Mesentriske Lymfe Duct kannulert Rat Modell: Søknad til Vurdering av Intestinal Lymphatic Drug Transport

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Trevaskis, N. L., Hu, L., Caliph, S. M., Han, S., Porter, C. J. The Mesenteric Lymph Duct Cannulated Rat Model: Application to the Assessment of Intestinal Lymphatic Drug Transport. J. Vis. Exp. (97), e52389, doi:10.3791/52389 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Tarm lymfesystemet spiller nøkkelroller i væsketransport, lipid absorpsjon og immunforsvar. Lymfe renner direkte fra tynntarmen via en serie av lymfekar og noder som konvergerer ved den overlegne mesenteriske lymfe kanal. Kanylering av mesenteriske lymfeknutekanalen muliggjør således innsamling av mesenteriske lymfeknuter som strømmer fra tarmen. Mesenteriske lymfeknute består av en cellulær fraksjon av immunceller (99% lymfocytter), vandig fraksjon (fluid, peptider og proteiner, slik som cytokiner og hormoner gut) og lipoprotein fraksjon (lipider, lipofile molekyler og apo-proteiner). Den mesenteriske lymfeknutekanalen kanylering modell kan derfor brukes til å måle konsentrasjonen og hastighet på transport av en rekke faktorer fra tarmen via lymfesystemet. Endringer av disse faktorene som svar på ulike utfordringer (f.eks, dietter, antigener, narkotika) og i sykdom (f.eks, inflammatorisk tarmsykdom, HIV, diabetes) kan også be bestemt. Et område for å utvide interesse er rollen til lymfatisk transport i absorpsjon av oralt administrerte lipofile legemidler og forløpere som assosierer med tarm lipid absorpsjon trasé. Her beskriver vi, i detalj, en mesenteriske lymfeknutekanal kanylert rottemodell som muliggjør evaluering av hastigheten og graden av lipid og medikamenttransport via lymfesystemet i flere timer tarm levering. Fremgangsmåten er lett tilpasses til måling av andre parametre i lymfe. Vi gir detaljerte beskrivelser av de vanskeligheter som kan oppstå ved etablering av denne komplekse kirurgisk metode, samt representative data fra mislykkede og vellykkede eksperimenter for å gi instruksjoner om hvordan du kan bekrefte eksperimentell suksess og tolke data innhentet.

Introduction

Lymfe flyter fra tynntarmen via en enveis prosess som kommer på enkelt lacteals som finnes i hver liten tarmtottene en. Lacteals er relativt gjennomtrengelig for væske, makromolekyler og celler og lymfe dannelse og dermed starter med oppføring av disse faktorene i lacteals. Den innledende lymfe i lacteals senere strømmer fra tarmen via et nettverk av lymfatisk microvessels, samle (afferent) lymfekar, en serie av mesenteriets lymfeknuter og til slutt de post-nodal (efferent) lymfeårer. Innenfor de noder, passerer lymfe gjennom en serie av medullære bihuler hvor utvekslingen skjer med node hørende immunceller så vel som materialet som kommer inn i noden fra blodet. All lymfe som strømmer fra tynntarmen til slutt konvergerer inn i efferent mesenteriske lymfe kanal og senere cisterna chyli. Den cisterna chyli samler også lymfe drenering hale perifert vev, INTESTInal, lever- og korsrygg og tiltrer thorax lymfe kanalen sammen med lymfe fra mediastinum og kranie deler av kroppen. Thorax lymfe duct tømmer lymfe direkte inn i venesystemet i krysset venstre indre hals og subclavia årer. Protokollen er beskrevet her, noe som muliggjør oppsamling av lymfe direkte fra mesenteriske lymfeknutekanal, letter således analyse av forskjellige faktorer i transitt direkte fra tarmen til systemisk (generelt) sirkulasjonen via tarm lymfesystemet.

De store fysiologiske funksjoner tildelt tarm lymfesystemet er å opprettholde væskebalansen, for å lette lipid og lipofilt molekyl absorpsjon, og for å muliggjøre hensiktsmessige immunresponser en. Tumorceller og virus også forplante via tarm lymfekar 2-4 og viktige endringer skjer innen lymphatics i flere inflammatoriske og metabolske sykdommer 5-7. Kannulation av den mesenteriske lymfeknute kanal for å samle lymfen innen mesenteriet muliggjør en analyse av bulkfluidstrømmen via tarm lymfekar, samt kvantifisering av konsentrasjonen og transporthastighet for forskjellige celler og molekyler. Endringer i konsentrasjonen eller transitt av disse faktorene som svar på ulike utfordringer (f.eks dietter, antigener, narkotika) og i sykdomsmodeller (for eksempel kolitt, HIV, diabetes) kan også bli vurdert. Mens det er umulig å beskrive hver omfattende lymfe komponent som kan analyseres og sammenlignes her, éntrådet består mesenteriske lymfeknute av vandig, lipid og cellulære faser. Komponenter av interesse i den vandige fasen omfatter peptider og proteiner så som antigener eller tolerogens 8, immun budbringere slik som cytokiner og mastcellemediatorer 9 og metabolske mediatorer slik som inkretinene 10. Den cellulære brøkdel av post-nodal mesenteriske lymfe består nesten utelukkende (over 99%) av lymphocytes 11. Ulike immunceller (dendrittiske celler, mastceller, etc.) inn pre-nodal mesenteriske lymfekar men forblir innenfor noden 12. Hvis cellene i afferent lymfe er av interesse, er det mulig å samle disse cellene via fjerning av mesenteriske lymfeknuter i flere dager før kanylering av mesenteriske lymfeknutekanalen 12. På denne måte vil afferente og efferente lymph kanaler er direkte forbundet og lymfe celler i afferent lymfe passere direkte inn i den mesenteriske lymfeknutekanalen. Transitt og fenotype av forskjellige immunceller som passerer gjennom tarm lymfekar kan således bli undersøkt. Kanskje den vanligste årsaken sitert for å samle mesenteriske lymfe til dags dato, er imidlertid å studere intestinal behandling, absorpsjon og transport av lipider og lipofile molekyler 10.

Etter inntak, er lipider spaltet (for eksempel fra triglycerid til fettsyrer og monoglycerid, phospholipid til fettsyrer og lysophospholipid og kolesterolester i fettsyrer og kolesterol, etc.) og er dispergert inne i tarmlumen i små micelle og vesikulær strukturer ved tillegg av amfifiler fra galle (fosfolipider, kolesterol og gallesalter) og virkningen av pancreatic enzymer 10,13. Herfra blir de absorbert inn enterocytter. En del av de absorberte komponenter er gjenforestres for dannelse av triglyserider, fosfolipider og kolesterolestere i de absorberende celler (enterocytter). Disse re-forestrede lipider er satt sammen av en kombinasjon av eksogent inge lipidkomponenter og endogene lipidkomponenter fra det utskilte galle, mukosale lipid bassenger eller tarmblodtilførsel 13. Herfra de forestrede lipider er enten lagret i enterocytter eller satt sammen til tarm lipoproteiner (chylomikroner, meget lav tetthet lipoproteiner (VLDL)) sammen med forskjellige apoproteiner og andre lipofile molekyler ( 10,13. Etter å ha forlatt enterocytter, er lipoproteiner spesifikt transporteres fra tarmen til den systemiske sirkulasjon via det mesenteriske lymfesystemet som tarm lacteals er mer gjennomtrengelige for de trer enn tarmblodkapillærer. En andel av absorbert lipidkomponenter er også transporteres fra tarmen til den systemiske sirkulasjon via blodkapillærer og portalvenen som enkelt, ikke-lipoprotein assosiert, 14 molekyler. Men generelt, er portalen blodåre transportrute bare en betydelig aktør i absorpsjon av korte og mellomkjedelengde lipider.

Samlingen av mesenteriske lymfe muliggjør dermed vurderingen av transport av lipoproteiner og tilhørende komponenter (lipider, lipofile molekyler, Apo-proteiner) fra tarmen. Lipoproteinene kan kvantifiseres og karakterisert med den fordel at mesenteriske lymfeknuter lipoproteiner, generelt, er i en nascent tilstand siden de har ikke blitt omfattende modifisert ved systemiske enzymer slik som lipoproteinlipase 15. Mens den mesenteriske lymfeknute kannulert rottemodell har kanskje historisk vært mest omfattende beskrevet for analyse av lipid / lipoprotein transport fra tarmen, et område for å utvide området er rollen til lymfekar i transport av lipofile legemidler, prodrugs og andre xenobiotika 13,16 som er fokus for den modellen som er beskrevet her. Lipofile legemidler (vanligvis de med log P> 5 og løselighet i langkjedede triglyserider> 50 mg / g selv om unntakene er tilsynelatende) 17,18, prolegemidler 19 og andre xenobiotika 13,16 kan få tilgang til tarm lymfekar enten passivt eller ved aktivt integrere i tarm lipoprotein transportveier 19.

Rotte mesenteriske lymfe kanylering teknikken har dermed mange programmer. Bollman et al. Først beskrevet en technique å cannulate mesenteriske lymfe kanalen hos rotter i 1948 20. Siden den gang en rekke varianter på modellen har blitt beskrevet. For eksempel, kan samlingen oppstå når rotten bedøvet med forskjellige bedøvelsesmidler 21,22, eller i bevisst tilstand mens behersket 15 eller fritt bevege seg 23,24. Rotter kan gis ulike rehydrering løsninger og andre stoffer som lipider og narkotika formuleringer ved ulike priser i magen, tarmene eller parenteralt (typisk 0-5 ml / time) 25. I noen studier thorax lymfe kanalen i stedet for mesenteriske lymfeknutekanal kanylert for å estimere transport fra tarmen via lymfesystemet selv om dette kan overvurdere transitt fra tynntarm, avhengig av faktoren av interesse, som thorax lymfe kanalen mottar også lymfe fra annen regioner 22,26. Lymfe kanylering modeller har også blitt beskrevet i flere andre arter, inkludert mus 15,27, mini-pigs 12, sau 28,29, griser 30 og hunder 31. Imidlertid er rottemodellen den mest utbredte og konsekvent sitert. Detaljerte protokoller for kanylering av mesenteriske lymfe duct fulgt av samling av lymfe i bevisst 25 eller bedøvet 22 rotter og mus 15,27 har blitt publisert tidligere, og den interesserte leser er rettet mot disse protokollene. Denne protokollen er den første til å demonstrere teknikken i en visualisert format.

Lymfe kanulert rottemodell har fordeler fremfor større dyremodeller i form av utgifter, den enkle operasjonen og etiske hensyn. Når sammenlignet med mus-modellen, er mesenteriske lymfeknute kanylering kirurgi også lettere i rotte selv om musemodell gjør det mulig for mer detaljerte studier av transgene dyr 27. Ikke desto mindre, er det noen begrensninger i rottemodellen, spesielt de som er forbundet med forskjeller i fysiologi, som begrenser extrapolation til andre pre-kliniske og kliniske situasjoner. For eksempel, i rottegallestrøm er konstant og uavhengig av matinntaket mens i høyere arter mat eller lipider stimulere gallestrøm 32. Dette skaper utfordringer for å skaffe representative pre- og post prandiale miljøer i rotte som gjenspeiler det som er sett i større arter og mennesker. For stoffet leverings studier, større arter kan også ved vurderingen lymfatisk transport etter administrasjon av realistisk menneskelig dosering danner 25 trekkes. I en fersk undersøkelse, ble lipid transport priser i mesenteriske lymfe funnet å være sammenlignbare på tvers av arter (mus, rotte, hund) etter administrasjon av en tilsvarende masse og type lipid som gir en viss sikkerhet i ekstrapolere lipid transportdata på tvers av arter 27. Imidlertid transport av en modell lipofilt medikament, halofantrin, rangert i rekkefølge av animalsk størrelse (dvs., dog> rat> mus). En skaleringsfaktor kan således være nødvendig for å extrapolate lymfatiske narkotika transportdata fra rotte til andre arter.

En begrensning av lymfe kanylering modeller, generelt, er at passive lymfe samling direkte fra en lymfatisk kanal kan modifisere lymfestrømmen og transport siden lymfekar arbeide mot en trykk-gradient som endres når fartøyet er kanylert 33. Lymfe kanylering modellen kan også være vanskelig å etablere i laboratorier som er ukjente med teknikken. Alternative modeller har dermed blitt beskrevet. For eksempel, transitt av faktorer via tarm lymfesystemet, som lipoproteiner og lipofile molekyler, har blitt studert via indirekte innsamling av blod. En slik modell er å sammenligne konsentrasjonene av lipider og / eller legemidler blod etter oral administrering i nærvær og fravær av inhibitorer (f.eks, colchicin, Pluronic L81, cykloheksimid) av intestinal lipoprotein produksjon som blokkerer lymfatisk transport 34. En fordelav modeller som kvantifiserer lymfatisk transport indirekte via samling av blodprøver, er at den muliggjør en vurdering av lymfatisk transport hos mennesker som invasiv kirurgi ikke er påkrevet 35. Men hemmere av lymfatisk transport er ikke spesifikke og faktorer som transporteres via lymfekar fortynnes og endret i den systemiske sirkulasjon som kompliserer slike vurderinger. In vitro alternativer har også blitt beskrevet. For eksempel har Caco-2 cellekulturer eller isolert enterocyte blitt benyttet for å studere nærmere intestinal sekresjon av molekyler som inngår lymphatics 36-38. En avansert in vitro modell som er mer representativt for den menneskelige tarmmikromiljøet ble også nylig beskrevet 39. I denne modellen, en lymfatisk endotel cellelaget er ko-dyrket med Caco-2-celler som muliggjør mer detaljert analyse av overføring av stoffer fra tarmen inn i lymfekjertlene. Men i vitro cellesystemer mangler utveksling flyt og overføre dvs. samtrafikk med en intestinal lumen og underliggende blod og lymfatiske vaskulær forsyning. I en alternativ tilnærming, Kassis et al. Etablert en dual-channel (høyhastighets video lyse-feltet og fluorescens) in situ imaging system som muliggjør kvantitative sammenligninger mellom fartøy sammentrekning, lymfe flyt og fluorescerende lipidkonsentrasjoner i mesenteriske lymfekar 33. En fordel med denne modellen over den nevnte in vitro-systemer er at den gjør det mulig nøyaktig sporing av passasjen av immunceller gjennom lymfesystemet. Absolutte målinger av masse lipid (eller narkotika) transport er imidlertid ennå ikke etablert ved hjelp av avbildningsmetoder. In vitro og i silico tilnærminger til spesifikt forutsi omfanget av lipofilt stoffet transport via tarm lymfekar har også blitt publisert 40-42. For eksempel, ex vivo affinitet av flere compounds for plasma kylomikroner ble funnet å korrelere rimelig bra med sin lymfatisk transport in vivo 41. Deretter den samme gruppen etablert en in silico modell for å forutsi narkotika affinitet for kylomikroner basert på flere fysisk-kjemiske egenskaper 40. Holm et al. Også etablert en forholdsvis komplisert i silico-modell for å forutsi direkte lymfatisk transport av lipofile forbindelser på basis av molekylære deskriptorer 42. Disse modellene kan gi en nyttig fremgangsmåte for å forutsi omfanget av lymfatisk transport av ukjente stoffer. Validering av modellene med et bredt utvalg av legemidler og på tvers av ulike laboratorier vil imidlertid være nødvendig for å bekrefte deres nøyaktighet og reproduserbarhet.

Kanylering av mesenteriske lymfeknutekanalen forblir således det eneste middel for direkte å undersøke innholdet av lymfe drenere tynntarmen og transitthastighet av komplekset rekke faktorer (celler, proteiner,peptider, lipider, narkotika) i lymfe i en in vivo situasjon. Heri vi beskriver en protokoll for kanylering av mesenteriske lymfeknutekanalen og arteria carotis som muliggjør innsamling av mesenteriske lymfeknuter og systemisk blod fra bedøvede rotter. Representative data viser hvordan modellen kan brukes til å undersøke lipid og medikamenttransport fra tarmen via den mesenteriske lymfesystemet. Dette etterfølges av en diskusjon av problemer som kan oppstå i å etablere modellen og en feilsøkingsveiledning. Når etablert modellen er et kraftig verktøy for å undersøke tarm lymfatisk transport.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Studiene som er beskrevet i dette manuskriptet ble godkjent av den lokale dyreetisk komité og ble gjennomført i samsvar med den australske og New Zealand råd for stell av dyr i forskning og undervisning retningslinjer. Før du begynner på et dyr prosedyre, påse at nødvendig tillatelse er innhentet gjennom lokal institusjon / organisasjon. Som med alle dyre operasjoner, sikre at operasjonen er utført av kvalifisert operatører, under aseptiske forhold, og at anestesi, smertestillende og antibiotika administreres når det er nødvendig for å sikre en etisk og vellykket resultat.

1. Forberedelser dagen før det kirurgiske inngrepet

  1. Spole rotte natten før operasjonen om nødvendig. Sikre rotta har fri tilgang til vann.
  2. Klargjør oppløsninger som skal administreres til rotter.
    1. Forberede en rehydrering løsning som sterilt saltvann eller Ringers løsning.
    2. Utarbeide enestetiske løsninger etter behov. Bedøvelsen anvendt i eksperimentene som beskrives her besto av "Cocktail 1" fremstilt ved å kombinere 1,9 ml av ketamin 100 mg / ml, 0,5 ml xylazin 100 mg / ml, 0,2 ml acepromazin 10 mg / ml og 2,5 ml av salt- og " cocktail 2 "består av en ml av ketamin 100 mg / ml og 0,1 ml acepromazin 10 mg / ml. MERK: Inhalert isofluran eller sevoflurane kan være foretrukket som den kan tilveiebringe en kirurgisk anestesi planet for en lengre tidsperiode.
    3. Eventuelt fremstille en formulering inneholdende stoffet i, for eksempel, en lipidemulsjon. Utføre studier passende stabilitet for å sikre stabiliteten i formuleringen over perioden for lagring og administrasjon.
      NB: Den nøyaktige natur av formuleringen og medikamentet som skal administreres, vil variere med hver studie som målet for lymfatiske medikament transportstudier er oftest for å vurdere effektiviteten av lymfatiske medikamenttransport som en funksjon av formuleringen og medikament Administered.
      1. Formuleringen benyttet i de representative eksperimenter i figur 4 og 5 her fremstilles, som tidligere beskrevet 43. I korthet innlemme 14 C oleinsyre (2-5 uCi) og halofantrin (200 ug) i 40 mg oljesyre før dispergering i 5,6 ml av en vandig fase bestående av 5 mM natriumtaurocholat i fosfatbufret saltvann (pH 6,9).
      2. For preparater inneholdende 2-monoolein, tilsett 7,1 mg 2-monoolein sammen med andre komponenter, til den vandige fasen samtidig som oljesyre fase inneholdende halofantrin. Fremstille preparater som inneholder to-monoolein umiddelbart før administrering til rotter som 2-monoolein er relativt ustabil og isomerises til 1-monoolein.
      3. Deretter emulgere formuleringene ved ultralydbehandling i 2 minutter ved RT.
        MERK: Som har blitt beskrevet tidligere 43, overvåke stabiliteten i formuleringene av i) visuell inspeksjon av emulsjon under polarisert lys for å sikre at emulsjonen ikke blir faseseparert, ii) partikkelstørrelsesanalyse umiddelbart etter fremstilling og etter dosering ved hjelp av dynamisk lysspredning for å gi en indikasjon på eventuelle faseforandringer og / eller separering, og iii) analyse av halofantrin-konsentrasjoner ved hjelp en validert HPLC-analyse.
  3. Forbered antikoagulerende oppløsning inneholdende 10 mg / ml EDTA i sterilt vann eller 10 IU / ml heparin i saltoppløsning for å skylle lymfe kanyle. Også forberede antikoagulerende løsning som inneholder 2,5 til 10 IE / ml heparin i saltvann for å skylle carotisar kanyle.
  4. Fremstille polyetylen kanyler for innføring i den mesenteriske lymfeknutekanalen (0,8 mm utvendig diameter, 0,5 mm ID), arteria carotis (0,96 mm ytre diameter, 0,58 mm ID, eller 0,8 mm ytre diameter, 0,5 mm ID) og tolvfingertarmen (0,96 mm ytre diameter, 0,58 mm ID )
    1. Skjær kanyler til ønsket lengde (vanligvis 25-30 cm for halspulsåren og duodenal kanyle og 10-15 cm for lymfe CannUla) og plassere en skråkant på tuppen av kanyler ved hjelp av en steril kirurgisk blad (se figur 1).
      MERK: Dette øker enkel kanyle innsetting og reduserer forekomsten av kanylen blokkering etter innsetting.
    2. Plasser en J form forankringspunkt i den intraduodenale kanylen ved å feste en liten del av kanylen tilbake på seg selv, og oppvarmet med en lysere eller varm plate og deretter å skjære til størrelse (se figur 1).
  5. Fest lymfe kanyle til en 25 G nål og sprøyte som inneholder en antikoagulerende (fremstilt i trinn 1.3). Fyll lymfe kanyle med anti-koagulant løsningen og la løsningen i kanylen O / N for å redusere forekomsten av koageldannelse i lymfe kanyle i løpet av lymfe-samling.
  6. Forberede rør for lymfe og blod prøvetaking. Pre-veie lymfe samling rør, label rør for lymfe og blod prøvetaking og legge antikoagulerende løsning. Tilsett tilstrekkelig anti-koagulant solution for å oppnå en sluttkonsentrasjon på 1 mg / ml EDTA i sterilt vann, eller 10 - 20 IU / ml heparin i det oppsamlede lymfe eller blod.

2. Forberedelser Umiddelbart før du starter den kirurgiske prosedyren

  1. Sjekk alle kanyler ved å spyle med sterilt saltvann eller antikoagulerende løsning for å sikre at de er i patentet.
  2. Klargjør rotte for den kirurgiske prosedyren.
    MERK: mesenteriske lymfe kanalen er mer synlig i rotter som har spist eller blitt administrert en dose av olje som mesenteriske lymfe blir melke og ugjennomsiktig med høyere lipid lasting. Noen operatører, spesielt de nye til kirurgi, derfor synes det er lettere å cannulate mesenteriske lymfe kanalen når rottene er pre-dosert med en olje (rundt 0,1 til 1 ml), for eksempel olivenolje eller soyaolje 0,5 til 2 timer før du begynner kirurgi . Imidlertid påvirker pre-dosering olje lymfatiske transport av lipider, lipofile legemidler og andre faktorer i lymfe slik at det ikke kan være ideelt å pre-dose oljeavhengig av målet for forsøket.
    1. Bedøve rotte hele kirurgi og prøvetaking periode.
      1. For eksempel initiere anestesi ved subkutan injeksjon av 1,5 ml / kg av Cocktail I (fra trinn 1.2.2) inn i en fold huden på baksiden av halsen rotter ved anvendelse av en 1 ml sprøyte festet til en 25 G nål. Opprettholde anestesi via intraperitoneal injeksjon av 0,44 ml / kg Cocktail 2 (fra trinn 1.2.2) omtrent hver time etter behov, ved anvendelse av en 1 ml sprøyte festet til en 25 G nål.
      2. Før igangsetting av operasjonen sikre at anestesidybden er tilstrekkelig ved å observere respirasjonsfrekvens, whisker-bevegelse, muskeltonus og respons på stimuli slik som klemming av fot. Administrer anestesi ved behov.
    2. Barbere pelsen fra den kirurgiske områder, som inkluderer den høyre side av abdomen for lymfen og duodenum kanylering, og halsen og venstre krage region for arteria carotis kanylesjon.
    3. Rengjør de kirurgiske områder aseptisk ved hjelp povidine-jod-løsning eller klorhexidin-løsning og en 70% etanol kratt. Gjenta dette 3 ganger for hver region, etterbehandling med en endelig rensing med 70% etanol.
  3. Plasserer dyret i dorsal recumbence på en ren arket over en oppvarmet kirurgisk pute (37 ° C).

3. Kanylering av mesenteriske Lymfe Duct

  1. Plasser dyret med sin høyre side som vender mot operatøren. Utføre kirurgi med eller uten hjelp av et kirurgisk mikroskop etter behov.
  2. Åpne topplaget av bukmuskelveggen med en rett 4 cm innsnitt som strekker seg fra midtlinjen (xyphoid fremgangsmåte) til den høyre flanke ca. 2 cm under brystkasse (kyst margin) ved hjelp av en steril skalpell blad (se figur 2B).
  3. Åpne de gjenværende lag av den bukmuskelveggen 4-5 mm lateralt i forhold til midtlinjen til høyre flanke med en liten parav kirurgiske sakser (se figur 2B).
  4. Trekke tynntarmen under venstre bukmuskelveggen og holde den på plass med 2-3 stykker av sterilt gasbind mettet med vanlig saltvann.
  5. Bro over rotte i løpet av en 10 ml plastikksprøyte plassert horisontalt under rotte tilbake på nivået av høyre nyre for å lette visualiseringen av den mesenteriske lymfeknutekanalen.
  6. Finne mesenteriske lymfeknute kanal: en beholder omtrent 0,5 til 1 mm i diameter som er vinkelrett på den høyre nyre og umiddelbart rostralt og parallelt med den mesenteriske arterien (en pulserende mørk rød blodkaret, se figur 2C).
    NB: I ikke-fastende eller olje pre-dosert rotter fartøyet er hvit, opak og lettere å visualisere enn hos fastende rotter hvor det er helt gjennomsiktig.
  7. Inspisere området umiddelbart caudal til den store mesenteriske lymfe kanalen og mesenteriske arterien for å avgjøre om en annen, mindre tilbehør lymfe kanal ertilstede. Hvis til stede, blokkere strømmen av lymfe gjennom kanalen ved å adskille kanalen og okkludering med superlim, eller binde en sutur rundt kanalen, for å sikre at hele volumet av lymfe som strømmer fra tarmen samles opp fra mesenteriske lymfeknutekanal.
  8. Passerer et par rette tang gjennom peri-nyre fett sengen ved den nedre kant av den høyre nyren, og gjennom bindevev lagene umiddelbart under vena cava, i en retning parallelt med den store mesenteriske lymfeknutekanal.
  9. Ved hjelp av spissen av tang griper lymfe kanyle og trekker den gjennom peri-renal fett seng med en ende i umiddelbar nærhet av den mesenteriske lymfeknutekanalen og den andre exteriorised fra dyret i høyde med den høyre nyre.
  10. Isolere mesenteriske lymfe kanalen fra overliggende lag av bindevev og fettvev ved stump disseksjon. Pass på å ikke punkteres eller skade lymfe kanalen.
  11. Etter å ha isolert lymfe duct, lage en liten hole i lymfen kanal med enten mikro saks, den skarpe tuppen av gullsmed pinsett eller en 25 G nål. Pass på å ikke helt kutte fartøyet.
  12. Kontroller at lymfe kanylen er helt fylt med antikoagulerende løsning (ved hjelp av en sprøyte og 25 G nål) uten luftspalter. Sett lymfe kanyle omtrent 2 - 4 mm innenfor den mesenteriske lymfeknutekanalen via det lille hullet ved hjelp av en liten pinsett.
  13. Observere lymfe kanyle i et par minutter. Observere en gradvis strøm av intestinal lymfe fra gratis innsamling enden av kanylen hvis kanylering er vellykket. Hvis kanylering er ikke vellykket, gjenta trinn 03.08 til 03.12.
  14. Hvis kanylering er vellykket, feste kanylen ved å plassere en liten dråpe av veterinærklebemiddel over inngangshullet i lymfen kanalen. Pass på å ikke okkludere karet via anvendelsen av overflødig veterinær lim.
  15. Mens du venter på veterinær limet å stille, observe strømmen av lymfe i flere minutter for å sikre at kanylering prosedyren var vellykket. Når enkelte av suksessen til kanylering, fjerne gasbind stykker som ble plassert i bukhulen forsiktig og plasser tynntarmen i sin opprinnelige posisjon.
  16. Plasser en lymfe samling rør inneholdende anti-koagulant (se trinn 1.6) i enden av kanylen for å samle opp frittflytende lymfe.
  17. Deretter cannulate tolvfingertarmen for infusjon av rehydrering løsninger og / eller formuleringer.

4. kanylering av tolvfingertarmen

  1. Fest duodenum kanyle til en sprøyte (f.eks, 10 ml) fylt med rehydrering løsning.
  2. Identifiser duodenum som lys rosa (med flere blodkar) delen av tynntarmen, som ved mild nedad trekke avslører magen.
  3. Lag en liten punktering hull i tolvfingertarmen ca 2 cm nedenfor krysset mellom magesekken og tolvfingertarmen (pylorus) ved hjelpen steril 23 G nål.
  4. Sett J formet hektet enden av duodenal kanylen gjennom punktering hull. Fest på plass med en dråpe cyanoakrylatlim.
  5. Starte hydrering av rotte ved å feste kanylen til rehydrering sprøyte lagt i en infusjonspumpe. Ifølge litteraturen rehydrering, varierer 0,5 til 3 ml / time 15,25.
  6. Etter fullførelse av lymfe og duodenum kanylering, lukke innsnitt i bukmuskelveggen med suturer. Deretter lukker hudens innsnitt ved anvendelse av noen få dråper av vevlim (cyanoakrylat) langs siden av innsnittet og å klemme huden på begge sider av snittet sammen.

5. Kanylering av arteria carotis

Karotidarterien kanylering kan utføres før eller etter kanylering av mesenteriske lymfeknutekanalen. Noen operatører foretrekker å cannulate karotidarterien før kanylerør lymfe kanalen for derved å redusere potentially dislodging lymfe kanyle ved flytting av dyr.

  1. Plasser et merke på halspulsåren kanyle 2,5 cm fra den koniske spissen for å identifisere den delen av slangen for å sette inn i arterien. Den andre enden av kanylen (dvs. uten fasett) til en 23 eller 25 G nål festet til en sprøyte fylt med anti-koagulant løsning og fylle kanylen med antikoagulerende løsning gjør at ingen luftspalter er til stede.
  2. For å lette kanylering, plasser bedøvet rotte i ryggleie med halsen strukket og hodet pekende mot brukeren. Legg merke til at enkelte operatører foretrekker å utføre denne teknikken med rotte hale peker mot brukeren.
  3. Plassere en 1 - 1,5 cm langsgående snitt gjennom hudlaget over venstre av luftrøret i det sagittale plan.
  4. Dissekere det subkutane bindevev med butte spissen tang for å avsløre de underliggende sammenkoblede nakkemusklene.
  5. Trekk inn nakkemusklene to avsløre venstre halspulsåren (plassert ~ 1 cm under hudoverflaten og pulserende). Rengjør liggende bindevev fra arterien ved stump disseksjon.
  6. Isolere en ~ 1 cm delen av arterien nøye med butte vev tang, tar seg ikke å skade den tilstøtende vagal nerve spor. Utfør dette ved å åpne og lukke butt spiss tang vertikalt langs begge sider av arterien for å frigjøre den fra omkringliggende vev og nervus vagus.
  7. Ved hjelp av fin spiss tang, træ to silkesuturer under halspulsåren og plassere dem på hver ende av den isolerte arterie delen. Feste sutur nærmest operatør og lengst fra rotte hjerte og krageben (figur 3A).
  8. Tilstoppe blodstrøm gjennom arterien ved å plassere et par rette fin spiss pinsett under arterien (figur 3B).
  9. Ved hjelp av den fine spiss iris saks, plasserer et lite snitt i den øvre overflate av arterien (ca 1/3 avvei nedover fra toppen av det isolerte området). Skyll eventuelt sølt blod på overflaten av arterien med heparinisert saltvann og tørk forsiktig ved bruk av bomull tips.
  10. Sett tuppen av kanylen inn i arterien med et par av buede tippe tang. Når den er satt, fjerne de rette fin spiss tang, pumpeblodstrømmen og gå videre kanylen 2,5 cm inn i arterien ved hjelp av to par tenger, ett for å holde kanylen på innsiden av arterien for å stoppe blod fra å lekke tilbake, og den andre for å sette inn en kanyle.
  11. Bruk en liten arterie klemme til å holde kanylen inne i arterien og fjerne de rette fin spiss tang som ble plassert under arterien i trinn 5,8 til okkludere blodstrømmen.
  12. Bekrefte patens av kanylen ved å injisere antikoagulerende oppløsning inn i kanylen og trekke tilbake en liten mengde av blod (figur 3C). Deretter skylle kanylen med antikoagulerende løsning og forsegle slutten hjelp flammen av en lighter eller en kanyle plugg.
  13. Knytte the kanyle på plass med de to sting plassert under arterien i trinn 5.8.
  14. Fjern arterien klemme og sikre en tredje sutur rundt arterien og kanyle. Lukke halsen sår med sting.

6. Post-kirurgisk Periode og Formulering Infusion

  1. Fortsette å opprettholde rotte under narkose og på den oppvarmede pad.
  2. Rehydrere rotte via infusjon av rehydrering løsning i tolvfingertarmen i minst 0,5 timer etter ferdigstillelse av cannulations. Observere lymfe flow rate reduksjon (~ 0,1 - 0,5 ml / time) under den første perioden etter kanylering og snart øke til en jevn baseline (0,4 til 2,5 ml / time avhengig av rehydrering rate).
  3. Etter utvinning perioden, sette mot utformingen av interesse (som inneholder lipider, narkotika, etc.) inn i tolvfingertarmen via kanylen. Eventuelt kan bruke en infusjonspumpe for å regulere strømningshastigheten for formulering. MERK: I protokollen som er beskrevet her dyrene forbli anaesthetised hele kirurgi og lymfe innsamlingsperioden og blir avlivet under narkose slik at ytterligere smertelindring ikke nødvendig. Hvis protokollen er endret og dyr er i stand til å gjenvinne bevissthet da passende analgesi og postoperativ behandling vil være nødvendig.
  4. Ved fullføring av formuleringen infusjon fortsette å rehydrere rotte ved hastighet på 1,5 til 3 ml / time med normal saltløsning inn i tolvfingertarmen for å forhindre dehydrering.
  5. Fortsette å holde rotta på 37 ˚C oppvarmet kirurgisk pad for å opprettholde temperaturen (som per trinn 2.3), hurtig urin fra blæren via skånsom nedover trykk på nedre del av magen etter behov og på nytt oftalmisk salve hver time (som per trinn 2.2. 3). Regelmessige kroppen posisjon endringer anbefales hvis dyret er å gjenvinne bevissthet etter inngrepet.

7. Innsamling av lymfe og blodprøver for å vurdere Lipid and Drug Absorption

  1. Samle lymfe kontinuerlig innRørene inneholdende anti-koagulant. Endre strømpene på nødvendige tidsintervaller (for eksempel hver time).
  2. Samle blodprøver på settet tidspunkter.
    1. Tilstoppe blodstrømmen gjennom kanylen ved å bøye kanylen tilbake omtrent 2 cm fra den forseglede ende. Unseal kanylen ved å kutte av den forseglede ende eller fjerne kanylen pluggen.
    2. Ved hjelp av en tom sprøyte trekkes heparinisert saltvann fra kanylen til blod fyller hele kanyle.
    3. Ved hjelp av en ny tom sprøyte trekkes ønsket volum av blod og sted i et rør som inneholder anti-koagulant.
    4. Ved hjelp av den første sprøyten, erstatte blod tatt før prøvetaking for å redusere unødvendig blodtap. Før injeksjon flick sprøyten mens du holder den stående for å sikre at ingen luftbobler inn kanylen.
    5. Ved hjelp av en sprøyte, erstatte volumet av blod som er fjernet fra rat med anti-koagulant løsning. Sørg for at ingen gjenværende blod er synlig i kanylen som eventuelt gjenværende kan koagulereog blokkere kanylen.
    6. Bend kanylen omtrent 2 cm fra det uforseglede ende til å blokkere blodstrømmen og fjerne sprøyten. Ved hjelp av flammen av en lighter eller en kanyle plugg, forsegle kanylen.
  3. Ved fullførelsen av blod og lymfe samling fra rotte, avlive rotte via intraperitoneal administrering på> 100 mg / kg natriumpentobarbiton.
  4. Bestem lymfe strømningsrate ved å måle massen av lymfe samles i løpet av hver tidsperiode.
  5. Måle konsentrasjonen av medikament og lipid i blod og lymfe ved hjelp av, for eksempel HPLC, HPLC-MS eller ved hjelp av kommersielle sett, for å vurdere lipid og medikament absorpsjonen effektivitet.
  6. Beregne massetransport av medikament og lipider i lymfe fra produktet av de målte konsentrasjoner og volumet av lymfe oppsamlet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Resultatene fra et representativt eksperiment for å kvantifisere den kumulative omfang og hastighet av lipid og medikamenttransport via lymfesystemet følgende intestinal-avgivelses hjelp av mesenteriske lymfeknute kanylering modellen er vist i figur 4 og figur 5. I dette forsøket ble 200 ug av modellen lipofile medikament halofantrin ble administrert inn i duodenum til rotter i løpet av 2 timer i en formulering inneholdende 40 mg oljesyre (blant annet 2-5 uCi 14 C-oljesyre) og 7,1 mg 2-monoolein dispergert i 5,6 ml av 5 mM natriumtaurocholat i fosfatbufret saltvann pH 6,9. Etter formulering administrering ble rottene rehydrert med en hastighet på 2,8 ml / hr med normalt saltvann infusert inn i tolvfingertarmen. Lymfeknuter ble oppsamlet kontinuerlig i rør endret hver time i 10 timer. Formuleringen ble fremstilt, og forsøket utført i henhold til en protokoll som er beskrevet tidligere for en formulering inneholdende de samme kompentene unntatt det ikke inkluderte to-monoolein 43.

Som vist i figur 4, i disse eksperimentelle betingelser midlere lymfe strømningshastighet for vellykket kannulerte rotter var mellom 0,4 til 1,3 ml / time. I noen rotter lymfe strømningshastigheten var noe lavere i første 1 - 3 hr følgende kanylering og deretter økt. Dette er vanligvis sett etter lymfe kanylering. Også vist i figur 4 er den lymfe strømningshastighet for et mislykket forsøk. I dette tilfelle er strømningshastigheten forble vesentlig lavere enn det som ble sett i de vellykkede forsøk i løpet av innsamlingsperioden. Likeledes, den kumulative lymfatisk transport av triglycerid og halofantrin var vesentlig lavere i den mislykkede forsøk (figur 5A og B). Var gjennomsnittlig kumulativ halofantrin transport i den vellykkede gruppen var 15,1% av dosen, den kumulative triglyserid transport var 61 mg over 10 timer og andelen av administrert radiolabelled eksogene lipid dose transporteres i lymfe var 54% (figur 5C). Disse verdier er ikke signifikant forskjellig fra det som tidligere er sett for et lignende preparat som inneholdt de samme komponenter bortsett fra fraværet av 2-monoolein 43 (tabell 1). Dette tyder på at formuleringer inneholdende fettsyrer i fravær av en kilde til monoglyserid kan støtte lignende lipid og medikamenttransport i lymfen til dem som ikke inneholder monoglycerid. Dette resultat er nærmere beskrevet i diskusjonen delen.

Figur 5D viser representative data for frekvensen av halofantrin og triglyserid transport i lymfe over tid etter administrering. Transporthastighet på både triglyserid og narkotika inn i lymfe topper et par timer etter lipid and Drug Administration og deretter tilbake til utgangsnivåer. Som er vanlig i tarm lymfatiske lipid og narkotika transport eksperimenter, frekvensen av narkotika trant i lymfe under hver tidsperiode speil som sett for triglyserid transport som stoffet transporteres inn lymfe i tilknytning til triglyserid lipoproteiner.

Figur 1
Figur 1 viser skjematisk formen på den skrå spissen av en halspulsåre eller lymfe kanyle, og den J-formede skrå spissen av en duodenal kanyle.

Figur 2
Figur 2. Fotografier av (A) magen barbert i forberedelse for å cannulate lymfe kanalen, (B) den bukmuskelveggen åpnet med en rett 4 cm innsnitt som strekker seg fra midtlinjen til høyre flanken til å få tilgang til lymfe kanal, og (C ) den overlegne mesenteriske lymfe kanal (i gul sirkel) vinkelrett på høyre nyre. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. Fotografier av (A) til halsarterien isoleres med to silkesuturer med den nærmest operatøren bundet av, (b) den karotidarterie isoleres og blodstrøm okkludert med et par rette fin spiss tang plassert under arterien, og (C) et halspulsåren med kanylen på plass og åpenheten blir sjekket ved å trekke tilbake en liten mengde blod. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4 "src =" / files / ftp_upload / 52389 / 52389fig4highres.jpg "/>
Figur 4. Representative data for mesenteriske lymfeknutestrømningshastighet (pl / t) over tid. Rotter ble administrert en formulering inneholdende 200 ug halofantrin, 40 mg oleinsyre (med 2 uCi 14 C-oljesyre) og 7,1 mg 2-monoolein i 5.6 ml 5 mM natriumtaurocholat i fosfatbufret saltvann (pH 6.9) 0-2 timer. Data som vises er gjennomsnitt ± SEM for n = 3 vellykkede eksperimenter (lukkede sirkler, ●) og n = 1 mislykket utfall (åpne trekanter, Δ).

Figur 5
Figur 5. Representative data for lipid og medikamenttransport inn i mesenteriske lymfeknuter. Kumulativ transport av (A) av modellen medikament halofantrin (Hf,% dose), (B) triglyserid (TG, mg) og (C) eksogen fettsyre (% dose), og hastigheten for transport av (D) TG (mg / time) og Hf (% dose / time) inn i mesenteriske lymfeknuter over tid etter administrering av en formulering inneholdende 200 ug halofantrin, 40 mg oleinsyre (med 2 uCi 14 C-oljesyre) og 7,1 mg 2-monoolein i 5,6 ml 5 mM natriumtaurocholat i fosfatbufret saltvann (pH 6.9) 0-2 timer. Data som vises er gjennomsnitt ± SEM for n = 4 vellykkede eksperimenter (lukkede sirkler, ●) og n = 1 mislykket utfall (åpne trekanter, Δ). Eksogent fettsyre transport ble ikke målt i den mislykkede forsøk, men er vanligvis lav på mislykkede forsøk. Data for det mislykkede forsøket er utelatt fra Panel D for klarhet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Uten monoolein Med 2-monolein
Mener SEM Mener SEM
Halofantrin (% dose) 15.1 0.8 15 1.6
Triglyserid (mg) 67 4 61 6
Total fettsyre (umol) 261 16 248 23
Eksogen oljesyre (mikromol) 82 5 65 6
Endogen fettsyre (umol) 180 17 183 28

Tabell 1. Sammenligning av kumulative lymfatiske transportdata over 10 timer etter administrering av 200 mikrogram halofantrin å mesenteriske lymfe kanal kannulerte rotter i formuleringer som inneholder 40 mg oljesyre (som ing 1 uCi 14 C-oljesyre) emulgert i 5 mM natriumtaurocholat i fosfatbufret saltvann (pH 6,9), med og uten 7,1 mg 2-monoolein. Data representerer middelverdi ± SEM for n = 4 rotter. Ingen statistisk signifikante forskjeller er sett mellom de to gruppene.

a I gruppen dosert med 2-monoolein dette er ikke et nøyaktig mål på endogen fettsyre transport som oljesyre festet til to-monoolein ryggraden ikke er redegjort for i den målte eksogene oljesyre transport inn lymfe.

b Dataene for halofantrin og total fettsyre transport i gruppen dosert uten to-monoolein er tidligere publisert i figur 5 referanse 43 og er gjengitt her i tabellformat.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Rotte mesenteriske lymfeknute kanylering modellen muliggjør direkte kvantifisering av konsentrasjonen og hastigheten for transport av forskjellige celler og molekyler (for eksempel lipider og medikamenter) fra tarmen inn i lymfesystemet og endringer i disse som forekommer som respons på utfordring av forskjellige stoffer (diett , antigen, medikamenter, blandinger, etc.) 10,27 og sykdommer (kreft, virus, kolitt, insulinresistens, etc.) 5-7. Komponentene som er samlet i lymfen kan også bli ytterligere anvendt i ytterligere forsøk. For eksempel kan cellene dyrkes 44, lipoproteiner fraksjonert og lymfe eller dets komponenter så som lipoproteiner eller celler, lastet med markører inkludert medikamenter, radiomerkinger og fluorescerende prober. Disse kan da bli re-infused inn mottaker dyr til mer direkte vurdere sin funksjon, metabolisme, fortolling og / eller vev disposisjons mønstre 45-47. Rotte lymfe kanylering modellen har flere fordeler fremfor den other in vitro, in situ, i silico, og in vivo-modellene som ble beskrevet i innledningen. Viktigst er kanylering den eneste metoden som muliggjør direkte tilgang til hele volumet av komponentene i lymfevæsken. Når arbeidet er utført i hendene på en erfaren operatør modellen er robuste, reproduserbare og eksperimentelle suksessrater på> 80% kan oppnås. Imidlertid kan den kirurgiske teknikken være vanskelig å mestre innledningsvis, spesielt i et laboratorium som ikke er kjent med teknikken.

Flere trinn er avgjørende for å lykkes med mesenteriske lymfe kanylering modell. Den første er riktig valg av kirurgiske instrumenter og kanyle type og forberedelse. Vår lab bruker PE kanyler med dimensjoner OD 0.8 x ID 0,5 mm. Imidlertid har andre laboratorier opplevd suksess med PVC kanyler av samme dimensjon 15. Avfasing tuppen av kanylen og forhånds å legge den i en anti-koagulant også bidrar til å hindreokklusjon av, og dannelse av blodpropp innenfor, kanylen etter innsetting (trinn 3.13). Det første trinnet av den kirurgiske prosedyren at enkelte operatører finner spesielt kritisk er å ta vare å rengjøre lag av bindevev og fettvev over lymfe duct (trinn 3.10). Dette bidrar til å unngå innføring av kanylen mellom vevet og lymfe kanalen i stedet for inn i lymfe kanalen. Imidlertid er dette rengjøringstrinnet vanskelig som lymfe kanalen er skjøre og lett å skade. For noen, blir dette trinnet, og innføring av kanylen mest vellykket gjennomført ved hjelp av et kirurgisk mikroskop selv om andre finner et mikroskop er ikke nødvendig. Ved innsetting av en kanyle inn i kanalen retningen og dybden av innføringen i forhold til den skrå spissen krever noen behandling for å hindre at kanylen blir tilstoppet av beholderveggen (trinn 3.12). Hver operatør har en tendens til å finne sin egen individuelle preferanser. Det er også viktig å unngå luftbobledannelse inne i ca.nnula under innsetting som luftspalter gjelder mottrykk til den frie flyten av lymfe (trinn 3.12). Endelig bør anvendelsen av veterinærklebemiddel for å feste kanylen på plass være under punktet for innsetting i kanalen som limet plasseres direkte på toppen av kanalen kan føre til at fartøyet til å kollapse og tilstoppe kanylen spissen (trinn 3.14).

Den enkleste innledende guide med hensyn til om en operasjon er vellykket er strømningshastigheten av lymfe. Når kanylen er på plass lymfe generelt begynner å strømme langsomt i de første 30 min, og deretter øker. Typisk er strømningshastighetene for vellykket cannulations på rotter> 250 g er> 0,1 ml / time i den første time og deretter øke til> 0,4 ml / time ved stabil tilstand som er vist i figur 4. Selv om det selvfølgelig dette kan variere avhengig . eksperimentell betingelse gjelder feilsøking, er lav hvis ingen lymfe strømmer gjennom kanylen eller strømningshastigheten dette kan være fordi:

    kanylen ble ikke satt riktig inn i kanalen
  1. kanylen er i kanalen, men okkludert ved siden av beholderveggen
  2. kanylen er i kanalen, men okkludert av klebemiddel påført i feil stilling
  3. kanylen er i kanalen, og en luftboble i kanylen avtar strømmen
  4. en blodpropp er dannet inne i kanylen

Nøye inspeksjon avslører vanligvis den underliggende faktor. Hvis operatøren mener kanylen ble ikke plassert riktig i første omgang (dvs. lymfe ble aldri flyter) så re-innsetting er nødvendig. Dersom kanylen synes å være på riktig sted og deretter den første faktor for å sjekke er om en luftboble eller blodpropp er tilstede. Luftbobler vil vanligvis passere gjennom kanylen som lymfe strømmer og midlertidig langsom flyt. Det er noen ganger mulig å fjerne luftbobler eller blodpropper ved å trekke tilbake på kanylen ved å bruke en 25 G nål festet til, for eksempel, en 1 ml sprøyte. Hvis det ikke er luftboble eller blodpropp det kan være nyttig å prøve re-posisjonering rotte og / eller slå eller trekke kanylen litt. Dette kan noen ganger omstille kanylen, slik at det ikke er blokkert mot karveggen. Av og til å fjerne klebemidlet med eller uten liten bevegelse av kanylen muliggjør lymfe å flyte igjen også. Men hvis alt annet svikter kanylen må gjeninnsettes. I vår erfaring eksperimenter er mindre vellykket når kanylen ikke ble satt riktig på første forsøk. Imidlertid er kirurgisk rednings mulig. En annen komplikasjon som kan oppstå er vanskeligheter med kanylering grunn av anatomiske avvik mellom rotter. For eksempel, noen ganger passerer den mesenteriske lymfeknutekanalen i en vanskelig retning, eller det er et tilbehør lymfe kanalen på den motsatte side av den mesenteriske arterie til større mesenteriske lymfeknutekanal. I forsøk som krever samling av hele volumet av lymfe som strømmer fra tynntarmen (som er tilfelletved vurdering av total lipid og medikamenttransport fra tarmen via lymfesystemet), må tilbehøret lymfe kanal som skal okkluderes, slik at all lymfe er rettet mot den overlegne lymfe kanalen. Dette er vanskelig å oppnå, men kan forsøkes ved å binde en sutur rundt tilbehøret kanal eller avskjæringen av tilbehøret kanalen og som tetter igjen den med veterinærklebemiddel (trinn 3.6). Tilstedeværelsen av et tilbehør lymfe kanalen er en av de viktigste faktorene som resulterer i eksperimentell feil i lymfatiske medikament transport eksperimenter. Dersom tilbehøret fartøyet ikke er fullstendig okkludert, lymfestrømmen og lipid og medikamenttransport er betydelig lavere enn forventet.

I den protokoll som presenteres her dyret forblir bedøvet hele lymfe oppsamlingsperiode. Bedøvet rotte-modell (i motsetning til bevisste modeller beskrevet nedenfor) øker eksperimentell gjennomstrømning som kirurgi og eksperiment kan utføres i løpet av en heller enn flere dager og den kirurgiske suksess rspiste er større da det er lettere å opprettholde åpenhet i kanylen immobiliserte dyr. Anestesi kan teoretisk redusere magetømming, intestinal lipid behandling og lymfe flyt og transport. I vår erfaring, men lymfatisk lipid og narkotika transport er like i bedøvede rotter som ble gitt stoffet direkte inn i tolvfingertarmen (til bypass magen tømming) innenfor pre-fordøyd og pre-spredt kjøretøyer (f.eks, fettsyrer og monoglyserid micellepartikler systemer spredt med tensider ) i forhold til bevisste rotter som administreres medikamentet via oral tvangsforing i magen i en tilsvarende triglycerid 21,23,27. Faktisk har de fleste av tarm lymfatiske narkotika transport eksperimenter i vårt laboratorium i de siste 10 årene vært gjennomført i bedøvet modell på grunn av høyere gjennomstrømning som kan oppnås. I disse forsøk har vi oftest administrert medikamenter i formuleringer inneholdende fettsyre (for eksempel oljesyre) og 43 overflateaktivt middel.Fettsyrene er syntetisert i triglyserider før inkorporering intestinal lymfe lipoproteiner, og dette krever at kilden av komponenter for å danne glycerol ryggraden i triglyserid (dvs. 2-monoglyserid eller glyserol-3-fosfat). Dette tyder på at inntak av fettsyrer i fravær av en glyserol kilde kan føre til redusert lymfatisk transport. Administrering av fettsyren, men muliggjør den direkte beregning av bidraget av det eksogene administrert fettsyre og endogene lipider til lymfesystemet lipid og medikamenttransport 43. I tillegg er 2-monoglycerid kostbare og generelt ustabile som det lett isomerises til 1-monoglycerid som spaltes til glycerol i tarmlumen. I de studier som er rapportert her vi videre vise at lymfatisk lipid og medikamenttransport er ekvivalent etter administrering av modellen medikament halofantrin med en fettsyre (for eksempel oljesyre) og overflateaktivt middel (gallesalt) formulering i enten presence eller fravær av glycerol kilden 2-monoolein (tabell 1). Endogene kilder av glycerol således å være tilstrekkelig til å understøtte tilsvarende lymfestrømmen og lipid og medikamenttransport etter administrering av denne modellen stoffet med fettsyrer (for eksempel oljesyre) i fravær av en glycerol-kilde. Dette gir tillit til at representative lymfatiske transportdata kan oppnås med enkle fettsyre formuleringer.

Bedøvet Modellen kan lett utvides til en bevisst modell når det er nødvendig. I de bevisste modeller formuleringer kan gavaged direkte inn i magen eller tilført i tolvfingertarmen eller intravenøst, kan direkte sammenligninger gjøres til farmakokinetiske studier utført i ikke-lymfe kannulert bevisste dyr og resultatene kan vurderes mer fysiologisk relevant. Jo lengre tidsperiode tillatt i bevisste dyr har også den fordelen at den samling av mer komplette farmakokinetiske profiler for drug konsentrasjoner i blodet, mens i bedøvede eksperimenter, blodprofiler er ofte ufullstendige, spesielt for lange halveringstid narkotika. Som beskrevet ovenfor, men suksessraten for bevisste lymfe kannulert studier er lavere og eksperimenter ta lengre tid å fullføre. Det finnes to typer av bevisste lymfe kanylering modellene som er beskrevet i litteraturen. I bevisste behersket modeller 15, etter lymfe kanylering kirurgi, blir dyret bare skrudd på dens fremre og plassert i en passende tilbakeholdenhet for resten av eksperimentet med lymfe kanyle eksternalisert og satt inn i en samling rør. Dyret blir så tillatt å gjenvinne bevisstheten og komme seg fra den kirurgiske prosedyren O / N. Suksessraten med denne modellen er veldig bra i hendene på erfarne operatører, men det kan være vanskelig å få etikk klaring for å holde dyr for lengre periode av tid som kreves for lymfe samling. En alternativ modell er der lymfe samlesfra bevisste og fritt bevegelige rotter. Denne modellen har blitt beskrevet tidligere 25. I denne modellen lange kanyler er satt inn i den mesenteriske lymfeknutekanalen, duodenum og arteria carotis. Kanylene blir deretter graver seg under huden, kom frem på baksiden av halsen, og som er lagt inn via et dreibart system. Rotten plasseres i en sele festet til svivelen og tillatt å gjenvinne bevisstheten og å gjenvinne fra den kirurgiske prosedyren O / N. Dyret har fri bevegelse innenfor en metabolsk bur og lymfe og blodprøver kan hentes fra kanyler utagerende utenfor buret.

Mesenteriske lymfe kanylering er fortsatt det eneste verktøyet som muliggjør direkte vurdering av lymfe komponenter i sin begynnende tilstand. Lymfe kanylering er oftest beskrevet i rotter som operasjonen er mindre kompleks enn mindre og store dyr, modellen rimeligere enn store dyr og resultatene vises rimelig sammenlignbare på tvers av arter 27. Rotte modusJeg kan bli endret i henhold til eksperimentell behov og suksessraten er høy i hendene på erfarne operatører. Modellen kan også bli kombinert med andre in vitro eller in vivo studier for å undersøke, i detalj, metabolismen eller funksjon av intestinal lymfe komponenter. Når etablert den mesenteriske lymfeknute kannulert rottemodell er således et kraftig verktøy for å evaluere konsentrasjonen, transport, funksjon og metabolisme av forskjellige parametere som passerer direkte fra tarm til lymfesystemet (og i mange tilfeller strømme til slutt til den systemiske sirkulasjon).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sterile saline Baxter healthcare AHB 1307 Any brand can be used. Example here is Baxter 100 ml saline bags, box of 50
70 % ethanol in water Any Any brand can be used
Chlorhexidine gluconate solution (Microshield 4) Livingstone International JJ60243L Any brand can be used. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search
=JJ60243L
Betadine solution Livingstone International BU0510 Any brand can be used. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search
=BU0510
Ilium Ketamil (Ketamine 100 mg/ml) PROVET VICTORIA  KETA I 1 http://www.provet.com.au/
Ilium Xylazil (Xylazine 100 mg/ml) PROVET VICTORIA  TRO-3828 http://www.provet.com.au/
ACP 10 Injection (Acepromazine 10 mg/ml) PROVET VICTORIA  VTG-DACP010020 http://www.provet.com.au/
Sodium pentobarbitone PROVET VICTORIA  24529 Any brand can be used. Example here is Lethabarb® 325 mg/ml sodium pentobarbitone, Virbac Animal Health. http://www.provet.com.au
Heparin (35000I.U. in 35 mL) Sigma Pharmaceuticals 337220 http://sigmaco.com.au/
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) disodium salt dihydrate Sigma-Aldrich E1644 Any brand can be used. Example here is disodium salt of EDTA from Sigma. 
Polyethylene (PE) cannula o.d. 0.96 mm x i.d. 0.58 mm Microtube extensions PE8050 Any brand can be used. Example here is PE tubing 0.96 x0.58 mm, 30 m
Polyethylene (PE) cannula o.d. 0.8 mm x i.d. 0.5 mm Microtube extensions PE9658 Any brand can be used. Example here is PE tubing 0.8 x0.5 mm, 30 m
Ruler Any Any brand can be used
Markers Any Any brand can be used
Cigarette lighter Any Any brand can be used
Veterinary adhesive Any Any brand can be used
23 gauge needles Livingstone International DN23GX0.75LV Any brand can be used. Example here is Livingstone Disposable Needle, Sterile, 23GX0.75inch, 100/BOX. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=
6&search=DN23GX0.75LV
25 gauge needles Livingstone International DN25GX1.0LV Any brand can be used. Example here is Livingstone Disposable Needle, Sterile, 25GX1.0inch, 100/BOX. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search=
DN25GX1.0LV
1 ml syringe Livingstone International T3SS01TA Any brand can be used. Example here is Terumo syringe 1 ml Slip Tuberculin 100/Box. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search
=T3SS01TA
10 ml syringe Livingstone International T3SS10SA Any brand can be used. Example here is Terumo syringe 10 ml Slip 100/Box. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search
=T3SS10SA
Gauze swabs Livingstone International GSC075 Any brand can be used and cut to required size. Example here is gauze swabs cotton filled 7.5x7.5 cm, 8 ply. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search
=GSC075
Cotton buds Livingstone International CTAST075DP Any brand can be used. Example here is Livingstone cotton applicator plastic double tipped. 75MM. 100/PK. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search
=CTAST075DP
Heating pad Ratek WT1 Any brand that keeps temperature at 37C can be used. Example here is Ratek warming tray.
Surgical light Harvard Apparatus 72-0215 with 72-0267 Any brand can be used. Example here is Harvard apparatus V-Lux 1000 Cold Light Source with Bifurcated Gooseneck Light Guide, Black, 4.7 mm fiber diameter (each arm). http://www.harvardapparatus.com/webapp/wcs/stores/servlet/product_11051_10001_50601_
-1_HAI_ProductDetail and  http://www.harvardapparatus.com/webapp/wcs/stores/servlet/product_11051_10001_35487_
-1_HAI_ProductDetail___
Surgical microscope Zeiss 495005-0014-000 Any brand can be used. Example here is Zeiss Stereomicroscope Stemi 2000-C with Stand S Double Spot and KL 300 LED. https://www.micro-shop.zeiss.com/?l=en&p=us&f=e&i=10143
Silk suture Livingstone International DTSK163019F4 Any brand can be used. Example here is  

3/8 Circle Reverse Cut Silk Suture 3/0 Thread 19mm. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search
=DTSK163019F4
Scalpel blades Fine Science Tools (FST) 10020-00 Any brand can be used. Example here is FST Scalpel Blade #20. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=191
Scalpel handle Fine Science Tools (FST) 10004-13 Any brand can be used. Example here is FST Scalpel Handle #4. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=298&CategoryId=51
1 x Small surgical scissors Fine Science Tools (FST) 14060-09 Any brand can be used. Example here is FST Fine Scissors, 9 cm with 21 mm cutting edge, sharp, straight. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=40&CategoryId=17
2 x Forceps with serrated curved tip Fine Science Tools (FST) 11001-13 Any brand can be used. Example here is FST 13 cm standard pattern forceps with curved 2.8x1.4 mm tip. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=405&CategoryId=32
1 x Iridectomy scissors Fine Science Tools (FST) 15000-08 Any brand can be used. Example here is FST Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge, Straight. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=17&CategoryId=16 
1 x Forceps with straight serated tip Fine Science Tools (FST) 11650-10 Any brand can be used. Example here is FST Graefe 10 cm straight with serrated 1 x 0.99 mm tip. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=390&CategoryId=32
1 x Forceps with smooth sharp straight fine tip Fine Science Tools (FST) 11251-10 Any brand can be used. Example here is FST Dumont #5 forceps straight 11cm with 0.08 x 0.04mm tip. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=335&CategoryId=29
1 x Forceps with smooth fine curved forceps Fine Science Tools (FST) 11063-07 Any brand can be used. Example here is FST Delicate Forceps 9 cm with smooth 0.4 x 0.3mm tip. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=360
2 x Hemostats Fine Science Tools (FST) 13010-12 Any brand can be used. Not all operators use the hemostats. Example is FST 12 cm Micro-Mosquito Hemostats with 20 mm length x 1.3 mm width serrated, straight tip. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=377&CategoryId=33
1 x Suture needle holder Fine Science Tools (FST) 12001-13 Any brand can be used. Example here is FST 13cm Hasley Needle Holder with 16 mm length x 1.9 mm width tip. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=254&CategoryId=70
1 x Artery clamp Fine Science Tools (FST) 18050-28 Any brand can be used. Example here is FST Bulldog Serrefines straight, 28 mm long, 9x1.6 mm jaw dimension with medium clamp press. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=270&CategoryId=82
Oleic acid Sigma Aldrich O1008 When required, any brand can be used. Example here is 99% pure oleic acid. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/o1008?lang=en&region=AU
14C-oleic acid Perkin  NEC317050UC  Any brand can be used. Example here is Oleic Acid, [1-14C]-, 50µCi (1.85MBq). http://www.perkinelmer.com/Catalog/Product/ID/NEC317050UC
Sodium taurocholate Sigma Aldrich T4009 Any brand can be used. Example here is taurocholic acid sodium salt hydrate ≥95% (TLC) . http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t4009?lang=en&region=AU
Halofantrine Glaxo Smith Kline Halofantrine was kindly provided as a gift from Glaxo Smith Kline
Sodium phosphate monobasic Sigma Aldrich 71507 Any brand can be used. Example here is sodium phosphate monobasic monohydrate, BioXtra, for molecular biology, >99.5%. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/71643?lang=en&region=AU
Sodium phosphate dibasic Sigma Aldrich 71643 Any brand can be used. Example here is sodium phosphate dibasic dihydrate, BioUltra, for molecular biology, >99%. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/71507?lang=en&region=AU

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Barrowman, J. A., Tso, P. Gastrointestinal lymphatics. Comprehensive Physiology. 1733-1777 (2010).
  2. Karaman, S., Detmar, M. Mechanisms of lymphatic metastasis. J Clin Invest. 124, (3), 922-928 (2014).
  3. Mossel, E. C., Ramig, R. F. A lymphatic mechanism of rotavirus extraintestinal spread in the neonatal mouse. J Virol. 77, (22), 12352-12356 (2003).
  4. Pantaleo, G., et al. Hiv-Infection Is Active and Progressive in Lymphoid-Tissue during the Clinically Latent Stage of Disease. Nature. 362, (6418), 355-358 (1993).
  5. Chakraborty, S., Zawieja, S., Wang, W., Zawieja, D. C., Muthuchamy, M. Lymphatic system: a vital link between metabolic syndrome and inflammation. Annals of the New York Academy of Sciences. 1207, R94-R102 (2010).
  6. Dixon, J. B. Lymphatic lipid transport: sewer or subway. Trends Endocrinol Metab. 21, (8), 480-487 (2010).
  7. Weid, P. -Y., Rehal, S., Ferraz, J. G. Role of the lymphatic system in the pathogenesis of Crohn's disease. Current Opinion in Gastroenterology. 27, (4), 335-341 (2011).
  8. Wang, Y., et al. Chylomicrons promote intestinal absorption and systemic dissemination of dietary antigen (ovalbumin) in mice. PloS one. 4, (12), e8442 (2009).
  9. Ji, Y., et al. Activation of rat intestinal mucosal mast cells by fat absorption. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 302, (11), G1292-G1300 (2012).
  10. Kohan, A., Yoder, S., Tso, P. Lymphatics in intestinal transport of nutrients and gastrointestinal hormones. Ann N Y Acad Sci. 1207, Suppl 1. E44-E51 (2010).
  11. Trevaskis, N. L., Charman, W. N., Porter, C. J. Targeted drug delivery to lymphocytes: a route to site-specific immunomodulation. Mol Pharm. 7, (6), 2297-2309 (2010).
  12. Rothkotter, H. J., Huber, T., Barman, N. N., Pabst, R. Lymphoid cells in afferent and efferent intestinal lymph: lymphocyte subpopulations and cell migration. Clin Exp Immunol. 92, (2), 317-322 (1993).
  13. Trevaskis, N. L., Charman, W. N., Porter, C. J. Lipid-based delivery systems and intestinal lymphatic drug transport: a mechanistic update. Adv Drug Deliv Rev. 60, (6), 702-716 (2008).
  14. Mansbach, C. M., Dowell, R. F., Pritchett, D. Portal transport of absorbed lipids in rats. Am J Physiol. 261, (3 Pt 1), G530-G538 (1991).
  15. Kohan, A. B., Howles, P. N., Tso, P. Methods for studying rodent intestinal lipoprotein production and metabolism. Curr Protoc Mouse Biol. 2, 219-230 (2012).
  16. Porter, C. J., Trevaskis, N. L., Charman, W. N. Lipids and lipid-based formulations: optimizing the oral delivery of lipophilic drugs. Nat Rev Drug Discov. 6, (3), 231-248 (2007).
  17. Trevaskis, N. L., et al. The role of the intestinal lymphatics in the absorption of two highly lipophilic cholesterol ester transfer protein inhibitors (CP524,515 and CP532,623). Pharm Res. 27, (5), 878-893 (2010).
  18. Choo, E. F., et al. The Role of Lymphatic Transport on the. Systemic Bioavailability of the Bcl-2 Protein Family Inhibitors Navitoclax (ABT-263) and ABT-199. Drug Metabolism and Disposition. 42, (2), 207-212 (2014).
  19. Han, S., et al. Targeted delivery of a model immunomodulator to the lymphatic system: comparison of alkyl ester versus triglyceride mimetic lipid prodrug strategies. J Control Release. 177, 1-10 (2014).
  20. Bollman, J. L., Cain, J. C., Grindlay, J. H. Techniques for the collection of lymph from the liver, small intestine, or thoracic duct of the rat. J Lab Clin Med. 33, (10), 1349-1352 (1948).
  21. Porter, C. J., Charman, S. A., Charman, W. N. Lymphatic transport of halofantrine in the triple-cannulated anesthetized rat model: effect of lipid vehicle dispersion. J Pharm Sci. 85, (4), 351-356 (1996).
  22. Boyd, M., Risovic, V., Jull, P., Choo, E., Wasan, K. M. A stepwise surgical procedure to investigate the lymphatic transport of lipid-based oral drug formulations: Cannulation of the mesenteric and thoracic lymph ducts within the rat. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 49, (2), 115-120 (2004).
  23. Porter, C. J., Charman, S. A., Humberstone, A. J., Charman, W. N. Lymphatic transport of halofantrine in the conscious rat when administered as either the free base or the hydrochloride salt: effect of lipid class and lipid vehicle dispersion. J Pharm Sci. 85, (4), 357-361 (1996).
  24. Caliph, S. M., Charman, W. N., Porter, C. J. Effect of short-, medium-, and long-chain fatty acid-based vehicles on the absolute oral bioavailability and intestinal lymphatic transport of halofantrine and assessment of mass balance in lymph-cannulated and non-cannulated rats. J Pharm Sci. 89, (8), 1073-1084 (2000).
  25. Edwards, G. A., Porter, C. J., Caliph, S. M., Khoo, S. M., Charman, W. N. Animal models for the study of intestinal lymphatic drug transport. Adv Drug Deliv Rev. 50, (1-2), 45-60 (2001).
  26. Noguchi, T., Charman, W. N. A., Stella, V. J. Lymphatic Appearance of Ddt in Thoracic or Mesenteric Lymph Duct Cannulated Rats. International Journal of Pharmaceutics. 24, (2-3), 185-192 (1985).
  27. Trevaskis, N. L., et al. A mouse model to evaluate the impact of species, sex, and lipid load on lymphatic drug transport. Pharm Res. 30, (12), 3254-3270 (2013).
  28. Kota, J., et al. Lymphatic absorption of subcutaneously administered proteins: influence of different injection sites on the absorption of darbepoetin alfa using a sheep model. Drug Metab Dispos. 35, (12), 2211-2217 (2007).
  29. McHale, N. G., Adair, T. H. Reflex modulation of lymphatic pumping in sheep. Circ Res. 64, (6), 1165-1171 (1989).
  30. White, D. G., Story, M. J., Barnwell, S. G. An Experimental Animal-Model for Studying the Effects of a Novel Lymphatic Drug Delivery System for Propranolol. International Journal of Pharmaceutics. 69, (2), 169-174 (1991).
  31. Khoo, S. M., Edwards, G. A., Porter, C. J., Charman, W. N. A conscious dog model for assessing the absorption, enterocyte-based metabolism, and intestinal lymphatic transport of halofantrine. J Pharm Sci. 90, (10), 1599-1607 (2001).
  32. Kararli, T. T. Comparison of the gastrointestinal anatomy, physiology, and biochemistry of humans and commonly used laboratory animals. Biopharm Drug Dispos. 16, (5), 351-380 (1995).
  33. Kassis, T., et al. Dual-channel in-situ optical imaging system for quantifying lipid uptake and lymphatic pump function. J Biomed Opt. 17, (8), 086005 (2012).
  34. Dahan, A., Hoffman, A. Evaluation of a chylomicron flow blocking approach to investigate the intestinal lymphatic transport of lipophilic drugs. Eur J Pharm Sci. 24, (4), 381-388 (2005).
  35. Xiao, C., Lewis, G. F. Regulation of chylomicron production in humans. Biochim Biophys Acta. 1821, (5), 736-746 (2012).
  36. Seeballuck, F., Ashford, M., O'Driscoll, C. The Effects of Pluronic® Block Copolymers and Cremophor EL on Intestinal Lipoprotein Processing and the Potential Link with P-Glycoprotein in Caco-2 Cells. Pharmaceutical Research. 20, (7), 1085-1092 (2003).
  37. Levy, E., Mehran, M., Seidman, E. Caco-2 cells as a model for intestinal lipoprotein synthesis and secretion. The FASEB Journal. 9, (8), 626-635 (1995).
  38. Cartwright, I. J., Higgins, J. A. Isolated rabbit enterocytes as a model cell system for investigations of chylomicron assembly and secretion. Journal of Lipid Research. 40, (7), 1357-1365 (1999).
  39. Dixon, J. B., Raghunathan, S., Swartz, M. A. A Tissue-Engineered Model of the Intestinal Lacteal for Evaluating Lipid Transport by Lymphatics. Biotechnology and Bioengineering. 103, (6), 1224-1235 (2009).
  40. Gershkovich, P., et al. The role of molecular physicochemical properties and apolipoproteins in association of drugs with triglyceride-rich lipoproteins: in-silico prediction of uptake by chylomicrons. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 61, (1), 31-39 (2009).
  41. Gershkovich, P., Hoffman, A. Uptake of lipophilic drugs by plasma derived isolated chylomicrons: Linear correlation with intestinal lymphatic bioavailability. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 26, (5), 394-404 (2005).
  42. Holm, R., Hoest, J. Successful in silico predicting of intestinal lymphatic transfer. International Journal of Pharmaceutics. 272, (1-2), 189-193 (2004).
  43. Trevaskis, N. L., Porter, C. J., Charman, W. N. Bile increases intestinal lymphatic drug transport in the fasted rat. Pharm Res. 22, (11), 1863-1870 (2005).
  44. Miura, S., et al. Increased proliferative response of lymphocytes from intestinal lymph during long chain fatty acid absorption. Immunology. 78, (1), 142-146 (1993).
  45. Caliph, S. M., et al. The impact of lymphatic transport on the systemic disposition of lipophilic drugs. J Pharm Sci. 102, (7), 2395-2408 (2013).
  46. Caliph, S. M., Trevaskis, N. L., Charman, W. N., Porter, C. J. Intravenous dosing conditions may affect systemic clearance for highly lipophilic drugs: implications for lymphatic transport and absolute bioavailability studies. J Pharm Sci. 101, (9), 3540-3546 (2012).
  47. Trevaskis, N. L., et al. Tissue uptake of DDT is independent of chylomicron metabolism. Arch Toxicol. 80, (4), 196-200 (2006).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics