Kültürlü HL-1 Atriyal miyositlerdeki Monolayer Gerilim ve Kalsiyum Çift Kanal Optik Haritalama

* These authors contributed equally
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Yan, J., Thomson, J. K., Zhao, W., Fast, V. G., Ye, T., Ai, X. Voltage and Calcium Dual Channel Optical Mapping of Cultured HL-1 Atrial Myocyte Monolayer. J. Vis. Exp. (97), e52542, doi:10.3791/52542 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Optik haritalama kalpleri ex vivo hem sağlam ve kültürlü miyosit mono tabakaları kardiyak elektriksel aktiviteyi tespit etmek için değerli bir teknik olduğu kanıtlanmıştır. HL-1 hücreleri, yaygın olarak kalp fizyolojisi çeşitli yönlerini incelemek için bir 2-boyutlu hücresel bir model olarak kullanılmıştır. Ancak, bir kültür HL-1 atriyal hücre tek tabaka içinde aynı görüş alanında aynı anda optik haritası kalsiyum (Ca) geçici ve aksiyon potansiyelleri büyük bir sorun olmuştur. Özel kullanım ve bakım elektriksel yakalanan ve optik eşlenebilir sağlıklı hücreleri hazırlamak için gerekli olmasıdır. Bu nedenle, biz çift kanallı optik haritalama için optimal çalışma protokolü geliştirdik. Bu yazıda, çift kanallı optik haritalama deneyi gerçekleştirmek için nasıl ayrıntılı olarak tarif var. Bu protokol aritmi gelişiminde aksiyon potansiyeli yayılması ve Ca kinetik anlayışı geliştirmek için bir araçtır.

Introduction

Benzersiz kalsiyum (Ca) ve gerilim (V m) çift kanal optik haritalama tekniği 1-5 eşzamanlı sağlam kalpleri ve kültürlü hücre tek tabakalarında hem de V m ve Ca sinyallerini kaydetmek için etkili bir araç olarak ortaya çıkmaktadır. Bu teknik sayesinde daha iyi kardiyak aritmilerin yatan elektrofizyolojik mekanizmaları anlamak için kalsiyum geçici ve aksiyon potansiyellerinin arasındaki ilişki ile ilgili güçlü bilgi edinmek için yapar.

Kültürlenmiş hücre tekli katmanları, kardiyak elektrofizyoloji ve aritmiler altında yatan mekanizma üzerinde çalışmak için yararlı bir hücre modeli olduğunu kanıtlamıştır. 4,6-8 HL-1 hücreleri, iyi karakterize edilmiş atriyal miyosit kültür çizgisidir. HL-1 hücreleri de morfolojik, elektrofizyolojik ve yetişkin atriyal miyositlerin farmakolojik özelliklerini içeren benzersiz farklılaşmış genotip ve fenotip korumak. Bu hücreler importa dahil olmak üzere kalp genleri ve proteinleri ekspresent kardiyak iyon kanalları (örneğin, L- ve T-tipi kalsiyum kanalları) 9 ve sarkomerik kontraktil proteinlerin olgun izoformları normal diğerleri gibi yetişkin atriyal miyositlerde bulunan ve daha önce de bildirilmiştir. 10-13 Buna ek olarak, HL-1 hücreleri olabilir 2-boyutlu (2-D), miyosit mono-katman oluşturmak için kültürlendi. Bu nedenle, kültürlenmiş HL-1 tek tabakaları kullanılmasının avantajları şunlardır: 1) göreceli olarak düşük bir maliyet ve kolay bir izole edilmesi ve birincil yenidoğan miyositleri kültür daha miyosit kültür satır elde etmek için; 2) hücrelerinin konfluent tek tabaka kalbin 3-B yapısından kaynaklanan yapısal karmaşıklığı azaltır; 3) Bir hücre tek tabaka sağlam kalbinde meydana interstisyel fibrozis girişim ortadan kaldırabilir. Bu fibroblast ve arası matris müdahalesi olmadan miyositler bir grup özel elektrofizyolojik fonksiyonlarını incelemek için de kullanılabilir; Cul farmakolojik veya genetik manipülasyon fonksiyonel sonuçları 4) değerlendirilmesiYapılandırılmış hücre mono tabakaları etkili bir şekilde elde edilebilir. Bu nedenle, HL-1 hücreleri miyosit fizyolojisi farklı yönlerini yanı sıra pili kaynaklı anormal elektriksel faaliyetleri incelemek için yaygın olarak kullanılan hücresel model haline gelmiş. Harici cevap 13-16 Ancak, özel işlem ve bakım kültürü için gerekli sağlıklı hücre tek tabakaları Optik haritalama çalışmaları için elektrik pili. Buna ek olarak, ikili floresan boya boyama işlemi kolayca kültüre karışan hücre monokatmanlarından bütünlüğünü zarar verebilir. Böylece, kültürlü HL-1 mono tabakaları performans V m / CA çift kanallı optik haritalama büyük bir mücadele olmuştur.

Bu yöntemin amacı, başarılı bir şekilde kültür HL-1 tek katmanlarda çift kanal optik eşleme gerçekleştirmek için temel aşamalarının temin edilmesidir. Burada HL-1 hücre tek tabaka hazırlanması, bir kültür hücre tek tabaka çift kanal optik haritalama ve haritalama veri işleme için optimize edilmiş protokol kapsamlı detaylar sağladı.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Çözüm hazırlanması

  1. Norepinefrin (NP) çözeltisi
    1. . Saflaştınlmış Milli-Q (MQ), 25 ml su içinde, 30 mM askorbik asit (0,1475 g askorbik asit, 25 ml içine NP 40 mg çözülür norepinefrin (NP) ışığa duyarlı olduğu için bu çözüm hazırlanması sırasında doğrudan ışığa maruz kaçının.
    2. 0.22 mikron şırınga filtresi ile NP çözüm Filtre. -20 ° C'de 1 ml steril mikrotüpler içine çözeltisi ve mağaza alikosu. Dondurulmuş sonra, NP, bir ay boyunca stabildir.
  2. Tümlenmiş Yıkama ve Son Claycomb medya
    1. Claycomb ortamının 43.5 ml ile başlar ve fetal sığır serumu (FBS), 5 ml, penisilin / streptomisin, 0.5 ml, NP, 0.5 ml, 1 ile ek: son takviye Claycomb ortamı 50 ml yapmak için L-glutamin seyreltildi 100. Claycomb orta ışığa duyarlı olduğundan bu çözüm hazırlanması sırasında doğrudan ışık maruz kalmaktan kaçının.
    2. Sup aynı tarifi kullanarak yıkayın Claycomb orta hazırlayınhariç eklentilerle Claycomb ortamı% 5 FBS ekleyebilir ve NP ve L-glutamin bileşenleri ihmal.
      NOT: Doğrudan ışığa maruz kalmadan 4 ° C'de saklandığında takviye Final ve Yıkama Claycomb medya iki hafta için iyi.
  3. Soya fasulyesi tripsin önleyici çözelti
    1. Ca-içermeyen ve Mg-içermeyen Dulbecco fosfat tamponlu tuzlu su, 100 ml (PBS) içine soya fasulyesi tripsin inhibitörü, 25 mg eritin.
    2. 0.22 mikron şırınga filtre kullanarak çözüm Filtre.
      Not: 4 ° C'de depolandığında steril çözelti, bir ay boyunca stabildir.
  4. Jelatin / Fibronektin çanak kaplama çözümü
    1. % 0.02 jelatin yapmak için MQ 500 ml su içine jelatin ve 0.1 g.
    2. Otoklav, ardından% 0.02 jelatin 199 ml fibronektin 1 ml sulandırmak ve hafifçe karıştırın.
    3. Kısım, -20 ° C'de jelatin ayrı tüplere çözeltisi ve deposunun 6 mi.
  5. Hanks tuz çözeltisi
    1. Bir heyecan kullanmalevha, NaCl (136.9), KCI (5,366), KH 2 PO 4 (0,4409) NaH 2 PO 4 (0,4000), MgSO 4 (0,8142), D-GLC MQ su (mg / L) içinde, aşağıdaki tuzlar eritildi (5,051), NaHCO 3 (4,162), HEPES (5,042), CaCl2 (1,261).
  6. Kalsiyum duyarlı bir boya (Rhod2) çözeltisi
    1. Bir Rhod2 -20 ° C 'de stok çözeltisi ve mağaza boya için DMSO içinde% 20, Pluronic F-127 400 ul Rhod2 kuru tozun, 1 mg seyreltin.
    2. Deneye başlamadan önce, son çalışma çözeltisi için 1.000 Hanks tuz çözeltisi ile: bu stok çözeltisi 1 seyreltin.
  7. Voltaja duyarlı bir boya (Rh237) çözeltisi
    1. -20 ° C de stok çözeltisi ve depolayın DMSO 2 ml Rh237 5 mg seyreltin. Deneye başlamadan önce son bir çalışma çözüm yapmak için 1.000 Hanks 'Tuz çözeltisi ile: stok solüsyonu 1 sulandırınız.

& #160; Not: 4/1 çözüm küçük değişiklikler ile Claycomb HL-1 hücre kültürü protokolüne dayanmaktadır.

2. Pasajlanması ve Kültürleme HL-1 Atriyal miyositlerde lameller üzerine

NOT: HL-1 hücreleri, Dr. Claycomb (Louisiana Eyalet Üniversitesi) elde edilebilir.

  1. T25 şişelerinde HL-1 hücrelerinin büyümeye ve günlük takviye Claycomb 5 ml ortam ile beslenir. Geçiş T25 hücreleri Claycomb HL-1 hücre kültürü protokolü (aşağıda tarif edilen), 10 göre, her beş günde şişeleri.
  2. 24 saat T25 şişesi içinde hücreler önce 12 gözlü kültür levhaları içerisine Mermiyi lamelleri (20 mm çapında) pasajlandı ve daha sonra gece boyunca 37 ° C'de jelatin / fibronektin ile lamelleri kapak için tamamen birleşir ve hazır.
  3. Sonraki gün, aspirat ve kültür plakalarından jelatin / fibronektin atmak ve de her takviye Nihai Claycomb ortamı, 1.5 ml ile değiştirin.
  4. Bir T25 Kültür Split hücreleraspire birleşik kültürü içeren T25 şişesi ortamı ve 37 ° C 'de PBS ile kısa süreli bir kültür durulama 5. günde tam kaynaşmaya eriştikten sonra E şişe.
  5. PBS aspire ve hücreler ile doğrudan temasını engellemek için T25 şişesi alt üzerine tripsin / EDTA ile pipetleme 37 ° C'de, 3 ml% 0.05 tripsin / EDTA ilave edin. 1 dakika için 37 ° C'de inkübe edilir.
  6. Aspirasyon ile tripsin / EDTA çıkarın ve T25 şişesi başına başka tripsin 1.3 ml / EDTA ekleyin. 1 dakika için oda sıcaklığında inkübe edilir. Bir mikroskop altında incelemek ve hücreler hala balona bağlı ise, tam kalan hücreleri çıkarmak için dokunun.
  7. 15 ml'lik bir santrifüj tüpü içine şişeden hücreler ve transfer hücrelere soya fasulyesi tripsin inhibitörü, 1.3 ml ilave edilir. Yıkama Claycomb 5 ml ortam ile boş bir şişe durulayın. 15 ml'lik bir santrifüj tüpü içinde hücrelere durulama ekleyin. 5 dakika boyunca 500 x g'de santrifüjleyin.
  8. Yavaşça süpernatant aspire ve santrifüj sonra hücre pelet yeniden askıyatakviye Nihai Claycomb ortamı 6 ml.
  9. Hücre pasajlayarak hücre süspansiyonu, 0.5 ml, 12-çukurlu bir levhanın her çukuruna Tohum. Günlük taze katkılı Final Claycomb ortamı ile hücreleri besleyin.
    NOT: yakından hücrelerinin büyümesini izlemek, tipik hücre tek tabakaları günde 4 birleşen durumunu ulaşmak ve spontan aktiviteler görünür kalır. Ardından, kültürlü tek tabakalı günde 4-5 optik haritalama için hazır olacak.

Hücreler 3. yükleme kalsiyum ve Voltaja duyarlı boyalar

  1. Optik haritalama çalışmaları için, hafifçe 12-yuvalı hücre kültürü plakasının lamel çıkarın ve Hanks tuz çözeltisi ile yıkayın.
  2. Ca duyarlı bir boya Rhod2 ile hücreleri boyamak için, 3 ml lamel, hücre tekli tabakası inkübe oksijen, 30 dakika için bir su banyosu içinde 37 ° C 'de Rhod2 çalışma çözeltisi (% 5 CO 2/95% O 2 gaz kabarcıkları) .
  3. V m duyarlı boya hücreleri boyamak içinRh237, başka bir 15 dakika için bir su banyosu içinde 37 ° C'de oksijenlenmiş Rh237 hazır çözelti 3 ml Rhod2 yüklü hücre tek tabaka bırakın.

4. Çift Kanallı Optik Haritalama

  1. Bir ters floresan mikroskop üzerinde bir sirkülasyon odasına, V m ve Ca boyalarla çift lekeli hücre tek tabaka, yerleştirin. 35 ± 1 ° C'de hücre odasının sıcaklığı tutmak için ısıtmalı sirkülasyon sistemi kullanın. Dikkatle bölmesi üzerinde fazla 0.3 ° C kadar bir gradyan önlemek için bölme içinde dolaşan akım hızını ayarlayarak perfüzat sıcaklığı kontrol eder.
    1. V m / Ca sinyallerini kaydetmeye önce, önceki boyama aşamalarına kalan boyayı çıkarmak için yaklaşık 5 dakika boyunca, taze Hanks çözeltisi ile hücre mono tabakasının yıkayın.
  2. Hanks tuz çözeltisi ve bir SILV dolu bir cam pipet oluşan iki kutuplu bir elektrot kullanarak Pace sağlıklı hücre mono tabakalarıer daha önce olduğu gibi pipet sarılı tel 12,17 nitelendirdi.
  3. Yaklaşık 1 mV bir pacing eşiği bekliyor 2 msn 200-500 milisaniye ve darbe genişliği bir döngü uzunluğunda hızı sağlıklı hücre tek tabakaları.
    Not: kültüre edilmiş mono tabakaların her parti için, en az iki muamele edilmemiş tek tabakalar, hücre toplu durumunu test etmek için kullanılır. Sağlıklı kontrol mono tabakaları 200-500 msn çevrim uzunlukları elektrik pili tarafından yakalanan gerekir. Kontrol mono tabakalar elektrik tempolu olması halinde, bu, tüm hücre yığın optik haritalama deneyleri için uygun olmayabilir göstermektedir.
  4. V m ve Ca duyarlı boyalar, her iki tahrik etmek için, bir uyarım filtre (510 nm / 40) ve bir dikroik ayna (561 nm) ile bağlanmış bir LED ışık kaynağını (520 nm dalga boyu) kullanın.
    1. V m bileşenine bir dikroik ayna (594 mil) ve bir Ca bileşeni ile 40X objektif ve bölünme yoluyla hücreler tarafından yayılan flüoresans sinyallerini toplamak.Bir bant geçiren filtre ile Ca kanal uzun geçiş filtresi (700 nm) ve yayılan ışık V m kanal yayılan ışığı Filtre (585/40 nm).
    2. İki CCD kameralar (; redshirt Görüntüleme 80 x 80 piksel, 1,000 fps) kullanarak filtre floresan ışığı toplayın.
    3. Boya photobleaching önlemek için, ışığa maruz kalma süresini sınırlamak için görüş her alanda en az 2 saniye kayıt olun. Burada, tipik görüntü her tek tabaka için dört farklı alanlarda.

V m veya Ca Recordings 5. Veri İşleme

  1. Hem V m ve Ca sinyalleri (80 x 80 piksel) için, arka plan gürültüsünü azaltmak için farklı kayıt süresi noktalarında bir yoğunluk değerine yoğunluğu yirmi beş (5 x 5) değerleri komşu pikselleri ortalama.
    NOT: veri ortalamaya sonra, bir bireysel eylem potansiyeli veya Ca geçici her kayıt süresi noktası ortalama x 16 16 yoğunluk değerleri ortalama içeren bir veri matrisi (verir50 um bir mekansal çözünürlükte veri kanalları).
  2. Kaydedilen V m veya Ca sinyallerinin aktivasyon süresi (AT) tanımlayın.
    1. Daha önce tarif edildiği gibi tek başına bir eylem potansiyeli veya Ca geçici bir aktivasyon süresi (AT) tanımlamak için, V m veya ısmarlama MATLAB dayalı bir algoritmayı kullanarak Ca sinyallerin tepe genlik% 50 süresini hesaplamak. 12
    2. Manuel Program analizi sırasında oluşabilecek hataları ortadan kaldırmak için analiz ATS tashih.
    3. Matrisin AT tanımlanan depolamak kullanılan yazılım, sırasıyla kaydedilen aksiyon potansiyeli ve kalsiyum geçici, (16 x 16 veri kanalları ortalama).
  3. Daha önce küçük değişiklikler 12,18 ile açıklandığı gibi vektör alanı analizi yöntemi kullanılarak AT matrisi üzerinde aksiyon potansiyeli veya kalsiyum geçici iletim hızı (CV) vektörleri hesaplayın.
    1. (5 × onun veri noktaları AT çevredeki bir veri kanalı akrabası CV vektör hesaplayın; 5 komşu MATLAB programı 12,18 içinde en az kare algoritması kullanarak) yüzeye AT aktivasyon süreleri (bir düz polinom yüzeyi simüle etmek) veri kanalları ortalama.
    2. Aşağıdaki formüller kullanılarak iletim vektör hesaplayın
      Formül 1:
      Denklem 1
      Formül 2:
      θ = arctan [(dy / dt) / (dx / dt)]
      NOT: Ve x- ve y-eksenleri olarak tahmin CV vektörü; dx / dt x ekseninde CV vektör projeksiyonu; dy / dt y-ekseninde CV vektör projeksiyonu. T AT yüzey; x, y koordinatları 2-D bakın; T, x = ∂T / ∂X x göre T kısmi türevi olduğu; T y = ∂T / ∂y y ile ilgili T kısmi türevi olduğu; θ CV vektörü son yönü.
    3. Pusula on derece sektörünü kapsayan her biri 36 yollara AT matris Grubu, tüm vektörler. </ Li>
    4. 36 iletim yollarının arasında CV vektörlerin en büyük nüfusa içeren yolunu seçin. Tek tabaka CV temsil etmek, bu yolun ortalama CV hesaplayın.

Wave Front Yayılma 6. Görselleştirme

  1. MATLAB kullanarak pik değerine bağlı olarak farklı kayıt zaman noktalarında bağımsız bir aksiyon potansiyelinin veya Ca geçici sinyal şiddetini normalize.
  2. Geçici kullanılan MATLAB yazılımı 16 x 16 yoğunluk matris içine kaydedilen her zaman noktasında normalleştirilmiş yoğunluk verileri depolamak.
  3. Surf.m fonksiyonunu kullanarak her kayıt süresi noktasının saklanan yoğunluğu matris bir renk kodlu yoğunluk haritası Construct.
    NOT: yoğunluk haritasında, kırmızı V m veya Ca sinyallerinin yüksek yoğunluğunu temsil eder ve mavi floresan sinyalleri düşük yoğunluğunu yansıtır.
  4. Avifile.m işlevini kullanarak bir .avi dosyası oluşturun.
  5. Tüm i kaydetaddframe.m işlevini kullanarak aksiyon potansiyeli veya Ca geçici farklı kayıt süresi noktalarında ntensity haritalar.
    NOT: Bu noktada, V m ve Ca yayılma iki ayrı avi dosyaları oluşturulur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Film 1 gösterildiği gibi bir kültür birleşik tek tabaka düzenli bir içsel ritmi sergiler. Biz o zaman tam konfluent HL-1 tek tabaka V m / Ca çift kanallı optik haritalama gerçekleştirdi. Şekil 1A kaydedilmiş bir tek V m ve Ca sinyallerinin örnek izlerini göstermektedir yendi. Eşit yayılır V m ve çift kanallı optik haritalama sistemi kullanılarak, Ca sinyallerinin Örnek eş zaman haritaları Şekil 1B ve 1C'de gösterilmiştir. Eşit yayılır aksiyon potansiyelleri ve Ca geçici Temsilcisi kronolojik görüntüleri aynı HL-1 kültür tek tabaka elde edilmiştir. Son olarak, Filmler 2 ve 3 HL-1 birleşen tek tabaka içinde homojen yayılan aksiyon potansiyeli (Film 2) ve kalsiyum geçici (Film 3) animasyon örneklerini sunmak.

Sayfalık = "always"> Şekil 1,
Şekil 1: (A) 500 msn siklus uzunluğunda (CL) bir elektriksel tempolu ritmi V m (mavi) ve Ca (kırmızı) Örnek izleri. (B) HL-1 mono tabakaları için optik haritalama sisteminin bir görüntü. (C), bütün görüş alanının boyunca aynı tempolu tempodan etkime potansiyeli yayılımının bir eş zaman haritası. (D) görme alanı boyunca aynı tempolu ritmi Ca geçici yayılma bir eş zaman haritası. Her iki eş zaman haritalarda, zaman atlamalı 50 milisaniye de başlatılması ve koyu kırmızı gibi koyu mavi ile başlayan, renkleri ile temsil edilmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

/52542/52542fig2highres.jpg "/>
Şekil 2: (A) 60 V m dağılımı haritaları serisi, 80, 140, ve kayıt başladıktan sonra 200 msn. (B) 60 ° Ca dağıtım Haritalar, 80, 140, ve kayıt başladıktan sonra 200 msn.

Film 1: 40X amacı ile bir ışık mikroskobu altında, kültür günde beş bir birleşene HL-1 tek tabaka kaydedilmiş bir temsilci film.

Film 2 : 500 msn bir CL bir pace ritmi yayılan bir aksiyon potansiyelinin bir temsilci film.

Film 3 : Bir pac yayılan bir Ca geçici bir temsilci filmed 500 msn bir CL de yendi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu makalede, kalsiyum ve gerilim duyarlı floresan boyalar ile boyanmış bir kültür HL-1 atriyal miyosit tek tabaka optik haritalama kilit yönlerini açıklar. Bu, optimal HL-1 hücre tek tabaka, haritalama ekipman kurulumu kültürleme bir kültür tek tabaka eşleme ve veri analizi içerir.

Başarıyla kültür hücreleri eşleştirmek için, anahtar düzgün yayılı hücre tek tabaka hazırlamaktır. Lamelleri üzerine hücreleri ekim yaparken, eşit hücrelerini dağıtmak için emin olun. Bu en iyi elektriksel atışı cevap verecektir Daima, tam büyümüş ve tamamen konfluent hücre tek tabakaları harita. Bu boyalar yüklenirken oksijenli hücreleri tutmak da önemlidir, ancak oksijen kabarcıkları bu öldürmek veya lamel onları çıkarmak olabilir hücrelerle doğrudan temas etmemelidir. Boya konsantrasyon derecesinden artırırken, boya konsantrasyonu düşürme ve sinyal şiddetini azaltmak ve sinyal gürültü oranını azaltacaktır ışık yoğunluğunu azaltmakve sinyal büyüklüğünü artırmak değil, aynı zamanda gürültü artacaktır ışık yoğunluğunu arttırıcı. Bu nedenle, floresan boya konsantrasyonu ve uyarım ışık gücü arasında optimal bir denge noktası kayıt sinyallerinin sinyal gürültü oranını arttırmak için belirlenmelidir. Bu ışık maruz alanda fotodinamik hücre hasarına neden olabilir Dahası, optik haritalama kayıt sırasında, konsantre ışık uzun pozlama hücre tek tabaka maruz kalmasını önlemek için emin olun. Son olarak, kayıt sinyallerin yüksek zamansal ve uzaysal çözünürlüğü sağlayan bir optik haritalama sistemi, yüksek kaliteli veri elde etmek için gereklidir.

Sağlam kalplerde çift kanal optik haritalama nedeniyle eşzamanlı toplamak gerilim ve kalsiyum sinyalleri yeteneği kardiyak elektrofizyoloji eğitimi için büyük bir potansiyele sahip olmakla birlikte, bir sınırlama bu tekniğin 2-D projeksiyon haritası olarak 3-D yüzeyinden bilgi toplar olduğunu. 3-D curvat göz ardı bilgi bozulmamış kalpleri 2-D Elde edilen verilerveri özellikle iletim hızı analizinde, analiz kalbin ure hatalara neden olabilir. Bir kültüre 2-D HL-1 hücre modeli kullanmanın avantajları ile, biz (üniforma veya olmayan, düzenli ve düzensiz ritimleri görselleştirmek Ca geçici ve aksiyon potansiyeli kinetik değerlendirmek, iletim hızını belirlemek ve Ca ve aksiyon potansiyeli yayılma desenleri karakterize edebiliyoruz sağlam bir kalbin 3-B yapısı karışmadan düzgün yayılması). Bu nedenle, başarılı bir ücretsiz bir yaklaşım olarak bir kültür HL-1 atriyal miyosit tek tabaka halinde geçici kalsiyum ve aksiyon potansiyelleri hem haritalama büyük ölçüde atriyal miyositlerin elektrofizyolojik özellikleri ve atriyal aritmogenez altında yatan mekanizmaların anlaşılması artırabilirsiniz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Biz HL-1 hücreleri ve ayrıntılı bakım protokolü sağlamak için Dr. Claycomb teşekkür etmek istiyorum. Biz de bizim çift kanal optik haritalama sistemi için bazı aksesuarlar yapım ile yaptığı yardım için hücre film ve Sayın Pete Caron üreten ile yardım için Bayan Elena Carrillo ve Dr Seth Robia teşekkür etmek istiyorum.

Bu eser (XA 10GRNT3770030 & 12GRNT12050478) Amerikan Kalp Derneği, Ulusal Sağlık Enstitüleri (XA HL113640), ve (XA) Loyola Üniversitesi Araştırma Geliştirme Fonu tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Rhod2 dry powder AAT Bioquest 21062
pluronic AAT Bioquest 20050
DMSO Sigma 276855
Rh237 Invitrogen S-1109
NaCl Sigma S7653
KCl Sigma P3911
KH2PO4 Sigma P0662
NaH2PO4 Sigma S9638
MgSO4 Sigma M7506
D-Glucose Sigma G8270
NaHCO3 Sigma S6014
CaCl2 Sigma C3881
HEPEs Sigma H3375

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G. Optical imaging of the heart. Circ Res. 95, (1), 21-33 (2004).
  2. Salama, G., Hwang, S. M., et al. Simultaneous optical mapping of intracellular free calcium and action potentials from Langendorff perfused hearts. Current protocols in cytometry / editorial board, J. Paul Robinson, managing editor ... [et al.]. 12, (Unit 12 17), (2009).
  3. Laurita, K. R., Singal, A. Mapping action potentials and calcium transients simultaneously from the intact heart. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 280, (5), H2053-H2060 (2001).
  4. Fast, V. G. Simultaneous optical imaging of membrane potential and intracellular calcium. J Electrocardiol. 38, (4 Suppl), 107-112 (2005).
  5. Sowell, B., Fast, V. G. Ionic mechanism of shock-induced arrhythmias: role of intracellular calcium. Heart Rhythm. 9, (1), 96-104 (2012).
  6. Fast, V. G., Kleber, A. G. Microscopic conduction in cultured strands of neonatal rat heart cells measured with voltage-sensitive dyes. Circ Res. 73, (5), 914-925 (1993).
  7. Hou, L., et al. A major role for HERG in determining frequency of reentry in neonatal rat ventricular myocyte monolayer. Circ Res. 107, (12), 1503-1511 (2010).
  8. Beauchamp, P., et al. Relative contributions of connexins 40 and 43 to atrial impulse propagation in synthetic strands of neonatal and fetal murine cardiomyocytes. Circ Res. 99, (11), 1216-1224 (2006).
  9. Xia, M., et al. Functional expression of L- and T-type Ca2+ channels in murine HL-1 cells. J Mol Cell Cardiol. 36, (1), 111-119 (2004).
  10. Claycomb, W. C., et al. HL-1 cells: a cardiac muscle cell line that contracts and retains phenotypic characteristics of the adult cardiomyocyte. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, (6), 2979-2984 (1998).
  11. Fahrenbach, J. P., Ai, X., Banach, K. Decreased intercellular coupling improves the function of cardiac pacemakers derived from mouse embryonic stem cells. J Mol Cell Cardiol. 45, (5), 642-649 (2008).
  12. Yan, J., et al. c-Jun N-terminal kinase activation contributes to reduced connexin43 and development of atrial arrhythmias. Cardiovasc Res. 97, (3), 589-597 (2013).
  13. White, S. M., Constantin, P. E., Claycomb, W. C. Cardiac physiology at the cellular level: use of cultured HL-1 cardiomyocytes for studies of cardiac muscle cell structure and function. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 286, (3), H823-H829 (2004).
  14. Yang, Z., Shen, W., Rottman, J. N., Wikswo, J. P., Murray, K. T. Rapid stimulation causes electrical remodeling in cultured atrial myocytes. J Mol Cell Cardiol. 38, (2), 299-308 (2005).
  15. Brundel, B. J., Kampinga, H. H., Henning, R. H. Calpain inhibition prevents pacing-induced cellular remodeling in a HL-1 myocyte model for atrial fibrillation. Cardiovasc Res. 62, (3), 521-528 (2004).
  16. Umapathy, K., et al. Electrogram fractionation in murine HL-1 atrial monolayer model. Heart Rhythm. 5, (7), 1029-1035 (2008).
  17. Fast, V. G., Cheek, E. R. Optical mapping of arrhythmias induced by strong electrical shocks in myocyte cultures. Circ Res. 90, (6), 664-670 (2002).
  18. Bayly, P. V., et al. Estimation of conduction velocity vector fields from epicardial mapping data. IEEE Trans Biomed Eng. 45, (5), 563-571 (1998).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics