تقييم المنقولة جنون الأنواع دماغي الحواجز مع

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Johnson, C. J., Carlson, C. M., Morawski, A. R., Manthei, A., Cashman, N. R. Assessing Transmissible Spongiform Encephalopathy Species Barriers with an In Vitro Prion Protein Conversion Assay. J. Vis. Exp. (97), e52522, doi:10.3791/52522 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

الاعتلال الإسفنجي للانتقال (TSEs، وأمراض بريون) هي مجموعة من الأمراض العصبية القاتلة مع فترات الحضانة الطويلة التي تؤثر على مجموعة متنوعة من الحيوانات والبشر. وتتألف العامل المسبب للمرض من المفترض TSEs من أيزومر تتجمع من بروتين بريون المضيف (بي ار بي) التي هي قادرة على التكاثر الذاتي التي يحركها قالب تحويل شكل الخلوي الطبيعي للبي ار بي (بي ار بي C) إلى معدية، ويرتبط مرض شكل (بي ار بي TSE) التي تتراكم في أنسجة الجهاز العصبي المركزي للمضيف المصاب 1. البريونات المعدية نقل الثدييات عموما من المضيف إلى المضيف بطريقة أنواع محددة، والتي أدت إلى مفهوم "الحواجز القائمة بين الأنواع بورصة طوكيو" الحد من انتقال الأحداث بين الأنواع 2. ليست مفهومة جيدا المحددات البيولوجية للالحواجز القائمة بين الأنواع بريون. الأحماض الأمينية تشابه تسلسل بين المعدية بي ار بي بورصة طوكيو والمضيف بي ار بي C جوتؤثر بقوة سواء التحويل يأخذ مكان 3-5، ولكن لا يزال غير كاف لتفسير كل الأحداث انتقال بريون لوحظ في الجسم الحي 6،7.

وبالتالي، فقد اعتمد توصيف حواجز الأنواع بورصة طوكيو إلى حد كبير على دراسات التحدي الحيوان: تعريض الحيوانات ساذجة من نوع معين لالبريونات من آخر وقياس الناتجة فترة حضانة ظهور المرض ومعدل الهجوم كمؤشرات للكفاءة الإرسال. وتستخدم أيضا الفئران معربا عن بي ار بي C من الأنواع مغاير لهذا النوع من الدراسة 8. التكاليف المرتبطة بإنتاج المعدلة وراثيا الماوس واختبارات بيولوجية بريون التي طال أمدها، فضلا عن الاعتبارات الأخلاقية للاستخدام الحيواني، هي العقبات التي تحول دون تحقيق التجريبي الحواجز الأنواع بورصة طوكيو. تقييم الحواجز القائمة بين الأنواع البشرية لTSEs يعتمد على الفئران المهندسة للتعبير عن الإنسان بي ار بي C. هذه الفئران تتطلب فترات حضانة طويلة الرضوخ لTSEs الإنسان أو تعديلات على رانه البشري جزيء بي ار بي C لبدء المرض السريع 9. فترات حضانة TSEs غير البشرية في هذه الفئران قد تمتد إلى ما بعد عمر الفأر العادي مما يجعل تفسير النتائج السلبية الصعبة. كما استخدمت الرئيسيات غير البشرية كوكلاء لدراسة حواجز الجنس البشري، ولكن هذه الدراسات لا محفوف نفس التحديات التي تواجهها أنواع أخرى من التجارب على الحيوانات والرئيسيات غير البشرية قد لا ألخص بالضبط المرض لأنها تسير في الإنسان المضيف.

لا تزال اختبارات بيولوجية الحيوان "المعيار الذهبي" طريقة لقياس قابلية الأنواع إلى بورصة طوكيو، ولكن أجبرت العقبات والتكاليف والأخلاق من هذه الدراسات على الحيوانات الحية التحقيق في البدائل. وهناك عدد من فحوصات في المختبر، استنادا إلى تقييم تحويل المضيفة بي ار بي C إلى بروتين K (PK) دولة مقاوم لل(احتياط PRP) عند المصنف من قبل بي ار بي بورصة طوكيو، وقد وضعت واستخدامها لتحقيق TSE SPecies الحواجز 10-12. أمثلة لفحوصات في المختبر وتشمل فحوصات خالية من الخلايا التحويل، البروتين misfolding التضخيم دوري (PMCA)، ونسبة كفاءة التحويل (CER) فحص 10-14. في حين أن أيا من هذه المقايسات تأخذ في الاعتبار العوامل المحيطية المشتركة في حواجز الأنواع بعد العدوى الطبيعية، وكلها يمكن أن تكون مفيدة لتحديد المضيفين يحتمل أن تكون عرضة للTSEs.

هنا نقدم بروتوكول للمقايسة CER، التي تستخدم اثنين من التشويه والتحريف ركائز بي ار بي C المستمدة من الخليط المخ المعتادة في مقاعد البدلاء الأعلى ردود الفعل تحويل بريون (الشكل 1) 13. بي ار بي C في الركيزة التشويه والتحريف في درجة الحموضة 7.4 لا يمكن تحويلها إلى الدقة PRP التي كتبها بي ار بي TSE المصنفة في رد الفعل في حالة عدم وجود الحواجز القائمة بين الأنواع 14. في المقابل، تمسخ من بي ار بي C في الركيزة الأخرى في درجة الحموضة 3.5 يسمح ليتم تحويلها إلى بي ار بي الدقة حضانة التاليةمع بي ار بي TSE من أي نوع من الأنواع وبمثابة الرقابة على التحويل. فإن نسبة التحويل من بي ار بي C إلى الدقة PRP في درجة الحموضة 7.4 الركيزة نسبة إلى أن الركيزة درجة الحموضة 3.5 يوفر قدرا من الحواجز القائمة بين الأنواع. لقد وجدنا أن الفحص CER يتنبأ يعرف الحواجز الأنواع من الفئران المخبرية لمختلف TSEs واستخدمت مقايسة في الجهود الرامية إلى التنبؤ الحواجز القائمة بين الأنواع العديد من أنواع الثدييات، بما في ذلك كبش الجبال الصخرية، إلى مرض الهزال المزمن (CWD) وغيرها من TSEs 14، 15. المحققون ترغب في أداة السماح الفحص السريع للحواجز الأنواع TSE أو تقييم تحويل بي ار بي C -to-بي ار بي احتياط سوف تجد هذه المنهجية مفيدة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تم تنفيذ العمل الحيوانات التي أجريت في المركز القومي للحياة البرية الصحة وفقا للمكتب NIH من المبادئ التوجيهية مختبر رعاية الحيوان وتحت رعاية الحيوان المؤسسية واللجنة استخدام بروتوكول # EP080716. وكانت الأنسجة من الحيوانات تحصد صياد الهدايا من ولاية ويسكونسن أو ميشيغان أقسام الموارد الطبيعية.

1. إعداد الحل

ملاحظة: الحلول المذكورة أدناه مطلوبة لإعداد الركيزة CER الفحص في القسم 2 أدناه. إعداد كل من هذه الحلول من ارتفاع حلول الأسهم تركيز. وستعطى تركيزات المستحسنة للحلول الأسهم في أقواس بعد كل اسم الكيميائية المدرجة ذات الصلة. إعداد جميع حلول جديدة على إعداد الركيزة وتخزينها في 4 درجات مئوية حتى استخدامها.

  1. للتحلل العازلة، وإعداد إيجاد حل لليلي في 10 ملي تريس، ودرجة الحموضة 7.5 (1 M تريس، ودرجة الحموضة 7.5 حل الأسهم مستحسن): 100 ملم الصورةكلوريد الكراهية (كلوريد الصوديوم، 1 M حل الأوراق المالية)، و 10 ملم حمض ethylenediaminetetraacetic (EDTA، 500 ملي EDTA، ودرجة الحموضة 8.0 حل الأسهم)، و 0.5٪ NP-40 (10٪ محلول المخزون)، و 0.5٪ deoxycholate (DOC، 10٪ محلول المخزون ).
  2. لعازلة التحويل، وإعداد محلول كبريتات الصوديوم 0.05٪ دوديسيل (SDS، 10٪ محلول المخزون) و 0.5٪ تريتون X-100 (10٪ محلول المخزون) في 1 الفوسفات مخزنة المالحة (PBS، 10، ودرجة الحموضة 7.4 حل الأسهم).
  3. عن حلول chaotropic، وإعداد اثنين 3 M حلول غوانيدين هيدروكلوريد (GdnHCl، 8 M الأسهم) في برنامج تلفزيوني 1X (حل 10X الأسهم). ضبط درجة الحموضة واحد من الحلول إلى 3.5 ± 0.05 باستخدام حمض الهيدروكلوريك المركز (حمض الهيدروكلوريك). تأكد من أن الرقم الهيدروجيني للمحلول الثاني يبقى في درجة الحموضة 7.4 ± 0.05 وضبط باستخدام حمض الهيدروكلوريك المركز أو هيدروكسيد الصوديوم (هيدروكسيد الصوديوم) إذا لزم الأمر.

2. إعداد أزواج CER الفحص الركيزة

  1. الحصول صحية أنسجة المخ، غير TSE-المصابة من الأنواع ذات الأهمية وإعداد 10٪ حجم الوزن لكل(ث / ت) جناسة في تحلل العازلة باستخدام أي من الطرق التالية: dounce، وحبة طاحونة، أو التجانس الهاون ومدقة. زيادة تحسين الناتجة الخليط بواسطة تعريضهم للتجانس حقنة وإبرة، وذلك باستخدام الإبر زيادة مقياس حتى يمكن يستنشق الركيزة وطرد بكل سهولة من خلال 27 G حقنة إبرة.
    1. لركائز أعدت من القوارض والثدييات الصغيرة الأخرى، التجانس الدماغ كله (ق)؛ لركائز أعدت من الثدييات الكبيرة، واستخدام OBEX (الدماغ) الأنسجة لتحضير الخليط. عند اختيار كمية جناسة الدماغ، وإعداد ما لا يزيد عن 50٪ من قدرة أجهزة الطرد المركزي المستخدمة لبروتين هطول الأمطار في الخطوة 2.6.
    2. إذا كانت نوعية أنسجة المخ المكتسبة أمر مشكوك فيه، وتقييم مستويات بي ار بي C بواسطة SDS-PAGE 16 و 17 طخة مناعية قبل الركيزة التحضير.
  2. تقسيم جناسة الدماغ إلى قسمين أحجام متساوية في أنابيب بلاستيكية المخروطية وصفت منفصلة. إضافة GdnHCl (3 M الحلول في 1 PBS) في أي درجة الحموضة 3.5 أو 7.4 إلى كل أنبوب في نسبة 1: حجم 1 إلى جناسة الدماغ.
  3. تحقق من قيم الرقم الهيدروجيني للحلول اثنين. ضبط درجة الحموضة من الحموضة 3.5 الركيزة لدرجة الحموضة ± 0.05 باستخدام حمض الهيدروكلوريك المركز. ضمان درجة حموضة الركيزة الأخرى تبقى في درجة الحموضة 7.4 ± 0.05 وضبط درجة الحموضة إذا لزم الأمر مع حمض الهيدروكلوريك هيدروكسيد الصوديوم أو حسب الحاجة. تجنب المبالغة قيم درجة الحموضة بإضافة حكيمة من حمض أو قاعدة.
  4. تدوير الحلول على نهاية الإفراط في نهاية خلاط في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 5 ساعة.
  5. يعجل البروتين من خلال إضافة أربعة مجلدات من الميثانول إلى حلول الركيزة في كل أنبوب مخروطي الشكل، دوامة لخلط جيدا، واحتضان عند درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة 16-18 ساعة.
  6. عينات الرواسب بواسطة الطرد المركزي عند 13،000 × ز لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية. صب بعناية وتجاهل supernatants والسماح الميثانول لتتبخر من الكريات. استخدام أدوات تطبيقها القطن ذات الرؤوس للمساعدة في امتصاص الميثانول تشبث إلى داخل الأنبوب. لا تسمح الكريات إلى الإفراط في الدكتورذ ومرة ​​واحدة الميثانول لم تعد مرئية، انتقل إلى الخطوة التالية.
  7. الكريات البروتين resuspend في عازلة التحويل. استخدام كمية من تحويل عازلة يساوي المبلغ من جناسة الدماغ المواد انطلاق الاستغناء في كل أنبوب في الخطوة 2.2.
    ملاحظة: ومن الأهمية بمكان أن المخزن المؤقت التحويل المستخدمة ل resuspend الكريات البروتين من كلا الأس الهيدروجيني 3.5 والاستعدادات الركيزة المعاملة 7.4 هو الحل المعرفة في الخطوة 1.2 أعلاه (والذي يحتوي على مستويات منخفضة من المنظفات ودرجة الحموضة الفسيولوجية).
  8. حلول يصوتن لفترة وجيزة الركيزة في sonicator cuphorn (10 ثانية في ~ 30٪ الطاقة القصوى)، قسامة إلى 0،5-1،0 مل مجلدات في المسمى 1.5 مل أنابيب microcentrifuge. إجراء طخة مناعية لمراقبة الجودة (الخطوة 2.9) على قسامة من كل الركيزة. تخزين مأخوذة أخرى في -80 درجة مئوية لتصبح جاهزة لإجراء فحص CER (القسم 4).
  9. أداء مراقبة الجودة على أزواج CER الركيزة قبل استخدامها (الشكل 2). هذه الخطوات تضمن ركائز CER سوف يقوم بتقديمالبريد أفضل النتائج في الدراسات التحويل.
    1. ضمان كميات مماثلة من بي ار بي C في ركائز اثنين. مقارنة مستويات بي ار بي في 10-25 ميكرولتر من كل الركيزة التي كتبها SDS-PAGE 16 و 17 immunoblotting. إذا كانت مستويات البروتين في الرقم الهيدروجيني 7.4 و 3.5 ركائز هي داخل ~ 10٪ من بعضها البعض، وأزواج الركيزة مناسبة للاستخدام في الدراسات CER.
      ملاحظة: يجب على immunoblots PRP لا تظهر أدلة على نطاق واسع تدهور بي ار بي C. يجب أن يكون مناعية بي ار بي أساسا> 20 كيلو دالتون. فرق أقل من هذه الكتلة الجزيئية يمكن أن تكون المنتجات التدهور. وينبغي أن تكون أنماط النطاقات يعادل تقريبا بين أزواج الركيزة.
    2. وبما أن بي ار بي C في كل من ركائز يجب أن تكون PK حساسة، علاج 10-25 ميكرولتر من كل الركيزة مع PK في تركيز النهائي من 100 ميكروغرام / مل وهضم العينات عند 1،000 دورة في الدقيقة عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة في الحرارية شاكر. تقييم أي إشارة PRP المتبقية SDS-PAGE 16 و 17 immunoblotting.ركائز مع الدقة PRP ليست مناسبة للاستخدام في الدراسات CER.

3. إعداد بذور TSE الوكيل

  1. الحصول TSE المصابة أنسجة المخ من الأنواع ذات الأهمية وإعداد 10٪ (ث / ت) جناسة في برنامج تلفزيوني 1X درجة الحموضة 7.4 باستخدام الأساليب المذكورة في الخطوة 2.1 أعلاه.
    ملاحظة: يمكن أيضا أن تنتج بذور من الأنسجة الأخرى TSE المصابة خارج الجهاز العصبي المركزي، ومع ذلك، كفاءة التحويل من الدماغ المستمدة ركائز عن طريق البذور المستمدة من الأنسجة الطرفية TSE المصابة لم يتم بعد تقييم التجربة في الأدبيات المنشورة.
  2. قسامة الناتجة جناسة (ق) في 100-300 حجم ميكرولتر في 0.5 مل أنابيب microcentrifuge وتخزينها في -80 درجة مئوية لتصبح جاهزة لأداء الفحص CER.

4. CER الفحص

ملاحظة: فحص CER ينطوي إضافة كمية صغيرة نسبيا من بي ار بي بورصة طوكيو (المنصوص عليها في "البذور") من نوع واحدإلى وجود فائض النسبي للبي ار بي C (المنصوص عليها في الدماغ غير مصاب "الركيزة") من الأنواع الأخرى التي تم التشويه والتحريف جزئيا في أي درجة الحموضة 3.5 أو 7.4. وبعد فترة حضانة تمتد الهز، ويتم تقييم يحركها قالب تحويل بي ار بي C التي كتبها بي ار بي بورصة طوكيو في كل رد فعل من جانب إشارة الكثافات من بي ار بي الدقة المتبقية بعد PK الهضم وكشف طخة مناعية. مقارنة مستويات الدقة PRP في ركائز التشويه والتحريف سابقا في درجة الحموضة 3.5 مقابل 7.4 يوفر قدرا من الحواجز القائمة بين الأنواع. وتقدم لمحة عامة التجريبية من هذا الإجراء فحص في الشكل 1.

  1. ذوبان الجليد ببطء غير المصابة أزواج CER الركيزة (الفحص يتطلب كميات متساوية من ركائز التشويه والتحريف سابقا في كل من درجة الحموضة 3.5 و 7.4) وحلول البذور TSE-المصابة عن طريق وضعها على رأس سرير من الجليد (حوالي 1 ساعة الوقت ذوبان الجليد).
  2. إذابة مرة واحدة بشكل كامل، نضح ثم طرد كل حل الركيزة من خلال27 G حقنة إبرة عدة مرات لإعادة التجانس عليه. يصوتن لفترة وجيزة كل حل البذور TSE المصابة لمدة 10 ثانية في ~ 30٪ الطاقة القصوى. إبقاء جميع الحلول على الجليد في حين تستعد ردود الفعل التحويل.
  3. التسمية 5 الفردية منخفضة ملزمة، وأنابيب PCR رقيقة الجدران في كيل بورصة طوكيو التي يجري اختبارها.
  4. إعداد ردود الفعل التحويل في هذه الأنابيب عن طريق إضافة 5 ميكرولتر من 10٪ محلول البذور TSE-المصابين إلى 95 ميكرولتر من (أ) الركيزة CER أعدت في درجة الحموضة 7.4 و (ب) الركيزة CER أعدت في درجة الحموضة 3.5.
    1. لكل عينة تجريبية، وإعداد ردود فعل موازية في أزواج الركيزة CER التشويه والتحريف سابقا في كل من درجة الحموضة 3.5 و 7.4.
    2. تحسين نسب TSE البذور وكيل لغير المصابة الركيزة الدماغ من خلال تقرير التجريبية. البذور مشترك: نسب الركيزة المستخدمة الحفاظ على حجم رد الفعل الكلي 100 ميكرولتر وتشمل 1:99 ميكرولتر، 2:98 5:95 ميكرولتر وميكرولتر. بالنسبة لمعظم التطبيقات، و5:95 ميكرولتر البذور: نسبة حجم الركيزة المناسبة وما قدمت في عشرهو بروتوكول.
  5. إعداد ثلاث عينات السيطرة في كيل بورصة طوكيو التي يجري اختبارها على النحو التالي: (أ) إضافة 5 ميكرولتر من 10٪ محلول البذور TSE-المصابين إلى 95 ميكرولتر عازلة تحويل كعنصر تحكم لمدخلات الدقة الحزب الثورى. إضافة 5 ميكرولتر عازلة التحويل إلى 95 ميكرولتر الركيزة أعد في (ب) الرقم الهيدروجيني 3.5 و (ج) ودرجة الحموضة 7.4 كما ضوابط لغير محددة التحويل، غير قالب.
  6. لفترة وجيزة دوامة كل عينة في أنبوب للPCR مغلقة لخلط البذور والركيزة جيدا. اتبع مع نبض لحظة في السرعة المنخفضة مقاعد البدلاء أعلى مصغرة الطرد المركزي لإزالة أي كمية من خليط التفاعل المحاصرين في أنبوب غطاء PCR.
  7. عينات الحمل في المسمى بشكل فردي أنابيب PCR إلى مقاعد البدلاء أعلى الحرارية شاكر مجهزة لقبول أنابيب PCR. يهز العينات عند 1،000 دورة في الدقيقة عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
  8. وبعد الهز، إضافة sarkosyl إلى تركيز النهائي من 2٪ (ث / ت) وPK إلى تركيز النهائي من 100 ميكروغرام / مل. عينات دايجست في 1،000 دورة في الدقيقة عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة في الحرارية شاكر.
    NOTE: إضافة sarkosyl لعينات المساعدات بعد التحويل في PK هضم بي ار بي C. يتم استبعاد اشارات ايجابية كاذبة في عينات غير المصنف (الخطوة 4.5) تقريبا بإضافة sarkosyl.
  9. إضافة SDS-PAGE عينة عازلة، وعينات الحرارة إلى 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق وحل بي ار بي المتبقية الدقة في كل عينة بواسطة SDS-PAGE 16 تليها immunoblotting 17.
    ملاحظة: بعد إضافة عينة العازلة والتدفئة، وعينات قد تتم معالجة فورا أو يمكن تخزين العينات في -20 ° C أو -80 ° C قبل immunoblotting. تم إنشاء جميع البيانات المقدمة هنا باستخدام أنظمة جل ونقل NOVEX NuPAGE. وعولج عينات فردية من الفحص CER مع العازلة عينة والحد من وكيل وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. تم تسخين العينات لاحقا عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق وتم تحميل 30 ميكرولتر من كل عينة إلى 12٪ مكرر تريس المواد الهلامية الجاهزة.
  10. حساب نسبة كفاءة التحويل (CER) كإجراءمن الحواجز القائمة بين الأنواع. مستويات قدر من الدقة PRP بواسطة قياس كثافة 17 و تقسيم الكثافة الإجمالية للعينة الرقم الهيدروجيني 7.4 قبل أن من درجة الحموضة 3.5 العينة. ضرب من قبل 100 لإنتاج مئوية.
  11. تجميع البيانات من مكررات التجريبية مستقلة لتوليد وسيلة CER ± الانحراف المعياري لالأنواع مع وكيل TSE معين.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

الاستخدام الناجح للمقايسة CER يعتمد إلى حد كبير على نوعية من أزواج الركيزة المستخدمة في تفاعلات التحويل. لهذا السبب، والإجراءات لإعداد أزواج الركيزة CER التالية، ينبغي إجراء طخة مناعية لمراقبة الجودة (الشكل 2). لكل من ركائز، فحص 10-25 ميكرولتر من immunoblotting. بي ار بي C يجب أن يكون كشفها بسهولة في كل الركيزة ويجب أن تكون مستويات بي ار بي C تقريبا نفس بين البلدين. سوف مناعية تكون مرئية بشكل رئيسي فوق 20 كيلو دالتون، ولكن قد تكون عصابات أصغر واضح أيضا. في تجربتنا، فإن وجود عصابات صغيرة هي الأنواع التي تعتمد. إذا لوحظ انخفاض المنتجات الوزن الجزيئي، ينبغي تأكيد وجودها في كل من أزواج الركيزة.

ومن المهم التأكد من أن ركائز CER خالية من الدقة PRP الذاتية عن طريق التعامل مع ركائز PK (الشكل 2). إذا الدقة PRP موجودة، والحيوان تستخدم لSUBSTإعداد معدل قد تم TSE-إصابة أو المصابة subclinically. بدلا من ذلك، بي ار بي C في الركيزة قد تتجمع إلى حالة مقاومة للPK خلال إجراءات تمسخ أو هطول الأمطار. مستقلة عن السبب، CER الركيزة التي تحتوي على الدقة PRP ليست مقبولة للاستخدام في فحص التحويل.

الفئران المعملية هي واحدة من الأكثر استخداما حيوانات التجارب في مجال البحوث بورصة طوكيو. على هذا النحو، قابليتها لمعظم TSEs يتميز جيدا-8، وتوفير معيارا في الجسم الحي الذي ضد لاختبار الاخلاص للمقايسة CER. الشكل 3A يعرض نتائج التحويل CER فحص من بي ار بي C من الماوس (سلالة CD1) الركيزة لبي ار بي الدقة في موعد أقصاه 1) سلالة RML من سكرابي-passaged الماوس وتكييفها وكيل إلى المضيف الماوس 18، 2) سكرابي الأغنام المحلي الكلاسيكي، وهو العامل الذي يمكن أن يحيل إلى الفئران بعد فترة حضانة طويلة 18، و 3) مبادرة الخوذ البيضاءالغزلان الشركة المصرية للاتصالات الذيل (Odocoileus virginianus) CWD و263K سلالة من-passaged الهامستر سكرابي، وكلاء التي الفئران هي الحد الأدنى أو لا عرضة 19،20. وكانت الناتجة مستويات الدقة PRP متغيرة عبر التشويه والتحريف ركائز الماوس على الرقم الهيدروجيني 7.4 والمصنفة مع مختلف وكلاء بورصة طوكيو في حين تم العثور على الدقة PRP في جميع ركائز التشويه والتحريف في درجة الحموضة 3.5 و المصنف مع وكيل بورصة طوكيو. نسب التحويل مقارنة مستويات بي ار بي الدقة في درجة الحموضة 7.4 و 3.5 ركائز تم حساب مستقل ثلاث مرات على الأقل ويعني ± SD وتظهر في الشكل 3B. لردود الفعل المصنفة من قبل RML، وكانت نسب التحويل بين درجة الحموضة 7.4 و 3.5 ركائز ما يقرب من 100٪. بالنسبة لأولئك المصنفة من قبل سكرابي، كان التحويل في الركيزة درجة الحموضة 7.4 ما يقرب من 75٪ من ذلك في الرقم الهيدروجيني 3.5 الركيزة. كان CWD أو من صنع 263K تحويل الركيزة درجة الحموضة 7.4 الحد الأدنى. وتحليل التباين في اتجاه واحد لا يمكن أن يميز الفرق في نسب التحويل من RML والصورةكانت crapie أو CWD و263K، ولكن نسب التحويل من RML وسكرابي تختلف كثيرا عن تلك التي CWD و263K.

الفحص CER يمكن تكييفها للاستخدام مع الأنسجة البشرية أو مع الأنواع الحيوانية حيث اختبارات بيولوجية هي صعبة جدا أو لا عدم رغبتك فى إنتاج الماوس الأخلاقي والمعدلة وراثيا. لقد تم استخدام هذا الاختبار لتوصيف قابلية أنواع الحيوانات البرية المختلفة لCWD. وكمثال على استخدام هذا الاختبار، فإننا نقدم بعض النتائج الأولية في الشكل (4). أدمغة من تشارلوت-المحاصرين صياد (الوشق روفوس) وجدت للا تزال تحتوي على مستويات ملحوظة من بي ار بي C والمنتجات انهيار الحزب الثورى لم تكن واسعة النطاق، مما يشير إلى أن هذه الأنسجة يمكن أن يكون مصدر مقبول لالركيزة CER (الشكل 4A). وأظهرت أزواج الركيزة المتولدة من البوبكات الدماغ بي ار بي مناعية من الوزن الجزيئي المناسب ولا تحتوي الدقة PRP الذاتية (الشكل 4B). عندما حضنت أزواج الركيزة البوبكات CER الناتجة عن اثنين من الحيوانات منفصلة مع نفس أبيض الذيل الغزلان وكيل CWD تستخدم في فحص الماوس CER هو موضح في الشكل (3)، وجدنا ركائز أعدت في درجة الحموضة 7.4 قد مستويات الدقة PRP مقارنة مع ركائز أعدت في درجة الحموضة 3.5 (الشكل 4C)، يدل على الحواجز القائمة بين الأنواع الأدنى من البوبكات بي ار بي C إلى التحويل عن طريق CWD. وCER لتحويل الغزلان أبيض الذيل بي ار بي C من قبل نفس CWD عزلها تستخدم لتحويل البوبكات بي ار بي C هنا، كما تحكم إيجابية، أفيد سابقا 95.2 ± 18.4٪ في MORAWSKI وآخرون (2013) 15.

الشكل (1)
يتم إعداد نظرة عامة تجريبية لفحص CER اثنين من ركائز الفحص قبل تغيير طبيعة جزئيا بي ار بي C في غير بريون المصابة أنسجة المخ ث: الشكل 1.حلول إيث chaotropic في أي درجة الحموضة 3.5 أو 7.4 درجة الحموضة. هي المصنفة ركائز مع بي ار بي TSE من وكيل بريون من الاهتمام وتخضع العينات التجريبية إلى 24 ساعة الحضانة مع اهتزاز للسماح بي ار بي C لتحويل بي ار بي بورصة طوكيو في كل من درجة الحموضة 3.5 و 7.4 ركائز. وبعد الحضانة، يتم تقييم التحويل عن طريق SDS-PAGE وimmunoblotting. تتم قراءة كثافة إشارة من كثافة ويتم احتساب CER من قبل نسبة الرقم الهيدروجيني 7.4 إلى 3.5 درجة الحموضة كثافة إشارة لكل عينة تجريبية.

الشكل 2
الشكل 2: مراقبة الجودة على ركائز CER. (A) قبل استخدامها في فحص CER، ركائز الماوس أعدت إما في درجة الحموضة 7.4 أو 3.5 ويعاير من طخة مناعية في 1) غياب المعالجة PK لتقييم بي ار بي C المحتوى من كل زوج الركيزة (يجب أن يكون مستويات بي ار بي C يعادل بين درجة الحموضة 7.4 و 3.5 substra قسم التدريب والامتحانات لاستخدامها في فحص CER) و 2) وجود PK (100 ميكروغرام / مل) معاملة لاختبار ما قبل القائمة الدقة PRP في الأنسجة المستخدمة في إعداد ركائز (أي ركائز يتم عرضها الدقة PRP موجودة من قبل ليست مناسبة للاستخدام في الفحص CER). (ب) لاختبار تشكيل غير محددة بي ار بي احتياط خلال فحص التحويل، هي المصنفة ركائز الماوس بي ار بي C أعدت إما في درجة الحموضة 7.4 أو 3.5 مع العازلة التحويل، واهتزت لمدة 24 ساعة عند 1،000 دورة في الدقيقة، 37 ° C وبعد ذلك PK المعاملة (100 ميكروغرام / مل)، ويعاير للوحدات السكنية PRP من قبل immunoblotting (يمين مسربين). غير اهتزت، ركائز الماوس غير PK المعالجة تمثل المحتوى الكلي للبي ار بي C في التفاعلات فحص (يسار مسربين). ل(B)، تم اقتصاص الممرات غير ذات صلة من أجل الوضوح، ولكن يستمد كل لوحة طخة مناعية من نفس هلام، غشاء والتعرض. Immunoblots في جميع لوحات تستخدم الأجسام المضادة وحيدة النسيلة SAF 83.

"> الشكل (3)
الرقم 3: CER الفحص باستخدام الماوس المختبر الركيزة (A) ماوس CER فحص الركيزة أعدت إما في درجة الحموضة 7.4 أو 3.5 وحضنت مع RML-تكييفها الماوس سكرابي والأغنام سكرابي الكلاسيكية المحلي، والغزلان أبيض الذيل مرض الهزال المزمن (CWD) أو 263K سلالة من سكرابي-تكييفها الهامستر في مقايسة CER. عينات التحكم (المسمى "لا شيء") الواردة فقط مبلغ مساو من وكيل المعدية وليس الركيزة الماوس. وقد تم تحليل عينات من وجود بروتين بريون مقاومة للPK (احتياط PRP) من خلال طخة مناعية مع الأجسام المضادة وحيدة النسيلة SAF 83. الخام القيم الكثافات لكل عينة يتم عرضها أسفل كل حارة. (B) بار الرسم البياني يشير إلى أن متوسط ​​نسب (± الانحراف المعياري) بين درجة الحموضة 7.4 و 3.5 ركائز الماوس لكل عامل معد على أساس لا يقل عن 3 أشواط فحص مستقلة. الأحرف الصغيرة تشير إلى إحصائيامجموعات فرعية متجانسة (تحليل التباين مع طريقة توكي-كرامر الخلافات الدنيا الأهمية؛ P <0.05). تم تعديل هذا الرقم من MORAWSKI وآخرون. 2013 15.

الشكل (4)
الشكل 4: استخدام عينة من CER فحص للتحقيق BOBCAT القابلية للCWD البوبكات جناسة الدماغ (A) والركيزة CER فحص (B) تم اختبارها من قبل immunoblotting في غياب وجود PK (100 ميكروغرام / مل) لتقييم بي ار بي C الموجودة. المستويات وجود احتياط PRP موجودة من قبل، على التوالي. والمصنفة (C) ركائز البوبكات مع العازلة التحويل ويعاير في مقايسة CER لتقييم تشكيل بي ار بي غير محددة الدقة (يسار مسربين). غير اهتزت، ركائز البوبكات غير PK المعالجة تمثل المحتوى الكلي للبي ار بي C في التفاعلات فحص (يمين مسربين).وقد حضنت (D) البوبكات الركيزة التي أعدت في أي درجة الحموضة 7.4 أو 3.5 مع الأبيض الذيل CWD الغزلان باستخدام الفحص CER. والعينة الضابطة (المسمى "لا شيء") تحتوي على مبلغ مساو من وكيل CWD ولكن لا الركيزة البوبكات. يتم عرض القيم الكثافات الخام لكل عينة أدناه كل حارة. Immunoblots في جميع لوحات تستخدم الأجسام المضادة وحيدة النسيلة 3F4، الذي يتفاعل مع القطط بريون البروتين 21.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

لالانتهاء بنجاح من هذا البروتوكول، ينبغي إيلاء الاهتمام لمستويات بي ار بي C في غير المصابة أنسجة المخ تستخدم لإعداد الركيزة (الخطوة 2.1.2) والبذور إلى الركيزة نسبة للتفاعلات التحويل (الخطوة 4.4.2). في تجربتنا، والعقول يمكن استخراجها لاستخدامها بوصفها الركيزة CER بعد فترة كبيرة بعد الوفاة، ما دام بي ار بي C موجود من قبل immunoblotting (الشكل 4). في الواقع، وقد لوحظ بعض انحلال ذاتي في أدمغة بوبكاتس المستخدمة للدراسات CER. ومع ذلك، حضانة ركائز المستمدة من هذه العقول لا يزال أسفر عن تشكيل الدقة الحزب الثورى. نحن التكهن بأن، في جزء منه، مشتق من متانة مقايسة CER من تمسخ من ركائز CER في 1.5 M GdnHCl، والتي سوف تعطيل العديد من البروتياز.

البذور إلى الركيزة نسب قد تحتاج إلى أن تكون مصممة تجريبيا للحصول مقبول بي ار بي الدقة إشارة من immunoblotting. كثيرا جدا أو لالدقة PRP إيتل لأداء كثافة، خلفية عالية الدقة مستويات PRP في عينات السيطرة تفتقر الركيزة ونسب التحويل تتعارض كلها أسباب لتحسين البذور: نسب الركيزة. الاختلافات الحفاظ على حجم رد الفعل الكلي 100 ميكرولتر وتشمل 1:99 ميكرولتر، 2:98 5:95 ميكرولتر وميكرولتر. في جميع المناسبات تقريبا، وجدنا أن 5:95 البذور ميكرولتر: نسبة حجم الركيزة هو الأمثل. بغض النظر عن نسبة ويعمل، وتستخدم كميات متساوية من وكيل وبورصة طوكيو للمقايسة منسجمة داخليا. ومع ذلك، تركيز البذور من جناسة الدماغ المصابة بريون تستخدم لردود الفعل قالب المرجح يؤثر على نتائج الفحص CER في ذلك متفاوتة التتر البذور أو التخفيفات يمكن أن يؤدي إلى مستويات التحويل بي ار بي C -to-بي ار بي احتياط متفاوتة. وقد تجلى هذا التأثير في الآخر في المختبر المقايسات تحويل بريون 22 و قد تعقد مقارنة يعزل بريون مختلف. لمعالجة هذه في مقايسة CER والبذور جولد أن معاير في كل الركيزة بي ار بي C أعدت في درجة الحموضة 3.5 و 7.4 لتحديد مجموعة من التخفيفات ذلك القالب بي ار بي C التحويل. التخفيفات البذور مثالية تجنب تشبع الحل مع البريونات البذور الزائدة وبعد توفر نظرة ثاقبة لحساسية رد فعل التحويل. بدلا من ذلك، يمكن قياس تحويل بي ار بي C -to-بي ار بي الدقة في فحص ردود الفعل CER في متعددة، timepoints العادية طوال فترة الفحص وتآمر كما معدل للتحويل المنحنيات، وأقرب إلى قراءات في الوقت الحقيقي للتفاعل البلمرة المتسلسل ( QPCR) 23 في الوقت الحقيقي ومهتز تحويل يسببها (RT-QUIC) 24 المقايسات. هذه قراءات قد يسمح تفسيرات أكثر شمولا من الحواجز الأنواع وهم تركيز اهتمام للتنمية المستقبلية لهذه المنهجية.

في بروتوكول المعروضة هنا، ونحن نستخدم منخفضة ملزمة، وأنابيب PCR رقيقة الجدران، لكننا قد استخدمت أيضا القياسية 1.5 مل الأنابيب في-شاكر الحرارية مجهزة لهذا النوع من الأنبوب. هناك حاجة إلى أي اختلافات أخرى لبروتوكول لاستخدام أنابيب أكبر الحجم. في تجربتنا، ومع ذلك، فقد كان لدينا المزيد بي ار بي احتياط الإنتاج والمزيد من النتائج استنساخه في أنابيب PCR منخفضة ملزم مقارنة مع 1.5 مل أنابيب. بينما تفسيرات لتحسين أداء الفحص في أنابيب PCR هي المضاربة فقط في هذا الوقت، وبناء على النتائج تشير إلى أن واجهة بين الهواء والماء هو أمر حاسم لبي ار بي fibrillization 25، فإننا نفترض أن أنابيب أصغر توفر التوتر السطحي أكثر الأمثل لبي ار بي التحويل.

ولعل الرئيس الاقتصار على استخدام الفحص CER هو في فهم ما تمثل نسب التحويل من حيث في الجسم الحي حواجز الأنواع المحددات، مثل انتفاذ المرض أو طول فترة الحضانة. في حين ينبغي أن تصبح غير معروفة حاليا، الترجمة بين في التجارب المختبرية والعوامل الحواجز القائمة بين الأنواع الجسم الحي أكثر وضوحا مع استمرار استخدام الفحص CER في اختبار الخاحواجز الأنواع IONAL بورصة طوكيو التي تم تأسيسها في الجسم الحي، وسوف تساعد على التأهل النتائج في الأنواع حيث البيانات الأحيائي غير متوفرة. ميزة للمقايسة CER مقارنة PMCA هي وجود الرقابة الداخلية لتحويل بي ار بي، وهي الركيزة الرقم الهيدروجيني 3.5، والتي يمكن تحويلها من قبل أي وكيل بورصة طوكيو. هذه السيطرة هي ذات قيمة عندما يكون غير واضح، إن وجدت، يجب أن كلاء بورصة طوكيو يسبب misfolding من مضيف الغريبة في بي ار بي C. يمكن تفسير عدم قدرة ركيزة المضيف نظرا لتضخيم وكيل TSE معين في PMCA كدليل على وجود الحواجز القائمة بين الأنواع أو قد يكون عائدا لالإخفاقات التقنية. وتشمل عيوب فحص CER مقارنة PMCA التضخيم من الدقة PRP، خطوات إضافية في إعداد الركيزة CER ولا العدوى المعروفة في الدقة PRP التي تنتجها ردود الفعل CER محدودة. ومن الجدير بالذكر أنه في دراسة سابقة، ومع ذلك، وجدنا أسفر فحص CER في نمط مماثل من الدقة PRP FOrmation كما ان من PMCA 15. النتائج المعروضة هنا يشير أيضا إلى أن الفحص CER يتوقع الحواجز الأنواع بشكل صحيح لنقل مختلف TSEs على الفئران المعملية (الشكل 3) وتشير إلى أن تشارلوت قد يكون التعرض للCWD (الشكل 4)، وذلك بالاتفاق مع تقارير تفيد بأن القطط المنزلية (فليس catus) يمكن الحصول على مرض بريون بعد CWD التجريبي التحدي 26،27. الدراسات باستخدام الفحص CER يمكن أن يكمل جهود التسلسل PRP لفهم قابلية الحياة البرية لCWD 28.

الفحص CER تمكن السريعة ومنخفضة التكلفة، وتقييم موثوق الحواجز الأنواع بورصة طوكيو في المختبر. في حين لا بديل كامل لل"المعيار الذهبي" من الأحيائي الحيواني، وفحص CER يمكن استخدام تقييما أوليا لوجود الحواجز القائمة بين الأنواع بورصة طوكيو التي قد تبرر أو تفادي مزيد من الدراسات في الحيوانات الحية. لهذا السبب، ولأن فحص يعتمد فقطعلى أنسجة المخ والتي يمكن الحصول عليها من الحيوانات غير التجريبية، وCER يتماشى مع الجهود الرامية إلى استبدال، والحد من وصقل الإجراءات التجريبية الحيوانية 29. وبالإضافة إلى تقييم الحواجز الأنواع، يمكن فحص CER أيضا توفير منصة مبسطة التي للتحقيق في آليات الحدث الأساسي تحديد البيولوجيا مرض بريون: تحويل العادي، وظيفية بي ار بي C إلى شكل تتجمع.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12% Bis-Tris SDS-PAGE gels Life Technologies NP0342
0.5 mm Zirconium oxide beads Next Advance ZROB05 Other varieties of beads are also effective
Antibodies various suppliers Select appropriate primary and secondary antibodies for immunoblot detection of PrPres from species of interest
Bead homogenizer Next Advance BBY24M
Centrifuge Beckman Coulter 369434 High speed with temperature control
Conical tubes any brand
Cotton-tipped applicator Uline S-18991
Cuphorn sonicator Heat Systems-Ultrasonics W-380 Heat Systems-Ultrasonics, Inc. is now Qsonica, LLC
Densitometry software program UVP Vision Works LS Image Acquisition and Analysis software Other programs, such as NIH ImageJ, will also work
Dounce homogenizer Kimble Chase 885300
End-over-end mixer Labnet International H5600
Ethylenediaminetetra acetic acid Boston Bioproducts P-770 Hazardous chemical: eye irritation
Guanidine hydrochloride, 8 M Thermo Fisher Scientific 24115 Hazardous chemical: acute toxicity, skin irritation, eye irritation
Heating block Fisher Scientific 11-718
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich 435570 Hazardous chemical: strong acid
Lithium dodecyl sulfate sample buffer, 4x Life Technologies NP0008 Hazardous chemical: skin & respiratory irritation, serious eye damage, flammable solid
Methanol Fisher Scientific A454-4 Hazardous chemical: acute toxicity, flammable liquid
Microcentrifuge tubes any brand
Mini-centrifuge Labnet International C1301
N-lauroyl-sarcosine (sarkosyl) Sigma-Aldrich  L-5125 Hazardous chemical: acute toxicity, skin irritation, eye damage
Nonidet P-40 Amresco M158 Hazardous chemical: skin irritation, eye damage
SDS-PAGE gel system Life Technologies NuPAGE electrophoresis system Other SDS-PAGE systems will also work
PCR tubes (low-binding) Axygen PCR-02-L-C
Pestle homogenizer Fisher Scientific 03-392-106
pH meter Sentron SI600
Polyvinyldifluoride membrane Millipore IPVH00010
Proteinase K Promega V3021 Hazardous chemical: skin & eye irritation, respiratory sensitisation, organ toxicity
Reducing agent for SDS-PAGE samples, 10x Life Technologies NP0009
Sodium chloride Fisher Scientific 7647-14-5
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich  D6750 Hazardous chemical: acute toxicity
Sodium dodecyl sulfate Thermo Fisher Scientific 28364 Hazardous chemical: acute toxicity, skin irritation, eye damage, flammable solid
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich S5881 Hazardous chemical; strong base
Syringe BD Biosciences various Use syringe size appropriate to volumes of substrate to be homogenized
Syringe needles BD Biosciences various
Thermoshaker (PCR tube shaker) Hangzhou All Sheng Instruments MS-100
Tris base Bio Basic 77-86-1 Hazardous chemical: skin, eye, respiratory irritation
Triton X-100 Integra Chemical Company T756.30.30 Hazardous chemical: acute toxicity, eye irritation
Vortexer Fisher Scientific 12-812

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Colby, D. W., Prions Prusiner, S. B. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3, (1), a006833 (2011).
  2. Hill, A. F., Collinge, J. Prion strains and species barriers. Contrib Microbiol. 11, 33-49 (2004).
  3. Scott, M., et al. Transgenic mice expressing hamster prion protein produce species-specific scrapie infectivity and amyloid plaques. Cell. 59, (5), 847-857 (1989).
  4. Prusiner, S. B., et al. Transgenetic Studies Implicate Interactions between Homologous Prp Isoforms in Scrapie Prion Replication. Cell. 63, 673-686 (1990).
  5. Telling, G. C., et al. Prion Propagation in Mice Expressing Human and Chimeric Prp Transgenes Implicates the Interaction of Cellular Prp with Another Protein. Cell. 83, 79-90 (1995).
  6. Hill, A. F., et al. The same prion strain causes vCJD and BSE. Nature. 389, (6650), 448-450 (1997).
  7. Torres, J. M., et al. Elements modulating the prion species barrier and its passage consequences. PLoS One. 9, (3), e89722 (2014).
  8. Groschup, M. H., Buschmann, A. Rodent models for prion diseases. Vet Res. 39, (4), 32 (2008).
  9. Korth, C., et al. Abbreviated incubation times for human prions in mice expressing a chimeric mouse-human prion protein transgene. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, (8), 4784-4789 (2003).
  10. Kocisko, D. A., et al. Species specificity in the cell-free conversion of prion protein to protease-resistant forms: a model for the scrapie species barrier. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, (9), 3923-3927 (1995).
  11. Raymond, G. J., et al. Evidence of a molecular barrier limiting susceptibility of humans, cattle and sheep to chronic wasting disease. EMBO J. 19, (7), 4425-4430 (2000).
  12. Fernandez-Borges, N., de Castro, J., Castilla, J. In vitro studies of the transmission barrier. Prion. 3, (4), 220-223 (2009).
  13. Zou, W. Q., Cashman, N. R. Acidic pH and detergents enhance in vitro conversion of human brain PrPC to a PrPSc-like form. J Biol Chem. 277, (46), 43942-43947 (2002).
  14. Li, L., Coulthart, M. B., Balachandran, A., Chakrabartty, A., Cashman, N. R. Species barriers for chronic wasting disease by in vitro conversion of prion protein. Biochem Biophys Res Commun. 364, (4), 796-800 (2007).
  15. Morawski, A. R., Carlson, C. M., Chang, H., Johnson, C. J. In vitro prion protein conversion suggests risk of bighorn sheep (Ovis canadensis) to transmissible spongiform encephalopathies. BMC Vet Res. 9, 157 (2013).
  16. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Separating Protein with SDS-PAGE. JoVE. Cambridge, MA. Available from: http://www.jove.com/science-education/5058/separating-protein-with-sds-page (2014).
  17. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. JoVE. Cambridge, MA. Available from: http://www.jove.com/science-education/5065/the-western-blot (2014).
  18. Chandler, R. L. Encephalopathy in mice produced by inoculation with scrapie brain material. Lancet. 1, (7191), 1378-1379 (1961).
  19. Browning, S. R., et al. Transmission of prions from mule deer and elk with chronic wasting disease to transgenic mice expressing cervid PrP. J Virol. 78, (23), 13345-13350 (2004).
  20. Hadlow, W. J., Race, R. E., Kennedy, R. C. Experimental infection of sheep and goats with transmissible mink encephalopathy virus. Can J Vet Res. 51, (1), 135-144 (1987).
  21. Rubenstein, R., et al. Immune surveillance and antigen conformation determines humoral immune response to the prion protein immunogen. J Neurovirol. 5, (4), 401-413 (1999).
  22. Castilla, J., et al. Crossing the species barrier by PrP(Sc) replication in vitro generates unique infectious prions. Cell. 134, (5), 757-768 (2008).
  23. Kubista, M., et al. The real-time polymerase chain reaction. Mol Aspects Med. 27, 95-125 (2006).
  24. Atarashi, R., Sano, K., Satoh, K., Nishida, N. Real-time quaking-induced conversion: a highly sensitive assay for prion detection. Prion. 5, (3), 150-153 (2011).
  25. Ladner-Keay, C. L., Griffith, B. J., Wishart, D. S. Shaking Alone Induces De Novo Conversion of Recombinant Prion Proteins to beta-Sheet Rich Oligomers and Fibrils. PLoS One. 9, (6), e98753 (2014).
  26. Mathiason, C. K., et al. Susceptibility of domestic cats to chronic wasting disease. J Virol. 87, (4), 1947-1956 (2013).
  27. Seelig, D. M., et al. Lesion Profiling and Subcellular Prion Localization of Cervid Chronic Wasting Disease in Domestic Cats. Vet Pathol. (2014).
  28. Stewart, P., et al. Genetic predictions of prion disease susceptibility in carnivore species based on variability of the prion gene coding region. PLoS One. 7, (12), e50623 (2012).
  29. Russell, W. M., Burch, R. I. The Principles of Humane Experimental Technique. Metheun. Methuen. (1959).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics