, наркотики и т.д.) в двенадцатиперстную кишку через канюли. При желании, использовать инфузионного насоса для регулирования расхода препарата. ПРИМЕЧАНИЕ: В протокол, описанный здесь животные остаются anaesthetised в течение операции и лимфатических сбора периода и эвтаназии под наркозом, так что дополнительное обезболивание не требуется. Если протокол изменяется, и животные имеют возможность прийти в сознание, то потребуется соответствующая анестезия и послеоперационный уход.
  4. По завершении разработки инфузии продолжают увлажняет крысу со скоростью 1,5-3 мл / ч с физиологическим раствором в двенадцатиперстную кишку, чтобы предотвратить обезвоживание.
  5. Продолжайте держать крысу на 37с с подогревом хирургического площадку для поддержания температуры (в соответствии с шагом 2,3), экспресс мочи из мочевого пузыря с помощью мягкого вниз нажатием на нижнюю часть живота по мере необходимости и повторно глазная мазь каждый час (как при шаге 2.2. 3). Регулярные изменения положение тела рекомендуется, если животное очнуться после процедуры.

7. Сбор лимфатических и образцы крови для определения липидного и наркотиков поглощение

  1. Сбор лимфы постоянно вПробирки, содержащие антикоагулянт. Изменить трубки на требуемом промежутки времени (например, ежечасно).
  2. Соберите образцы крови в точках заданного времени.
    1. Закрывают приток крови через канюлю посредством изгиба канюли назад примерно 2 см от запечатанного конца. Распечатайте канюли, отрезав запечатанный конец или удаления канюли пробку.
    2. Использование пустой шприц, снять гепарином солевой раствор из канюли, пока кровь не заполнит всю канюли.
    3. Использование новой пустой шприц, вывести требуемый объем крови и поместить в пробирку, содержащую антикоагулянт.
    4. С помощью первого шприца, замените крови, взятой перед отбором проб, чтобы уменьшить ненужные потери крови. Перед инъекцией, Флик шприца, удерживая его в вертикальном положении для того, чтобы пузырьки воздуха не ввести канюлю.
    5. С помощью шприца, заменить объем крови удалена от крыс с анти-коагулянта раствора. Убедитесь, что нет остатков крови не видно в канюле как оставшаяся может свернутьсяи блок канюли.
    6. Bend канюли примерно 2 см от негерметичной конце блокировать приток крови и удалить шприц. Использование пламя зажигалки или канюли вилку, запечатать канюли.
  3. По завершении крови и лимфы из коллекции крысы, эвтаназии крысу с помощью внутрибрюшинного введения> 100 мг / кг пентобарбитона натри.
  4. Определить скорость потока лимфы путем измерения массы лимфы, собранной в течение каждого периода времени.
  5. Измерение концентрации лекарственного средства и липида в крови, лимфы и с использованием, например, ВЭЖХ, ВЭЖХ-МС или с использованием коммерческих наборов, чтобы оценить липидов и эффективность абсорбции лекарственного средства.
  6. Рассчитать массоперенос препарата и липидов в лимфу из продукта измеренных концентраций и объема лимфы, собранных.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Результаты типичного эксперимента для количественного определения совокупный объем и скорость липидов и транспорта лекарства через лимфатическую систему кишечника следующей поставки с использованием брыжеечных лимфатических модель катетеризации показаны на рисунке 4 и на фиг.5. В этом эксперименте, 200 мкг модели липофильных Препарат Галофантрин вводили в двенадцатиперстную кишку крыс в течение 2 ч в композиции, содержащей 40 мг олеиновой кислоты (в том числе 2 - 5 мкКи 14 C-олеиновой кислоты) и 7,1 мг 2-моноолеина, диспергированные в 5,6 мл 5 мМ таурохолата натри в фосфатном буферном солевой рН 6,9. После введения препаративной формы крыс регидратации со скоростью 2,8 мл / ч с физиологическим раствором, введенная в двенадцатиперстную кишку. Лимфодренаж была собрана постоянно в трубах изменяется каждый час в течение 10 часов. Препарат получали, и эксперимент проводили в соответствии с протоколом, описанным ранее для композиции, содержащей все же COMPONЭнты кроме него не включают 2-моноолеина 43.

Как показано на фиг.4, в этих экспериментальных условиях средняя скорость лимфы для успешного канюлированных крыс был между 0,4 - 1,3 мл / ч. У некоторых крыс расход лимфатических была несколько ниже, в первом 1 - 3 ч после пункции, а затем увеличивается. Это часто наблюдается после лимфы катетеризации. Кроме того, показано на фиг.4 представляет собой скорость потока лимфы для неудачного эксперимента. В этом случае скорость потока оставалась значительно ниже, чем видно на успешных экспериментов в течение всего периода сбора данных. Аналогичным образом, совокупное лимфатической перенос триглицеридов и Галофантрин был значительно ниже в неудачного эксперимента (фиг 5А и В). Среднее суммарное Галофантрин транспорт в успешной группе у 15,1% дозы, кумулятивный триглицеридов транспорта было 61 мг в течение 10 ч и доля введенной гadiolabelled экзогенный доза липидов транспортируется в лимфе 54% (5С). Эти значения существенно не отличается от видели ранее для подобной формулировкой, которая содержала те же самые компоненты на отсутствие 2-моноолеина 43 (таблица 1), за исключением. Это говорит о том, что препараты, содержащие жирные кислоты в отсутствие источника моноглицерида может поддерживать подобное липидов и транспорта лекарства в лимфе, чтобы те, которые содержат моноглицерид. Этот результат описывается далее в разделе обсуждения.

Рисунок 5D показаны репрезентативные данные для расчета Галофантрин и триглицеридов транспорта в лимфу с течением времени после введения. Скорость транспорта обеих триглицеридов и наркотиков в лимфатические пики пару часов после липидов и введения препарата, а затем возвращается к исходному уровню. Как это обычно бывает при кишечных лимфатических липидов и наркотиков транспортных экспериментов, скорость наркотиков транспортировт в лимфе в течение каждого периода времени зеркал, что видно по триглицеридов транспорта как препарат транспортируется в лимфу в сочетании с богатых триглицеридами липопротеинов.

Рисунок 1
Рисунок 1. Схематическое изображение в форме скошенной оконечности канюли сонной артерии или лимфы, и J-образной скошенной оконечности двенадцатиперстной канюли.

Фиг.2
Рисунок 2. Фотографии (А) живота побрился в подготовке к иглу в лимфатический проток, (B) мышца живота стена открылась прямо 4 см разрез, проходящий от средней линии на правый фланг, чтобы получить доступ к лимфатический проток и ) верхняя брыжеечная лимфатический проток (в желтом круге) перпендикулярно к правой почке. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3
Рисунок 3. Фотографии (а) сонной артерии, изолированных с двумя шелковыми швами с ближайшей к оператору обвязывается, (B) сонной артерии выделяли и кровотока окклюзии с парой прямых тонкий наконечник пинцетом, размещенных внизу артерии, и (C) сонной артерии с канюли на месте и проходимости проверяется путем определенного небольшое количество крови. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 4 "SRC =" / файлы / ftp_upload / 52389 / 52389fig4highres.jpg "/>
Рисунок 4. Представитель данных для расхода брыжеечных лимфатических (мкл / ч) с течением времени. Крысам вводили препарат, содержащий 200 мкг Галофантрин, 40 мг олеиновой кислоты (с 2 мкКи 14 C-олеиновой кислоты) и 7,1 мг 2-моноолеина в 5,6 мл 5 мМ таурохолата натри в фосфатном буферном солевом растворе (рН 6,9) от 0 - 2 ч. Данные, приведенные являются среднее ± SEM для п = 3 успешные эксперименты (закрашенные кружки, ●) и N = 1 Неудачный исход (открытые треугольники, Δ).

Рисунок 5
Рисунок 5. Типичные данные для липидов и транспорта лекарства в брыжеечных лимфатических. Накопительное перенос (а) Модель Галофантрин наркотиков (HF,% дозы), (В) триглицеридов (ТГ, мг) и (С) экзогенные жирной кислоты (% досе), а скорость транспортировки (D), Т. (мг / ч) и HF (% дозы / ч) в брыжеечных лимфатических с течением времени после введения композиции, содержащей 200 мкг Галофантрин, 40 мг олеиновой кислоты (с 2 мкКи 14 С-олеиновой кислоты) и 7,1 мг 2-моноолеин в 5,6 мл 5 мМ таурохолата натри в фосфатном буферном физиологическом растворе (рН 6,9) от 0 - 2 ч. Данные, приведенные являются среднее ± SEM при п = 4 успешные эксперименты (закрашенные кружки, ●) и N = 1 Неудачный исход (открытые треугольники, Δ). Экзогенный транспортного жирных кислот не было измерено в неудачного эксперимента, но, как правило, с низким содержанием неудачных экспериментов. Данные для неудачного эксперимента исключается из панели D для ясности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Без мonoolein С 2-monolein
Означать SEM Означать SEM
Галофантрин (% дозы) 15,1 0,8 15 1,6
Триглицериды (мг) 67 4 61 6
Всего жирных кислот (мкмоль) 261 16 248 23
Экзогенный олеиновой кислоты (мкмоль) 82 5 65 6
Эндогенный жирной кислоты (мкмоль) 180 17 183 28

Таблица 1. Сравнение кумулятивных лимфатических данных транспортных более 10 ч после введения 200 мкг Галофантрин в брыжеечных лимфатических протоков канюлированного крыс в препаратах, содержащих 40 мг олеиновой кислоты (containinG 1 мкКи 14 С-олеиновой кислоты) эмульгируют в 5 мМ таурохолата натри в фосфатном буферном солевом растворе (рН 6,9) с и без 7,1 мг 2-моноолеин. Данные представляют собой среднее ± SEM для N = 4 крыс. Статистически значимых различий не видно между 2 группами.

В группе, получавшей 2-моноолеина это не точная мера эндогенного транспортировке жирных кислот в качестве олеиновая кислота прикрепляется к 2-моноолеина позвоночника не учитываются в измеряемом экзогенного транспорта олеиновой кислоты в лимфу.

б Данные по Галофантрин и общей транспортировки жирных кислот в группе без дозированной 2-моноолеина была ранее опубликована на фиг.5 ссылки 43 и воспроизводится здесь в виде таблицы.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Крыса брыжеечной лимфатических катетеризация модель позволяет прямое количественное определение концентрации и скорости переноса различных клеток и молекул (таких как липиды и наркотиков) из кишечника в лимфу и изменений в них, которые происходят в ответ на вызов различных веществ (диета , антиген, лекарственные средства, составы и т.п.) 10,27 и болезнь (рак, вирусы, колит, резистентность к инсулину, и т.д.) 5-7. Компоненты собраны в лимфе и могут быть дополнительно использованы в дополнительных экспериментах. Например, клетки можно культивировать 44, липопротеины фракционируют и лимфатических или ее компоненты, такие как липопротеины или клеток, нагруженных маркеров в том числе препаратов, радиоактивные метки и флуоресцентных зондов. Они могут быть повторно вливаются в животных-реципиентов более непосредственно оценить их функции, метаболизм, зазор и / или тканей утилизации модели 45-47. Крыса лимфатических катетеризация модель имеет несколько преимуществ по сравнению с дрэ в пробирке, на месте, в кремнии, а в моделях естественных условиях, что были описаны во введении. Самое главное, катетеризация является единственным методом, который обеспечивает прямой доступ ко всему объему компонентов в лимфатической жидкости. При выполнении в руках опытного оператора модель надежные, воспроизводимые и экспериментальные показатели успеха> 80% может быть достигнута. Тем не менее, хирургическая техника может быть трудно вначале освоить, в частности, в лаборатории, что не знаком с техникой.

Несколько шагов имеют решающее значение для успеха брыжеечной модели лимфатических катетеризации. Первый правильный выбор хирургических инструментов и типа канюли и подготовки. Наша лаборатория использует канюли PE с размерами OD 0,8 х ID 0,5 мм. Тем не менее, другие лаборатории испытали успех с ПВХ канюли той же размерности 15. Кромкофрезерные кончик канюли и предварительно погрузив его в анти-коагулянта также помогает предотвратитьокклюзия, и формирование тромбов в течение, канюли после вставки (этап 3.13). Первый этап хирургической процедуры, что некоторые операторы найти особенно важно заботится, чтобы очистить слои соединительной и жировой ткани над лимфатический проток (этап 3.10). Это помогает избежать вставки канюли между тканью и лимфатический проток, а не в лимфатический проток. Тем не менее, это уборка шаг сложно, как лимфатический проток является хрупким и легко повредить. Для некоторых этот шаг и вставки канюли наиболее успешно завершена с помощью операционного микроскопа, хотя другие считают микроскоп не нужно. При установке канюли в канал направление и глубина введения по отношению к скошенной оконечности требуется некоторое внимание, чтобы предотвратить канюлю быть поглощается стенки сосуда (этап 3.12). Каждый оператор имеет тенденцию находить свой индивидуальный предпочтение. Также важным является предотвращение образования пузырьков воздуха в окnnula во время введения в воздушные зазоры применить обратное давление свободного потока лимфы (шаг 3,12). И, наконец, применение в ветеринарии клеем, чтобы обеспечить канюлю в месте должна быть ниже точки вставки в канале в качестве клея, установленным непосредственно в верхней части канала может привести к судну коллапс и закрывают наконечник канюли (этап 3.14).

Самый простой начальный руководство относительно того, операция успешна расход лимфы. После того, как канюли в место лимфы, как правило, начинает течь медленно в первые 30 мин, а затем увеличивается. Как правило, скорость потока для успешного cannulations у крыс> 250 г являются> 0,1 мл / ч в течение первого часа, а затем увеличить до> 0,4 мл / ч в стационарном состоянии, как показано на рисунке 4. Хотя это, конечно, может изменяться в зависимости от . экспериментальное условие С точки зрения устранения неисправностей, если не лимфатического не течет через канюлю или скорости потока мала, это может быть из-за:

    канюли не был правильно установлен в воздуховоде
  1. канюли в канале, но поглощается боковой стенке сосуда
  2. канюли в канале, но окклюзии с помощью адгезива, применяемого в неправильном положении
  3. канюли в канале и пузырьков воздуха в канюлю замедляется поток
  4. сгусток сформировался внутри канюли

Тщательный осмотр обычно показывает сдерживающим фактором. Если оператор считает, канюля не был правильно помещен в первую очередь (т.е., лимфатических никогда не течет), а затем повторно ввод необходимо. Если канюли, как представляется, в правильном месте, то первый фактор, чтобы проверить, является ли воздушный пузырь или сгусток присутствует. Пузырьки воздуха, как правило, проходят через канюли, как лимфатических потоков и временно медленным течением. Иногда возможно, чтобы удалить пузырьки воздуха или сгустков, опираясь обратно на канюлю с использованием 25 G иглу, прикрепленную к, например, 1 мл шприц, Если нет воздушного пузыря или сгусток может быть полезно, чтобы попытаться повторно позиционирует крысу и / или поворота или вытягивания канюли незначительно. Иногда это может перестроить канюли таким образом, что он не заблокирован от стенки сосуда. Иногда удаление клея с или без малого движения канюли позволяет лимфатических течь снова также. Тем не менее, если все остальное не канюли должен быть повторно. По нашему опыту эксперименты оказываются менее успешными, когда канюля не был вставлен правильно с первой попытки. Тем не менее, хирургическое спасение это возможно. Еще одна сложность, которая может возникнуть трудность в катетеризации из-за анатомической дисперсии между крысами. Например, брыжеечных лимфатических протока иногда проходит в неудобном направлении или есть аксессуары лимфатический проток на противоположной стороне брыжеечной артерии в большей брыжеечной лимфатический проток. В экспериментах, которые требуют сбора всего объема протекающей лимфы из тонкой кишки (как это имеет местоПри оценке общего липида и транспорта лекарства из кишечника через лимфатические сосуды), аксессуары лимфатический проток должен быть окклюзии таким образом, что все лимфатических направлено на верхней лимфатический проток. Это трудно достичь, но можно попытаться, связывая нити вокруг вспомогательного канала или разрыва аксессуар канал и окклюзии его с ветеринарной клея (шаг 3,6). Наличие вспомогательного лимфатический проток является одним из основных факторов, который приводит к экспериментальной недостаточности в лимфатических транспорта лекарства экспериментов. Если вспомогательное судно не полностью окклюзии, лимфы и липидов и транспорта лекарства значительно ниже, чем ожидалось.

В протоколе, представленной здесь животное остается под наркозом в течение всего периода сбора лимфатических. Наркозом модель крысы (а не сознательных моделей, описанных ниже) увеличивает пропускную способность экспериментальной хирургии и эксперимент может быть осуществлен в один, а не несколько дней и хирургического успеха гели больше, как это легче поддерживать канюли проходимости в иммобилизованных животных. Анестезия теоретически может уменьшить опорожнение желудка, кишечника обработку липидов и лимфоток и транспорт. По нашему опыту, однако, лимфатический липидов и транспорта лекарства схожи в анестезированных крыс, которым вводился препарат непосредственно в двенадцатиперстную кишку (Чтобы обойти опорожнения желудка) в предварительно переваривается и предварительно диспергируют транспортных средств (систем Е., жирных кислот и моноглицеридов мицеллярные дисперсных поверхностно-активными веществами ) по сравнению с сознании крыс, вводимых препарат через желудочный зонд в желудок в эквивалентном триглицеридов 21,23,27. В самом деле, большинство кишечных лимфатических препарат транспортных экспериментов в нашей лаборатории в течение последних 10 лет были проведены в анестезированных модели из-за более высокой пропускной способности, которые могут быть достигнуты. В этих экспериментах мы чаще вводят лекарственных веществ в препаратах, содержащих жирную кислоту (например, олеиновую кислоту), и поверхностно-активное вещество 43.Жирные кислоты синтезируются в триглицериды до введения в кишечных лимфатических липопротеинов, и это требует источник компонентов с образованием глицерина основу триглицеридов (например, 2-моноглицерида или глицерол-3-фосфат). Это говорит о том, что введение жирных кислот в отсутствие источника глицерина может привести к снижению лимфатического транспорта. Администрация жирной кислоты, однако, позволяет прямой расчет вклада экзогенного вводить жирной кислоты и эндогенных липидов в лимфатические липидов и транспорта лекарства 43. Кроме того, 2-моноглицерид дорого и как правило, нестабильны, поскольку это легко изомеризуется 1-моноглицерида, который расщепляется на глицерин в просвет кишечника. В исследованиях, указанные здесь, мы дополнительно показывают, что лимфатическую липидов и транспорта лекарства эквивалентно после введения лекарственного модели Галофантрин с жирной кислотой (например, олеиновой кислоты) и поверхностно-активного вещества (желчные соли) препарат либо в прesence или отсутствие исходного глицерина 2-моноолеина (Таблица 1). Эндогенные источники глицерина, таким образом, появляется достаточно, чтобы поддерживать эквивалентную лимфы и липидов и транспорта лекарства после введения этой модели лекарственного средства с жирными кислотами (например, олеиновой кислоты) в отсутствие источника глицерина. Это дает уверенность, что представительные лимфатические данных транспортных может быть получено с помощью простых составов жирных кислот.

Наркозом модель легко обобщается на сознательный модели при необходимости. В сознательных моделей препараты могут быть вводили через зонд непосредственно в желудок или инфузии в двенадцатиперстную кишку или внутривенно, прямое сравнение может быть сделано, чтобы фармакокинетических исследований, проведенных в не-лимфатических канюлю сознании животных и результаты могут быть рассмотрены более физиологически отношение. Длительный период времени допускается в сознании животных также имеет то преимущество, что позволяет обеспечить сбор более полных фармакокинетических профилей для DRКонцентрации мкг в крови, в то время как под наркозом в экспериментах, профили крови часто являются неполными, особенно в течение длительного Half Life препаратов. Как описано выше, однако, вероятность успеха для сознательных лимфатических канюлируют исследований является ниже и эксперименты занять больше времени, чтобы закончить. Существуют два типа моделей сознательных лимфатических катетеризации, описанные в литературе. В сознании сдержанных моделей 15, после лимфатической катетеризации операции, животное просто развернулся на его передней и помещена в соответствующий пресечения оставшейся части эксперимента с лимфой канюли экспортированной и вставляется в пробирку. Животное затем дают опомниться и восстановить после хирургического вмешательства O / N. Шанс с этой моделью очень хорошо в руках опытных операторов, но это может быть трудно получить разрешение этики сдерживать животных для длительного периода времени, необходимого для лимфатического коллекции. Альтернативный модель, где лимфа собранысознательных и свободно движущихся крыс. Эта модель была подробно ранее 25. В этой модели длинные канюли вставляются в брыжеечных лимфатических протоков, двенадцатиперстной кишки и сонной артерии. Канюли затем туннель под кожей, выводили на задней части шеи и помещают через систему поворота. Крысу помещают в жгуте, прикрепленной к поворотной и позволило в сознание и для восстановления после хирургического вмешательства O / N. Животное имеет свободное движение в метаболическую клетку и лимфатических и крови могут быть собраны из канюли экспортированной за пределами клетки.

Брыжеечных лимфатических катетеризация остается единственным средством, которое позволяет напрямую оценить лимфатических компонентов в их стадии зарождения. Лимфодренаж катетеризация наиболее часто описывается в крыс, как хирургия является менее сложным, чем более мелкие и крупных животных, модель дешевле, чем крупные животные и результаты появляются достаточно сопоставимы у разных видов 27. Режим крысал могут быть изменены в соответствии с экспериментальной необходимости и вероятность успеха высока в руках опытных операторов. Модель также может быть соединен с другом в пробирке или в естественных условиях исследования, чтобы изучить в деталях, метаболизме или функции кишечника лимфатических компонентов. После создания брыжеечной лимфатических модель канюлируют крыса, таким образом, мощным инструментом для оценки концентрации, транспорт, функцию и метаболизм различных параметров, которые проходят непосредственно из кишечника в лимфатическую систему (и во многих случаях течь в конечном итоге в большой круг кровообращения).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sterile saline Baxter healthcare AHB 1307 Any brand can be used. Example here is Baxter 100 ml saline bags, box of 50
70 % ethanol in water Any Any brand can be used
Chlorhexidine gluconate solution (Microshield 4) Livingstone International JJ60243L Any brand can be used. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search
=JJ60243L
Betadine solution Livingstone International BU0510 Any brand can be used. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search
=BU0510
Ilium Ketamil (Ketamine 100 mg/ml) PROVET VICTORIA  KETA I 1 http://www.provet.com.au/
Ilium Xylazil (Xylazine 100 mg/ml) PROVET VICTORIA  TRO-3828 http://www.provet.com.au/
ACP 10 Injection (Acepromazine 10 mg/ml) PROVET VICTORIA  VTG-DACP010020 http://www.provet.com.au/
Sodium pentobarbitone PROVET VICTORIA  24529 Any brand can be used. Example here is Lethabarb® 325 mg/ml sodium pentobarbitone, Virbac Animal Health. http://www.provet.com.au
Heparin (35000I.U. in 35 mL) Sigma Pharmaceuticals 337220 http://sigmaco.com.au/
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) disodium salt dihydrate Sigma-Aldrich E1644 Any brand can be used. Example here is disodium salt of EDTA from Sigma. 
Polyethylene (PE) cannula o.d. 0.96 mm x i.d. 0.58 mm Microtube extensions PE8050 Any brand can be used. Example here is PE tubing 0.96 x0.58 mm, 30 m
Polyethylene (PE) cannula o.d. 0.8 mm x i.d. 0.5 mm Microtube extensions PE9658 Any brand can be used. Example here is PE tubing 0.8 x0.5 mm, 30 m
Ruler Any Any brand can be used
Markers Any Any brand can be used
Cigarette lighter Any Any brand can be used
Veterinary adhesive Any Any brand can be used
23 gauge needles Livingstone International DN23GX0.75LV Any brand can be used. Example here is Livingstone Disposable Needle, Sterile, 23GX0.75inch, 100/BOX. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=
6&search=DN23GX0.75LV
25 gauge needles Livingstone International DN25GX1.0LV Any brand can be used. Example here is Livingstone Disposable Needle, Sterile, 25GX1.0inch, 100/BOX. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search=
DN25GX1.0LV
1 ml syringe Livingstone International T3SS01TA Any brand can be used. Example here is Terumo syringe 1 ml Slip Tuberculin 100/Box. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search
=T3SS01TA
10 ml syringe Livingstone International T3SS10SA Any brand can be used. Example here is Terumo syringe 10 ml Slip 100/Box. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search
=T3SS10SA
Gauze swabs Livingstone International GSC075 Any brand can be used and cut to required size. Example here is gauze swabs cotton filled 7.5x7.5 cm, 8 ply. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search
=GSC075
Cotton buds Livingstone International CTAST075DP Any brand can be used. Example here is Livingstone cotton applicator plastic double tipped. 75MM. 100/PK. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search
=CTAST075DP
Heating pad Ratek WT1 Any brand that keeps temperature at 37C can be used. Example here is Ratek warming tray.
Surgical light Harvard Apparatus 72-0215 with 72-0267 Any brand can be used. Example here is Harvard apparatus V-Lux 1000 Cold Light Source with Bifurcated Gooseneck Light Guide, Black, 4.7 mm fiber diameter (each arm). http://www.harvardapparatus.com/webapp/wcs/stores/servlet/product_11051_10001_50601_
-1_HAI_ProductDetail and  http://www.harvardapparatus.com/webapp/wcs/stores/servlet/product_11051_10001_35487_
-1_HAI_ProductDetail___
Surgical microscope Zeiss 495005-0014-000 Any brand can be used. Example here is Zeiss Stereomicroscope Stemi 2000-C with Stand S Double Spot and KL 300 LED. https://www.micro-shop.zeiss.com/?l=en&p=us&f=e&i=10143
Silk suture Livingstone International DTSK163019F4 Any brand can be used. Example here is  

3/8 Circle Reverse Cut Silk Suture 3/0 Thread 19mm. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search
=DTSK163019F4
Scalpel blades Fine Science Tools (FST) 10020-00 Any brand can be used. Example here is FST Scalpel Blade #20. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=191
Scalpel handle Fine Science Tools (FST) 10004-13 Any brand can be used. Example here is FST Scalpel Handle #4. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=298&CategoryId=51
1 x Small surgical scissors Fine Science Tools (FST) 14060-09 Any brand can be used. Example here is FST Fine Scissors, 9 cm with 21 mm cutting edge, sharp, straight. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=40&CategoryId=17
2 x Forceps with serrated curved tip Fine Science Tools (FST) 11001-13 Any brand can be used. Example here is FST 13 cm standard pattern forceps with curved 2.8x1.4 mm tip. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=405&CategoryId=32
1 x Iridectomy scissors Fine Science Tools (FST) 15000-08 Any brand can be used. Example here is FST Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge, Straight. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=17&CategoryId=16 
1 x Forceps with straight serated tip Fine Science Tools (FST) 11650-10 Any brand can be used. Example here is FST Graefe 10 cm straight with serrated 1 x 0.99 mm tip. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=390&CategoryId=32
1 x Forceps with smooth sharp straight fine tip Fine Science Tools (FST) 11251-10 Any brand can be used. Example here is FST Dumont #5 forceps straight 11cm with 0.08 x 0.04mm tip. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=335&CategoryId=29
1 x Forceps with smooth fine curved forceps Fine Science Tools (FST) 11063-07 Any brand can be used. Example here is FST Delicate Forceps 9 cm with smooth 0.4 x 0.3mm tip. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=360
2 x Hemostats Fine Science Tools (FST) 13010-12 Any brand can be used. Not all operators use the hemostats. Example is FST 12 cm Micro-Mosquito Hemostats with 20 mm length x 1.3 mm width serrated, straight tip. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=377&CategoryId=33
1 x Suture needle holder Fine Science Tools (FST) 12001-13 Any brand can be used. Example here is FST 13cm Hasley Needle Holder with 16 mm length x 1.9 mm width tip. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=254&CategoryId=70
1 x Artery clamp Fine Science Tools (FST) 18050-28 Any brand can be used. Example here is FST Bulldog Serrefines straight, 28 mm long, 9x1.6 mm jaw dimension with medium clamp press. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=270&CategoryId=82
Oleic acid Sigma Aldrich O1008 When required, any brand can be used. Example here is 99% pure oleic acid. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/o1008?lang=en&region=AU
14C-oleic acid Perkin  NEC317050UC  Any brand can be used. Example here is Oleic Acid, [1-14C]-, 50µCi (1.85MBq). http://www.perkinelmer.com/Catalog/Product/ID/NEC317050UC
Sodium taurocholate Sigma Aldrich T4009 Any brand can be used. Example here is taurocholic acid sodium salt hydrate ≥95% (TLC) . http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t4009?lang=en&region=AU
Halofantrine Glaxo Smith Kline Halofantrine was kindly provided as a gift from Glaxo Smith Kline
Sodium phosphate monobasic Sigma Aldrich 71507 Any brand can be used. Example here is sodium phosphate monobasic monohydrate, BioXtra, for molecular biology, >99.5%. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/71643?lang=en&region=AU
Sodium phosphate dibasic Sigma Aldrich 71643 Any brand can be used. Example here is sodium phosphate dibasic dihydrate, BioUltra, for molecular biology, >99%. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/71507?lang=en&region=AU

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Barrowman, J. A., Tso, P. Gastrointestinal lymphatics. Comprehensive Physiology. 1733-1777 (2010).
  2. Karaman, S., Detmar, M. Mechanisms of lymphatic metastasis. J Clin Invest. 124, (3), 922-928 (2014).
  3. Mossel, E. C., Ramig, R. F. A lymphatic mechanism of rotavirus extraintestinal spread in the neonatal mouse. J Virol. 77, (22), 12352-12356 (2003).
  4. Pantaleo, G., et al. Hiv-Infection Is Active and Progressive in Lymphoid-Tissue during the Clinically Latent Stage of Disease. Nature. 362, (6418), 355-358 (1993).
  5. Chakraborty, S., Zawieja, S., Wang, W., Zawieja, D. C., Muthuchamy, M. Lymphatic system: a vital link between metabolic syndrome and inflammation. Annals of the New York Academy of Sciences. 1207, R94-R102 (2010).
  6. Dixon, J. B. Lymphatic lipid transport: sewer or subway. Trends Endocrinol Metab. 21, (8), 480-487 (2010).
  7. Weid, P. -Y., Rehal, S., Ferraz, J. G. Role of the lymphatic system in the pathogenesis of Crohn's disease. Current Opinion in Gastroenterology. 27, (4), 335-341 (2011).
  8. Wang, Y., et al. Chylomicrons promote intestinal absorption and systemic dissemination of dietary antigen (ovalbumin) in mice. PloS one. 4, (12), e8442 (2009).
  9. Ji, Y., et al. Activation of rat intestinal mucosal mast cells by fat absorption. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 302, (11), G1292-G1300 (2012).
  10. Kohan, A., Yoder, S., Tso, P. Lymphatics in intestinal transport of nutrients and gastrointestinal hormones. Ann N Y Acad Sci. 1207, Suppl 1. E44-E51 (2010).
  11. Trevaskis, N. L., Charman, W. N., Porter, C. J. Targeted drug delivery to lymphocytes: a route to site-specific immunomodulation. Mol Pharm. 7, (6), 2297-2309 (2010).
  12. Rothkotter, H. J., Huber, T., Barman, N. N., Pabst, R. Lymphoid cells in afferent and efferent intestinal lymph: lymphocyte subpopulations and cell migration. Clin Exp Immunol. 92, (2), 317-322 (1993).
  13. Trevaskis, N. L., Charman, W. N., Porter, C. J. Lipid-based delivery systems and intestinal lymphatic drug transport: a mechanistic update. Adv Drug Deliv Rev. 60, (6), 702-716 (2008).
  14. Mansbach, C. M., Dowell, R. F., Pritchett, D. Portal transport of absorbed lipids in rats. Am J Physiol. 261, (3 Pt 1), G530-G538 (1991).
  15. Kohan, A. B., Howles, P. N., Tso, P. Methods for studying rodent intestinal lipoprotein production and metabolism. Curr Protoc Mouse Biol. 2, 219-230 (2012).
  16. Porter, C. J., Trevaskis, N. L., Charman, W. N. Lipids and lipid-based formulations: optimizing the oral delivery of lipophilic drugs. Nat Rev Drug Discov. 6, (3), 231-248 (2007).
  17. Trevaskis, N. L., et al. The role of the intestinal lymphatics in the absorption of two highly lipophilic cholesterol ester transfer protein inhibitors (CP524,515 and CP532,623). Pharm Res. 27, (5), 878-893 (2010).
  18. Choo, E. F., et al. The Role of Lymphatic Transport on the. Systemic Bioavailability of the Bcl-2 Protein Family Inhibitors Navitoclax (ABT-263) and ABT-199. Drug Metabolism and Disposition. 42, (2), 207-212 (2014).
  19. Han, S., et al. Targeted delivery of a model immunomodulator to the lymphatic system: comparison of alkyl ester versus triglyceride mimetic lipid prodrug strategies. J Control Release. 177, 1-10 (2014).
  20. Bollman, J. L., Cain, J. C., Grindlay, J. H. Techniques for the collection of lymph from the liver, small intestine, or thoracic duct of the rat. J Lab Clin Med. 33, (10), 1349-1352 (1948).
  21. Porter, C. J., Charman, S. A., Charman, W. N. Lymphatic transport of halofantrine in the triple-cannulated anesthetized rat model: effect of lipid vehicle dispersion. J Pharm Sci. 85, (4), 351-356 (1996).
  22. Boyd, M., Risovic, V., Jull, P., Choo, E., Wasan, K. M. A stepwise surgical procedure to investigate the lymphatic transport of lipid-based oral drug formulations: Cannulation of the mesenteric and thoracic lymph ducts within the rat. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 49, (2), 115-120 (2004).
  23. Porter, C. J., Charman, S. A., Humberstone, A. J., Charman, W. N. Lymphatic transport of halofantrine in the conscious rat when administered as either the free base or the hydrochloride salt: effect of lipid class and lipid vehicle dispersion. J Pharm Sci. 85, (4), 357-361 (1996).
  24. Caliph, S. M., Charman, W. N., Porter, C. J. Effect of short-, medium-, and long-chain fatty acid-based vehicles on the absolute oral bioavailability and intestinal lymphatic transport of halofantrine and assessment of mass balance in lymph-cannulated and non-cannulated rats. J Pharm Sci. 89, (8), 1073-1084 (2000).
  25. Edwards, G. A., Porter, C. J., Caliph, S. M., Khoo, S. M., Charman, W. N. Animal models for the study of intestinal lymphatic drug transport. Adv Drug Deliv Rev. 50, (1-2), 45-60 (2001).
  26. Noguchi, T., Charman, W. N. A., Stella, V. J. Lymphatic Appearance of Ddt in Thoracic or Mesenteric Lymph Duct Cannulated Rats. International Journal of Pharmaceutics. 24, (2-3), 185-192 (1985).
  27. Trevaskis, N. L., et al. A mouse model to evaluate the impact of species, sex, and lipid load on lymphatic drug transport. Pharm Res. 30, (12), 3254-3270 (2013).
  28. Kota, J., et al. Lymphatic absorption of subcutaneously administered proteins: influence of different injection sites on the absorption of darbepoetin alfa using a sheep model. Drug Metab Dispos. 35, (12), 2211-2217 (2007).
  29. McHale, N. G., Adair, T. H. Reflex modulation of lymphatic pumping in sheep. Circ Res. 64, (6), 1165-1171 (1989).
  30. White, D. G., Story, M. J., Barnwell, S. G. An Experimental Animal-Model for Studying the Effects of a Novel Lymphatic Drug Delivery System for Propranolol. International Journal of Pharmaceutics. 69, (2), 169-174 (1991).
  31. Khoo, S. M., Edwards, G. A., Porter, C. J., Charman, W. N. A conscious dog model for assessing the absorption, enterocyte-based metabolism, and intestinal lymphatic transport of halofantrine. J Pharm Sci. 90, (10), 1599-1607 (2001).
  32. Kararli, T. T. Comparison of the gastrointestinal anatomy, physiology, and biochemistry of humans and commonly used laboratory animals. Biopharm Drug Dispos. 16, (5), 351-380 (1995).
  33. Kassis, T., et al. Dual-channel in-situ optical imaging system for quantifying lipid uptake and lymphatic pump function. J Biomed Opt. 17, (8), 086005 (2012).
  34. Dahan, A., Hoffman, A. Evaluation of a chylomicron flow blocking approach to investigate the intestinal lymphatic transport of lipophilic drugs. Eur J Pharm Sci. 24, (4), 381-388 (2005).
  35. Xiao, C., Lewis, G. F. Regulation of chylomicron production in humans. Biochim Biophys Acta. 1821, (5), 736-746 (2012).
  36. Seeballuck, F., Ashford, M., O'Driscoll, C. The Effects of Pluronic® Block Copolymers and Cremophor EL on Intestinal Lipoprotein Processing and the Potential Link with P-Glycoprotein in Caco-2 Cells. Pharmaceutical Research. 20, (7), 1085-1092 (2003).
  37. Levy, E., Mehran, M., Seidman, E. Caco-2 cells as a model for intestinal lipoprotein synthesis and secretion. The FASEB Journal. 9, (8), 626-635 (1995).
  38. Cartwright, I. J., Higgins, J. A. Isolated rabbit enterocytes as a model cell system for investigations of chylomicron assembly and secretion. Journal of Lipid Research. 40, (7), 1357-1365 (1999).
  39. Dixon, J. B., Raghunathan, S., Swartz, M. A. A Tissue-Engineered Model of the Intestinal Lacteal for Evaluating Lipid Transport by Lymphatics. Biotechnology and Bioengineering. 103, (6), 1224-1235 (2009).
  40. Gershkovich, P., et al. The role of molecular physicochemical properties and apolipoproteins in association of drugs with triglyceride-rich lipoproteins: in-silico prediction of uptake by chylomicrons. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 61, (1), 31-39 (2009).
  41. Gershkovich, P., Hoffman, A. Uptake of lipophilic drugs by plasma derived isolated chylomicrons: Linear correlation with intestinal lymphatic bioavailability. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 26, (5), 394-404 (2005).
  42. Holm, R., Hoest, J. Successful in silico predicting of intestinal lymphatic transfer. International Journal of Pharmaceutics. 272, (1-2), 189-193 (2004).
  43. Trevaskis, N. L., Porter, C. J., Charman, W. N. Bile increases intestinal lymphatic drug transport in the fasted rat. Pharm Res. 22, (11), 1863-1870 (2005).
  44. Miura, S., et al. Increased proliferative response of lymphocytes from intestinal lymph during long chain fatty acid absorption. Immunology. 78, (1), 142-146 (1993).
  45. Caliph, S. M., et al. The impact of lymphatic transport on the systemic disposition of lipophilic drugs. J Pharm Sci. 102, (7), 2395-2408 (2013).
  46. Caliph, S. M., Trevaskis, N. L., Charman, W. N., Porter, C. J. Intravenous dosing conditions may affect systemic clearance for highly lipophilic drugs: implications for lymphatic transport and absolute bioavailability studies. J Pharm Sci. 101, (9), 3540-3546 (2012).
  47. Trevaskis, N. L., et al. Tissue uptake of DDT is independent of chylomicron metabolism. Arch Toxicol. 80, (4), 196-200 (2006).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics