Bedöma transmissibel spongiform encefalopati artbarriärer med en

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Johnson, C. J., Carlson, C. M., Morawski, A. R., Manthei, A., Cashman, N. R. Assessing Transmissible Spongiform Encephalopathy Species Barriers with an In Vitro Prion Protein Conversion Assay. J. Vis. Exp. (97), e52522, doi:10.3791/52522 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Transmissibla spongiforma encefalopatier (TSE, prionsjukdomar) är en grupp av dödliga neurodegenerativa sjukdomar med förlängda inkubationsperioder som påverkar en mängd olika djur och människor. Den förmodade etiologiska medlet för TSE består av ett felvikt isomer av värdprionprotein (PrP) som är kapabel att själv-förökning genom mallstyrd omvandling av den normala cellulära formen av PrP (PrP ^) i ett infektiöst, sjukdomsassocierad formen (PrP TSE) som samlas i det centrala nervsystemet vävnader hos den infekterade värden 1. Smittdäggdjurs prioner allmänhet sänder från värd-till-värd i en artspecifik sätt, vilket har gett upphov till begreppet "TSE artbarriären" begränsande mellan arter transmissionshändelser 2. De biologiska faktorerna för prion artbarriären är inte väl förstådd. Aminosyrasekvenslikhet mellan den smitt PrP TSE och värd PrP Ccett starkt påverka om konvertering sker 3-5, men är fortfarande otillräcklig för att förklara alla priontransmissionshändelser observerats in vivo 6,7.

Således har karakterisering av TSE hinder arter i stort åberopas djurprovokationsstudier: exponera naiva djur från en given art till prioner från en annan och mäta den resulte inkubationstiden för insjuknande och attack hastighet som indikatorer på överföringseffektiviteten. Möss som uttrycker PrP C från heterologa arter används också för denna typ av studie 8. Kostnaderna för transgen produktion musen och utdragna prion biologiska testsystem, samt etiska överväganden av animaliskt användning, utgör hinder för experimentell undersökning av TSE artbarriärer. Bedömning av den mänskliga arten hinder för TSE bygger på möss engineered att uttrycka humant PrP C. Dessa möss kräver långa inkubationstider att ge efter för mänskliga TSE eller ändringar till tHan humant PrP C-molekylen för snabb sjukdomsdebut 9. Inkubationsperioder för icke-human TSE i dessa möss kan sträcka sig bortom den normala musen livslängden gör tolkning av negativa resultat utmanande. Icke-mänskliga primater har också använts som ombud för att studera hinder mänskliga arter, men dessa studier är förenat med samma utmaningar som andra typer av djurförsök och icke-mänskliga primater får inte exakt rekapitulera sjukdom som det fortsätter i den mänskliga värden.

Djur bioanalyser förblir den "gyllene standarden" metod för att mäta risken för att en art till en TSE, men hinder, kostnader och etik dessa levande djurstudier har tvingat utredning alternativ. Ett antal in vitro-analyser, baserade på en bedömning av omvandling av värd PrP C till en proteinas K (PK) resistenta tillstånd (PrP res) när seedade av PrP TSE, har utvecklats och använts för att undersöka TSE species barriärer 10-12. Exempel på in vitro analyser inkluderar cellfria omvandlingsanalyser, protein misfolding cyklisk förstärkning (PMCA), och omvandlingseffektiviteten förhållandet (CER) analys 10-14. Även om ingen av dessa analyser ta hänsyn perifera faktorer som hinder arter efter naturlig infektion, kan alla vara användbara för att identifiera potentiellt mottagliga värdar för TSE.

Här presenterar vi protokollet för CER analysen, i vilken två denature PrP C substrat som härrör från normala hjärnhomogenater används i bänk prionomvandlingsreaktioner (Figur 1) 13. PrP C i substratet denatureras vid pH 7,4 kan endast omvandlas till PrP res av PrP TSE seedade i reaktions i frånvaro av en artbarriär 14. I motsats härtill tillåter denaturering av PrP ^ i det andra substratet vid pH 3,5 den att omvandlas till PrP res efter inkubationmed PrP TSE från vilken art och fungerar som en kontroll för konvertering. Förhållandet av omvandlingen av PrP '^ till PrP res i pH 7,4-substrat relativt den för pH 3,5 substratet ger ett mått på artbarriären. Vi har funnit att CER analysen förutspår kända artbarriärer av laboratoriemöss till olika TSE och har använt analysen i arbetet med att förutsäga artbarriären för många däggdjursarter, däribland bighornfår, till chronic wasting disease (CWD) och andra former av TSE 14, 15. Utredarna är intresserade av ett verktyg som gör snabb screening av TSE artbarriärer eller bedömning av PrP C -till-PrP res konvertering kommer att finna denna metod användbar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Djurarbete bedrivs vid USGS National Wildlife Health Center utfördes enligt NIH Office of Laboratory Animal Welfare riktlinjer och under institutions djuromsorg och använda kommitté protokoll # EP080716. Vävnader från jägare-skördade djur var gåvor från Wisconsin eller Michigan Institutioner för naturresurser.

1. Lösning Förberedelse

OBS: De lösningar som anges nedan krävs för beredning av CER analyssubstrat i avsnitt 2 nedan. Förbered alla dessa lösningar från högre koncentration stamlösningar; rekommenderade koncentrationer för stamlösningar kommer att ges inom parentes efter respektive kemiska namn i listan. Förbered alla lösningar färska på substrat förberedelse och förvara vid 4 ° C fram till användning.

  1. För lysbuffert, bereda en lösning av följande i 10 mM Tris, pH 7,5 (1 M Tris, pH 7,5 stamlösning rekommenderas): 100 mM sodium klorid (NaCl, 1 M stamlösning), 10 mM etylendiamintetraättiksyra (EDTA, 500 mM EDTA, pH 8,0 stamlösning), 0,5% NP-40 (10% stamlösning), 0,5% deoxicholat (DOC, 10% förrådslösning ).
  2. För omvandling buffert, bereda en lösning av 0,05% natriumdodecylsulfat (SDS, 10% förrådslösning) och 0,5% Triton X-100 (10% stamlösning) i en fosfatbuffrad saltlösning (PBS, 10, pH 7,4 stamlösning).
  3. För kaotropiska lösningar, förbereda två 3 M lösningar av guanidinhydroklorid (GdnHCl, 8 M lager) i 1x PBS (10x stamlösning). Justera pH i en av lösningarna till 3,5 ± 0,05 med användning av koncentrerad saltsyra (HCl). Kontrollera att pH hos den andra lösningen förblir vid pH 7,4 ± 0,05 och justera den med koncentrerad HCl eller natriumhydroxid (NaOH) om så krävs.

2. Förbered CER Assay Substrate Pairs

  1. Skaffa friska, icke-TSE-infekterade hjärnvävnad från arter av intresse och förbereda en 10% vikt per volym(Vikt / volym) homogenat i lysbuffert med användning av någon av följande metoder: Dounce, pärlkvarn, eller mortel och stöt homogenisering. Förfina resultehomogen genom att utsätta dem för sprut-and-nål homogenisering, med hjälp av nålar av ökad spårvidd fram substrat kan aspireras och utvisas med lätthet genom en 27 G sprutnål.
    1. För substrat framställda från gnagare och andra små däggdjur, homogenisera hela hjärnan (s); för substrat framställda av större däggdjur, använd obex (hjärnstammen) vävnad för att förbereda homogen. Vid val av kvantitet av hjärnhomogenat, förbereda inte mer än 50% av kapaciteten av centrifugen används för proteinutfällning i steg 2.6.
    2. Om kvaliteten på förvärvade hjärnvävnad är tveksamt, bedöma PrP C-nivåer med SDS-PAGE 16 och immunoblot 17 före substrat beredning.
  2. Dela upp hjämhomogenat i två lika stora volymer i separata märkta plast koniska rör. Lägg GdnHCl (3 M-lösningar i en PBS) vid antingen pH 3,5 eller 7,4 till varje rör i en 1: 1 volymförhållande till hjärnhomogenat.
  3. Kontrollera pH-värdena för de två lösningarna. Justera pH i pH 3,5 substratet till pH ± 0,05 med användning av koncentrerad HCl. Se till pH hos det andra substratet förblir vid pH 7,4 ± 0,05 och justera pH-värdet om så är nödvändigt med HCl eller NaOH efter behov. Undvik överskjutning pH-värden genom omdömesgill tillsats av syra eller bas.
  4. Rotera lösningar på en ände-över-ände-blandare vid rumstemperatur (RT) under 5 h.
  5. Fällning protein genom tillsats av fyra volymer metanol till substratlösningarna i varje koniskt rör, till virvel blanda väl och inkubera vid -20 ° C under 16-18 h.
  6. Sediment prover genom centrifugering vid 13000 x g under 30 min vid 4 ° C. Dekantera försiktigt och kassera supernatanterna och tillåta metanol för att avdunsta från pelletsen. Använd bomullspinne applikatorer för att hjälpa till att absorbera metanol klamrade sig fast vid insidan av röret. Låt inte pellets över-dry och när metanol inte längre syns, gå vidare till nästa steg.
  7. Slamma proteinpellets under omställning buffert. Använd en mängd omvandlingsbufferten som är lika med den mängd hjämhomogenat utgångsmaterial dispenseras i varje rör i steg 2.2.
    OBS: Det är viktigt att omvandlingen buffert som används för att resuspendera proteinpellets från både pH 3,5 och 7,4-behandlade substrat förberedelser är lösningen definieras i steg 1.2 ovan (som innehåller låga halter av tvättmedel och ett fysiologiskt pH).
  8. Kortfattat Sonikera substratlösningar i ett cuphorn sonicator (10 sek på ~ 30% maximal effekt), delmängd i 0,5-1,0 ml volymer i märkta 1,5 ml mikrorör. Utför en kvalitetskontroll immunoblot (steg 2,9) på en del av varje substrat. Förvara andra portioner vid -80 ° C tills den ska utföra CER analys (avsnitt 4).
  9. Utför kvalitetskontroll på CER substratparen före användning (Figur 2). Dessa steg garantera att CER substrat kommer provide optimala resultat i konverteringsstudier.
    1. Säker jämförbara mängder av PrP C i de två substraten. Jämför PrP-nivåer i 10-25 | il av varje substrat genom SDS-PAGE 16 och immunoblotting 17. Om proteinnivåer i pH 7.4 och 3.5 substrat är inom ~ 10% av varandra, substratparen är lämpliga att använda i CER studier.
      OBS: De PrP immunoblottar ska inte visa tecken på kraftig försämring PrP C. PrP immunoreaktivitet bör vara främst> 20 kDa. Band som är mindre än denna molekylvikt kan vara nedbrytningsprodukter. Bandmönster bör vara ungefär likvärdiga mellan substratparen.
    2. Eftersom PrP C i båda substraten bör vara PK känslig, behandla 10-25 | il av varje substrat med PK vid en slutlig koncentration av 100 | ig / ml och smälta prover vid 1000 rpm vid 37 ° C under 1 h i den termo-skak. Bedöm eventuella kvar PrP signal med SDS-PAGE 16 och immunoblotting 17.Substrat med PrP res inte är lämpliga att använda i CER studier.

3. Förbered TSE Agent Frön

  1. Skaffa TSE-smittade hjärnvävnad från arter av intresse och förbereda en 10% (vikt / volym) homogenatet i 1x PBS pH 7,4 med hjälp av de metoder som anges i steg 2.1 ovan.
    OBS: Frön kan också framställas ur andra TSE-smittade vävnader utanför det centrala nervsystemet, men effektiviteten i omvandlingen av hjärn härledda substrat genom frön som härstammar från TSE-smittade perifera vävnader har ännu inte experimentellt bedömts i den publicerade litteraturen.
  2. Alikvot resulte homogenatet (s) i 100-300 il volymer i 0,5 ml mikrocentrifugrör och förvara vid -80 ° C tills den ska utföra CER analysen.

4. CER Assay

OBS: CER analys involverar tillsättning av en relativt liten mängd av PrP TSE (ges i "frö") från en arttill ett relativt överskott av PrP ^ (anordnad i oinfekterade hjärnan "substrat") från en annan art som har delvis denatureras vid antingen pH 3,5 eller 7,4. Efter en längre skaka inkubationstid, är mallbaserade omvandlingen av PrP C genom PrP TSE i varje reaktion bedömas av densitometriska signalen av PrP res står efter PK matsmältning och immunblotdetektering. Jämföra PrP res nivåer i substraten tidigare denatureras vid pH 3,5 jämfört med 7,4 ger ett mått på artbarriären. En experimentell översikt av detta analysförfarande ges i figur 1.

  1. Långsamt tina oinfekterade CER substratpar (analys kräver lika volymer av substrat tidigare denatureras vid både pH 3,5 och 7,4) och TSE-infekterade utsädes lösningar genom att placera dem ovanpå en bädd av is (ca 1 tim tö tid).
  2. När helt tinade, aspirera och sedan utvisa varje substratlösning genom en27 G sprutnål flera gånger för att återhomogenisera den. Sonikera ett ögonblick varje TSE-smittade frö lösning för 10 sek vid ~ 30% maximal effekt. Håll alla lösningar på is medan du förbereder omvandlingsreaktioner.
  3. Märknings 5 ​​individuella lågbindande, tunnväggiga PCR-rör per TSE medel som undersöks.
  4. Förbered omvandlingsreaktioner i dessa rör genom att tillsätta 5 | il 10% TSE-infekterade groddupplösning till 95 pl av (a) CER substrat framställda vid pH 7,4 och (b) CER substrat framställt vid pH 3,5.
    1. För varje experimentell prov, förbereda parallella reaktioner i CER substrat par tidigare denatureras vid både pH 3,5 och 7,4.
    2. Optimera förhållanden av TSE agent frö till oinfekterade hjärnsubstrat genom empiriska beslutsamhet. Vanliga frö: substratförhållanden används upprätthålla en total reaktionsvolym 100 l och inkluderar 1:99 il, 2:98 pl och 5:95 pl. För de flesta applikationer, den 5:95 pl frö: är substratvolymförhållandet lämpligt och vad som presenteras i thär protokollet.
  5. Förbered tre kontrollprover per TSE agent som testas enligt följande: (a) tillsätt 5 ìl av 10% TSE-smittade frö lösning på 95 pl omvandlingsbuffert som en kontroll för ingångs PrP res; lägg till 5 l konvertering buffert till 95 pl substrat beredd på (b) pH 3,5 och (c) pH 7,4 som kontroller för ospecifik, icke-styrd omvandling.
  6. Virvel korthet varje prov i sin slutna PCR-rör för att blanda frön och substrat väl. Följ med en momentan puls i en låg hastighet bänk mini-centrifug för att avlägsna eventuell volym av reaktionsblandningen instängd i röret locket PCR.
  7. Last prover i individuellt märkta PCR-rör i en bänk termo shaker utrustad för att acceptera PCR-rör. Skaka proverna vid 1000 rpm vid 37 ° C under 24 h.
  8. Efter skakning, till sarkosyl till en slutlig koncentration av 2% (vikt / volym) och PK till en slutlig koncentration av 100 pg / ml. Digest prover vid 1000 rpm vid 37 ° C under 1 h i den termo-skakapparat.
    NOTE: Tillägg av sarkosyl till prover efter konvertering hjälpmedel i PK nedbrytning av PrP C. Falskt positiva signaler i unseeded prover (Steg 4.5) är praktiskt taget elimineras genom tillsats av Sarkosyl.
  9. Lägg SDS-PAGE-provbuffert, värme prover till 95 ° C under 5 minuter och lösa återstående PrP res i varje prov genom SDS-PAGE 16 följt av immunoblotting 17.
    OBS: Efter tillsats av provbuffert och upphettning, prov kan omedelbart bearbetas eller prover kan förvaras vid -20 ° C eller -80 ° C före immunoblottning. Alla data som presenteras här genererades med hjälp av Novex NuPAGE gel och transfereringssystemen. Individuella prover från CER-analysen behandlades med provbuffert och reduktionsmedel enligt tillverkarens instruktioner. Proverna har därefter upphettades vid 95 ° C under 5 min och 30 ul av varje prov laddades i en 12% bis-tris förgjutna geler.
  10. Beräkna förhållandet omvandlingseffektiviteten (CER) som ett måttav arter barriär. Mät nivåer PrP res genom densitometri 17 och dividera den totala tätheten av pH 7,4 provet genom att av pH 3,5 provet. Multiplicera med 100 för att producera en procentsats.
  11. Sammanställa uppgifter från oberoende experimentella replikat för att generera en genomsnittlig CER ± standardavvikelse för en art med en given TSE agent.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Framgångsrik användning av CER-analysen är i hög grad beroende av kvaliteten på de substratparen som används i omvandlingsreaktioner. Av denna anledning, efter stegen för att förbereda CER substratparen, en kvalitetskontroll immunoblot bör utföras (Figur 2). För båda substraten, analys 10-25 pl genom immunoblotting. PrP C bör vara enkelt kan upptäckas i varje substrat och PrP C-nivåer måste vara ungefär lika mellan de två. Immunreaktivitet kommer huvudsakligen synlig ovanför 20 kDa, men mindre band kan också vara uppenbart. Enligt vår erfarenhet är förekomsten av mindre band arter beroende. Om lågmolekylära produkter observeras, bör deras närvaro bekräftas i båda substratparen.

Det är viktigt att se till att CER substrat är fria från endogena PrP res genom att behandla substrat med PK (Figur 2). Om PrP res är närvarande, djuret som används för substberedning takt kan ha TSE-smittade eller subclinically-smittade. Alternativt kan PrP ^ i substratet har felvikt till en PK-resistent tillstånd under denaturerings- eller fällningsförfaranden. Oberoende från anledning är CER substrat innehållande PrP res inte acceptabelt för användning i omvandlingsanalysen.

Laboratoriemöss är en av de mest använda försöksdjur i TSE-forskning; som sådan, deras känslighet för de flesta TSE är väl karakteriserad 8, som ger en in vivo riktmärke för att testa trohet av CER-analysen. Figur 3A visar resultaten av CER analys omvandling av PrP C från mus (CD1 stam) substrat till PrP res av 1) RML stam av mus-passe scrapie, en agent anpassad till musvärd 18, 2) tamfår klassisk skrapie, ett medel som kan överföra till möss efter en lång inkubationstid 18, och 3) white-tailed hjortar (Odocoileusvirginianus) CWD och 263K stam av hamster-passe scrapie, agenter till vilka möss är minimalt eller inte mottagliga 19,20. Resulte PrP Res nivåerna var variabel över mus substrat denatureras vid pH 7,4 och såddes med de olika TSE-smittämnen medan PrP res hittades i alla underlag denatureras vid pH 3,5 och ympades med TSE. Omvandlingsförhållanden som jämför PrP res nivåer i pH 7,4 och 3,5 substraten oberoende beräknas minst tre gånger och medelvärden ± SD visas i figur 3B. För reaktioner sådda av RML, omräkningssatserna mellan pH 7,4 och 3,5 substrat var ca 100%. För de ympades genom skrapie, omvandling i pH 7,4 substratet var approximativt 75% av den i pH 3,5 substratet. CWD eller 263K-inducerad omvandling av pH 7,4 underlaget var minimal. En envägs variansanalys kunde inte urskilja en skillnad i omräkningsförhållanden av RML och scrapie eller CWD och 263K, dock omräkningssatserna av RML och scrapie var signifikant skiljer sig från CWD och 263K.

CER-analysen kan anpassas för användning med mänskliga vävnader eller djurarter där biologiska testsystem är för utmanande eller inte etiskt och transgen produktions musen inte är önskvärd. Vi har använt denna analys för att karakterisera känsligheten hos olika vilda arter till CWD. Som ett exempel på användningen av denna analys, presenterar vi några preliminära resultat i figur 4. Hjärnor från Hunter-fångade rödloar (Lynx rufus) befanns fortfarande innehålla detekterbara nivåer av PrP ^ och PrP nedbrytningsprodukter var inte omfattande, vilket tyder på att dessa vävnader kan vara en acceptabel källa för CER substrat (Figur 4A). Substratpar genereras från Bobcat hjärna visade PrP immunoreaktivitet av en lämplig molekylvikt och inte innehöll endogena PrP res (Figur 4B). När Bobcat CER substratpar genererade från två separata djur inkuberades med samma vitsvanshjort CWD medel som används i musen CER analysen beskriven i figur 3, fann vi substrat framställda vid pH 7,4 hade nivåer av PrP res jämfört med substrat framställda vid pH 3,5 (Figur 4C), tyder på en minimal artbarriär av bobcat PrP C till konvertering av CWD. CER för konvertering av vitsvanshjort PrP C av samma CWD isolat används för att konvertera bobcat PrP C här, som en positiv kontroll, har tidigare redovisats som 95,2 ± 18,4% i Morawski et al. (2013) 15.

Figur 1
Figur 1:. Experimentell översikt över CER analysen Två analyssubstrat framställs genom delvis denaturera PrP C i icke-prion infekterad hjärnvävnad wed kaotropiska lösningar vid antingen pH 3,5 eller pH 7,4. Substrat ympas med PrP TSE från prion agent intresse och experimentella prover undergår 24 tim inkubation med skakning tillåta PrP C till PrP TSE konvertering i både pH 3,5 och 7.4 substrat. Efter inkubering är omvandlingen bedöms genom SDS-PAGE och immunoblotting. Signal densiteter avläses genom densitometri och CER beräknas genom förhållandet mellan pH 7,4 till pH 3,5 signal densiteter för varje experimentellt prov.

Figur 2
Figur 2: Kvalitetskontroll på CER substrat. (A) Före deras användning i CER-analysen, mus substrat beredd antingen pH 7,4 eller 3,5 analyseras med immunoblot i 1) avsaknad av PK behandling för att bedöma PrP C innehållet i varje substratparet (PrP C-nivåer bör motsvara mellan pH 7,4 och 3,5 substra tes för användning i CER-analys) och 2) närvaro av PK (100 mikrogram / ​​ml) behandling för att testa för redan existerande PrP res i vävnader som används för att framställa substrat (alla substrat som visar pre-existerande PrP res är inte lämpliga för användning i CER-analys). (B) För att testa med avseende på icke-specifik PrP ​​res formation under omvandlingsanalysen, är mus PrP C-substrat framställda vid antingen pH 7,4 eller 3,5 ympades med omvandlingsbuffert, skakades under 24 h vid 1000 varv per minut, 37 ° C och därefter PK-behandlade (100 ^ g / ml) och analyserades för PrP res genom immunoblotting (höger två körfält). Icke skakas, icke-PK behandlade mus substrat representerar totalt PrP C innehåll i analysreaktioner (vänster två körfält). För (B), har irrelevanta körfält blivit beskuren för tydlighet, men varje immunoblot panel härrör från samma gel, membran och exponering. Immunoblots i alla paneler använde monoklonal antikropp SAF 83.

"> Figur 3
Figur 3:. CER analys med hjälp laboratorie musen substrat (A) Mus CER analyssubstrat beredd antingen pH 7,4 eller 3,5 inkuberades med RML mus-anpassad scrapie, tamfår klassisk skrapie, vitsvanshjort chronic wasting disease (CWD) eller 263K stam av hamster-anpassade scrapie i CER-analysen. Kontrollprover (märkt "ingen") endast innehöll en lika stor mängd smittämne och ingen mus substrat. Prover analyserades med avseende på närvaro av PK-resistent prionprotein (PrP res) med immunoblot med monoklonal antikropp SAF 83. Råa densitometriska värden för varje prov visas nedan varje bana. (B) Stapeldiagram som anger genomsnittliga kvoter (± standardavvikelse) mellan pH 7,4 och 3,5 mus substrat för varje smittämne baserat på minst 3 oberoende analyskörningar. Gemener hänvisar till statisthomogena undergrupper (variansanalys med Tukey-Kramer minsta signifikansskillnader metod; p <0,05). Denna siffra har modifierats Morawski et al. 2013 15.

Figur 4
Figur 4: Exempel på användning av CER analys för att undersöka bobcat mottaglighet för CWD Bobcat hjämhomogenat (A) och CER analys substrat (B) testades genom immun i frånvaro och närvaro av PK (100 mikrogram / ​​ml) för att bedöma befintliga PrP C. nivåer och förekomsten av pre-existerande PrP res, respektive. (C) Bobcat substrat ympades med omvandlingsbuffert och analyserade i CER-analysen för att utvärdera icke-specifik PrP ​​res bildning (vänster två körfält). Icke skakas, icke-PK behandlade bobcat substrat representerar totalt PrP C innehåll i analysreaktioner (höger två körfält).(D) Bobcat substrat beredd på antingen pH 7,4 eller 3,5 inkuberades med vitsvanshjort CWD använder CER-analysen. Kontrollprovet (märkt "none") innehöll en lika stor mängd CWD agent men ingen bobcat substrat. Raw densitometriska värden för varje prov visas nedan varje bana. Immunoblots i alla paneler används monoklonal antikropp 3F4, som reagerar med kattdjur prionproteinet 21.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

För ett framgångsrikt slutförande av detta protokoll, bör hänsyn tas till PrP C-nivåerna i oinfekterade hjärnvävnad används för beredning substrat (steg 2.1.2) och fröet till substrat förhållande för omvandlingsreaktioner (steg 4.4.2). Enligt vår erfarenhet kan hjärnor utvinnas för användning som CER substratet efter en betydande tid efter slakt, så länge PrP C är närvarande genom immunoblotting (Figur 4). I själva verket var en del autolys observerats i hjärnan hos de Bobcats används för CER studier. Ändå inkubation av substrat härledda från dessa hjärnor fortfarande resulterade i bildningen av PrP res. Vi spekulerar att, delvis är robustheten i CER analysen kommer från denaturering av CER substrat i 1,5 M GdnHCl, som inaktiverar många proteaser.

Seed till substrat förhållanden kan behöva bestämmas empiriskt att erhålla acceptabel PrP res signal genom immunoblotting. För mycket eller för little PrP res att utföra densitometry, höga bakgrunds PrP res nivåer i kontrollprover som saknar underlag och inkonsekventa omräkningssatserna är alla skäl att optimera frö: substratförhållanden. Variationer upprätthålla en total reaktionsvolym av 100 mikroliter och inkluderar 1:99 il, 2:98 | il och 5:95 il. Vid nästan alla tillfällen, har vi funnit att 5:95 il frö: substrat volymförhållandet är optimal. Oavsett vilken förhållandet användes, är lika stora mängder av TSE-medlet som används och analysen är internt konsekvent. Men sannolikt påverkar utsäde koncentration av prioninfekterade hjämhomogenat användes för mall reaktioner resultatet av CER-analysen i att varierande utsädes titrar eller utspädningar kan resultera i olika nivåer av PrP ^ -till-PrP res omvandling. Denna effekt har visats i andra i prion konverterings vitro 22 och komplicera jämförelsen av olika prion isolat. För att lösa detta i CER-analysen, frön could titreras i varje PrP ^ substrat framställt vid pH 3,5 och 7,4 för att identifiera ett intervall av utspädningar som mall PrP ^ konvertering. Ideal utsäde späd undvika mättar lösningen med överskott utsäde prioner och ändå ge insikt i hur känsliga omvandlingsreaktionen. Alternativt kunde PrP C -till-PrP res konvertering i CER analysreaktioner mätas vid multipel, regelbundna tidpunkter under hela analysen och ritas som hastighet-of-konvertering kurvor, besläktad med de avläsning för realtids polymeras kedjereaktion ( qPCR) 23 och realtids skälva inducerad omvandling (RT-QUIC) 24 analyser. Sådana avläsningar kan tillåta mer omfattande tolkningar av artbarriärer och är en intressant fokus för framtida utveckling av denna metod.

I protokollet presenteras här använder vi låga bindande, tunnväggiga PCR-rör, men vi har också använt standard 1,5 ml rör i en termo shaker utrustade fördenna typ av rör. Inga andra varianter av protokollet behövs för att använda större storlek rören. I vår erfarenhet, har vi dock haft mer PrP res produktion och mer reproducerbara resultat i svagt bindande PCR-rör jämfört med 1,5 ml rör. Medan förklaringar till det förbättrade resultatet av analysen i PCR-rör är endast spekulativa vid denna tid, baserat på resultat indikerar att luft-vattengränssnittet är avgörande för PrP fibrillization 25, hypotes vi att de mindre rören ger en mer optimal ytspänning för PrP omvandling.

Kanske chefen begränsningen till användning av CER analysen är att förstå vad omräkningssatserna representerar i termer av in vivo artbarriärer faktorer, såsom sjukdom penetrans eller längd inkubationstiden. Medan närvarande okända, översättning mellan in vitro och in vivo arter barriär faktorer bör bli tydligare med fortsatt användning av CER-analysen inom test Additional TSE artbarriärer som redan har fastställts i vivo och hjälper att kvalificera leder arter där bioassay-data inte tillgängliga. En fördel med CER-analysen jämfört med PMCA är förekomsten av en intern kontroll för PrP konvertering, nämligen pH 3,5 substrat, som kan omvandlas av någon TSE. Denna kontroll är av värde när det är oklart vilka, om några, borde TSE-agens orsaka felveckning av en exotisk värdens PrP C. Oförmågan hos ett givet värdsubstrat för att förstärka en viss TSE i PMCA kan tolkas som bevis på en artbarriär eller kan bero på tekniska brister. Nackdelar med CER-analysen jämfört med PMCA inkluderar begränsad förstärkning av PrP res, ytterligare steg i CER substrat förberedelse och ingen känd smitt i PrP res produceras av CER reaktioner. Det bör noteras att i en tidigare studie, men vi hittade CER analysen resulterade i ett liknande mönster av PrP res formation som för PMCA 15. Resultaten som presenteras här visar också att CER analysen förutspår korrekt hindren arter för överföring av olika typer av TSE till laboratoriemöss (Figur 3) och föreslår att Bobcats kan ha känslighet för CWD (Figur 4), i samförstånd med rapporter om att huskatter (Felis catus) kan förvärva prionsjukdom efter experimentell CWD utmaning 26,27. Studier med CER-analysen kunde komplimang PrP sekvense ansträngningar att förstå djurliv mottaglighet för CWD 28.

CER-analysen möjliggör snabb, billig, tillförlitlig bedömning av TSE artbarriärer in vitro. Även om inte en fullständig ersättning för den "gyllene standarden" djur bioassay kan CER analysen användas som en första bedömning av förekomsten av TSE artbarriär som kan motivera eller undanröja fortsatta studier i levande djur. Av denna anledning, och eftersom analysen bygger enbartpå hjärnvävnad som kan förvärvas från icke-försöksdjur är CER i linje med ansträngningarna att ersätta, begränsa och förbättra djurförsök experimentella procedurer 29. Förutom att bedöma artbarriärer kan CER analysen också ge en förenklad plattform som man kan undersöka mekanismerna för den grundläggande händelsen definierar prionsjukdom biologi: omvandling av normala, funktionella PrP C till en felvikt formulär.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12% Bis-Tris SDS-PAGE gels Life Technologies NP0342
0.5 mm Zirconium oxide beads Next Advance ZROB05 Other varieties of beads are also effective
Antibodies various suppliers Select appropriate primary and secondary antibodies for immunoblot detection of PrPres from species of interest
Bead homogenizer Next Advance BBY24M
Centrifuge Beckman Coulter 369434 High speed with temperature control
Conical tubes any brand
Cotton-tipped applicator Uline S-18991
Cuphorn sonicator Heat Systems-Ultrasonics W-380 Heat Systems-Ultrasonics, Inc. is now Qsonica, LLC
Densitometry software program UVP Vision Works LS Image Acquisition and Analysis software Other programs, such as NIH ImageJ, will also work
Dounce homogenizer Kimble Chase 885300
End-over-end mixer Labnet International H5600
Ethylenediaminetetra acetic acid Boston Bioproducts P-770 Hazardous chemical: eye irritation
Guanidine hydrochloride, 8 M Thermo Fisher Scientific 24115 Hazardous chemical: acute toxicity, skin irritation, eye irritation
Heating block Fisher Scientific 11-718
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich 435570 Hazardous chemical: strong acid
Lithium dodecyl sulfate sample buffer, 4x Life Technologies NP0008 Hazardous chemical: skin & respiratory irritation, serious eye damage, flammable solid
Methanol Fisher Scientific A454-4 Hazardous chemical: acute toxicity, flammable liquid
Microcentrifuge tubes any brand
Mini-centrifuge Labnet International C1301
N-lauroyl-sarcosine (sarkosyl) Sigma-Aldrich  L-5125 Hazardous chemical: acute toxicity, skin irritation, eye damage
Nonidet P-40 Amresco M158 Hazardous chemical: skin irritation, eye damage
SDS-PAGE gel system Life Technologies NuPAGE electrophoresis system Other SDS-PAGE systems will also work
PCR tubes (low-binding) Axygen PCR-02-L-C
Pestle homogenizer Fisher Scientific 03-392-106
pH meter Sentron SI600
Polyvinyldifluoride membrane Millipore IPVH00010
Proteinase K Promega V3021 Hazardous chemical: skin & eye irritation, respiratory sensitisation, organ toxicity
Reducing agent for SDS-PAGE samples, 10x Life Technologies NP0009
Sodium chloride Fisher Scientific 7647-14-5
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich  D6750 Hazardous chemical: acute toxicity
Sodium dodecyl sulfate Thermo Fisher Scientific 28364 Hazardous chemical: acute toxicity, skin irritation, eye damage, flammable solid
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich S5881 Hazardous chemical; strong base
Syringe BD Biosciences various Use syringe size appropriate to volumes of substrate to be homogenized
Syringe needles BD Biosciences various
Thermoshaker (PCR tube shaker) Hangzhou All Sheng Instruments MS-100
Tris base Bio Basic 77-86-1 Hazardous chemical: skin, eye, respiratory irritation
Triton X-100 Integra Chemical Company T756.30.30 Hazardous chemical: acute toxicity, eye irritation
Vortexer Fisher Scientific 12-812

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Colby, D. W., Prions Prusiner, S. B. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3, (1), a006833 (2011).
  2. Hill, A. F., Collinge, J. Prion strains and species barriers. Contrib Microbiol. 11, 33-49 (2004).
  3. Scott, M., et al. Transgenic mice expressing hamster prion protein produce species-specific scrapie infectivity and amyloid plaques. Cell. 59, (5), 847-857 (1989).
  4. Prusiner, S. B., et al. Transgenetic Studies Implicate Interactions between Homologous Prp Isoforms in Scrapie Prion Replication. Cell. 63, 673-686 (1990).
  5. Telling, G. C., et al. Prion Propagation in Mice Expressing Human and Chimeric Prp Transgenes Implicates the Interaction of Cellular Prp with Another Protein. Cell. 83, 79-90 (1995).
  6. Hill, A. F., et al. The same prion strain causes vCJD and BSE. Nature. 389, (6650), 448-450 (1997).
  7. Torres, J. M., et al. Elements modulating the prion species barrier and its passage consequences. PLoS One. 9, (3), e89722 (2014).
  8. Groschup, M. H., Buschmann, A. Rodent models for prion diseases. Vet Res. 39, (4), 32 (2008).
  9. Korth, C., et al. Abbreviated incubation times for human prions in mice expressing a chimeric mouse-human prion protein transgene. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, (8), 4784-4789 (2003).
  10. Kocisko, D. A., et al. Species specificity in the cell-free conversion of prion protein to protease-resistant forms: a model for the scrapie species barrier. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, (9), 3923-3927 (1995).
  11. Raymond, G. J., et al. Evidence of a molecular barrier limiting susceptibility of humans, cattle and sheep to chronic wasting disease. EMBO J. 19, (7), 4425-4430 (2000).
  12. Fernandez-Borges, N., de Castro, J., Castilla, J. In vitro studies of the transmission barrier. Prion. 3, (4), 220-223 (2009).
  13. Zou, W. Q., Cashman, N. R. Acidic pH and detergents enhance in vitro conversion of human brain PrPC to a PrPSc-like form. J Biol Chem. 277, (46), 43942-43947 (2002).
  14. Li, L., Coulthart, M. B., Balachandran, A., Chakrabartty, A., Cashman, N. R. Species barriers for chronic wasting disease by in vitro conversion of prion protein. Biochem Biophys Res Commun. 364, (4), 796-800 (2007).
  15. Morawski, A. R., Carlson, C. M., Chang, H., Johnson, C. J. In vitro prion protein conversion suggests risk of bighorn sheep (Ovis canadensis) to transmissible spongiform encephalopathies. BMC Vet Res. 9, 157 (2013).
  16. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Separating Protein with SDS-PAGE. JoVE. Cambridge, MA. Available from: http://www.jove.com/science-education/5058/separating-protein-with-sds-page (2014).
  17. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. JoVE. Cambridge, MA. Available from: http://www.jove.com/science-education/5065/the-western-blot (2014).
  18. Chandler, R. L. Encephalopathy in mice produced by inoculation with scrapie brain material. Lancet. 1, (7191), 1378-1379 (1961).
  19. Browning, S. R., et al. Transmission of prions from mule deer and elk with chronic wasting disease to transgenic mice expressing cervid PrP. J Virol. 78, (23), 13345-13350 (2004).
  20. Hadlow, W. J., Race, R. E., Kennedy, R. C. Experimental infection of sheep and goats with transmissible mink encephalopathy virus. Can J Vet Res. 51, (1), 135-144 (1987).
  21. Rubenstein, R., et al. Immune surveillance and antigen conformation determines humoral immune response to the prion protein immunogen. J Neurovirol. 5, (4), 401-413 (1999).
  22. Castilla, J., et al. Crossing the species barrier by PrP(Sc) replication in vitro generates unique infectious prions. Cell. 134, (5), 757-768 (2008).
  23. Kubista, M., et al. The real-time polymerase chain reaction. Mol Aspects Med. 27, 95-125 (2006).
  24. Atarashi, R., Sano, K., Satoh, K., Nishida, N. Real-time quaking-induced conversion: a highly sensitive assay for prion detection. Prion. 5, (3), 150-153 (2011).
  25. Ladner-Keay, C. L., Griffith, B. J., Wishart, D. S. Shaking Alone Induces De Novo Conversion of Recombinant Prion Proteins to beta-Sheet Rich Oligomers and Fibrils. PLoS One. 9, (6), e98753 (2014).
  26. Mathiason, C. K., et al. Susceptibility of domestic cats to chronic wasting disease. J Virol. 87, (4), 1947-1956 (2013).
  27. Seelig, D. M., et al. Lesion Profiling and Subcellular Prion Localization of Cervid Chronic Wasting Disease in Domestic Cats. Vet Pathol. (2014).
  28. Stewart, P., et al. Genetic predictions of prion disease susceptibility in carnivore species based on variability of the prion gene coding region. PLoS One. 7, (12), e50623 (2012).
  29. Russell, W. M., Burch, R. I. The Principles of Humane Experimental Technique. Metheun. Methuen. (1959).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics