Automatizado Cuantificación de células hematopoyéticas - Interacciones de células del estroma en histológicas Imágenes de descalcificados Hueso

Developmental Biology

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Zehentmeier, S., Cseresnyes, Z., Escribano Navarro, J., Niesner, R. A., Hauser, A. E. Automated Quantification of Hematopoietic Cell – Stromal Cell Interactions in Histological Images of Undecalcified Bone. J. Vis. Exp. (98), e52544, doi:10.3791/52544 (2015).

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Abstract

La microscopía confocal es el método de elección para el análisis de la localización de múltiples tipos de células dentro de los tejidos complejos, tales como la médula ósea. Sin embargo, el análisis y la cuantificación de la localización celular es difícil, ya que en muchos casos se basa en el recuento manual, teniendo así el riesgo de introducir un sesgo rater-dependiente y la reducción de la fiabilidad entre. Por otra parte, a menudo es difícil juzgar si la co-localización entre dos células resultados de posicionamiento aleatorio, especialmente cuando los tipos de células se diferencian fuertemente en la frecuencia de su ocurrencia. Aquí, se introduce un método para la cuantificación insesgada de co-localización celular en la médula ósea. El protocolo describe la preparación de la muestra utilizado para obtener secciones histológicas de los huesos largos murinos enteros incluyendo la médula ósea, así como el protocolo de tinción y la adquisición de imágenes de alta resolución. Un flujo de trabajo de análisis que abarca desde el reconocimiento de hematopoyéticas y no hemattipos de células opoietic en imágenes de la médula ósea de 2 dimensiones (2D) a la cuantificación de los contactos directos entre esas células se presenta. Esto también incluye un análisis de vecindad, para obtener información sobre el microambiente celular que rodea a un determinado tipo de célula. Con el fin de evaluar si co-localización de dos tipos de células es el mero resultado de posicionamiento celular aleatoria o refleja asociaciones preferenciales entre las células, una herramienta de simulación que es adecuado para probar esta hipótesis en el caso de hematopoyéticas, así como las células del estroma, es se utiliza. Este enfoque no se limita a la médula ósea, y se puede ampliar a otros tejidos para permitir reproducible análisis, cuantitativa de los datos histológicos.

Introduction

Debido a los rápidos avances tecnológicos recientes en microscopía, incluyendo imágenes ópticas, el análisis de las células dentro del contexto de todo el tejido se ha convertido cada vez más accesible para los inmunólogos. La caracterización de las células individuales en suspensión representa un método valioso e indispensable para entender la función celular y molecular. Sin embargo, el análisis de las células dentro de su (micro) -anatomical medio ambiente es esencial para la comprensión de las interacciones entre los diversos tipos de células que colaboran en procesos complejos, tales como el desarrollo de respuestas inmunes.

Si bien es relativamente fácil para los microscopistas para obtener información cualitativa de las imágenes, sigue siendo un desafío para cuantificar estos datos, en parte debido al hecho de que los métodos de análisis en este campo se están quedando atrás en comparación con lo que es posible en la adquisición de imágenes. Muchos investigadores todavía dependen de tiempo de conteo manual de células en sus imágenes de histología,introduciendo así un sesgo entre los diferentes evaluadores y dificultando la replicación por otros grupos. A menudo, se elige una imagen representativa para subrayar una declaración sobre la posición celular o co-localización en una publicación, por lo que es difícil para el lector a juzgar la relevancia estadística de tal evento.

Junto con el hecho de que el contenido de la información completa de los datos de la imagen raramente explotado, esto pone de relieve la necesidad de un enfoque más imparcial, rápido y completo para analizar imágenes histológicas.

La médula ósea es un tejido complejo, que lleva en funciones vitales importantes como el órgano de la hematopoyesis en los vertebrados adultos. Además de ser el lugar de nacimiento de las células hematopoyéticas 1,2 y jugar un papel importante en el desarrollo de linfocitos B 3, que también actúa como un sitio donde se inician 4 reacciones inmunes y apoya, células B maduras recirculación 5. Además, su papel en el mantenimiento imemoria mmunological cada vez más valorada en la última década, ya que se han encontrado varios tipos de células que constituyen la memoria inmune a residir allí 6-9.

La relación entre el complejo de la arquitectura del tejido de la médula ósea y sus funciones siguen siendo difícil de alcanzar. A diferencia de los órganos linfoides secundarios, que se organizan en la macro-departamentos, tales como zonas de células T y B, la médula ósea carece de una clara macro-compartimentación. Hasta ahora distintos compartimentos en la médula ósea se definen por su proximidad a la corteza del hueso o de la vasculatura. La importancia de las distintas poblaciones de células del estroma residentes en la médula ósea por una serie de procesos tales como las células madre de apoyo, el desarrollo de las células B o el mantenimiento de las poblaciones de células de memoria inmunes (tales como células de plasma de larga vida (PCs), CD4 + y CD8 + células T de memoria) indica claramente que existe un cierto grado de micro-compartimentación en la médula ósea.

10. La visualización y caracterización de células estromales en la médula ósea es difícil debido a sus características morfológicas con largos, las extensiones dendríticas delgada que forma una red a lo largo de la médula ósea, y la falta de marcadores apropiados para discriminar subpoblaciones estromales.

Aún no está claro hasta qué punto estos nichos tienen características comunes con respecto a su compositio celular y molecularn, y qué elementos hacen que un determinado nicho único. Además de las células del estroma, se ha demostrado tipos de células hematopoyéticas a desempeñar un papel crucial al proporcionar ciertas señales al menos para algunos de los nichos. Claramente, la complejidad de la composición nicho requiere su análisis in situ, y se ha convertido cada vez más importante para los inmunólogos y hematólogos para hacer un zoom en la microarquitectura ósea de hueso, por ejemplo, mediante el análisis de las relaciones espaciales entre sus componentes celulares.

Aquí, una estrategia para cuantificar las relaciones co-localización y vecinales celulares en la médula ósea de una forma automática e imparcial se presenta. Un flujo de trabajo detallada, incluyendo la generación de ratones quiméricos, que alberga las células fluorescentes del estroma y células hematopoyéticas no fluorescentes, la preparación de las secciones histológicas de los huesos sin descalcificar, adquisición de imágenes confocales que cubren todo el hueso, así como el análisis de imágenes automatizado de c celularo-localización y su validación / discriminación de colocación al azar por una herramienta de simulación se proporciona (Figura 8).

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Protocol

Los experimentos con animales fueron aprobadas por los comités estatales apropiadas para el bienestar animal (Landesamt für Gesundheit und Soziales, Berlín) y se realizaron de acuerdo con las directrices y la normativa vigente (licencia experimento con animales G0194 / 11).

1. Generación de ratones quiméricos fluorescente de Médula Ósea

NOTA: La generación de la médula ósea fluorescente ratones quiméricos para visualizar las células estromales de médula ósea se realizó como se describió antes 9.

  1. Comience el tratamiento Del-Cre x ratones ROSA-tdRFP (ratones que expresaban la proteína tándem rojo fluorescente (tdRFP) ubicua 11-13) a fin de prepararlos para la irradiación. Como alternativa, utilice cualquier otra cepa con expresión ubicua de la proteína fluorescente. Administrar 1 mg / ml de neomicina y 1 mg / ml de vitaminas (A, D3, E, C) a través del agua potable de dos días antes de la irradiación.
  2. Irradiar ratones dos veces con 3,8 gris con un irradiador gamma-wi Cesio-137delgada de un intervalo de 3 horas. Para ello, colocar los ratones en una jaula de tarta de la irradiación adecuada para el respectivo irradiador.
    NOTA: Para la irradiación de los ratones, nuestro Instituto no requiere anestesia. Siga las políticas institucionales locales con respecto a la anestesia para la irradiación. Tratar a los animales con 5 mg / kg por vía subcutánea de carprofeno (sc) por día después de la irradiación si hay signos de dolor.
  3. El día siguiente, reconstituir ratones mediante una inyección intravenosa de 3 x 10 6 células de médula ósea preparadas a partir de huesos largos de ratones C57BL / 6 ratones donantes en tampón de transferencia 9. Mantenga los ratones en neomicina y vitaminas para un máximo de 2 semanas y un seguimiento de su bienestar y de peso durante este tiempo. Espere al menos 4 semanas para permitir la reconstitución del sistema inmunológico antes de iniciar los tratamientos experimentales específicas (por ejemplo, la inmunización) 9.
  4. Sacrificar los ratones y colocarlos en una tabla de disección, esterilizar las piernas con etanol al 70%. Euthanize ratones en conformidad con las políticas institucionales locales. Nuestro Instituto realiza dislocación cervical.
  5. Utilice pinzas y tijeras para quitar la piel de los muslos. Quitar el tejido muscular para exponer el hueso femoral. Luxate el hueso femoral de la articulación de la cadera y la rodilla utilizando pinzas y tijeras. Tenga cuidado de no romper o cortar el hueso.
  6. Para sacar el resto de grandes piezas de tejido muscular y el cartílago del hueso con unas tijeras. Quitar el tejido muscular restante por el roce de los huesos con papel de seda de laboratorio. Recoger los huesos limpios en una placa de Petri con tampón fosfato salino (PBS).
  7. Fijar los huesos femorales enteros en 4% de paraformaldehído (PFA, electrón grado microscopía) de 4 - 6 horas.
  8. Deseche PFA e incubar huesos en 10% de sacarosa en PBS O / N. El día siguiente, se incuban los huesos en 20% de sacarosa O / N. El día después, incubar los huesos en el 30% de sacarosa O / N.

2. cryosectioning de los Huesos

NOTA: Después de 16 - 24 h en 30% de sacarosa, congelar los huesos y cryosection de acuerdo con el método de cinta de Kawamoto 14,15.

  1. Preparar un vaso de precipitados grande (2000 ml de volumen) con hielo seco y acetona (aproximadamente 2: 1 relación de volumen, por ejemplo, 400 ml de hielo seco y 200 ml de acetona) bajo una campana de humos. Coloque un vaso pequeño (150 a 250 ml de volumen) con hexano en el interior (30 a 50 ml aproximadamente). Esperar a que la mezcla se enfríe (aproximadamente 10 min, hasta que aparezca escarcha en el exterior del vaso de precipitados grande).
  2. Llenar ¾ partes de la criomolde etiquetado con Súper Cryoembedding Medio (SCEM); coloque cuidadosamente los huesos en el interior hasta que estén totalmente sumergidos, teniendo cuidado de que no se toquen los bordes del molde. Con grandes fórceps sostener el criomolde en el vaso de precipitados con la parte inferior del molde simplemente tocando la superficie del hexano.
    1. Deje que los bordes exteriores de la congelación SCEM (indicado por la opacidad, esto toma aproximadamente 15 segundos). A continuación, colocar totalmente el molde en el hexano y se deja freeze para 1 - 2 min. Saque la muestra congelada y envolver en papel celofán y luego papel de aluminio (para proteger la muestra se seque y para evitar la exposición a la luz). Conservar a -80 ° C hasta cryosectioning.
  3. Para cryosectioning de huesos femorales utilizar un estándar de cuchillas de microtomo y micrótomo para tejidos duros.
  4. Establecer la muestra y la cuchilla temperatura del micrótomo a -24 ° C. Deje que la muestra se sientan dentro del microtomo durante aproximadamente 15 minutos antes de cortar.
    1. Fijar el bloque de muestras para el soporte de la muestra de metal con SCEM o la temperatura óptima de corte (OCT) medio. Ajustar la orientación del bloque si es necesario. Recorte la muestra hasta que está totalmente abierta el hueso y la médula ósea es visible. Ajustar el espesor de corte de 7 mm (deseche la primera sección).
    2. Fije un trozo de cinta Kawamoto con el lado adhesivo en la parte superior del bloque de muestras usando una espátula de madera cubiertas de piel de ciervo. Posteriormente, cortar la muestra y gire la cinta de modo que la sección essituado en el lado superior. Transferir la cinta a un portaobjetos de vidrio utilizando fórceps. Fijar la cinta al portaobjetos de vidrio con cinta adhesiva.
  5. Deje secciones se sequen durante al menos 30 minutos y se almacenan a -80 ° C hasta su uso. Guarde diapositivas sin teñir y sin montar en cajas de diapositivas de plástico con separadores entre diapositivas individuales con el fin de evitar que se peguen. Manchado y montados diapositivas se pueden almacenar durante un máximo de una semana en cartón carpetas de diapositivas a 4 ° C.

3. Imagen de la colección

  1. Descongele y cryosections mancha de acuerdo con los protocolos de inmunofluorescencia comunes 9. Incluir un tinte nuclear, por ejemplo, 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol dihidrocloruro (DAPI) para visualizar la integridad del tejido.
    NOTA: Mancha, por ejemplo, para RFP para visualizar las células del estroma (anti-RFP-biotina de anticuerpos y estreptavidina-Alexa Fluor 555), la mancha con eosinófilos de rata anti-proteína básica mayor (MBP) y anticuerpo anti-rata-Alexa Fluor 647 anticuerpo , células Bcon la rata anti-B220-Alexa Fluor 594 anticuerpos y PCs con luz anti-κ cadena fluoresceína iso-tiocianato (FITC) y anticuerpos anti-λ1 cadena-FITC luz (detalles del procedimiento de tinción se describen en 9).
  2. Montar las secciones teñidas: poner una gota de Fluoromount en la sección y luego cubra con una cubierta de vidrio antideslizante # 1, al tiempo que evita cuidadosamente la formación de burbujas de aire. Posteriormente, realice láser confocal de microscopía de barrido con un instrumento equipado con líneas de láser adecuados para la tinción.
  3. Para grabar imágenes para el análisis de co-localización automatizada de las células hematopoyéticas de la médula ósea con células del estroma con la función Wimasis, aplicar los siguientes ajustes:
    1. Utilice una lente objetivo de 20X y un campo de visión de 708,15 x 708,15 m. Para el análisis automatizado, mantener el tamaño de todas las imágenes consistentes en 2048 x 2048 píxeles (px) con el fin de mantener los resultados comparables.
    2. Grabar un canal para las estructuras del estroma (por ejemplo, (por ejemplo, DAPI, 405 nm) y los canales adicionales para las células hematopoyéticas de interés (por ejemplo, 3 canales, 488/594/633 nm para eosinófilos, células B y PCs).
    3. Grabar imágenes mediante línea con un promedio de 4 16. Lo ideal sería que cubren toda la sección femoral tomando imágenes adyacentes individuales. Otra opción es tomar imágenes no adyacentes de varias regiones de la médula ósea (diáfisis y epífisis).
      NOTA: Tenga cuidado de no producir solapamientos entre las imágenes adyacentes (para evitar el análisis repetido de las células en las áreas de solapamiento).
  4. Guarde las imágenes en un formato de archivo de imagen de microscopía. Compruebe y, si es necesario, ajustar el contraste para todos los canales en el software Visor de imágenes / análisis.
  5. Exportación 3 archivos .jpg por archivo imagen: un archivo .jpg para el canal DAPI (formato de color rojo / verde / azul (RGB), falso color codificado en amarillo), un archivo .jpg para el canal de estroma (escala de grises) y una .jpg archivo que contienelos canales de células hematopoyéticas (3 canales máximo, en formato RGB, por ejemplo, FITC (PCs, falso color: verde) / (células Alexa Fluor 594 B, falso color: azul) / Alexa Fluor 647 (eosinófilos, falso color: rojo)) .

4. Automatizado de Análisis de Imágenes

  1. Utilice una herramienta de análisis de imagen para realizar la segmentación de imágenes, la cuantificación de co-localización y análisis de vecindad (ver Discusión).
  2. Si el uso de las herramientas Wimasis, haga lo siguiente:
    1. Sube las series de 3 archivos .jpg por imagen con el mismo nombre de archivo seguido de un subrayado y un número que indica el tipo de la imagen.
    2. Utilice _1 para el archivo .jpg con células hematopoyéticas, _2 para el archivo .jpg para el canal DAPI, _3 para el archivo .jpg para el canal de estroma. Por ejemplo: Image1_1.jpg (células hematopoyéticas), Image1_2.jpg (canal DAPI), y Image1_3.jpg (canal estroma). Sube las imágenes a través de la cuenta del cliente.
    3. Para contacto celular cuantificaciónelegir la herramienta de contacto celular haciendo clic en el campo respectivo. Para la cuantificación proximidades celular, elija la herramienta proximidades celular y entrar en el radio de proximidad preferido en micras (que se mide a partir de los bordes de las células).
    4. Descargue los resultados.
      NOTA: Los resultados se proporcionan como archivos .jpg que muestran las células hematopoyéticas y el canal de estroma con los límites de los objetos detectados resaltado, así como archivos .csv individuales que contienen las mediciones para cada imagen, además de un resumen .csv que contiene los datos de todas las imágenes subidas.
  3. Desde el contacto mediciones determinan la frecuencia de células hematopoyéticas (rojo, verde o azul células) en contacto con las células del estroma, o las frecuencias de las células rojas, verdes o azules en contacto los otros tipos de células hematopoyéticas (un ejemplo se muestra en resultados representativos , la Figura 4). Con el fin de determinar las frecuencias, dividir los recuentos de contacto dados por imagen porla cuenta total de células por imagen.
    1. Para los experimentos con ratones individuales, resumir los recuentos de contacto totales de todas las imágenes para los ratones individuales y dividirlos por la suma de los recuentos de células totales de todas las imágenes.
  4. De las mediciones alrededores, determinar la frecuencia de las células rojas, verdes o azules dentro de la distancia seleccionada a partir de células estromales y / o las frecuencias de las células rojas, verdes o azules en la proximidad preferido a los otros tipos de células hematopoyéticas tal como se describe en el paso 4.3 ( véase también resultados representativos, Figura 4).

5. Simulación de Random Médula Ósea Posicionamiento

  1. Antes de ejecutar las simulaciones de posicionamiento celular al azar en la médula ósea imágenes histológicas analizadas, preparar los siguientes archivos de antemano: los archivos .csv individuales proporcionados por la herramienta de contacto celular, los archivos .jpg originales para el canal DAPI y los archivos .jpg originales para el canal de estroma.
  2. Para llevar a cabosimulaciones por lotes en una serie de imágenes (por ejemplo, todas las imágenes de una sección femoral), recogen todos los archivos .jpg originales (_1, _2 y _3) y los archivos .csv individuales correspondientes en una carpeta.
    NOTA: La herramienta de simulación para el posicionamiento de células de médula ósea al azar está disponible bajo petición.
  3. Inicie la herramienta de simulación, marque la casilla "Auto-carga de datos de imagen".
    NOTA: El programa leerá los recuentos de células y el tamaño medio de celda del archivo .csv automáticamente. Estos valores se muestran en las casillas de "número de teléfono" y "AVG tamaño Cell" (Figura 5).
  4. Introduzca la etiqueta común para los archivos .csv, es decir, el factor común en sus nombres. Introduce el número de conjuntos de imágenes que se deben utilizar para la simulación en modo batch.
  5. Cargue el archivo .jpg generada a partir del canal estroma (con el nombre de archivo que termina _3).
  6. Introduzca los ajustes para la generación de la máscara del canal DAPI:
    1. Marque la casilla "? Aplicar máscara "Establecer el umbral para la conversión de la imagen DAPI en una máscara binaria de 10 (rango de 0 - 255).
    2. Marque la casilla "8 bits?" Marque la casilla "Dilatar?" Y establecer el grado de dilatación de 5 px. Marque la casilla "w / erosión?".
    3. Introduzca el valor deseado para el radio de proximidad (radio de vecindad) utilizado para el análisis de las imágenes simuladas. Para una imagen de 708,15 x 708,15 m con un tamaño de 2048 x 2048 px (píxel de escala xy: 0,346 micras), 29 px corresponden a 10 micras.
  7. Marque la casilla "Use Otsu?", Para usar el algoritmo de Otsu 17 para la detección automática de las estructuras del estroma.
    NOTA: Este es el mismo algoritmo que se utiliza por la herramienta de contacto y alrededores. Utilizando el mismo algoritmo de segmentación de imágenes en el análisis automatizado de la imagen grabada y la imagen simulada es crucial con el fin de mantener los datos comparable.
  8. Introduzca los ajustes para las células hematopoyéticas, que are simula como formas circulares.
    NOTA: Los números de células de glóbulos rojos, verdes, y azules se cargan directamente desde el archivo .csv (véase también el paso 5.6).
    1. Utilice la herramienta de simulación para calcular el diámetro medio en px de glóbulos rojos, verdes y azules. Determinar el área promedio de una sola célula como el área total de cada tipo de célula en la imagen en px dividido por el recuento total de células por imagen. Utilice el área de promedio para calcular el radio de un disco utilizando la fórmula. El doble de la radio para determinar el diámetro promedio.
  9. Medir la distribución de tamaño de las células de los tipos celulares analizados con cualquier software de análisis de imágenes que incluye funciones de segmentación de objetos. Determinar σ para todos los tipos de células hematopoyéticas (18 y Figura 5B).
    NOTA: Puesto que las distribuciones de tamaño celular de las células grabadas no son determinados por el análisis de imágenes automatizado, utilizar una distribución gaussiana como una aproximación de las distribuciones reales. La anchura de tél curva de distribución es descrito por σ y puede ser muy diferente para diversos tipos de células. (Para más detalles, véase la figura 5B).
    1. A partir de estas mediciones, determinar el "corte de tamaño de celda": el diámetro en px que describe el objeto más pequeño todavía reconocida como una célula completa por la herramienta de análisis de imagen.
  10. Introduzca los parámetros en los cuadros de la interfaz gráfica de usuario (Figura 5).
    1. Introduzca el tamaño de la celda de corte, es decir, el tamaño de celda mínimo permitido en la simulación, como un diámetro en px.
    2. Introduzca σ en px para la simulación de la distribución de tamaño de celda para los glóbulos rojos, verdes, y azules (del paso 5.9).
    3. Marque la casilla "Eliminar" en la subsección "Las células en la máscara". Con esta configuración, el programa se eligió una nueva posición para una célula si se solapa con al menos un píxel con una zona prohibida de la máscara. Marque la casilla "Evitar solapamiento celular? ̶1; en la "exclusión de la célula" subsección.
    4. Introduzca la distancia mínima permitida entre los centros de dos células en px.
      NOTA: La distancia mínima debe ser determinado a partir de las imágenes grabadas. Erróneamente distancias mínimas medidas conducirán a resultados sesgados / artificiales para la comparación de las imágenes grabadas y simulados.
    5. Ajuste el área máxima de superposición a 100% si el solapamiento se define por la distancia mínima de centro a centro.
    6. Ajuste la herramienta de simulación para 1000 repeticiones.
    7. Marque la casilla "células de guardado automático?" Para guardar las coordenadas de los objetos simulados para todas las repeticiones de cada imagen de la hornada como archivos .rect (formato de texto). Marque la casilla "imágenes de guardado automático?" Para guardar un archivo .tiff para cada imagen simulada. Introduzca una etiqueta común para los archivos guardados.
      NOTA: El "? Células de guardado automático" opción reduce el tiempo de funcionamiento de simulación y el tamaño total de datos, en comparación con al guardar el real ima simuladages. Los archivos .rect guardar las coordenadas de las células simuladas como rectángulos y por lo tanto se pueden convertir en imágenes simuladas si es necesario.
  11. Inicie la simulación haciendo clic en "simulación Ejecutar".
    NOTA: La herramienta de simulación genera automáticamente un archivo .csv para los 1.000 simulaciones de cada imagen, incluidos los recuentos de contacto medias y recuentos alrededores de glóbulos rojos, verdes y azules con los glóbulos rojos, verdes, azules, y del estroma para cada conjunto de simulaciones repetidas . Además, para todos estos valores, se proporcionan los promedios de las 1.000 simulaciones con desviación estándar (STD) y el error estándar de la media (SEM).
  12. Determine el promedio de frecuencias de contacto y frecuencias alrededores de un conjunto de 1.000 imágenes simuladas. Para ello, se divide el contacto media y cuenta alrededores por el recuento de células grabado por imagen. Comparar las frecuencias de los resultados del análisis de co-localización automatizada de la imagen grabada.
  13. Aplicar Stati adecuadasmétodos stical en función del análisis de 19 (para la figura 7, se utilizó un Wilcoxon de dos colas firmado rank test).

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Representative Results

Cortar cryosections de hueso sin descalcificar con el método de la cinta Kawamoto permite todo el hueso a cortar como una sección intacta, con la médula ósea de la región endóstica todavía unido al hueso mineralizado, tanto en la diáfisis, así como en las áreas epifisarias con su alta densidad del hueso trabecular (Figura 1). Tinción nuclear de las secciones revela que aunque pequeñas grietas en la preparación no se pueden evitar totalmente, la estructura de los sinusoides y arterias, así como la red reticular del parénquima se mantiene intacta.

Como un ejemplo de una tinción de inmunofluorescencia de rojo fluorescente médula ósea quimérico y su posterior análisis, se muestra una tinción de eosinófilos (proteína básica principal, MBP), PCs (κ y la luz λ cadena) y células B (B220). Los ratones fueron inmunizados con hapteno 100 g de 4-hidroxi-3-nitrofenilacetilo acoplado a γ globulina de pollo (NP-CGG) en alumbre ip, 4 semanas después dereconstitución, potenciado con 50 mg de NP-CGG en PBS iv 21 días más tarde y se analiza en el día 30 después del refuerzo. El análisis de imagen automatizado resultó en un reconocimiento muy precisa de las estructuras del estroma, incluyendo también fragmentos muy pequeños de los procesos reticulares. Dado que el número de células de las células estromales no se puede determinar con el sistema presentado aquí (véase también la discusión), no umbral de tamaño se introdujo para el canal de estroma, con el fin de detectar todos los fragmentos en las imágenes (Figura 2). PCs y eosinófilos son más grandes que las células B y también muestran una forma más heterogénea. Los tres tipos de células han sido bien reconocido a primera vista. Cúmulos celulares, especialmente de las células B, estaban bien separados. La herramienta de análisis está optimizado para los tipos de células antes mencionadas (eosinófilos, PCs, células B). Para otros tipos de células, los ajustes podrían ser necesarios. Los archivos .csv generados por la herramienta de contactos célula contienen las siguientes medidas pertinentes para células hematopoyéticas:recuento de células para cada población de células; superficie total para cada población de células en px; recuento de contacto de los glóbulos rojos (en este caso eosinófilos), células verdes (aquí PCs) o células azules (aquí células B) con células de rojo, verde, azul o gris (células estromales). Los archivos .csv generados por la herramienta en un radio de célula contienen las siguientes mediciones para las células hematopoyéticas: recuento de células para cada población de células; superficie total para cada población de células en px; recuento de proximidad de las células rojas, verdes, y azules con los glóbulos rojos, verdes, azules y grises (células estromales).

Con el fin de validar la calidad de las herramientas de análisis de imagen, los resultados del análisis automatizado se compararon con la de un conteo manual por 6 evaluadores entrenados (Figura 3). Todos los evaluadores recibieron imágenes idénticas para su análisis. Estructuras del estroma y células hematopoyéticas fueron cuidadosamente descritos con una herramienta de análisis de imágenes y estas regiones de interés fueron salvados y analizados. Para las estructuras del estroma, el área total por imagense comparó entre el análisis automático y manual. Estructuras estromales parecían ser difícil para los evaluadores entrenados para reconocer precisamente, como se refleja por la gran variación observada para el tamaño de la superficie total de estroma contadas manualmente (Figura 3A). Aquí, el análisis automatizado determina un valor cercano a la superficie media detectada por evaluadores entrenados. Para todas las células, la herramienta de análisis automatizado determina una cantidad ligeramente menor de células que contó manualmente. Sin embargo, para PCs y eosinófilos, el número todavía estaba en el rango de varianza interrater observado para los recuentos manuales. El número de células B detectados por el análisis automatizado, sin embargo, era ligeramente por debajo de este rango (Figura 3A). El tamaño medio de celda (área en píxeles) tal como se determina por el análisis automatizado era 512 px para PCs, 436 px para eosinófilos, y 317 px para las células B, mientras que los evaluadores entrenados determinó un tamaño de 515 px para PCs, 464 px para eosinófilos, y 291 px de células B. Por lo tanto, la c mediatamaño ell para las células B, PC y eosinófilos determinados por el análisis automatizado era comparable a los tamaños medios de las células determinados por los evaluadores manuales (Figura 3B). Esta herramienta de análisis de imagen automatizado ahora se puede utilizar para cuantificar los contactos directos de la médula ósea candidato tipos de células nicho. Además, la frecuencia de las células de un determinado tipo de célula células estromales vecinos u otros tipos de células hematopoyéticas puede ser determinada. Un análisis de los PCs de médula ósea y sus contactos para células estromales, eosinófilos, células B, y otros PCs se muestra, así como la frecuencia de PCs vecinos estos tipos de células dentro de 10 y 20 micras (Figura 4A). Adicionalmente, las frecuencias de contacto de diversos tipos de células hematopoyéticas con estroma pueden ser cuantificados (Figura 4B).

Antes de realizar una simulación de posicionamiento de la médula ósea al azar de estas células con la herramienta de simulación, los parámetros que describen la distribución del tamaño de celda como una Gausdistribución Sian tiene que ser determinado. Para una distribución de Gauss, que se puede visualizar como una curva "en forma de campana" simétrica y, sólo dos parámetros deben determinarse: la ubicación del centro de la curva (el modo, es decir, donde se encuentra el pico de la curva ) y la anchura de la curva simétrica (esto se describe por el parámetro σ anteriormente mencionado). Este procedimiento se muestra aquí para PCs, eosinófilos y células B (Figura 5B). Distribuciones de tamaño de celda medidos muestran que, para las células B, la anchura de la curva de distribución descrito por σ es menor que para PCs y eosinófilos. Para la simulación, se mantuvieron los valores relativos de σ medido para las tres poblaciones de células (es decir, las células B fueron siempre simulados por una distribución estrecha de tamaño doble que el de los PC 'y eosinófilos'), mientras que los valores σ definidos en px eran conjunto para que coincida con el aspecto visual de las células registrada (Figura6B). Esto nos llevó a aplicar una σ de 2 px para las células B y σ de 4 px tanto para PCs y eosinófilos. El punto de corte del tamaño celular se determina a partir de las distribuciones de tamaño de celda de medición. Para PCs y eosinófilos, un punto de corte en 300 px tamaño del objeto, dando como resultado 20 px diámetro para un objeto circular (aproximadamente 7 m) y para las células B un punto de corte a 220 px, lo que lleva a un diámetro de 17 px (alrededor de 6 micras) se utilizó para la simulación.

Con el fin de definir áreas en la imagen aleatoria simulada donde se permite a las células para ser colocado por la herramienta de simulación, una máscara se genera a partir de señales nucleares en el canal de DAPI de una imagen histológica de la médula ósea (Figura 6A). Un valor de 10 se determinó que era el umbral de intensidad óptima para la generación de las imágenes binarias (panel superior, imagen derecha). El umbral determinado por el algoritmo de Otsu no conduce a pleno reconocimiento de todos los núcleos en la imagen (panel superior, imagen central), de manera similar a la intensidad fijoumbrales de 50 o 150 (panel inferior, izquierda y centro de la imagen) .La pertinencia de los contactos de PCs, eosinófilos, o células B con células estromales (Figura 4B) fue probada usando la herramienta de simulación (Figura 7). Este análisis reveló significativamente más altas tasas de contacto en las imágenes grabadas en comparación con la simulación para PC y células B (Figura 7A), en línea con el concepto de nichos del estroma de apoyo a estas poblaciones. Esto fue confirmado en 5 ratones quiméricos fluorescentes individuales (Figura 7B, D). En contraste, hay una clara diferencia se determinó en el caso de los eosinófilos (Figura 7A, C).

Figura 1
Figura 1. Descripción general imagen de fluorescencia de una sección longitudinal de un fémur murino cryosectioned con el método de la cinta de Kawamoto. El método de la cinta permite cutting secciones con una región endosteal intacta, tanto en la diáfisis, así como en las áreas epifisarias, a partir de hueso sin descalcificar. Una sección del hueso de espesor 7 micras de un ingenuo C57BL / 6 mouse se tiñó para la proteína de la matriz extracelular laminina (rojo), para Sca-1 para visualizar las arteriolas (verde) y para los núcleos (azul, DAPI). 47 azulejos de 1.446 x 1.088 m, resolución de 1360 x 1024 px se registraron y se cose para crear la imagen de la descripción. Esta imagen fue adquirida en un microscopio de fluorescencia de campo amplio, con una lente objetivo de 10X (0,45 NA). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2. automatizada detección de células del estroma y de médula ósea hematopoyética. Una sección del hueso femoral de una chi fluorescente de color rojoratón meric en el día 30 después del refuerzo se tiñó de RFP (gris) para visualizar estroma, MBP (rojo, eosinófilos), κ y λ cadena ligera (verde, PC) y B220 (azul, células B). Izquierda: imagen original adquirida en un microscopio confocal, usando una lente de objetivo 20X (0,8 NA) y un campo de visión de 708,15 x 708,15 m. Derecha: imagen segmentada. Se resaltan los contornos de los objetos reconocidos. Los rectángulos blancos marcan el área que se muestra en las imágenes de abajo. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3
Figura 3. Validación del análisis de imagen automatizado por evaluadores entrenados. (A) El área total de las estructuras del estroma y el número de células totales de células hematopoyéticas contados por evaluadores entrenados en uno (estructuras del estroma), 10 (PCs), dos (eosinófilos) y una imagen (células B) en comparación con el número de células obtenidas por análisis de imagen automatizado. Los puntos representan los valores individuales (n = 5-6). Las barras indican los valores medios o valores determinados de forma automática. Distribución de tamaño (B) de objetos de objetos contados manualmente en comparación con el tamaño medio de objeto determinado por el análisis automatizado. Con el fin de dar cuenta de las diferentes frecuencias de los diferentes tipos de células, PCs se contaron en 10, eosinófilos en dos y células B en una imagen. Los puntos representan los objetos individuales. Las líneas indican media. (C), que expondrá Manual de estructuras del estroma por evaluadores entrenados. Izquierda: imagen original. Secundaria: ejemplos de imágenes analizadas manualmente. Derecha:. Estructuras del estroma detectados por análisis automatizado Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4. Análisis automatizado co-localización de PCs, eosinófilos, células B y células del estroma en la médula ósea femoral. (A) Izquierda: Frecuencia de PCs en contacto directo con las estructuras del estroma, eosinófilos, células B u otros PCs en fluorescente ratones quiméricos en el día 30 después del refuerzo. Medio y derecha: Frecuencia de PCs en 10 micras inmediaciones o 20 micras proximidades de estructuras del estroma, eosinófilos, células B u otros PCs. Algunas partes de esta cifra (contacto directo, 10 micras alrededores) se modifican de Zehentmeier et al. 9 (B) Frecuencia de PCs, eosinófilos y células B en contacto directo con las estructuras del estroma. 52-515 PCs, 918-3.179 eosinófilos, desde 4.146 hasta 13.063 células B en 10-21 imágenes fueron contados a partir de 5 ratones quiméricos fluorescentes en el día 30 después del refuerzo, agrupados de dos experimentos independientes. Los puntos representan los ratones individuales. Las líneas indican la mediana.: //www.jove.com/files/ftp_upload/52544/52544fig4highres.jpg "Target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5
Figura 5. Determinación de la distribución de tamaño de las células de la médula ósea PCs, eosinófilos y células B. (A) Captura de pantalla de la interfaz gráfica de usuario (GUI) de la herramienta de simulación. (B) La distribución del tamaño celular (área en píxeles) de PCs (κ y λ luz cadena, verde), eosinófilos (MBP, rojo) y las células B (B220, azul) se muestra en histogramas, medido después del reconocimiento de objetos por software Volocity (panel superior). En las imágenes de la médula ósea del fémur (panel inferior), detectan PCs están marcados en rojo (superponer amarillo), eosinófilos en azul (superposición violeta) y células B en amarillo (se superponen gris). Segmentación de imágenes se realizó mediante el establecimiento de un umbral mínimo tamaño de 180 píxeles para las PC,300 px de eosinófilos y 220 px de células B. Se midieron 250 objetos para PC, 650 objetos de eosinófilos y 3.000 objetos para células B. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6
Figura 6. Generación de la máscara para simulada posicionamiento celular aleatoria. (A) El canal original DAPI (amarillo) así como superposiciones de DAPI con imágenes binarias generadas por la aplicación de diversos umbrales se muestran. La máscara generada a partir de la imagen binaria (umbral ajustado a 10) se muestra a continuación (panel inferior, imagen de la derecha). Las áreas negras representan zonas prohibidas, las zonas blancas representan áreas donde se permite a las células para ser colocado. (B) La imagen grabada (izquierda) y la imagen simulada correspondiente (derecha) muestran una alta visualsimilitud. Los eosinófilos (MBP), PC (κ y la cadena λlight), células B (B220) y las células del estroma (RFP) se muestran. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7
Figura 7. El contacto directo de tipos de células hematopoyéticas con estructuras estroma en imágenes simuladas registrados vs.. (A) Frecuencia de PCs, eosinófilos y células B en contacto directo con estroma en simulado en comparación con las imágenes grabadas de ratones quiméricos fluorescente en el día 30 después del refuerzo. Las líneas conectan correspondiente simulados y las imágenes grabadas (puntos). Imágenes de un ratón representativo se muestran en cada parcela. (B) las frecuencias de PCs, eosinófilos y células B en contacto directo con estroma en simulado en comparación con las imágenes grabadas de 5 ratones individuales de dos experimentos independientes. Prueba de Wilcoxon, de dos colas (PC: *** p = 0,0001; p = 0,0371 *; * p = 0,0161; ** p = 0,0012; **** p <0,0001; eosinófilos: *** p = 0,0007 ; p = 0,1055; p = 0,0161 *; p = 0,4143; p = 0,0007 ***; células B: **** p <0,0001; ** p = 0,0020; *** p = 0,0005; ** p = 0,0012 ; **** p <0,0001). Los puntos representan las imágenes individuales. Las barras indican media. Los valores de p 0,05 se consideran diferencias significativas. Los asteriscos en cifras indican los siguientes valores de p: ns: p> 0,05; *: P 0,05; **: P 0,01; ***: P 0,001; ****: P 0,0001. Algunas partes de esta cifra (el contacto directo de las PC con las estructuras del estroma) se modifican de Zehentmeier et al. 9 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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. Figura 8. flujo de trabajo completo del enfoque de cuantificación para células hematopoyéticas - interacciones de las células del estroma de la médula ósea murina El enfoque se divide en tres partes principales: 1. Las secciones de médula ósea murina se preparan y datos en bruto se recoge por microscopía confocal de barrido láser, 2 . se realiza el análisis automatizado de las imágenes grabadas y la simulación de posicionamiento aleatorio de células de médula ósea, 3. los recuentos de contacto y vecinales obtenidos a partir de imágenes grabadas y simulados se compararon. La entrada (archivos de imagen) y de salida (archivo de texto) del análisis automatizado está indicada en azul, la entrada (archivos de imágenes) y de salida (archivos de texto y, opcionalmente, los archivos de imagen) de la herramienta de simulación se indica en verde. Por favor, haga clic en aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

A pesar de los avances en los métodos modernos de imagen óptica, el análisis de los datos histológicos se sigue a menudo obstaculizada por la falta de herramientas de cuantificación y métodos adecuados, o por los análisis parciales que se centran en una pequeña área de interés. El enfoque sinérgico se presenta aquí combina análisis de imagen que cubre la región entera de la médula ósea, la segmentación automática y reconocimiento de objetos de diversos tipos de células hematopoyéticas y del estroma, análisis de co-localización, y finalmente una herramienta de validación de los contactos no se producen al azar proporcionadas por un nuevo Custom- software de simulación diseñado.

Histología de los huesos enteros, incluyendo la médula ósea ha sido difícil de realizar debido a las diferentes densidades de tejido presentes en una sección - por una parte, la muy duro, hueso mineralizado, por otro lado, la extrema fragilidad ósea, que fácilmente se interrumpe cuando se corta junto con el hueso. Como alternativa, el método de la cinta para el corte de secciones de hueso presentados aquí 14,15 tiene la ventaja de que se estabilice el tejido, dejando de ese modo las áreas endoóseos intacta (Figura 1). Además de ser rico en osteoblastos, estas áreas se ha sugerido que desempeñar un papel en el mantenimiento de células madre 20.

El papel crucial de las células del estroma en los procesos de desarrollo y mantenimiento celular en la médula ósea es cada vez más evidente. Sin embargo, el análisis de estas células raras, frágiles ha demostrado ser difícil por dos razones: en primer lugar, son difíciles de aislar de la médula ósea; segundo, el grado de heterogeneidad de la población estromal no se conoce, y por lo tanto uno podría perderse una importante población mediante el uso de ciertos marcadores que se han descrito para las células del estroma. El método para generar quimeras de médula ósea fluorescentes es útil a la marca con fluorescencia y posteriormente analizar la médula ósea población de células del estroma en su conjunto. Sin embargo, cabe señalar que en estos mice todas las células mesenquimales de la médula ósea se visualizan, incluyendo las células endoteliales y los osteoblastos. Esto debe ser tenido en cuenta si se analizaron los datos de tales ratones quiméricos. A pesar de que también hay un riesgo de células hematopoyéticas de origen receptor supervivientes de la irradiación, estas células normalmente sólo cubren un área muy pequeña por campo de vista comparación con las células CD45 + de donantes, lo que no afectaron el análisis histológico 9. Claramente, este método debe combinarse en una etapa posterior con una detección más específica de estroma (sub) poblaciones. Actualmente, el análisis de estas células se realiza principalmente por la histología debido a las razones mencionadas anteriormente, se establece un límite en el número de parámetros que pueden ser analizados al mismo tiempo. El desarrollo de múltiples parámetros análisis en microscopía ayudará a superar estos límites.

Durante el análisis de imagen, se llevó a cabo la segmentación usando el algoritmo original de Otsu. Esencialmente, Este método de umbral basado en la agrupación determina automáticamente el umbral de intensidad para la separación óptima de primer plano (señal) y de fondo (ruido) píxeles en dos grupos con la divergencia estadística más bajo en un canal dado, resultando en una imagen binaria 17. Aquí, el método de Otsu se aplicó a la versión logaritmo natural de la imagen original, es decir:

Imagen de entrada de Otsu = ln (imagen de entrada)

Esto funciona mejor para imágenes de fluorescencia desde el método de Otsu puede identificar células oscuras como fondo. Adición de la función logarítmica permite una mejor separación de las células y el fondo en dos clases diferentes por el algoritmo de Otsu. Sin embargo, de umbrales de intensidad por sí sola no es suficiente para detectar con precisión los objetos individuales. Funciona de manera eficiente cuando la detección de objetos bien separados en imágenes, pero no es suficiente para las células individuales separados situados dentro de los grupos. Como algunos de los tipos de células quefueron de interés para nosotros, como los eosinófilos o células B, se agrupan a menudo juntos en el tejido, sus núcleos en el canal DAPI fueron segmentados utilizando un algoritmo basado en el k-significa la agrupación del histograma intensidad con k = 10 21. El algoritmo de segmentación de células trazará el más brillante a los píxeles más débiles (agrupadas en 10 contenedores) y constantemente buscar la formación de objetos de células que se asemeja. Estos objetos A continuación, se definen como células. Cuando se han utilizado todos los píxeles, los núcleos resultantes se dilatan para generar una máscara que se aplica entonces a los otros canales para la separación de clúster.

Cabe señalar que este análisis funciona bien para las células hematopoyéticas que son compactos, pero que es limitado con respecto a las células del estroma, ya que no es posible determinar las fronteras de estos grandes, células repartidas de salida debido a la interconexión de sus extensiones dendríticas que forman una red reticular. Por lo tanto, los recuentos de células para las células del estromano puede ser proporcionada. Etiquetado de las células individuales a través de los periodistas de mapeado de destino bajo el control de promotores-estroma específica resolverá este problema, de acuerdo con lo que se ha publicado para las neuronas (utilizando el "Brainbow" sistema 22) y para el etiquetado de las células dendríticas foliculares en los ganglios linfáticos 23.

Además de aplicar una etapa de reducción de ruido para todos los canales mediante la exclusión de objetos por debajo de 30 px, exclusión por tamaño se aplicó en el proceso de reconocimiento de objetos para hematopoyéticas pero no las células del estroma. Pequeños fragmentos de células que fueron cortadas por el corte pueden ser excluidos; sin embargo, la pérdida se puede despreciar en este caso a favor de un reconocimiento inequívoco de las células. Extendiendo el análisis y la simulación de dos a tres dimensiones va a superar esta limitación. El desarrollo de métodos para el estudio de la distribución celular en su conjunto se monta, por ejemplo, por microscopía de fotones múltiples o la luz hoja de microscopía / SPIM, sin duda ayudará en ªes el respeto. Con el fin de estudiar la composición celular complejo de nichos de múltiples componentes, también será necesario ampliar el número de parámetros que están siendo analizadas in situ. Los enfoques prometedores para el análisis multiparamétrico de la información histológica en combinación con la cuantificación de citometría se han publicado recientemente 24, 25.

El análisis de contacto se realizó mediante la cuantificación de la superposición de dos objetos. El contacto directo se define como una superposición de al menos un píxel. Es importante destacar que este análisis está limitada por la resolución de las imágenes de microscopía y por lo tanto depende de la longitud de onda y el modo de excitación, así como en la apertura numérica de la lente del objetivo utilizado en el microscopio, y el tamaño del agujero de alfiler. En el análisis que se muestra aquí, un objetivo del 0,8 NA, 20X con combinaciones fluorocromo excitado con 488, 561, 594, y se aplicó 633 nm utilizando una excitación de fotones. Por lo tanto, la resolución lateral valores entreSe obtuvieron 0.372 y 0.483 micras. Esto permite que las afirmaciones que se hacen sobre la yuxtaposición de diferentes subconjuntos de células; sin embargo, no da ninguna información sobre los mecanismos moleculares implicados en las interacciones putativas celulares. Además, se necesitan otros métodos tales como 2-fotón microscopía intravital para mejorar la caracterización de estos contactos intercelulares 9. Sistemas basados ​​Förster-resonantes transferencia de energía (FRET) pueden ayudar a confirmar si estas interacciones son realmente funcional 26.

Con el fin de evaluar el microambiente celular de nichos de tejidos, no sólo es crucial para analizar los contactos directos de células, sino también para cuantificar los tipos de células en la vecindad de un cierto tipo de célula de interés ("análisis de proximidad"). Publicado previamente estudios distancias entre las células y las estructuras de tejido medidos tales como barcos con base en la posición del núcleo 27. Ya que estábamos interesados ​​en determining la distancia de diversos tipos de células, en parte con diferentes proporciones de volumen nuclear a citoplásmica, preferimos medir la distancia entre las superficies. Con este fin, se calculó el radio de proximidad mediante la determinación de la distancia euclidiana de un límite cell's después de convertir los valores de ma px. La distancia euclidiana es la distancia en línea recta entre dos píxeles y puede ser descrito por la fórmula 28:
Ecuación 1

Las células con píxeles de sus límites dentro de una distancia euclídea de, por ejemplo, 10 m de los píxeles de los límites de una célula diana se contaron como esta célula vecina.

En su forma actual, el análisis sólo determina si una célula se pone en contacto o abordado por otra célula del mismo o diferente tipo, proporcionando así sólo un binario SÍ / NO caracterización. El número real de célulass que en contacto con la célula de interés o están dentro de un radio determinado de ella no se calcula. El próximo paso será extender el análisis actual de una manera que el tamaño del grupo de contacto o las células vecinas puede ser detectado y se compara entre las diferentes células diana del mismo tipo. Esto conducirá a una importante información adicional sobre la composición de los nichos de la médula ósea, tales como el nicho de supervivencia para las células plasmáticas de la médula ósea, para los que una contribución variable de células accesorias hematopoyéticas se ha discutido 29-33.

Los algoritmos de reconocimiento de objetos se han optimizado junto con los especialistas de Wimasis utilizando su servicio disponible en el mercado de soluciones personalizadas y están disponibles bajo petición. Otra opción es utilizar un software disponible comercialmente para el análisis de imagen, como Definiens, Volocity, o Imaris, o freeware tales como CellProfiler.

La segmentación celular y análisis de imágenes herramientas automatizadas nosotrosre validado comparando sus resultados con los datos analizados manualmente proporcionadas por 6 evaluadores entrenados imagen con respecto a dos parámetros, a saber, el tamaño del objeto y el número de células en diferentes poblaciones de células. Como se muestra en la Figura 3B, el tamaño medio de objeto para células hematopoyéticas (PCs, eosinófilos y células B) fue similar entre ambos métodos, con una variación mayor para la determinación del tamaño manual para células plasmáticas y eosinófilos, probablemente debido a comparó su forma más irregular a las células B. La detección automática del número de células produjo valores ligeramente más bajos que los detectados manualmente queridos. En particular, todavía estaban dentro del rango de los valores manuales en el caso de los eosinófilos y los PCs, mientras que estaban por debajo de estos valores en el caso de las células B, probablemente debido a una mayor heterogeneidad de expresión de B220, que se utilizó como un marcador para las células B. B220 es conocido por ser hasta reguladas durante la diferenciación de células B en la médula ósea, y las células B con bajas así como alta itinción ntensity de B220 se puede observar. Las células B con señales de baja B220 cayeron por debajo del umbral aplicado, lo que puede haber dado lugar a la exclusión de las células más temprana etapa B. Un umbral más bajo para la detección automatizada puede resolver este problema. Para las células estromales, que son más difíciles de detectar debido a su menos compacto, más dendríticas, y la morfología extendido, la detección manual de resultó en altas variaciones entre evaluadores individuales. Curiosamente, el área total promedio de estroma era igual al área total determinada de forma automática, lo que indica que el análisis es muy adecuado para compensar el sesgo individuo por los evaluadores. Tomados en conjunto, estos datos muestran que los resultados automatizados generalmente representan los valores medios de los análisis manuales y son muy adecuadas para reducir la variabilidad entre observadores en el análisis.

Con el fin de discriminar posicionamiento aleatoria y no aleatoria de las células dentro de las limitaciones estructurales de los tejidos, una herramienta de simulación fue desarrollado. During la simulación, se crea una imagen artificial con células hematopoyéticas colocados al azar para cada imagen histológica de la médula ósea grabado. En primer lugar, la imagen del canal de estroma se utiliza en su formato original. Una máscara se genera a partir de la imagen DAPI mediante la aplicación de un umbral basado en la intensidad fija, convirtiendo así la imagen en formato binario; la máscara binaria a continuación, se somete a múltiples pasos de la dilatación y la erosión basado en píxeles. La máscara define áreas en el campo de la imagen en donde se permite células simuladas para ser colocado. Las coordenadas de los centros de las células simuladas son proporcionados por un generador de números aleatorio uniforme, los límites de los cuales donde determinados por el tamaño de la imagen. La información sobre el número de células y tamaño de celda promedio para cada población determinada por análisis de imagen automatizado de las imágenes grabadas se utilizan para definir las poblaciones de células hematopoyéticas simulados. El diámetro de la celda simulada se supone que sigue una distribución Gaussiana unidimensional de la que el realdiámetro de la celda se selecciona al azar: El diámetro se modifica a continuación, de manera que se introducen de tamaño de celda cut-off para el tamaño mínimo del objeto permisible. En caso de que la celda simulada se coloca de tal manera que uno o más píxeles se superponen con una zona prohibida o estarían dentro de una distancia predefinida de otra célula ya colocado (4 micras, de centro a centro, definido de imágenes grabadas), nuevas coordenadas aleatorias se elegirá mientras que el diámetro se deja inalterada. Esto se repite hasta que el número de células simuladas es igual al número de células en la imagen grabada.

La herramienta se basa en la suposición de que las células hematopoyéticas pueden ser posicionados libremente dentro de la médula ósea, mientras que las estructuras del estroma actúan como una matriz fija dentro del tejido. La herramienta fue optimizada para la situación en la médula ósea, donde las zonas de parénquima están atravesadas por un sistema complejo de sinusoides. Un enfoque de modelo similar fue publicado recientemente por Frenette y compañeros de trabajo con el fin deanalizar el posicionamiento de las células madre hematopoyéticas en relación con las células del estroma y las estructuras vasculares, que representan alrededor del 30% del volumen de la médula ósea femoral total de 25. Con el fin de corregir este efecto, la herramienta de simulación que aquí se presenta se basa en una máscara de las áreas se están permitidos células para ser colocado. Esto se logró mediante el uso de una imagen de colorante nuclear, en el que los objetos que representan los núcleos se ampliaron por una dilatación de 5 pasos (véase la Figura 6) después de binarización. Las áreas con una baja densidad celular, es decir, la baja densidad de núcleos como el hueso y sinusoides, no contribuirán a la máscara y, por tanto, convertirse en zonas no-go. Con el fin de evitar una reducción artificial de estas áreas vedadas por el procedimiento de dilatación, una erosión de 5 pasos se aplicó posteriormente, reabriendo así las zonas de exclusión más grandes, dejando a la densidad nuclear de alto (de ahí "permitido") áreas inalteradas. Este método puede ser fácilmente adaptado para otros órganos linfoides. En los tcuestiones eran este método podría no funciona (por ejemplo, en las zonas donde las células con una alta relación de citoplasma / núcleo están presentes), otros métodos tales como el etiquetado citoplasmática se pueden utilizar para crear la máscara.

Se simularon las células hematopoyéticas como objetos circulares cuyo tamaño se determinó mediante el uso de un generador de número aleatorio gaussiano, la media de las cuales de acuerdo con el diámetro promedio calculado de cada tipo de célula. La anchura de la distribución se basa en las distribuciones de tamaño de celda medidos en las imágenes grabadas según lo determinado por un software de análisis de imagen. A fin de tener en cuenta que los pequeños fragmentos celulares fueron excluidos en el análisis de imágenes automatizado, de tamaño de celda cortes fueron introducidos como determinada a partir de las distribuciones de tamaño de celda medido para cada tipo de célula (véase la Figura 5).

Naturalmente, esto funciona bien para tipos de células que son relativamente uniformes en su tamaño y forma, pero puede conducir a problemas en el caso de las células que unare muy heterogéneo con respecto a estos parámetros. Cabe señalar que este análisis está optimizado para los principales tipos de células hematopoyéticas en la médula ósea (granulocitos, células progenitoras hematopoyéticas y linfocitos), que tienen en común que poseen una forma regular, casi redondeada. Sin embargo, este método no ha sido probado para las células dendríticas o los macrófagos, los tipos de células con cuerpos celulares fuertemente irregulares. Analizando estas células presentarán nuevos retos para nuestro análisis automatizado de imágenes, así como con el enfoque de simulación, incluyendo la necesidad de mejorar los algoritmos de racimo de células de separación 24, así como la forma detallada, análisis y simulación de no sólo las células de diferentes tamaños, sino también en forma diferente. Una alternativa sería un enfoque de simulación que trabaja con las formas exactas como está registrado. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que este método aumentaría significativamente el comportamiento determinista del sistema modelo.

Para el expe simuladarimentos, se generaron 1.000 repeticiones de la simulación para cada imagen grabada. El uso de esta cantidad de repeticiones reducirá el error relativo aportado por el proceso de simulación en sí a aproximadamente 3%. Es decir, si los valores de célula-célula co-localización se calculan a partir de simulaciones que son aleatorios, entonces el proceso de simulación en sí se caracteriza por una función de error -1/2 N, donde N es el número de simulaciones por imagen medido. Esta es la contribución por el proceso de simulación en sí al error acumulado de los valores de co-localización medidos. Por lo tanto, para N = 1000 el error contribuido es 3,16%. Las simulaciones muestran aquí corrieron durante 20 a 60 minutos por imagen por cada 1.000 repeticiones cuando sólo guardar las imágenes simuladas como archivos .rect (un formato de texto simple) en lugar de las imágenes como reales en formato .jpeg o .tiff (también una opción en el software ).

En conjunto, este enfoque permite un análisis de alto rendimiento imparcial de imagen histológicas y permite la generación de datos estadísticamente relevantes. Esto puede ser útil en la comparación de la localización celular en diferentes condiciones. Además, el componente temporal puede en el futuro integrarse en un enfoque de modelado de los movimientos de células de médula ósea, a medida que más datos sobre la motilidad de los diversos tipos de células en la médula ósea esté disponible. Este método puede ser utilizado para simular las perturbaciones del sistema, tales como la movilización de las células de la médula ósea a la circulación, por ejemplo, los neutrófilos en el caso de una inflamación aguda 34. Para aclarar aún más la función de la médula ósea como un lugar de almacenamiento de las células de memoria inmunes, también se puede imaginar extendiéndolo a modelar la competencia por los factores de supervivencia. Además, la posible interferencia entre distintos nichos podría abordarse, así como la inducción de nichos. En conjunto, esto le ayudará a entender los cambios fisiológicos (por ejemplo, los disparadores para el comportamiento regenerativo en las células madre) como well como las perturbaciones patológicas del sistema como un todo, por ejemplo en el caso de trastornos autoinmunes, neoplasias, o inflamación aguda. Como parte de un concepto iterativo de prueba y modelado, nuevas hipótesis pueden ser generados con base en las simulaciones, que a su vez de nuevo se pueden probar experimentalmente, lo que ayuda a comprender mejor la función y la interacción de los diversos tipos de células dentro de la complejidad de los tejidos.

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Acknowledgments

Damos las gracias a Andreas Radbruch valiosa para los debates. Estamos muy agradecidos a Sabine Gruczek, Patrick Thiemann y Manuela Ohde para obtener ayuda con el cuidado de animales y Robert Günther por su excelente asistencia técnica. Agradecemos a nuestros evaluadores entrenados Laura Oehme, Jannike Bayat-Sarmadi, Karolin Pollok, Katrin Roth, Florencia Pache y Katharina Cuerno para la evaluación de las muestras histológicas y Randy Lindquist para la corrección del manuscrito. Agradecemos a J. y N. Lee, Mayo Clinic, Scottsdale, Arizona, EE.UU. para anticuerpos MBP-específicos.

Este trabajo fue apoyado por DFG HA5354 / 4-1, por JIMI-una subvención red instalación central DFG para microscopía intravital y por TRR130 / TP17, y DFG PARA 2165 (HA5354 / 6-1) para AEHSZ fue apoyada por el Max Planck Internacional Escuela de Enfermedades Infecciosas e Inmunología (IMPRS-IDI), Berlín.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Neomycin Sigma N6386 SIGMA Neomycin trisulfate salt hydrate, EU hazard code: GHS08
Ursovit AD3EC Serumwerke Bernburg 1 ml contains: 50.000 I.E. retinyl palmitate, 5.000 I.E. cholecalciferol, 30 mg tocopheryl acetate, 100 mg ascorbic acid, 1 mg sorbic acid, 200 mg polyoxyl 35 castor oil, 0,5 mg propyl gallate
Transfer buffer (100 ml PBS, 1 ml 1 M HEPES, 50 U/ml penicillin/streptomycin) Sigma P4333, H3375
4-Hydroxy-3-nitrophenylacetyl hapten conjugated to chicken gamma globulin
Chicken gamma globulin (CGG) 100 mg Rockland D602-0100
20% Paraformaldehyde solution (EM-grade) Science Services 15713 EU hazard codes: GHS02, GHS05, GHS07, GHS08
D(+)-sucrose Carl Roth 4621.1
Dry ice
Acetone Sigma-Aldrich 179124 SIGMA-ALDRICH EU hazard codes: GHS02, GHS07
Hexane Sigma-Aldrich 208752 SIGMA-ALDRICH EU hazard codes: GHS02, GHS07, GHS08, GHS09
Tissue-Tek cryomolds (standard) Sakura 4557 25 x 20 x 5 mm
Tissue-Tek O.C.T. Sakura 4583
Kawamoto's SCEM embedding medium Section-Lab, JP
Kawamoto's cryosection preparation kit  Section-Lab, JP
Kawamoto's cryofilm type 2C(9) Section-Lab, JP
Microtome blade MX35 premier plus, low profile Thermo Scientific 3052835 L X W: 80 x 8 mm (31.5 x 3.13"), thickness: 0.25 mm (0.01")
Polyclonal rabbit anti-RFP antibody, biotinylated Rockland 600-406-379
Alexa Fluor 555 streptavidin Life Technologies S-32355
Rat anti-MBP J. and N. Lee available from: J. and N. Lee, Mayo Clinic, Scottsdale, AZ , U.S.A., clone MT-14.7
Goat anti-rat-Alexa Fluor 647 Life Technologies A-21247
Rat anti-B220 - Alexa Fluor 594 produced and coupled in-house (DRFZ), clone RA3.6B2, Alexa Fluor 594 from Life Technologies
Mouse anti-l1 light chain -FITC produced and coupled in-house (DRFZ), clone LS136
Rat anti-k light chain - FITC produced and coupled in-house (DRFZ), clone 187.1
DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) Sigma D9542 SIGMA
Fluorescent mounting medium DAKO S3023
Cover slips (24 x 24 x 0.13-0.16 mm) Carl Roth H875.2
Superfrost slides glasses (75 x 25 mm) VWR 48311-703
Laser scanning confocal microscope equipped with laser lines of 405, 488, 561, 594, 633 nm and a 20X/0.8 NA air objective lens. We used a Zeiss LSM710 and Zen 2010 Version 6.0 software.
Automated image analysis tools for bone marrow Wimasis, Munich The cell contact tool and cell vicinity tool will be made available by Wimasis upon request.
VC2012 runtime Microsoft free download
Simulation tool for random cell positioning available from us, upon request
Image analysis software with image segmentation functions We used Volocity (Perkin Elmer) for measuring cell size distributions of hematopoietic cell types in bone marrow (Figure 5). Alternatives are Definiens Image Analysis (Definiens) or Cell Profiler (free download)
Fiji image analysis software  free download. Fiji was used by trained raters for manual cell count (Figure 3).

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