एक साथ संक्रामक Spongiform Encephalopathy प्रजाति बाधाओं का आकलन

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Johnson, C. J., Carlson, C. M., Morawski, A. R., Manthei, A., Cashman, N. R. Assessing Transmissible Spongiform Encephalopathy Species Barriers with an In Vitro Prion Protein Conversion Assay. J. Vis. Exp. (97), e52522, doi:10.3791/52522 (2015).

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Abstract

Introduction

संक्रामक Spongiform encephalopathies (TSEs, prion रोगों) पशुओं और मनुष्यों की एक किस्म को प्रभावित करने वाले विस्तारित ऊष्मायन समय के साथ घातक neurodegenerative रोगों का एक समूह है। TSEs के ख्यात हेतुकविज्ञानी एक संक्रामक, रोग-जुड़े में पीआरपी (पीआरपी सी) के सामान्य सेलुलर फार्म के टेम्पलेट चालित रूपांतरण द्वारा आत्म-प्रचार के लिए सक्षम है कि मेजबान prion प्रोटीन (पीआरपी) के एक misfolded isomer के शामिल है संक्रमित मेजबान एक के केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के ऊतकों में जम जाता है कि फार्म (पीआरपी त्से)। संक्रामक स्तनधारी prions आम तौर पर interspecies संचरण घटनाओं 2 सीमित "त्से प्रजातियों बाधा 'की अवधारणा को जन्म दिया है जो एक प्रजाति विशेष के तरीके में मेजबान करने वाली मेजबान से संचारित। prion प्रजातियों बाधा के जैविक निर्धारकों को अच्छी तरह से समझ नहीं रहे हैं। संक्रामक पीआरपी त्से और मेजबान पीआरपी सी सी के बीच अमीनो एसिड अनुक्रम समानताएक जोरदार रूपांतरण 3-5 जगह लेता है, लेकिन इन विवो 6,7 में मनाया सभी prion संचरण घटनाओं की व्याख्या करने के लिए अपर्याप्त रहता है कि क्या प्रभावित करते हैं।

इस प्रकार, त्से प्रजातियों बाधाओं के लक्षण वर्णन बड़े पैमाने पर पशु चुनौती के अध्ययन पर भरोसा है: दूसरे से prions के लिए एक दिया प्रजातियों से भोले जानवरों को उजागर करने और रोग शुरुआत और संचरण क्षमता के संकेतक के रूप में हमले की दर के परिणामस्वरूप ऊष्मायन समय मापने। Heterologous प्रजातियों से पीआरपी सी व्यक्त चूहे भी अध्ययन 8 के इस प्रकार के लिए उपयोग किया जाता है। ट्रांसजेनिक माउस उत्पादन और दीर्घ prion bioassays, साथ ही पशु उपयोग की नैतिक विचारों के साथ जुड़े लागत, त्से प्रजातियों बाधाओं की प्रायोगिक जांच करने के लिए बाधाएं हैं। TSEs करने के लिए मानव प्रजाति बाधा का आकलन मानव पीआरपी सी व्यक्त करने के लिए इंजीनियर चूहों पर निर्भर करता है। इन चूहों मानव TSEs या टी के लिए संशोधन का शिकार करने के लिए लंबे समय तक ऊष्मायन अवधि की आवश्यकता होती हैतेजी से रोग शुरुआत 9 के लिए वह मानव पीआरपी सी अणु। इन चूहों में गैर मानव TSEs के लिए ऊष्मायन अवधि चुनौतीपूर्ण नकारात्मक परिणामों की व्याख्या कर रही सामान्य माउस उम्र से परे का विस्तार कर सकते हैं। गैर मानव प्राइमेट भी मानव प्रजाति बाधाओं के अध्ययन के लिए परदे के पीछे के रूप में इस्तेमाल किया गया है, लेकिन यह मानव की मेजबानी में आय के रूप में इन अध्ययनों ठीक रोग पुनरावृत्ति नहीं हो सकता पशु प्रयोग और गैर मानव प्राइमेट के अन्य प्रकार के रूप में एक ही चुनौतियों से भरा है।

पशु bioassays एक त्से को एक प्रजाति की संवेदनशीलता को मापने के लिए 'सोने के मानक' विधि बने हुए हैं, लेकिन बाधाओं, लागत और इन लाइव जानवरों के अध्ययन की नैतिकता विकल्प में जांच के लिए मजबूर कर दिया है। पीआरपी त्से द्वारा वरीयता प्राप्त जब एक proteinase कश्मीर (पीके) प्रतिरोधी राज्य (पीआरपी रिस) के लिए मेजबान पीआरपी सी के रूपांतरण का आकलन के आधार पर इन विट्रो assays, के एक नंबर, विकसित और त्से सपा जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया हैecies बाधाओं को 10-12। इन विट्रो assays के उदाहरण सेल मुक्त रूपांतरण assays के, प्रोटीन चक्रीय प्रवर्धन (PMCA) misfolding, और रूपांतरण दक्षता अनुपात (सीईआर) परख 10-14 शामिल हैं। इन assays में से कोई भी प्राकृतिक संक्रमण के बाद प्रजातियों बाधाओं में शामिल खाता परिधीय कारकों में रखना है, सभी TSEs के लिए संभावित रूप से अतिसंवेदनशील मेजबानों की पहचान के लिए उपयोगी हो सकता है।

यहाँ हम सामान्य मस्तिष्क homogenates से निकाली गई दो विकृत पीआरपी सी substrates के बेंच शीर्ष prion रूपांतरण प्रतिक्रियाओं में उपयोग किया जाता है, जिसमें सीईआर परख के लिए प्रोटोकॉल, चित्रा (1) 13 उपस्थित थे। 7.4 पीएच पर विकृत सब्सट्रेट में पीआरपी सी ही एक प्रजाति बाधा 14 के अभाव में प्रतिक्रिया में वरीयता प्राप्त पीआरपी त्से द्वारा पीआरपी रिस करने के लिए परिवर्तित किया जा सकता है। इसके विपरीत, पीएच 3.5 पर अन्य सब्सट्रेट में पीआरपी सी का विकृतीकरण यह पीआरपी रिस निम्नलिखित ऊष्मायन के लिए परिवर्तित किया जा करने की अनुमति देताऔर किसी भी प्रजाति से पीआरपी त्से साथ रूपांतरण के लिए एक नियंत्रण के रूप में कार्य करता है। पीएच 3.5 सब्सट्रेट की है कि पीएच 7.4 सब्सट्रेट सापेक्ष में पीआरपी रिस को पीआरपी सी के रूपांतरण का अनुपात प्रजातियों बाधा का एक उपाय प्रदान करता है। हम सीईआर परख विभिन्न TSEs के लिए प्रयोगशाला के चूहों की प्रजाति बाधाओं जाना जाता भविष्यवाणी और जीर्ण बर्बाद कर रोग (CWD) और अन्य TSEs से 14 bighorn भेड़ सहित कई स्तनधारी प्रजातियों, की प्रजातियों में बाधा की भविष्यवाणी करने के प्रयासों में परख का इस्तेमाल किया है कि मिल गया है 15। उपयोगी इस पद्धति मिलेगा त्से प्रजातियों अवरोध या पीआरपी सी -to-पीआरपी रिस रूपांतरण के आकलन की तेजी से जांच के लिए अनुमति देता है एक उपकरण में रुचि रखते जांचकर्ताओं।

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Protocol

यूएसजीएस राष्ट्रीय वन्यजीव स्वास्थ्य केंद्र में आयोजित पशु काम प्रयोगशाला पशु कल्याण के दिशा-निर्देशों के एनआईएच कार्यालय के अनुसार और संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति प्रोटोकॉल # EP080716 के तहत किया गया था। शिकारी काटा जानवरों से ऊतकों विस्कॉन्सिन या प्राकृतिक संसाधनों के मिशिगन विभागों से उपहार थे।

1. समाधान तैयारी

नोट: नीचे सूचीबद्ध समाधान नीचे धारा 2 में सीईआर परख सब्सट्रेट की तैयारी के लिए आवश्यक हैं। उच्च एकाग्रता स्टॉक समाधान से इन समाधानों में से प्रत्येक को तैयार है; शेयर समाधान के लिए सिफारिश की सांद्रता सूचीबद्ध प्रत्येक संबंधित रासायनिक नाम के बाद कोष्ठक में दी जाएगी। इस्तेमाल किया जब तक 4 डिग्री सेल्सियस पर सब्सट्रेट तैयारी और दुकान पर ताजा सभी समाधान तैयार करें।

  1. 100 मिमी एस: lysis बफर के लिए, 10 मिमी Tris में, पीएच 7.5 (1 एम Tris, पीएच 7.5 शेयर समाधान अनुशंसित) निम्न में से एक समाधान तैयारबदनामी क्लोराइड (NaCl, 1 एम शेयर समाधान), 10 मिमी ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA, 500 मिमी EDTA, पीएच 8.0 शेयर समाधान), 0.5% एनपी-40 (10% शेयर समाधान), 0.5% deoxycholate (डॉक्टर, 10% शेयर समाधान )।
  2. रूपांतरण बफर के लिए, 0.05% सोडियम dodecyl सल्फेट (एसडीएस, 10% शेयर समाधान) और 0.5% ट्राइटन X-100 एक फॉस्फेट बफर खारा में (10% शेयर समाधान) (पीबीएस, 10, 7.4 पीएच शेयर समाधान) का एक समाधान तैयार है।
  3. Chaotropic समाधान के लिए, guanidine हाइड्रोक्लोराइड 1x पीबीएस में (GdnHCl, 8 एम स्टॉक) (10x शेयर समाधान) के दो 3 एम समाधान तैयार करते हैं। केंद्रित हाइड्रोक्लोरिक एसिड (एचसीएल) का उपयोग कर 3.5 ± 0.05 के समाधान के लिए एक के पीएच को समायोजित करें। दूसरा समाधान के पीएच 7.4 पीएच ± 0.05 पर बनी हुई है कि जाँच करें और केंद्रित एचसीएल या सोडियम हाइड्रोक्साइड (NaOH) यदि आवश्यक हो तो का उपयोग कर समायोजित करें।

2. सीईआर परख सब्सट्रेट जोड़े को तैयार

  1. ब्याज की प्रजातियों से स्वस्थ, गैर-त्से-संक्रमित मस्तिष्क के ऊतकों प्राप्त करें और एक 10% वजन-प्रति-मात्रा को तैयारनिम्न विधियों में से किसी का उपयोग lysis बफर में homogenate (w / v): Dounce, मनका-चक्की, या मोर्टार और मूसल homogenization के। इसके अलावा, सिरिंज व सुई homogenization के लिए उन्हें subjecting सब्सट्रेट aspirated और एक 27 जी सिरिंज सुई के माध्यम से आसानी से निष्कासित किया जा सकता है जब तक बढ़ती जा रही गेज की सुइयों का उपयोग करके homogenates जिसके परिणामस्वरूप परिष्कृत करें।
    1. कृन्तकों और अन्य छोटे स्तनधारियों से तैयार substrates के लिए, पूरे मस्तिष्क (ओं) homogenize; बड़े स्तनधारियों से तैयार substrates के लिए, homogenates तैयार करने के लिए OBEX (brainstem) ऊतक का उपयोग करें। मस्तिष्क homogenate की मात्रा का चयन, कदम 2.6 में प्रोटीन तेज़ी के लिए इस्तेमाल किया सेंट्रीफ्यूज की क्षमता का कोई 50% से अधिक तैयार करते हैं।
    2. अधिग्रहीत मस्तिष्क के ऊतकों की गुणवत्ता संदिग्ध है, तो एसडीएस पृष्ठ 16 और immunoblot 17 सब्सट्रेट करने के लिए पूर्व तैयारी से पीआरपी सी के स्तर का आकलन करें।
  2. अलग लेबल वाले प्लास्टिक शंक्वाकार ट्यूब में दो बराबर मात्रा में मस्तिष्क homogenate फूट डालो। (GdnHCl जोड़ेंमस्तिष्क homogenate के लिए एक मात्रा अनुपात: पीएच 3.5 या एक एक में प्रत्येक ट्यूब 7.4 या तो एक पीबीएस में 3 एम समाधान)।
  3. दो समाधान का पीएच मान की जाँच करें। केंद्रित एचसीएल का उपयोग कर 0.05 ± पीएच पीएच 3.5 सब्सट्रेट का पीएच को समायोजित करें। अन्य सब्सट्रेट का पीएच 7.4 पीएच ± 0.05 पर रहता है सुनिश्चित करें और एचसीएल या NaOH के साथ यदि आवश्यक हो तो जरूरत के रूप में पीएच को समायोजित करें। एसिड या आधार के विवेकपूर्ण अलावा द्वारा पीएच मान overshooting से बचें।
  4. 5 घंटे के लिए कमरे के तापमान (आरटी) में एक अंत के ऊपर अंत मिक्सर पर समाधान घुमाएँ।
  5. प्रत्येक शंक्वाकार ट्यूब में सब्सट्रेट समाधान करने के लिए मेथनॉल के चार खंडों जोड़कर प्रोटीन वेग, भंवर मिश्रण अच्छी तरह से, और 16-18 घंटे के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 13,000 × छ पर centrifugation द्वारा तलछट के नमूनों। ध्यान से छानना और supernatants त्यागें और मेथनॉल छर्रों से लुप्त हो जाना करने की अनुमति। ट्यूब के अंदर से चिपके रहे मेथनॉल को अवशोषित करने में सहायता करने के लिए कपास इत्तला दे दी applicators का प्रयोग करें। छर्रों over-डॉ करने की अनुमति न देंY और मेथनॉल अब नहीं दिख रहा है एक बार, अगले कदम के लिए आगे बढ़ें।
  7. रूपांतरण बफर में Resuspend प्रोटीन छर्रों। कदम 2.2 में प्रत्येक ट्यूब में तिरस्कृत मस्तिष्क homogenate प्रारंभिक सामग्री की राशि के बराबर रूपांतरण बफर की मात्रा का प्रयोग करें।
    नोट: यह रूपांतरण बफर दोनों पीएच 3.5 और 7.4 इलाज सब्सट्रेट तैयारी से प्रोटीन छर्रों resuspend करने के लिए (डिटर्जेंट के निम्न स्तर और एक शारीरिक पीएच शामिल है) से ऊपर 1.2 चरण में परिभाषित समाधान है कि प्रयोग किया महत्वपूर्ण है।
  8. एक cuphorn sonicator में संक्षेप में sonicate सब्सट्रेट समाधान (30% अधिक से अधिक बिजली ~ में 10 सेकंड), 0.5 में विभाज्य - लेबल वाले 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में 1.0 मिलीलीटर मात्रा। प्रत्येक सब्सट्रेट के एक विभाज्य पर एक गुणवत्ता नियंत्रण immunoblot (कदम 2.9) प्रदर्शन करते हैं। सीईआर परख (धारा 4) प्रदर्शन करने के लिए तैयार है जब तक -80 डिग्री सेल्सियस पर अन्य aliquots के स्टोर।
  9. का उपयोग करने से पहले सीईआर सब्सट्रेट जोड़े (चित्रा 2) पर गुणवत्ता नियंत्रण प्रदर्शन करते हैं। ये कदम सीईआर substrates के provid यह सुनिश्चित करेंगे किरूपांतरण के अध्ययन में ई इष्टतम परिणाम है।
    1. दो substrates में पीआरपी सी के तुलनीय मात्रा में सुनिश्चित करें। 10-25 एसडीएस पृष्ठ 16 से प्रत्येक सब्सट्रेट के μl और 17 immunoblotting में पीआरपी के स्तर की तुलना करें। 7.4 और 3.5 substrates के एक दूसरे का 10% ~ के भीतर हैं पीएच में प्रोटीन का स्तर, सब्सट्रेट जोड़े सीईआर पढ़ाई में उपयोग के लिए उपयुक्त हैं।
      नोट: पीआरपी immunoblots व्यापक पीआरपी सी गिरावट के सबूत दिखाने के लिए नहीं करना चाहिए। पीआरपी immunoreactivity मुख्य रूप से> 20 केडीए होना चाहिए। इस आणविक द्रव्यमान की तुलना में कम बैंड गिरावट उत्पादों हो सकता है। बैंडिंग पैटर्न सब्सट्रेट जोड़े के बीच लगभग बराबर होना चाहिए।
    2. दोनों को substrates में पीआरपी सी संवेदनशील पीके रूप में होना चाहिए, 100 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता में पी के साथ एक सब्सट्रेट के 10-25 μl इलाज के लिए और थर्मो-प्रकार के बरतन में 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 1000 rpm पर नमूने को पचाने। एसडीएस पृष्ठ 16 और 17 immunoblotting द्वारा किसी भी शेष पीआरपी संकेत का आकलन करें।पीआरपी रिस साथ substrates सीईआर के अध्ययन में इस्तेमाल के लिए उपयुक्त नहीं हैं।

3. त्से एजेंट बीज तैयार करें

  1. ब्याज की प्रजातियों में से त्से-संक्रमित मस्तिष्क के ऊतकों प्राप्त करें और 1x पीबीएस 7.4 पीएच में homogenate से ऊपर 2.1 कदम में सूचीबद्ध तरीकों का उपयोग कर (w / v) एक 10% तैयार करते हैं।
    नोट: बीज भी केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के बाहर अन्य त्से-संक्रमित ऊतकों से उत्पादन किया जा सकता है, तथापि, त्से-संक्रमित परिधि के ऊतकों से निकाली गई बीजों से मस्तिष्क व्युत्पन्न substrates के रूपांतरण की क्षमता अभी तक प्रयोगात्मक प्रकाशित साहित्य में मूल्यांकन नहीं किया गया है।
  2. 100 में homogenate (ओं) जिसके परिणामस्वरूप विभाज्य - तैयार है जब तक -80 डिग्री सेल्सियस पर 0.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में 300 μl मात्रा और दुकान सीईआर परख करने के लिए।

4. सीईआर परख

नोट: सीईआर परख एक प्रजाति से ("बीज" में प्रदान की) पीआरपी त्से की एक अपेक्षाकृत छोटी राशि के अलावा शामिलआंशिक रूप से पीएच 3.5 या 7.4 या तो विकृत कर दिया गया है कि अन्य प्रजातियों से (असंक्रमित मस्तिष्क "सब्सट्रेट" में प्रदान की) पीआरपी सी के एक रिश्तेदार अतिरिक्त में। एक विस्तारित मिलाते ऊष्मायन अवधि के बाद, प्रत्येक प्रतिक्रिया में पीआरपी त्से द्वारा पीआरपी सी के टेम्पलेट चालित रूपांतरण पीआरपी रिस शेष पीके पाचन और immunoblot पता लगाने के बाद की densitometric संकेत द्वारा मूल्यांकन किया है। पहले से पीएच 3.5 बनाम 7.4 पर विकृत substrates के में पीआरपी रिस स्तर की तुलना प्रजातियों बाधा का एक उपाय प्रदान करता है। इस परख प्रक्रिया के एक प्रयोगात्मक सिंहावलोकन चित्र 1 में प्रदान की जाती है।

  1. धीरे धीरे असंक्रमित सीईआर सब्सट्रेट जोड़े पिघलना बर्फ की एक बिस्तर (लगभग 1 घंटा पिघलना समय) के शीर्ष पर उन्हें रखने के द्वारा और त्से-संक्रमित बीज समाधान (परख पहले दोनों पीएच 3.5 और 7.4 पर विकृत substrates के बराबर मात्रा की आवश्यकता है)।
  2. पूरी तरह thawed एक बार, महाप्राण और फिर एक के माध्यम से प्रत्येक सब्सट्रेट समाधान निष्कासित27 जी सिरिंज सुई कई बार फिर से इसे homogenize करने के लिए। संक्षेप में 30% अधिक से अधिक बिजली ~ में 10 सेकंड के लिए प्रत्येक त्से-संक्रमित बीज समाधान sonicate। रूपांतरण प्रतिक्रियाओं की तैयारी समय बर्फ पर सभी समाधान रखें।
  3. त्से एजेंट प्रति लेबल 5 व्यक्ति कम बंधन, पतली दीवारों पीसीआर ट्यूब का परीक्षण किया जा रहा है।
  4. पीएच 3.5 पर तैयार पीएच 7.4 और (ख) सीईआर सब्सट्रेट पर तैयार (क) सीईआर सब्सट्रेट के 95 μl 10% त्से-संक्रमित बीज समाधान के 5 μl जोड़कर इन ट्यूबों में रूपांतरण प्रतिक्रियाओं तैयार करें।
    1. प्रत्येक प्रयोगात्मक नमूने के लिए, जैसा कि पहले दोनों पीएच 3.5 और 7.4 पर विकृत सीईआर सब्सट्रेट जोड़े में समानांतर प्रतिक्रियाओं तैयार करते हैं।
    2. अनुभवजन्य दृढ़ संकल्प के माध्यम से असंक्रमित मस्तिष्क सब्सट्रेट करने के लिए त्से एजेंट बीज के अनुपात का अनुकूलन। आम बीज: नियोजित सब्सट्रेट अनुपात 100 μl की कुल प्रतिक्रिया मात्रा को बनाए रखने और 1:99 μl, 2:98 μl और 5:95 μl शामिल हैं। सबसे अनुप्रयोगों के लिए, 5:95 μl बीज: सब्सट्रेट मात्रा अनुपात उचित है और वें में क्या प्रस्तुत किया जाता है हैप्रोटोकॉल है।
  5. इस प्रकार के रूप त्से एजेंट प्रति तीन नियंत्रण के नमूने का परीक्षण किया जा रहा है तैयार: (क) इनपुट पीआरपी Res के लिए एक नियंत्रण के रूप में 95 μl रूपांतरण बफर करने के लिए 10% त्से-संक्रमित बीज समाधान के 5 μl जोड़ने; (ख) पीएच 3.5 और गैर विशिष्ट, गैर templated रूपांतरण के लिए नियंत्रण के रूप में (ग) 7.4 पीएच पर तैयार 95 μl सब्सट्रेट करने के लिए 5 μl रूपांतरण बफर जोड़ें।
  6. संक्षेप में अच्छी तरह से बीज और सब्सट्रेट मिश्रण करने के लिए अपने बंद पीसीआर ट्यूब में प्रत्येक नमूने भंवर। पीसीआर ट्यूब ढक्कन में फंस प्रतिक्रिया मिश्रण के किसी भी मात्रा को हटाने के लिए एक कम गति बेंच शीर्ष मिनी अपकेंद्रित्र में एक क्षणिक नाड़ी के साथ पालन करें।
  7. पीसीआर ट्यूबों को स्वीकार करने के लिए सुसज्जित एक बेंच शीर्ष थर्मो-प्रकार के बरतन में अलग-अलग लेबल पीसीआर नलियों में लोड नमूने हैं। 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 1000 rpm पर नमूने हिलाएँ।
  8. निम्न (डब्ल्यू / वी) और पी 100 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता के लिए 2% की एक अंतिम एकाग्रता के लिए sarkosyl जोड़ने, मिलाते हुए। डाइजेस्ट नमूने थर्मो-प्रकार के बरतन में 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 1000 rpm पर।
    एनOTE: पीआरपी सी के पी के पाचन में नमूने के बाद रूपांतरण एड्स के sarkosyl के अलावा। गैरवरीय नमूने (4.5 चरण) में झूठी सकारात्मक संकेतों लगभग sarkosyl के अलावा द्वारा समाप्त हो जाते हैं।
  9. 17 immunoblotting द्वारा पीछा एसडीएस पृष्ठ 16 से प्रत्येक नमूने में शेष पीआरपी रिस 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस के लिए एसडीएस पृष्ठ नमूना बफर, गर्मी नमूने जोड़ें और हल करने के लिए।
    नोट: नमूना बफर और हीटिंग के अलावा, नमूने तुरंत कार्रवाई की जा सकती है या नमूने -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत जा सकता है या -80 डिग्री सेल्सियस से पहले immunoblotting करने के लिए। यहाँ प्रस्तुत सभी डेटा NOVEX NuPAGE जेल और हस्तांतरण प्रणाली का उपयोग करते हुए उत्पन्न किया गया। सीईआर परख से अलग-अलग नमूने नमूना बफर और निर्माता के निर्देशों के अनुसार एजेंट को कम करने के साथ इलाज किया गया। नमूने बाद में 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर गरम थे और प्रत्येक नमूने के 30 μl एक 12% बीआईएस Tris मिल में बना हुआ जैल में लोड किया गया था।
  10. एक उपाय के रूप में रूपांतरण दक्षता अनुपात (सीईआर) की गणनाप्रजातियों बाधा की। Densitometry 17 से पीआरपी रेस के उपाय स्तर और पीएच 3.5 नमूना के उस से 7.4 पीएच नमूना की कुल घनत्व विभाजित करते हैं। एक प्रतिशत का उत्पादन करने के लिए 100 से गुणा करें।
  11. एक दिया त्से एजेंट के साथ एक प्रजाति के लिए एक मतलब सीईआर ± मानक विचलन उत्पन्न करने के लिए स्वतंत्र प्रयोगात्मक प्रतिकृति से डेटा संकलित करें।

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Representative Results

सीईआर परख के सफल प्रयोग रूपांतरण प्रतिक्रियाओं में इस्तेमाल किया सब्सट्रेट जोड़े की गुणवत्ता पर काफी हद तक निर्भर है। इस कारण से, सीईआर सब्सट्रेट जोड़े तैयार करने के लिए प्रक्रियाओं के बाद, एक गुणवत्ता नियंत्रण immunoblot (चित्रा 2) किया जाना चाहिए। दोनों substrates के लिए, परख immunoblotting द्वारा 10-25 μl। पीआरपी सी प्रत्येक सब्सट्रेट में आसानी से detectable होना चाहिए और पीआरपी सी स्तरों दोनों के बीच लगभग एक ही होना चाहिए। Immunoreactivity 20 केडीए से ऊपर मुख्य रूप से दिखाई देगा, लेकिन छोटे बैंड भी स्पष्ट हो सकता है। हमारे अनुभव में, छोटे बैंड की उपस्थिति प्रजातियों निर्भर है। कम आणविक भार उत्पादों मनाया जाता है, तो उनकी मौजूदगी दोनों सब्सट्रेट जोड़े में पुष्टि की जानी चाहिए।

ऐसा लगता है कि सीईआर substrates के पी के साथ substrates के इलाज से (चित्रा 2) अंतर्जात पीआरपी रिस से मुक्त कर रहे हैं सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है। पीआरपी रिस मौजूद है, तो जानवर subst के लिए इस्तेमाल कियादर तैयारी त्से-संक्रमित या subclinically-संक्रमित किया गया है हो सकता है। वैकल्पिक रूप से, सब्सट्रेट में पीआरपी सी विकृतीकरण या वर्षा की प्रक्रिया के दौरान एक पीके प्रतिरोधी राज्य के लिए misfolded हो सकता है। कारण से स्वतंत्र, पीआरपी रिस युक्त सीईआर सब्सट्रेट रूपांतरण परख में उपयोग के लिए स्वीकार्य नहीं है।

प्रयोगशाला के चूहों त्से अनुसंधान के क्षेत्र में सबसे अक्सर इस्तेमाल प्रायोगिक पशुओं में से एक हैं; जैसे, सबसे TSEs के लिए अपनी संवेदनशीलता सीईआर परख की निष्ठा का परीक्षण करने के लिए। चित्रा 3 ए (CD1 तनाव) पीआरपी को सब्सट्रेट माउस से पीआरपी सी के सीईआर परख रूपांतरण के परिणाम प्रस्तुत जिसके खिलाफ एक Vivo में बेंचमार्क उपलब्ध कराने, 8 अच्छी तरह से विशेषता है माउस passaged scrapie की आरएमएल तनाव) एक से रिस, एक एजेंट माउस मेजबान 18, 2) घरेलू भेड़ शास्त्रीय scrapie, एक लंबी ऊष्मायन अवधि 18 निम्नलिखित चूहों को हस्तांतरित कर सकते हैं कि एक एजेंट, और 3) whi के लिए अनुकूलितते पूंछ हिरण (Odocoileus virginianus) CWD और हम्सटर-passaged scrapie की 263K तनाव, एजेंटों के लिए न्यूनतम या नहीं 19,20 अतिसंवेदनशील होते हैं जो चूहों। जिसके परिणामस्वरूप पीआरपी रिस स्तरों पीआरपी रिस पीएच 3.5 पर विकृत और एक त्से एजेंट के साथ वरीयता प्राप्त सभी substrates में पाया गया था, जबकि माउस substrates के 7.4 पीएच पर विकृत और विभिन्न त्से एजेंटों के साथ वरीयता प्राप्त भर में चर रहे थे। पीएच 7.4 और 3.5 के substrates में पीआरपी रिस स्तर की तुलना रूपांतरण अनुपात स्वतंत्र रूप से कम से कम तीन बार की गणना की और 3B चित्रा में दिखाए जाते हैं एसडी ± साधन थे। आरएमएल द्वारा वरीयता प्राप्त प्रतिक्रियाओं के लिए, पीएच 7.4 और 3.5 substrates के बीच रूपांतरण अनुपात लगभग 100% थे। Scrapie द्वारा वरीयता प्राप्त उन लोगों के लिए, 7.4 पीएच सब्सट्रेट में रूपांतरण पीएच 3.5 सब्सट्रेट में है कि लगभग 75% थी। CWD या 7.4 पीएच सब्सट्रेट के 263K प्रेरित रूपांतरण कम से कम था। विचरण का एक एक तरह से विश्लेषण आरएमएल और एस के रूपांतरण के अनुपात में एक अंतर भेद नहीं कर सकाcrapie या CWD और 263K, आरएमएल और scrapie की हालांकि रूपांतरण अनुपात CWD और 263K के उन लोगों से काफी अलग थे।

सीईआर परख मानव ऊतकों के साथ या bioassays भी चुनौती दे या नहीं नैतिक और ट्रांसजेनिक माउस उत्पादन वांछित नहीं है जहां जानवरों की प्रजातियों के साथ प्रयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। हम CWD करने के लिए विभिन्न वन्यजीव प्रजातियों की संवेदनशीलता को चिह्नित करने के लिए इस परख का उपयोग किया गया है। इस परख के उपयोग का एक उदाहरण के रूप में, हम चित्रा 4 में कुछ प्रारंभिक परिणाम प्रस्तुत करते हैं। शिकारी फंस Bobcats (लिंक्स Rufus) से दिमाग पाए गए अभी भी पीआरपी सी और पीआरपी टूटने उत्पादों की detectable स्तर को रोकने के लिए है कि इन सुझाव, व्यापक नहीं थे ऊतकों सीईआर सब्सट्रेट (चित्रा -4 ए) के लिए एक स्वीकार्य स्रोत हो सकता है। बनबिलाव मस्तिष्क से उत्पन्न सब्सट्रेट जोड़े एक उपयुक्त आणविक वजन का पीआरपी immunoreactivity दिखाया और अंतर्जात पीआरपी रिस शामिल नहीं किया था (4B चित्रा)। दो अलग-अलग जानवरों से उत्पन्न Bobcat सीईआर सब्सट्रेट जोड़े CWD एजेंट चित्रा 3 में वर्णित माउस सीईआर परख में इस्तेमाल एक ही सफेद पूंछ हिरण के साथ incubated रहे थे, हम पीआरपी रिस के स्तर पीएच पर तैयार substrates के लिए की तुलना में था 7.4 पीएच पर तैयार substrates के पाया CWD द्वारा रूपांतरण के लिए बनबिलाव पीआरपी सी की एक न्यूनतम प्रजातियों बाधा का संकेत 3.5 (चित्रा 4C),। एक ही CWD द्वारा सफेद पूंछ हिरण पीआरपी सी के रूपांतरण के लिए सीईआर एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में, यहाँ Bobcat पीआरपी सी में परिवर्तित किया जाता अलग-थलग, पहले Morawski एट अल में 95.2 ± 18.4% के रूप में सूचना मिली थी। (2013) 15।

चित्र 1
चित्रा 1:। सीईआर परख की प्रायोगिक सिंहावलोकन दो परख substrates के आंशिक रूप से मस्तिष्क के ऊतकों डब्ल्यू संक्रमित गैर prion में पीआरपी सी denaturing द्वारा तैयार कर रहे हैंपीएच 3.5 या 7.4 पीएच या तो ith chaotropic समाधान। Substrates ब्याज की prion एजेंट से पीआरपी त्से के साथ वरीयता प्राप्त कर रहे हैं और प्रयोगात्मक नमूने दोनों पीएच 3.5 और 7.4 के substrates में पीआरपी त्से रूपांतरण के लिए पीआरपी सी अनुमति देने के लिए झटकों के साथ 24 घंटा ऊष्मायन के अधीन हैं। ऊष्मायन के बाद, रूपांतरण एसडीएस पृष्ठ और immunoblotting के द्वारा मूल्यांकन किया है। सिग्नल घनत्व densitometry द्वारा पढ़ा जाता है और सीईआर प्रत्येक प्रयोगात्मक नमूना के लिए पीएच 3.5 संकेत घनत्व को 7.4 पीएच के अनुपात से गणना की है।

चित्र 2
चित्रा 2: सीईआर substrates पर गुणवत्ता नियंत्रण। सीईआर परख में उनके उपयोग करने से पहले, माउस substrates के पीएच 7.4 या 3.5 या तो कम से तैयार (ए) प्रत्येक सब्सट्रेट जोड़ी की पीआरपी सी सामग्री का आकलन करने के लिए पी के इलाज के 1) अनुपस्थिति में immunoblot assayed द्वारा किया जाता है (पीआरपी सी स्तर के बीच बराबर होना चाहिए पीएच 7.4 और 3.5 substra TES सीईआर परख में उपयोग) और 2) पीके की उपस्थिति (100 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल) के इलाज के लिए के लिए परीक्षण करने के लिए पहले से मौजूद substrates (पूर्व मौजूदा पीआरपी रेस में उपयोग के लिए उपयुक्त नहीं हैं कि प्रदर्शन किसी भी substrates के तैयार करने के लिए प्रयोग किया जाता ऊतकों में पीआरपी रिस सीईआर परख)। (बी) के रूपांतरण परख के दौरान गैर विशिष्ट पीआरपी रिस गठन के लिए परीक्षण करने के लिए, पीएच 7.4 या 3.5 या तो तैयार माउस पीआरपी सी substrates के 37 डिग्री सेल्सियस, 1000 rpm पर 24 घंटे के लिए हिल, रूपांतरण बफर के साथ वरीयता प्राप्त कर रहे हैं और बाद में पी के इलाज (100 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल) और (दाएं दो लेन) immunoblotting द्वारा पीआरपी रिस के लिए assayed। गैर-हिल, गैर-पी के इलाज माउस substrates के परख प्रतिक्रियाओं (बाएं दो लेन) में कुल पीआरपी सी सामग्री का प्रतिनिधित्व करते हैं। (बी) के लिए, अप्रासंगिक गलियों स्पष्टता के लिए फसली किया गया है, लेकिन प्रत्येक immunoblot पैनल में एक ही जेल, झिल्ली और जोखिम से निकला है। सभी पैनलों में Immunoblots एसएएफ 83 मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का इस्तेमाल किया।

"> चित्र तीन
चित्रा 3:। प्रयोगशाला माउस सब्सट्रेट का उपयोग सीईआर परख (ए) माउस सीईआर परख सब्सट्रेट पीएच 7.4 या 3.5 आरएमएल माउस अनुकूलित scrapie, घरेलू भेड़ शास्त्रीय scrapie, सफेद पूंछ हिरण जीर्ण बर्बाद कर रोग के साथ incubated किया गया था (CWD) या 263K या तो तैयार सीईआर परख में हम्सटर अनुकूलित scrapie का तनाव। नियंत्रण के नमूने (लेबल "कोई नहीं") ही संक्रामक एजेंट के बराबर राशि और कोई माउस सब्सट्रेट निहित। नमूने प्रत्येक लेन नीचे प्रदर्शित कर रहे हैं प्रत्येक नमूने के लिए मोनोक्लोनल एंटीबॉडी सैफ 83. कच्चे densitometric मूल्यों के साथ immunoblot द्वारा पी-प्रतिरोधी prion प्रोटीन (पीआरपी रिस) की उपस्थिति के लिए विश्लेषण किया गया। (बी) के बार ग्राफ औसत अनुपात का संकेत (± मानक विचलन) पीएच 7.4 और प्रत्येक संक्रामक एजेंट के लिए 3.5 माउस substrates के बीच कम से कम तीन स्वतंत्र परख रन पर आधारित है। छोटे अक्षरों सांख्यिकीय करने के लिए देखेंसमरूप कैंपेन्स (Tukey-क्रेमर न्यूनतम महत्व मतभेद विधि के साथ विचरण के विश्लेषण; पी <0.05)। यह आंकड़ा Morawski एट अल। 2013 में 15 से संशोधित किया गया है।

चित्रा 4
चित्रा 4: सीईआर परख के नमूने का उपयोग CWD को Bobcat संवेदनशीलता की जांच के लिए बनबिलाव मस्तिष्क homogenate (ए) और पीआरपी सी मौजूदा आकलन करने के लिए पी के अभाव और उपस्थिति में (100 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल) immunoblotting द्वारा परीक्षण किया गया था सीईआर परख सब्सट्रेट (बी)। स्तरों और पूर्व मौजूदा पीआरपी रिस की उपस्थिति, क्रमशः। (सी) बनबिलाव substrates के रूपांतरण बफर के साथ वरीयता प्राप्त और गैर विशिष्ट पीआरपी रिस गठन का आकलन करने के लिए सीईआर परख में assayed गया (दो गलियों को छोड़ दिया)। गैर-हिल, गैर पीके इलाज किया Bobcat substrates के परख प्रतिक्रियाओं (सही दो लेन) में कुल पीआरपी सी सामग्री का प्रतिनिधित्व करते हैं।या तो पीएच 7.4 या 3.5 पर तैयार (डी) बनबिलाव सब्सट्रेट सीईआर परख का उपयोग कर सफेद पूंछ हिरण CWD साथ incubated किया गया था। नियंत्रण नमूना (लेबल "कोई नहीं") CWD एजेंट के बराबर राशि, लेकिन कोई बनबिलाव सब्सट्रेट निहित। प्रत्येक नमूने के लिए कच्चे densitometric मूल्यों प्रत्येक लेन नीचे प्रदर्शित कर रहे हैं। सभी पैनलों बिल्ली के समान prion प्रोटीन 21 के साथ प्रतिक्रिया करता है, जो इस्तेमाल किया मोनोक्लोनल एंटीबॉडी 3F4 में Immunoblots।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल के सफल समापन के लिए, ध्यान सब्सट्रेट तैयारी (कदम 2.1.2) और रूपांतरण प्रतिक्रियाओं (कदम 4.4.2) के लिए अनुपात सब्सट्रेट करने के लिए बीज के लिए इस्तेमाल किया असंक्रमित मस्तिष्क के ऊतकों में पीआरपी सी स्तर के लिए भुगतान किया जाना चाहिए। हमारे अनुभव में, दिमाग में लंबे समय पीआरपी सी immunoblotting (चित्रा 4) से मौजूद है, के रूप में एक पर्याप्त अवधि पोस्टमार्टम के बाद सीईआर सब्सट्रेट के रूप में उपयोग के लिए निकाला जा सकता है। वास्तव में, कुछ स्वलयन सीईआर अध्ययन के लिए इस्तेमाल Bobcats के दिमाग में मनाया गया। फिर भी, इन दिमाग से निकाली गई substrates के ऊष्मायन अभी भी पीआरपी रिस के गठन में हुई। हम भाग में, सीईआर परख की मजबूती कई प्रोटिएजों निष्क्रिय जाएगा जो 1.5 एम GdnHCl में सीईआर substrates के विकृतीकरण, से ली गई है, अटकलें हैं कि।

अनुपात सब्सट्रेट करने के लिए बीज immunoblotting के द्वारा स्वीकार्य पीआरपी रिस संकेत प्राप्त करने के लिए empirically निर्धारित किया जाना पड़ सकता है। बहुत अधिक या बहुत एलसब्सट्रेट अनुपात: ittle पीआरपी रिस सब्सट्रेट और असंगत रूपांतरण अनुपात बीज का अनुकूलन करने के लिए सभी कारण हैं की कमी नियंत्रण नमूनों में densitometry, उच्च पृष्ठभूमि पीआरपी रिस स्तरों प्रदर्शन करने के लिए। विविधताएं 100 μl की कुल प्रतिक्रिया मात्रा को बनाए रखने और 1:99 μl, 2:98 μl और 5:95 μl शामिल हैं। सब्सट्रेट मात्रा अनुपात इष्टतम है: लगभग सभी अवसरों पर, हम 5:95 μl बीज मिल गया है। कोई फर्क नहीं पड़ता कार्यरत है क्या अनुपात, त्से एजेंट के बराबर राशि का उपयोग किया जाता है और परख आंतरिक रूप से संगत है। हालांकि, टेम्पलेट प्रतिक्रियाओं के लिए इस्तेमाल किया prion संक्रमित मस्तिष्क homogenate के बीज एकाग्रता की संभावना है कि अलग-अलग बीज titers या dilutions में सीईआर परख के परिणाम पीआरपी सी -to-पीआरपी रिस रूपांतरण के स्तर बदलती में परिणाम सकता है प्रभावित करता है। इस आशय विट्रो prion रूपांतरण assays के 22 में अन्य में प्रदर्शन किया गया और विभिन्न prion आइसोलेट्स की तुलना उलझा सकता है। सीईआर परख के इस पते पर, बीज गपीआरपी सी रूपांतरण टेम्पलेट कि dilutions की एक श्रृंखला की पहचान करने के लिए पीएच 3.5 और 7.4 में तैयार प्रत्येक पीआरपी सी सब्सट्रेट में titrated जा ould। आदर्श बीज dilutions के अतिरिक्त बीज prions के साथ समाधान saturating बचने के लिए और अभी तक रूपांतरण प्रतिक्रिया की संवेदनशीलता में अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं। वैकल्पिक रूप से, सीईआर परख प्रतिक्रियाओं में पीआरपी सी -to-पीआरपी रिस रूपांतरण परख की अवधि के दौरान कई नियमित रूप से timepoints पर मापा जाता है और वास्तविक समय पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन के लिए readouts (करने के लिए समान दर-की-रूपांतरण घटता, प्लॉट के रूप में किया जा सकता है qPCR) 23 और वास्तविक समय प्रेरित रूपांतरण (आरटी-quic) 24 assays के तड़पनेवाला। इस तरह के readouts प्रजातियों बाधाओं के और अधिक व्यापक व्याख्याओं की अनुमति है और इस पद्धति के भविष्य के विकास का एक दिलचस्प ध्यान केंद्रित कर रहे हैं सकता है।

यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल में, हम कम बंधन, पतली दीवारों पीसीआर ट्यूब का उपयोग करें, लेकिन हम भी करने के लिए सुसज्जित एक थर्मो-प्रकार के बरतन में मानक 1.5 मिलीलीटर ट्यूबों का इस्तेमाल किया हैट्यूब के इस प्रकार के। प्रोटोकॉल के लिए कोई अन्य विविधताओं बड़े आकार ट्यूब का उपयोग करने की जरूरत है। हमारे अनुभव में, हालांकि, हम और अधिक पीआरपी रिस उत्पादन और 1.5 मिलीलीटर ट्यूब की तुलना में कम-से बाध्यकारी पीसीआर नलियों में अधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम मिला है। पीसीआर नलियों में परख के बेहतर प्रदर्शन के लिए स्पष्टीकरण ही, इस समय में सट्टा हवा-पानी इंटरफ़ेस पीआरपी fibrillization 25 के लिए महत्वपूर्ण संकेत है कि परिणामों के आधार पर कर रहे हैं, हम छोटे ट्यूबों पीआरपी के लिए एक अधिक इष्टतम सतह तनाव प्रदान परिकल्पना है कि रूपांतरण।

शायद सीईआर परख का उपयोग करने के लिए प्रमुख सीमा रूपांतरण अनुपात में इस तरह के रोग अंतर्वेधन या ऊष्मायन अवधि की लंबाई के रूप में विवो प्रजातियों बाधाओं निर्धारकों, के मामले में प्रतिनिधित्व करते हैं क्या समझ में है। इन विट्रो के बीच और vivo प्रजातियों बाधा कारकों में वर्तमान में अज्ञात, अनुवाद परीक्षण addit में सीईआर परख के निरंतर उपयोग के साथ साफ हो जाना चाहिए जबकिपहले से ही विवो में स्थापित किया गया है और bioassay डेटा उपलब्ध नहीं हैं जहां प्रजातियों में परिणाम अर्हता प्राप्त करने में मदद मिलेगी कि ional त्से प्रजातियों बाधाओं। PMCA की तुलना में सीईआर परख का एक लाभ यह किसी भी त्से एजेंट द्वारा परिवर्तित किया जा सकता है, जो पीआरपी रूपांतरण, अर्थात् पीएच 3.5 सब्सट्रेट, के लिए एक आंतरिक नियंत्रण की उपस्थिति है। यह किसी भी अगर, त्से एजेंट एक विदेशी मेजबान के पीआरपी सी के misfolding कारण होना चाहिए, जो स्पष्ट नहीं है जब यह नियंत्रण मूल्य का है। PMCA में एक विशिष्ट त्से एजेंट बढ़ाना एक दिया मेजबान सब्सट्रेट की अक्षमता को एक प्रजाति बाधा के सबूत के रूप में व्याख्या की जा सकती है या तकनीकी असफलताओं के कारण हो सकता है। PMCA की तुलना में सीईआर परख का नुकसान पीआरपी रिस, सीईआर सब्सट्रेट तैयारी में अतिरिक्त कदम और सीईआर प्रतिक्रियाओं द्वारा उत्पादित पीआरपी रेस में कोई ज्ञात संक्रामकता के प्रवर्धन सीमित शामिल हैं। यह पिछले एक अध्ययन में, तथापि, हम सीईआर परख पीआरपी रिस की एक समान पैटर्न के लिए के परिणामस्वरूप पाया गया कि ध्यान दिया जाना चाहिए हैPMCA 15 के रूप में है कि rmation। यहाँ प्रस्तुत परिणाम भी सीईआर परख सही ढंग से प्रयोगशाला चूहों (चित्रा 3) के लिए विभिन्न TSEs के प्रसारण के लिए प्रजातियों बाधाओं भविष्यवाणी की है कि संकेत मिलता है और Bobcats कि घरेलू बिल्लियों (रिपोर्ट के साथ समझौते में, CWD (चित्रा 4) के लिए फेलिस संवेदनशीलता हो सकता है कि सुझाव है catus) प्रयोगात्मक CWD चुनौती 26,27 के बाद prion रोग प्राप्त कर सकते हैं। सीईआर परख का उपयोग अध्ययन CWD 28 को वन्य जीवन संवेदनशीलता को समझने के लिए पीआरपी अनुक्रमण के प्रयासों को बधाई देता हूं सकता है।

सीईआर परख तेजी से, कम लागत, इन विट्रो में त्से प्रजातियों बाधाओं के विश्वसनीय आकलन सक्षम बनाता है। पशु bioassay की "सोने के मानक 'के लिए नहीं एक पूरी प्रतिस्थापन, वहीं सीईआर परख का औचित्य साबित या रहने वाले जानवरों में आगे के अध्ययन के निराकरण हो सकता है कि एक त्से प्रजातियों बाधा के अस्तित्व के लिए एक प्रारंभिक आकलन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। इस कारण से, परख ही निर्भर करता है और क्योंकिगैर प्रायोगिक पशुओं से प्राप्त किया जा सकता है, जो मस्तिष्क के ऊतकों पर, सीईआर पशु प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं 29 की जगह कम करने और परिष्कृत करने के प्रयासों को ध्यान में रखते हुए है। एक misfolded फार्म के लिए सामान्य, कार्यात्मक पीआरपी सी के रूपांतरण: प्रजातियों बाधाओं का आकलन करने के अलावा, सीईआर परख भी prion रोग जीव विज्ञान को परिभाषित मौलिक घटना के तंत्र की जांच के लिए जो के साथ एक सरल मंच प्रदान कर सकते हैं।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
12% Bis-Tris SDS-PAGE gels Life Technologies NP0342
0.5 mm Zirconium oxide beads Next Advance ZROB05 Other varieties of beads are also effective
Antibodies various suppliers Select appropriate primary and secondary antibodies for immunoblot detection of PrPres from species of interest
Bead homogenizer Next Advance BBY24M
Centrifuge Beckman Coulter 369434 High speed with temperature control
Conical tubes any brand
Cotton-tipped applicator Uline S-18991
Cuphorn sonicator Heat Systems-Ultrasonics W-380 Heat Systems-Ultrasonics, Inc. is now Qsonica, LLC
Densitometry software program UVP Vision Works LS Image Acquisition and Analysis software Other programs, such as NIH ImageJ, will also work
Dounce homogenizer Kimble Chase 885300
End-over-end mixer Labnet International H5600
Ethylenediaminetetra acetic acid Boston Bioproducts P-770 Hazardous chemical: eye irritation
Guanidine hydrochloride, 8 M Thermo Fisher Scientific 24115 Hazardous chemical: acute toxicity, skin irritation, eye irritation
Heating block Fisher Scientific 11-718
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich 435570 Hazardous chemical: strong acid
Lithium dodecyl sulfate sample buffer, 4x Life Technologies NP0008 Hazardous chemical: skin & respiratory irritation, serious eye damage, flammable solid
Methanol Fisher Scientific A454-4 Hazardous chemical: acute toxicity, flammable liquid
Microcentrifuge tubes any brand
Mini-centrifuge Labnet International C1301
N-lauroyl-sarcosine (sarkosyl) Sigma-Aldrich  L-5125 Hazardous chemical: acute toxicity, skin irritation, eye damage
Nonidet P-40 Amresco M158 Hazardous chemical: skin irritation, eye damage
SDS-PAGE gel system Life Technologies NuPAGE electrophoresis system Other SDS-PAGE systems will also work
PCR tubes (low-binding) Axygen PCR-02-L-C
Pestle homogenizer Fisher Scientific 03-392-106
pH meter Sentron SI600
Polyvinyldifluoride membrane Millipore IPVH00010
Proteinase K Promega V3021 Hazardous chemical: skin & eye irritation, respiratory sensitisation, organ toxicity
Reducing agent for SDS-PAGE samples, 10x Life Technologies NP0009
Sodium chloride Fisher Scientific 7647-14-5
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich  D6750 Hazardous chemical: acute toxicity
Sodium dodecyl sulfate Thermo Fisher Scientific 28364 Hazardous chemical: acute toxicity, skin irritation, eye damage, flammable solid
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich S5881 Hazardous chemical; strong base
Syringe BD Biosciences various Use syringe size appropriate to volumes of substrate to be homogenized
Syringe needles BD Biosciences various
Thermoshaker (PCR tube shaker) Hangzhou All Sheng Instruments MS-100
Tris base Bio Basic 77-86-1 Hazardous chemical: skin, eye, respiratory irritation
Triton X-100 Integra Chemical Company T756.30.30 Hazardous chemical: acute toxicity, eye irritation
Vortexer Fisher Scientific 12-812

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References

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