Vurdere Overfør spongiform encefalopati Arter Barrierer med en

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Johnson, C. J., Carlson, C. M., Morawski, A. R., Manthei, A., Cashman, N. R. Assessing Transmissible Spongiform Encephalopathy Species Barriers with an In Vitro Prion Protein Conversion Assay. J. Vis. Exp. (97), e52522, doi:10.3791/52522 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Overførbare spongiforme encefalopatier (TSE, prionsykdommer) er en gruppe av fatale nevrodegenerative sykdommer med lengre inkubasjonsperioder som påvirker en rekke dyr og mennesker. Den antatte etiologiske middel for TSE består av en misfolded isomer av verten prionprotein (PrP) som er i stand til selv-formering med mal-drevet omdannelse av normal cellulær form av PrP (PrP C) i en infeksiøs sykdomsassosierte form (PrP TSE) som samler seg i sentralnervesystemet vev i en infisert vert. Smittsomme pattedyr prioner generelt overføre fra host-til-vert i et artsspesifikk måte, noe som har gitt opphav til begrepet "TSE arter barriere" begrenser artsoverførings hendelser 2. De biologiske determinanter av prion arter barriere er ikke godt forstått. Aminosyresekvens likheten mellom den smittsomme PrP TSE og verten PrP C cet sterkt påvirke om konvertering finner sted 3-5, men er fortsatt ikke tilstrekkelig til å forklare alle prion overførings hendelser observert in vivo 6,7.

Dermed har karakterisering av TSE arter barrierer i stor grad stole på dyr provokasjonsstudier: utsette naive dyr fra en gitt art til prioner fra hverandre og måle den resulterende inkubasjonstiden til sykdomsutbruddet og anfallsfrekvensen som indikatorer på transmisjonseffektivitet. Mus som uttrykker PrP C fra heterologe arter brukes også for denne typen studier åtte. Kostnadene forbundet med transgen muse produksjon og langvarige prion bioassays, samt etiske betraktninger av dyr bruk, er hindringer for eksperimentell undersøkelse av TSE arter barrierer. Vurdering av menneskelig barriere arter til TSE er avhengig av mus konstruert for å uttrykke menneskelige PrP C. Disse musene krever lange inkubasjonsperioder å gi etter for menneske TSE eller modifikasjoner til than menneskelige PrP C molekylet for rask sykdomsutbruddet 9. Inkubasjonsperioder for ikke-menneskelige TSE i disse musene kan strekke seg utover den normale mus levetid gjør tolkning av negative resultater utfordrende. Ikke-menneskelige primater har også blitt brukt som proxyer for å studere menneskelige arter barrierer, men disse studiene er fylt med de samme utfordringene som andre typer dyreforsøk og ikke-menneskelige primater kan ikke presist rekapitulere sykdom som det fortsetter i den menneskelige vert.

Dyr bioassay forbli "gullstandarden" metode for å måle i hvilken grad en art til en TSE, men hindringene, kostnader og etikk av disse live dyrestudier har tvunget gransking alternativer. Et antall in vitro-analyser, basert på å vurdere omdanning av verten PrP C til en proteinase K (PK) motstandsdyktig tilstand (PrP res) når utsådd av PrP TSE, er blitt utviklet og brukt for å undersøke TSE species barrierer 10-12. Eksempler på in vitro-analyser inkluderer cellefrie konverteringsanalyser, protein misfolding syklisk amplifisering (PMCA), og omdannelseseffektiviteten forholdet (CER) assay 10-14. Mens ingen av disse analysene tar hensyn til eksterne faktorer involvert i artsbarrierer etter naturlig infeksjon, kan alle være nyttig å identifisere potensielt mottakelige verter for TSE.

Her presenterer vi protokollen for CER analysen, der to denaturert PrP C underlag avledet fra normale hjerne homogenates brukes i benk topp prion konverterings reaksjoner (figur 1) 13. PrP C i substratet denaturert ved pH 7,4 kan bare omdannes til PrP res av PrP TSE podet inn i reaksjons i fravær av en art barriere 14. I motsetning til dette, denaturering av PrP C i det annet substrat ved pH 3,5 gjør at den kan omdannes til PrP res etter inkubasjonmed PrP TSE fra enhver art, og tjener som en kontroll for konvertering. Forholdet mellom omdannelse av PrP C til PrP res i pH 7,4 substrat i forhold til det av pH 3,5 substratet gir et mål for arten barriere. Vi har funnet ut at den CER analysen spår kjente arter barrierer av laboratoriet mus til ulike TSE, og har brukt den analysen i arbeidet med å forutsi artsbarrieren av mange pattedyrarter, inkludert Tykkhornsau, til kronisk wasting disease (CWD) og andre TSE 14, 15. Etterforskerne er interessert i et verktøy som tillater rask screening av TSE arter barrierer eller vurdering av PrP C-til-PrP res konverteringen vil finne denne metodikken nyttig.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Animal arbeid utført ved USGS National Wildlife Health Center ble utført i samsvar med NIH Office of Laboratory Animal Welfare retningslinjer og under institusjons dyr omsorg og bruk komité protokoll # EP080716. Vev fra jeger-høstet dyr var gaver fra Wisconsin eller Michigan Avdelinger for naturressurser.

1. Løsning Forberedelse

MERK: Løsningene er oppført nedenfor er nødvendig for utarbeidelse av CER-analysen underlaget i punkt 2 nedenfor. Forberede hver av disse løsningene fra høyere konsentrasjon stamløsninger; anbefalte konsentrasjoner for stamløsninger vil bli gitt i parentes etter hvert respektive kjemisk navn oppført. Forberede alle løsninger friske på forbehandling og oppbevares ved 4 ° C inntil bruk.

  1. For lyseringsbuffer, fremstille en oppløsning av de følgende i 10 mM Tris, pH 7,5 (1 M Tris, pH 7,5 stamløsning anbefales): 100 mM sodium klorid (NaCl, 1 M stamløsning), 10 mM etylendiamintetraeddiksyre (EDTA, 500 mM EDTA, pH 8,0 stamløsning), 0,5% NP-40 (10% stamløsning), 0,5% deoksycholat (DOC, 10% stamløsning ).
  2. For omdannelse buffer, fremstille en løsning av 0,05% natriumdodecylsulfat (SDS, 10% stamløsning) og 0,5% Triton X-100 (10% stamløsning) i en fosfat-bufret saltvann (PBS, 10, pH 7,4 stamløsning).
  3. For chaotropiske løsninger, forberede to 3 M løsninger av guanidinhydroklorid (GdnHCl, 8 M lager) i 1x PBS (10x lager løsning). Juster pH-verdien til en av løsningene til 3,5 ± 0,05 ved anvendelse av konsentrert saltsyre (HCl). Kontroller at pH i den andre oppløsning forblir ved pH 7,4 ± 0,05, og justerer ved hjelp av konsentrert HCl eller natriumhydroksyd (NaOH), hvis nødvendig.

2. Forbered CER analysen substratpar

  1. Skaffe friske, ikke-TSE-infisert hjernevev fra arter av interesse og forberede en 10% vekt per volum(W / v) homogenate i lysisbuffer bruker noen av følgende metoder: Dounce, perle-møllen, eller morter homogenisering. Sorter resulterer homogenates ved å utsette dem til sprøyte-og-nål homogenisering, ved hjelp av nåler av økende måler til underlaget kan bli aspirert og utvist med letthet gjennom en 27 G sprøytespissen.
    1. For underlag fremstilt av gnagere og andre små pattedyr, homogenisere hele hjernen (s); for underlag fremstilt av større pattedyr, bruker OBEX (hjernestammen) vev for å forberede homogenater. Når man velger mengden av hjernehomogenat, forberede ikke mer enn 50% av kapasiteten av sentrifugen benyttes for proteinutfelling i trinn 2.6.
    2. Hvis kvaliteten av ervervet hjernevev er tvilsom, vurdere PrP C nivåer ved SDS-PAGE 16 og immunoblot 17 før forbehandling.
  2. Fordel hjernehomogenat i to like volumer i separate merkede plast koniske rør. Legg GdnHCl (3 M løsninger i en PBS) ved enten pH 3,5 eller 7,4 til hvert rør i en 1: 1 volumforhold til hjernehomogenat.
  3. Kontroller pH-verdiene for de to oppløsningene. Juster pH-verdien til pH 3,5 til pH substrat ± 0,05 ved anvendelse av konsentrert HCl. Sikre at pH-verdien i det andre substratet forblir ved pH 7,4 ± 0,05, og justere pH-verdien hvis nødvendig med HCl eller NaOH etter behov. Unngå skyter pH-verdier ved skjønnsom tilsetning av syre eller base.
  4. Roter-løsninger på en ende-over-ende-blander ved romtemperatur (RT) i 5 timer.
  5. Utfelle protein ved å tilsette fire volumer av metanol til substratet løsninger i hver konisk rør, for å virvle bland godt og inkuber ved 20 ° C i 16-18 timer.
  6. Sedimentprøver ved sentrifugering ved 13.000 x g i 30 min ved 4 ° C. Nøye dekanteres og kastes supernatantene og tillater metanol for å fordampe fra pelletene. Bruk bomullstupp applikatorer for å bistå i å absorbere metanol klamret til innsiden av røret. Ikke la pellets å over-dry og når metanol er ikke lenger synlig, går du videre til neste trinn.
  7. Resuspender protein pellets i konvertering buffer. Bruke en mengde av omdannelse buffer lik mengden av hjernehomogenat utgangsmaterialet dispensert i hvert rør i trinn 2.2.
    MERK: Det er viktig at konverteringen buffer som brukes til å suspendere protein pellets fra både pH 3,5 og 7,4-behandlede substrat forberedelser er løsningen definert i trinn 1.2 (som inneholder lave nivåer av vaskemidler og en fysiologisk pH).
  8. Kort sonikere substrat løsninger i en cuphorn sonicator (10 sek på ~ 30% maksimal kraft), delmengde inn 0,5 til 1,0 ml volumer i merkede 1,5 ml mikrosentrifugerør. Utføre en kvalitetskontroll immunoblot (trinn 2.9) i en porsjon av hvert substrat. Lagre andre alikvoter ved -80 ° C inntil de er klare til å utføre CER-analyse (punkt 4).
  9. Utføre kvalitetskontroll på CER substratpar før bruk (figur 2). Disse trinnene sikre at CER underlag vil innsamlingsløse optimale resultater i konverterings studier.
    1. Sikre sammenlignbare mengder av PrP C i de to underlag. Sammenlign PrP-nivåer i 10 til 25 ul av hvert substrat ved hjelp av SDS-PAGE og immunoblotting 16 17. Hvis proteinnivåer i pH 7,4 og 3,5 substrater er innenfor ~ 10% fra hverandre, substratet parene er passende for bruk i CER-studier.
      MERK: PrP immunoblots bør ikke vise bevis for omfattende PrP C degradering. PrP immunoreaktivitets bør være hovedsakelig> 20 kDa. Band mindre enn denne molekylvekt kan være nedbrytningsprodukter. Banding mønstre bør være omtrent tilsvarende mellom substratpar.
    2. Som PrP C i begge substrater bør være PK sensitive, behandle 10-25 ul av hvert substrat med PK ved en sluttkonsentrasjon på 100 ug / ml og fordøye prøvene ved 1.000 rpm ved 37 ° C i 1 time i termo-shaker. Vurdere eventuelle gjenværende PrP signal ved SDS-PAGE 16 og immunoblotting 17.Substrater med PrP res er ikke egnet for bruk i CER studier.

3. Forbered TSE Agent Seeds

  1. Skaffe TSE-infeksjon hjernevev fra arter av interesse, og fremstille en 10% (vekt / volum) homogenat i 1 x PBS pH 7,4 ved hjelp av de fremgangsmåter som er oppført i trinn 2.1 ovenfor.
    NOTE: Frø kan også fremstilles fra andre TSE-infiserte vev utenfor sentralnervesystemet, men effektiviteten av omdannelsen av hjerne avledet substrater ved frø avledet fra TSE-infiserte perifere vev, er ennå ikke blitt eksperimentelt undersøkt i den publiserte litteraturen.
  2. Alikvoter resulterende homogenat (e) i 100-300 ul volumer i 0,5 ml mikrosentrifugerør og oppbevar ved -80 ° C inntil de er klare til å utføre CER-analysen.

4. CER-analyse

MERK: CER-analysen innebærer tillegg av et relativt lite beløp av PrP TSE (gitt i "frø") fra én artinn i en relativ overkant av PrP C (gitt i infisert hjernen "underlaget") fra en annen art som har blitt delvis denaturert på enten pH 3.5 eller 7.4. Etter en forlenget rysting inkubasjonsperioden blir templat-drevet omdannelse av PrP C av PrP TSE i hver reaksjon vurdert ved densitometrisk signal av PrP res som gjenstår etter PK fordøyelse og immunoblot deteksjon. Sammenligning av PrP res nivåer i de substrater som tidligere er denaturert ved pH 3,5 sammenlignet med 7,4 gir et mål for arten barriere. En eksperimentell oversikt over denne analyseprosedyre er gitt i figur 1.

  1. Sakte tine uinfiserte CER substratpar (analysen krever like volum av underlag tidligere denaturert på både pH 3,5 og 7,4) og TSE-infiserte frø løsninger ved å plassere dem på toppen av en seng av is (ca. 1 time rask tining).
  2. Når du er fullt tint, aspirer og deretter utvise hvert substrat løsning gjennom en27 g sprøytenål ​​flere ganger for å re-homogenisere det. Kort sonikere hver TSE-infisert såkorn løsning i 10 sek på ~ 30% maksimal kraft. Hold alle løsninger på is mens forbereder konverterings reaksjoner.
  3. Merk fem individuelle lave bindende, med tynne vegger PCR rør per TSE agenten blir testet.
  4. Forbered omdannelsesreaksjoner i disse rør ved å tilsette 5 ul av 10% TSE-infiserte frø løsning på 95 ul av (a) CER substrat fremstilt ved pH 7,4 og (b) CER substrat fremstilt ved pH 3,5.
    1. For hver eksperimentell prøve, forberede parallelle reaksjoner i CER substratpar tidligere denaturert på både pH 3,5 og 7,4.
    2. Optimalisere prosenter av TSE agenten frø til infisert hjernen underlaget gjennom empirisk besluttsomhet. Vanlige frø: substrat-forhold som anvendes opprettholde et totalt reaksjonsvolum på 100 pl og omfatter 1:99 ul, ul 2:98 og 5:95 ul. For de fleste bruksområder, den 5:95 ul sæd er underlaget volum ratio hensiktsmessig og er det som presenteres i ther protokollen.
  5. Forbered tre kontrollprøver per TSE agenten blir testet som følger: (a) legge til 5 pl 10% TSE-infiserte frø løsning til 95 mikroliter konvertering buffer som en kontroll for inngangs PrP res; tilsett 5 mL buffer omdannelse til 95 ul substrat fremstilt i (b) pH 3,5, og (c) pH 7,4 som kontroll for ikke-spesifikk, ikke-templated konvertering.
  6. I korthet vortex hver prøve i sin lukkede PCR-rør for å blande frø og underlaget godt. Følger med en kortvarig puls i en lav hastighet bench top mini-sentrifuge for å fjerne ethvert volum av reaksjonsblandingen fanget i PCR-rør lokket.
  7. Lastprøver i individuelt merkede PCR rør i en benk topp termo-shaker rustet til å ta imot PCR rør. Ryst prøvene ved 1.000 rpm ved 37 ° C i 24 timer.
  8. Etter risting, tilsett sarkosyl til en sluttkonsentrasjon på 2% (w / v) og PK til en endelig konsentrasjon på 100 pg / ml. Digest prøvene ved 1.000 rpm ved 37 ° C i 1 time i termo-shaker.
    NERK: Tilsetting av sarkosyl til prøvene post-konverterings hjelpemidler i PK fordøyelse av PrP C. Falske positive signaler i uanriket prøver (trinn 4.5) er praktisk talt eliminert ved tilsetting av sarkosyl.
  9. Legg SDS-PAGE-prøvebuffer, varme prøvene til 95 ° C i 5 minutter og løse resterende PrP res i hver prøve ved hjelp av SDS-PAGE etterfulgt av immunoblotting 16 17.
    MERK: Etter tilsetting av prøvebuffer og oppvarming, prøver kan umiddelbart behandlet eller prøven kan oppbevares ved -20 ° C eller -80 ° C før immunoblotting. Alle data som presenteres her ble generert ved hjelp av Novex NuPAGE gel og overføringssystemer. Enkelte prøver fra CER-analysen ble behandlet med sample buffer og reduksjonsmiddel i henhold til produsentens instruksjoner. Prøver ble deretter oppvarmet ved 95 ° C i 5 minutter og 30 ul av hver prøve ble fylt i en 12% bis-tris prefabrikerte geler.
  10. Beregn omdannelseseffektiviteten forholdet (CER) som et målav arter barriere. Måle nivåer av PrP-res ved densitometri 17 og dele den totale tettheten til pH 7,4 ved at prøven av pH 3,5 prøve. Multipliseres med 100 for å frembringe en prosentandel.
  11. Kompiler data fra uavhengige eksperimentelle replikater for å generere et midlere CER ± standardavvik for en art med en gitt TSE middel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vellykket bruk av CER-analysen er i stor grad avhengig av kvaliteten av de substratpar brukes i omdannelsesreaksjoner. Av denne grunn er følgende fremgangsmåter for å fremstille CER-substrat-par, en kvalitetskontroll immunoblot skal utføres (figur 2). For begge underlag, analyse 10-25 mL av immunblotting. PrP C bør være lett synlig i hvert substrat og PrP C nivåer må være omtrent den samme mellom de to. Immunoreaktivitets vil være hovedsakelig synlig over 20 kDa, men mindre band kan også være tydelig. I vår erfaring, er tilstedeværelsen av mindre band arter avhengig. Hvis lavmolekylære produkter er observert, bør deres tilstedeværelse bekreftes i begge substratpar.

Det er viktig å sikre at CER-substrater er fri for endogene PrP res ved å behandle substrater med PK (figur 2). Hvis PrP res er til stede, dyret som brukes for substtilbereding kan ha blitt TSE-infisert eller subklinisk infisert. Alternativt kan PrP C i substratet har misfoldede til en PK-resistent tilstand under denaturering eller utfelling prosedyrer. Uavhengig av den grunn er CER-substrat inneholdende PrP res ikke er akseptabelt for bruk i omdannelsen analysen.

Laboratoriet mus er en av de mest brukte forsøksdyr i TSE forskning; Som sådan, er deres følsomhet for de fleste TSE godt karakterisert 8, som gir en in vivo målestokk som å teste nøyaktigheten av CER-analysen. Figur 3A presenterer resultatene av CER-analyse omdannelse av PrP C fra mus (CD1 stammen) substrat til PrP res ved 1) RML-stammen av mus-passaged skrapesyke, et middel som er tilpasset til muse verten 18, 2) sau klassisk skrapesyke, et middel som kan overføre til mus etter en lengre inkubasjonstid 18, og 3) noe som tilsvarerte-tailed hjort (Odocoileus virginianus) CWD og 263K stamme av hamster-passaged skrapesyke, agenter som mus er minimal eller ikke utsatt 19,20. Resulterende PrP res nivåer var variabel over muse substrater denaturert ved pH 7,4 og tilsådd med de ulike TSE-midler, mens PrP-oppløsning ble funnet i alle substrater denaturert ved pH 3,5 og podet med en TSE middel. Konvertering forholdstall som sammenligner PrP res nivåer i pH 7,4 og 3,5 substrater ble beregnet uavhengig av hverandre minst tre ganger, og gjennomsnitt ± SD er vist i figur 3B. For reaksjoner seeded av RML, konvertering forholdstall mellom pH 7,4 og 3,5 underlag var omtrent 100%. For de som er podet med skrapesyke, omdannelse i pH 7,4 substratet var ca. 75% av det i pH 3,5 substratet. CWD eller 263K-indusert omdannelse av pH 7,4 substratet var minimal. En enveis variansanalyse ble ikke skjelne en forskjell i omdannelsesforhold av RML og scrapie eller CWD og 263K, men konvertering forholdstall av RML og skrapesyke var signifikant forskjellig fra de av CWD og 263K.

CER-analysen kan bli tilpasset for bruk med humant vev eller med dyrearter hvor bioassay er for vanskelig eller ikke etisk og transgen mus produksjonen ikke er ønsket. Vi har brukt denne analysen for å karakterisere mottakelighet for ulike dyrearter til CWD. Som et eksempel på anvendelse av denne analyse, vi presenterer noen foreløpige resultater på figur 4. Hjerner fra Hunter-fanget bobcats (Lynx Rufus) ble funnet å inneholde fremdeles påvisbare nivåer av PrP C og PrP-nedbrytningsprodukter var ikke omfattende, noe som tyder på at disse vev kan være en akseptabel kilde for CER substrat (figur 4A). Substratpar generert fra Hitachi hjernen viste PrP-immunoreaktivitet av en passende molekylvekt og inneholdt ikke endogene PrP-res (figur 4B). Når bobcat CER substratpar generert fra to separate dyr ble inkubert med den samme hvithale deer CWD middel som brukes i mus CER-analysen beskrevet i figur 3, har vi funnet substrater fremstilt ved pH 7,4 hadde nivåer av PrP-res i forhold til substrater fremstilt ved pH 3,5 (Figur 4C), en indikasjon på en minimal barriere arter av bobcat PrP C til konvertering av CWD. CER for konvertering av white-tailed hjort PrP C ved samme CWD isolat brukes til å konvertere bobcat PrP C her, som en positiv kontroll, ble tidligere rapportert som 95,2 ± 18,4% i Morawski et al (2013) 15..

Figur 1
Fig. 1: Eksperimentell oversikt over CER assay to analyse substrater fremstilles ved delvis å denaturere PrP C i ikke-prion infisert hjernevev with kaotropiske løsninger på enten pH 3,5 eller pH 7,4. Substrater er podet med PrP TSE fra prion middel av interesse og eksperimentelle prøver er utsatt for 24 timers inkubering med rysting for å tillate PrP C til PrP TSE konvertering i både pH 3,5 og 7,4 substrater. Etter inkubering blir omdannelsen vurdert ved SDS-PAGE og immunoblotting. Signal densiteter avleses ved densitometri og CER beregnes av forholdet mellom pH 7,4 til pH 3,5 signal densiteter for hver eksperimentell prøve.

Figur 2
Figur 2: Kvalitetskontroll på CER underlag. (A) før deres anvendelse i CER-analysen, mus substrater fremstilt ved enten pH 7,4 eller 3,5 som målt ved immunoblotanalyse i 1) fravær av PK-behandling for å vurdere PrP C-innholdet i hver substrat paret (PrP C nivåer bør være mellom ekvivalent pH 7,4 og 3,5 substra tes for bruk i CER-analyse) og 2) tilstedeværelse av PK (100 ug / ml) behandling for å teste for pre-eksisterende PrP res i vev som brukes for å fremstille substrater (noen substrater som viser pre-eksisterende PrP res, er ikke egnet for bruk i CER-analyse). (B) For å teste for ikke-spesifikk PrP ​​res formasjon under omdannelsen analysen blir mus PrP C substrater fremstilt ved enten pH 7,4 eller 3,5 podet med konvertering buffer, ble ristet i 24 timer ved 1000 opm, 37 ° C og deretter behandlet med PK (100 ug / ml) og analysert for PrP res ved immunoblotting (høyre to baner). Non-shaken, ikke-PK behandlede mus underlag representerer total PrP C-innholdet i analyse reaksjoner (venstre to baner). For (B), er irrelevante baner er beskåret for klarhetens skyld, men hver immunoblot panel stammer fra samme gel, membran og eksponering. Immunoblots i alle paneler brukes monoklonalt antistoff SAF 83.

"> Figur 3
Figur 3:. CER analysen bruker laboratorie mus substrat (A) Mouse CER analysen underlaget forberedt på enten pH 7.4 eller 3.5 ble inkubert med RML mus-tilpasset skrapesyke, sau klassisk skrapesyke, white-tailed hjort kronisk wasting disease (CWD) eller 263K stamme av hamster-tilpasset skrapesyke i CER analysen. Kontrollprøver (merket "ingen") inneholdt bare en lik mengde av smittestoff og ingen mus substrat. Prøver ble analysert for tilstedeværelse av PK-resistent prionprotein (PrP res) ved immunoblot med monoklonalt antistoff SAF 83. Rå densitometriske verdier for hver prøve er vist nedenfor for hver kjørebane. (B) av søylediagram som viser de gjennomsnittlige forhold (± standard avvik) mellom pH 7,4 og 3,5 muse substrater for hver infeksiøst middel basert på minst tre uavhengige analyser,. Små bokstaver henviser til statistiskhomogene undergrupper (analyse av varians med Tukey-Kramer minimum betydning forskjeller metode; p <0,05). Dette tallet har blitt forandret fra Morawski et al. 2013 15.

Figur 4
Figur 4: Eksempel på bruk av CER-analyse for å undersøke bobcat mottakelighet for CWD Hitachi hjernehomogenat (A) og CER assay substrat (B) ble testet ved immunoblotting i fravær og nærvær av PK (100 ug / ml) for å vurdere eksisterende PrP C. nivå og tilstedeværelse av pre-eksisterende PrP res, respektivt. (C) Bobcat substrater ble sådd med konvertering buffer og analysert på CER-analyse for å vurdere ikke-spesifikk PrP ​​res formasjon (venstre to baner). Non-shaken, ikke-PK behandlet bobcat underlag representerer total PrP C-innholdet i analyse reaksjoner (høyre to baner).(D) Bobcat underlaget forberedt på enten pH 7.4 eller 3.5 ble inkubert med white-tailed hjort CWD bruke CER-analysen. Kontrollprøven (merket "ingen") inneholdt en lik mengde av CWD middel, men ingen bobcat substrat. Rå densitometriske verdier for hver prøve vises under hvert kjørefelt. Immunoblot i alle paneler brukes monoklonalt antistoff 3F4, som reagerer med feline prionprotein 21.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

For vellykket gjennomføring av denne protokollen, må oppmerksomhet rettes mot PrP C nivå i infisert hjernevev brukes til forbehandling (trinn 2.1.2) og frøet til underlaget ratio for konvertering reaksjoner (trinn 4.4.2). I vår erfaring, kan hjernen bli trukket ut til bruk som CER underlaget etter en lang periode obduksjon, så lenge PrP C er til stede ved immunoblotting (figur 4). Faktisk var noen autolyse observert i hjernen til de Bobcats brukes for CER studier. Likevel inkubering av substrater som stammer fra disse hjerner fortsatt resulterte i dannelsen av PrP-res. Vi spekulerer i at delvis er robustheten av CER-analysen stammer fra denaturering av CER underlag i 1,5 M GdnHCl, som vil inaktivere mange proteaser.

Frø til underlaget forhold kan trenge å være empirisk bestemt på å oppnå akseptabel PrP res signal ved immunoblotting. For mye eller for little PrP res å utføre densitometry, høy bakgrunns PrP res nivåer i kontrollprøver mangler underlaget og inkonsistente konvertering forholdstall er alle grunner til å optimalisere frø: substrat forholdstall. Variasjoner opprettholde et totalt reaksjonsvolum på 100 pl og omfatter 1:99 ul, ul 2:98 og 5:95 ul. På nesten alle anledninger, har vi funnet ut at 5:95 ul frø: underlaget volumforholdet er optimal. Uansett hva forholdet er anvendt, er like mengder av TSE middel som anvendes, og analysen er internt konsistent. Imidlertid sannsynligvis påvirker frø konsentrasjon av prion-infiserte hjernehomogenat som brukes til mal reaksjoner utfallet av CER-analyse ved at varierende frø titere eller fortynninger kan resultere i varierende grad av PrP C -to-PrP res konvertering. Denne effekt er blitt demonstrert i andre in vitro prion konverterings assays 22 og kan vanskeliggjøre sammenligning av forskjellige prion-isolater. Å løse dette i CER-analysen, frø cOuld titreres i hver PrP C underlaget utarbeidet ved pH 3,5 og 7,4 for å identifisere en rekke fortynninger som mal PrP C konvertering. Ideelle frø fortynninger unngå metning av løsningen med overskudd av frø prioner og likevel gi innsikt i følsomheten av omdannelsesreaksjonen. Alternativt kan PrP C -to-PrP res konvertering i CER prøvereaksjonen bli målt på flere, faste tidspunkter gjennom hele varigheten av forsøket og plottet som sats-til-konvertering kurver, beslektet til de avlesninger for sanntids-polymerase kjedereaksjon ( qPCR) 23 og real-time skalv indusert konvertering (RT-Quic) 24 analyser. Slike avlesninger kan tillate mer omfattende tolkninger av artsbarrierer og er en interessant fokus for fremtidig utvikling av denne metodikken.

I protokollen presenteres her, bruker vi lave bindende, med tynne vegger PCR-rørene, men vi har også brukt standard 1,5 ml rør i en termo-shaker utstyrt fordenne type rør. Ingen andre varianter til protokollen er nødvendig å bruke større størrelse rør. I vår erfaring, har vi imidlertid hatt mer PrP res produksjon og mer reproduserbare resultater i lav-bindende PCR rør sammenlignet med 1,5 ml rør. Mens forklaringer for den forbedrede utførelse av analysen i PCR-rør er bare spekulativ på dette tidspunkt, basert på resultater som indikerer at grensesnittet luft-vann er kritisk for PrP fibrillization 25, hypoteser vi at de mindre rør gir en mer optimal overflatespenning for PrP konvertering.

Kanskje sjefen begrensning til bruk av CER-analysen er i forståelse hva konvertering forholdstall representerer i form av in vivo arter barrierer determinanter, som for eksempel sykdom pene eller lengden på inkubasjonstid. Mens foreløpig ukjent, oversettelse mellom in vitro og in vivo arter barriere faktorene bør bli klarere med fortsatt bruk av CER-analysen i testing additional TSE arter barrierer som allerede er etablert i vivo og vil bidra til å kvalifisere resultater i arter der bioassay data er ikke tilgjengelig. En fordel av CER-analysen sammenlignet med PMCA er tilstedeværelsen av en intern kontroll for PrP omdannelse, nemlig pH 3,5 substrat, som kan omdannes ved hjelp av en hvilken som helst TSE middel. Denne kontroll er av verdi når det er uklart hvilken, om noen, bør TSE-stoffer forårsake uriktig folding av en eksotisk vertens PrP C. Manglende evne til en gitt verts substrat for å forsterke en bestemt TSE agent i PMCA kan tolkes som bevis på en art barriere eller kan være på grunn av tekniske svakheter. Ulemper av CER-analysen sammenlignet PMCA inkluderer begrenset forsterkning av PrP res, flere skritt i CER forbehandling og ingen kjent smittsomhet i PrP res produsert av CER reaksjoner. Det skal bemerkes at i en tidligere studie, men vi fant CER-analysen resulterte i et tilsvarende mønster av PrP res fobekreftelse som for PMCA 15. Resultatene som presenteres her indikerer også at CER analysen spår riktig arts barrierer for overføring av ulike TSE til laboratoriet mus (figur 3), og foreslår at Bobcats kan ha mottakelighet for CWD (figur 4), i samråd med rapporter om at huskatter (Felis catus) kan skaffe prionsykdom etter eksperimentell CWD utfordring 26,27. Studier ved hjelp av CER-analysen kunne kompliment PrP sekvense innsats for å forstå dyreliv mottakelighet for CWD 28.

CER-analysen muliggjør rask, rimelig, pålitelig vurdering av TSE artsbarrierer in vitro. Selv ikke en komplett erstatning for "gullstandard" av dyr bioassay, kan CER-analysen brukes som en første vurdering av eksistensen av en TSE arter barriere som kan rettferdiggjøre eller unngå en videre studier i levende dyr. Av denne grunn, og fordi analysen avhenger kunpå hjernevevet som kan erverves fra ikke-forsøksdyr, er CER i tråd med arbeidet med å erstatte, redusere og avgrense dyre eksperimentelle prosedyrer 29. I tillegg til å vurdere artsbarrierer, kan CER-analysen gir også en forenklet plattform som brukes til å undersøke mekanismer for den grunnleggende arrangement som avgrenser prionsykdom biologi: omdannelse av normal, funksjonell PrP C til en misfolded form.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12% Bis-Tris SDS-PAGE gels Life Technologies NP0342
0.5 mm Zirconium oxide beads Next Advance ZROB05 Other varieties of beads are also effective
Antibodies various suppliers Select appropriate primary and secondary antibodies for immunoblot detection of PrPres from species of interest
Bead homogenizer Next Advance BBY24M
Centrifuge Beckman Coulter 369434 High speed with temperature control
Conical tubes any brand
Cotton-tipped applicator Uline S-18991
Cuphorn sonicator Heat Systems-Ultrasonics W-380 Heat Systems-Ultrasonics, Inc. is now Qsonica, LLC
Densitometry software program UVP Vision Works LS Image Acquisition and Analysis software Other programs, such as NIH ImageJ, will also work
Dounce homogenizer Kimble Chase 885300
End-over-end mixer Labnet International H5600
Ethylenediaminetetra acetic acid Boston Bioproducts P-770 Hazardous chemical: eye irritation
Guanidine hydrochloride, 8 M Thermo Fisher Scientific 24115 Hazardous chemical: acute toxicity, skin irritation, eye irritation
Heating block Fisher Scientific 11-718
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich 435570 Hazardous chemical: strong acid
Lithium dodecyl sulfate sample buffer, 4x Life Technologies NP0008 Hazardous chemical: skin & respiratory irritation, serious eye damage, flammable solid
Methanol Fisher Scientific A454-4 Hazardous chemical: acute toxicity, flammable liquid
Microcentrifuge tubes any brand
Mini-centrifuge Labnet International C1301
N-lauroyl-sarcosine (sarkosyl) Sigma-Aldrich  L-5125 Hazardous chemical: acute toxicity, skin irritation, eye damage
Nonidet P-40 Amresco M158 Hazardous chemical: skin irritation, eye damage
SDS-PAGE gel system Life Technologies NuPAGE electrophoresis system Other SDS-PAGE systems will also work
PCR tubes (low-binding) Axygen PCR-02-L-C
Pestle homogenizer Fisher Scientific 03-392-106
pH meter Sentron SI600
Polyvinyldifluoride membrane Millipore IPVH00010
Proteinase K Promega V3021 Hazardous chemical: skin & eye irritation, respiratory sensitisation, organ toxicity
Reducing agent for SDS-PAGE samples, 10x Life Technologies NP0009
Sodium chloride Fisher Scientific 7647-14-5
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich  D6750 Hazardous chemical: acute toxicity
Sodium dodecyl sulfate Thermo Fisher Scientific 28364 Hazardous chemical: acute toxicity, skin irritation, eye damage, flammable solid
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich S5881 Hazardous chemical; strong base
Syringe BD Biosciences various Use syringe size appropriate to volumes of substrate to be homogenized
Syringe needles BD Biosciences various
Thermoshaker (PCR tube shaker) Hangzhou All Sheng Instruments MS-100
Tris base Bio Basic 77-86-1 Hazardous chemical: skin, eye, respiratory irritation
Triton X-100 Integra Chemical Company T756.30.30 Hazardous chemical: acute toxicity, eye irritation
Vortexer Fisher Scientific 12-812

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Colby, D. W., Prions Prusiner, S. B. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3, (1), a006833 (2011).
  2. Hill, A. F., Collinge, J. Prion strains and species barriers. Contrib Microbiol. 11, 33-49 (2004).
  3. Scott, M., et al. Transgenic mice expressing hamster prion protein produce species-specific scrapie infectivity and amyloid plaques. Cell. 59, (5), 847-857 (1989).
  4. Prusiner, S. B., et al. Transgenetic Studies Implicate Interactions between Homologous Prp Isoforms in Scrapie Prion Replication. Cell. 63, 673-686 (1990).
  5. Telling, G. C., et al. Prion Propagation in Mice Expressing Human and Chimeric Prp Transgenes Implicates the Interaction of Cellular Prp with Another Protein. Cell. 83, 79-90 (1995).
  6. Hill, A. F., et al. The same prion strain causes vCJD and BSE. Nature. 389, (6650), 448-450 (1997).
  7. Torres, J. M., et al. Elements modulating the prion species barrier and its passage consequences. PLoS One. 9, (3), e89722 (2014).
  8. Groschup, M. H., Buschmann, A. Rodent models for prion diseases. Vet Res. 39, (4), 32 (2008).
  9. Korth, C., et al. Abbreviated incubation times for human prions in mice expressing a chimeric mouse-human prion protein transgene. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, (8), 4784-4789 (2003).
  10. Kocisko, D. A., et al. Species specificity in the cell-free conversion of prion protein to protease-resistant forms: a model for the scrapie species barrier. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, (9), 3923-3927 (1995).
  11. Raymond, G. J., et al. Evidence of a molecular barrier limiting susceptibility of humans, cattle and sheep to chronic wasting disease. EMBO J. 19, (7), 4425-4430 (2000).
  12. Fernandez-Borges, N., de Castro, J., Castilla, J. In vitro studies of the transmission barrier. Prion. 3, (4), 220-223 (2009).
  13. Zou, W. Q., Cashman, N. R. Acidic pH and detergents enhance in vitro conversion of human brain PrPC to a PrPSc-like form. J Biol Chem. 277, (46), 43942-43947 (2002).
  14. Li, L., Coulthart, M. B., Balachandran, A., Chakrabartty, A., Cashman, N. R. Species barriers for chronic wasting disease by in vitro conversion of prion protein. Biochem Biophys Res Commun. 364, (4), 796-800 (2007).
  15. Morawski, A. R., Carlson, C. M., Chang, H., Johnson, C. J. In vitro prion protein conversion suggests risk of bighorn sheep (Ovis canadensis) to transmissible spongiform encephalopathies. BMC Vet Res. 9, 157 (2013).
  16. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Separating Protein with SDS-PAGE. JoVE. Cambridge, MA. Available from: http://www.jove.com/science-education/5058/separating-protein-with-sds-page (2014).
  17. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. JoVE. Cambridge, MA. Available from: http://www.jove.com/science-education/5065/the-western-blot (2014).
  18. Chandler, R. L. Encephalopathy in mice produced by inoculation with scrapie brain material. Lancet. 1, (7191), 1378-1379 (1961).
  19. Browning, S. R., et al. Transmission of prions from mule deer and elk with chronic wasting disease to transgenic mice expressing cervid PrP. J Virol. 78, (23), 13345-13350 (2004).
  20. Hadlow, W. J., Race, R. E., Kennedy, R. C. Experimental infection of sheep and goats with transmissible mink encephalopathy virus. Can J Vet Res. 51, (1), 135-144 (1987).
  21. Rubenstein, R., et al. Immune surveillance and antigen conformation determines humoral immune response to the prion protein immunogen. J Neurovirol. 5, (4), 401-413 (1999).
  22. Castilla, J., et al. Crossing the species barrier by PrP(Sc) replication in vitro generates unique infectious prions. Cell. 134, (5), 757-768 (2008).
  23. Kubista, M., et al. The real-time polymerase chain reaction. Mol Aspects Med. 27, 95-125 (2006).
  24. Atarashi, R., Sano, K., Satoh, K., Nishida, N. Real-time quaking-induced conversion: a highly sensitive assay for prion detection. Prion. 5, (3), 150-153 (2011).
  25. Ladner-Keay, C. L., Griffith, B. J., Wishart, D. S. Shaking Alone Induces De Novo Conversion of Recombinant Prion Proteins to beta-Sheet Rich Oligomers and Fibrils. PLoS One. 9, (6), e98753 (2014).
  26. Mathiason, C. K., et al. Susceptibility of domestic cats to chronic wasting disease. J Virol. 87, (4), 1947-1956 (2013).
  27. Seelig, D. M., et al. Lesion Profiling and Subcellular Prion Localization of Cervid Chronic Wasting Disease in Domestic Cats. Vet Pathol. (2014).
  28. Stewart, P., et al. Genetic predictions of prion disease susceptibility in carnivore species based on variability of the prion gene coding region. PLoS One. 7, (12), e50623 (2012).
  29. Russell, W. M., Burch, R. I. The Principles of Humane Experimental Technique. Metheun. Methuen. (1959).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics