المناعية وصفها متعددة مع الأجسام المضادة من نوع المضيف نفسه لدراسة الكبار الحصين تكوين الخلايا العصبية

* These authors contributed equally
Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Ansorg, A., Bornkessel, K., Witte, O. W., Urbach, A. Immunohistochemistry and Multiple Labeling with Antibodies from the Same Host Species to Study Adult Hippocampal Neurogenesis. J. Vis. Exp. (98), e52551, doi:10.3791/52551 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

تكوين الخلايا العصبية الكبار هو عملية متعددة المراحل ينظم للغاية التي يتم إنشاؤها خلايا عصبية جديدة من الخلايا الجذعية العصبية تفعيلها عبر ملتزمة بشكل متزايد فرعية السلف وسيطة. كل من هذه الأنواع الفرعية عن مجموعة من الواسمات الجزيئية محددة، جنبا إلى جنب مع معايير شكلية محددة، ويمكن استخدامها للتعرف عليها. عادة، يتم تطبيق تقنيات مناعي التي تنطوي على الأجسام المضادة نوع فرعي معين في تركيبة مع علامات exo- أو الذاتية انتشار الأسلحة النووية. وصفنا هنا immunolabeling طرق للكشف النوعي والكمي لجميع مراحل تكوين الخلايا العصبية الحصين الكبار. تضم هذه تطبيق النظير ثيميدين، نضح transcardial، معالجة الأنسجة واسترجاعها حاتمة الناجم عن الحرارة، ABC المناعية، متعددة المناعي غير المباشر، الفحص المجهري متحد البؤر النوعي والكمي الخلية. وعلاوة على ذلك فإننا نقدم متتابعة متعددة بروتوكول المناعي التي تلتف مشاكل شالناشئة يو sually من الحاجة لاستخدام الأجسام المضادة الأولية التي أثيرت في الأنواع المضيفة نفسها. انها تسمح لتحديد دقيق لجميع أنواع فرعية السلف قرن آمون معا مع علامة الانتشار داخل قسم واحد. هذه التقنيات هي أداة قوية لدراسة تنظيم أنواع فرعية مختلفة السلف في موازاة ذلك، مشاركتهم في أمراض الدماغ ودورها في وظائف محددة في الدماغ.

Introduction

مناطق الدماغ اثنين توليد جوهري خلايا عصبية جديدة في جميع مراحل الحياة، ومنطقة subventricular من البطينات الجانبية ومنطقة جزئي التحبب (SGZ) من التلفيف المسنن قرن آمون (DG). الخلايا العصبية حديثي الولادة مستمدة من الخلايا الاصلية العصبية وتذهب من خلال مراحل مختلفة من التنمية المورفولوجية والفسيولوجية قبل أن تصل إلى مرحلة النضج 1،2. من تقسيم ببطء شعاعي تشبه الخلايا الجذعية الدبقية (نوع 1) مراحل متتالية العبور تضخيم الخلايا الاصلية المتوسطة تنشأ. أكثر الأنواع الفرعية غير متمايزة (نوع 2A و 2B نوع) لها شكل غير منتظم مع العمليات عرضية قصيرة. أنها تولد neuroblasts (نوع 3) أن الخروج تدريجيا دورة الخلية لتصبح خلايا عصبية غير ناضجة (مع التشعبات امتدت نحو الطبقة الجزيئية) ودمج أخيرا في شبكة الحصين الخلايا الحبيبية ناضجة كما. بسبب الخصائص الفسيولوجية الخاصة بها وتوفر هذه الخلايا الدوائر مع تعزيز اللدونة 3 suggesتينغ دورا فريدا في وظيفة قرن آمون. في الواقع، ولدت الدراسات في العقد الأخير أدلة قوية على تكوين الخلايا العصبية الكبار يساهم في الذاكرة المكانية، ونمط الانفصال والسلوك العاطفي 4،5.

ويمكن دراسة تكوين الخلايا العصبية الكبار باستخدام أساليب مختلفة. النظير ثيميدين تتضمن في الحمض النووي خلال المرحلة S من دورة الخلية وتسمح الولادة التي يرجع تاريخها، الكمي ومصير تحليل خلايا حديثي الولادة 6-8. تطبيق متتابعة من النظير ثيميدين مختلفة (على سبيل المثال، CldU، EDU أو إيدو) يمكن استخدامها لدراسة دوران خلية أو السكان الخلية ولد في نقاط زمنية مختلفة خلال تجربة 9. بديل، علامة الذاتية لتكاثر الخلايا هو Ki67. يتم التعبير عن ذلك في تقسيم الخلايا خلال جميع مراحل دورة الخلية (G1، S، G2، M) باستثناء مرحلة الراحة (G0) وبداية G1 10،11. لتحليل النمط الظاهري من السكان الخلية حديثي الولادة في الكبار dentatالبريد التلفيف عدة الواسمات الجزيئية مرحلة محددة يمكن استخدام مثل GFAP، nestin، DCX وNeuN 1،6. GFAP هو علامة من الخلايا النجمية الناضجة ولكن يتم التعبير أيضا في خلايا تشبه الخلايا الدبقية شعاعي في الدماغ الأمامي الكبار. Nestin هو خيوط وسيطة محددة لخلايا تشبه الخلايا الدبقية شعاعي والخلايا الاصلية المتوسطة في وقت مبكر. DCX هو بروتين المرتبط أنيبيب المعبر عنها في الأسلاف وسيطة، neuroblasts والخلايا العصبية غير ناضجة. وبناء على (المشارك) التعبير عن هذه العلامات الثلاث والميزات المورفولوجية من الخلايا المسمى ويمكن تحديد أربعة أنواع فرعية خلية سلفية متميزة: نوع 1 (GFAP nestin DCX -)، نوع 2A (GFAP nestin + ، DCX -)، نوع 2B (GFAP nestin DCX +) ونوع 3 (GFAP nestin DCX +) 1. شارك في وضع العلامات على DCX جنبا إلى جنب مع NeuN، وهو ما يعبر عنه في الخلايا العصبية تالية للتفتل، يسمح للتمايز immaturه (DCX NeuN +) وناضجة (DCX NeuN +) الخلايا العصبية الحبيبية.

وكثيرا ما تستخدم علامات المذكورة أعلاه لمناعي شارك في وضع العلامات واللاحق متحد البؤر المجهري لتحليل عدد وهوية الخلايا حديثي الولادة. وهذا يتطلب عادة الأجسام المضادة من الأنواع المضيفة مختلفة لمنع الأجسام المضادة غير مرغوب فيها عبر التفاعل. ومع ذلك، تربى معظم الأجسام المضادة الأولية المناسبة للبحوث الخلايا العصبية إما في الأرانب أو الفئران (على سبيل المثال، والماوس α-BrdU، والماوس α-NeuN، أرنب α-Ki67، أرنب α-GFAP). وهذا يؤدي إلى فرض قيود خطيرة على عدد ومجموعة من مولدات المضادات التي يمكن تقييمها في شريحة واحدة. وهذا بدوره لا يزيد فقط الجهد تلطيخ، كما stainings متعددة يجب أن يؤديها، ولكن يمكن أيضا تؤثر سلبا على مصداقية النتائج. وعلاوة على ذلك، فإن بعض المستضدات عرضة للالفورمالين التي يسببها تثبيت حاتمة اخفاء (على سبيل المثال، Ki67، nestin). وصفنا هنا التعديلات من البروتوكولات immunolabeling أحادية ومتعددة الكلاسيكية (على سبيل المثال، استرجاع حاتمة، متعددة المناعية متتابعة، واستخدام nestin-GFP الفئران المعدلة وراثيا 12) أن التغلب على الكثير من هذه القضايا. على وجه الخصوص، وبروتوكول المناعي متعددة متتابعة يسمح تلطيخ ضد ما يصل إلى أربعة مستضدات مختلفة حتى لو مشتق جزء من الأجسام المضادة من نفس المضيف. وهذا يتيح للكشف في وقت واحد من نوع 1، نوع 2A، 2B نوع ونوع الخلايا 3 السلف، وكذلك النشاط التكاثري في غضون مقطع واحد.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على الحيوانات التي تعيش بها وفقا للتوجيه EC 86/609 / EEC المبادئ التوجيهية على رعاية واستخدام الحيوانات المختبرية والتي وافقت عليها لجنة الأخلاقيات المحلية (Thüringer Landesamt FÜR Lebensmittelsicherheit اوند Verbraucherschutz).

1. حقن داخل الصفاق من ثيميدين النظير

  1. وزن الحيوانات قبل يوم واحد الحقن. حساب كمية ثيميدين التناظرية المطلوبة لجميع الحقن المخطط لها في اليوم التالي، وكذلك كميات حقن تعديل الوزن الفردية من 10 ملغ / مل محلول المخزون.
  2. إعداد 10 ملغ / مل حل الأسهم ثيميدين. (تنبيه! النظير ثيميدين سامة. اتبع أوراق بيانات سلامة المواد المحددة (MSDS) المقدمة من قبل الموردين، أي ارتداء معطف المختبر والقفازات، واستخدام غطاء الدخان الكيميائي).
    1. خذ ثيميدين التناظرية من الفريزر وإحضاره إلى RT، تقريبا. 21 ° C. تزن 10 ملغ و إضافةملحي معقم (لBrdU وCldU) أو 0.04 N هيدروكسيد الصوديوم (في المياه المالحة عقيمة، لإيدو)، دوامة. وضع لا يقل عن 10 - 15 دقيقة في 50 ° C حمام الماء ودوامة كل 2 - 3 دقائق لإذابة مسحوق.
      ملاحظة: استخدام الحلول لمدة تصل إلى 24 ساعة عند تخزينها في RT لعدة أسابيع في -20 ° C. حماية حلول من الضوء (غطاء مع رقائق الألومنيوم). تحقق دائما للرواسب وإعادة حل إذا لزم الأمر.
  3. كبح الماوس من القفا وحقن داخل الصفاق و، المعدلة الوزن حجم مناسب من محلول المخزون (في RT) باستخدام حقنة الدواء مع غرامة 30 G الإبرة.
    ملاحظة: في حالة CldU وإيدو يجب أن تدار بشكل تسلسلي ضمن نفس الحيوان، والنظر لحقن تركيزات متساوي المولية (على سبيل المثال، 42.5 ملغ / كغ CldU و57.5 ملغ / كغ عن طريق حقن المخدرات، والتي تتوافق إلى 50 مغ / كغ BrdU). لذلك، وضبط كميات حقن الحلول 10 ملغ / مل الأسهم وفقا لذلك.

2. إعداد الأنسجة

  1. Prepaإعادة 4٪ الفورمالديهايد في 0.1 M عازلة الفوسفات ودرجة الحموضة 7.4 قبل يوم التروية. تخزينها في 4 ° C.
  2. Transcardially يروي الفئران تخدير عميق (3.5٪ الأيزوفلورين) عن طريق البطين الأيسر مع PBS 10 مل الجليد الباردة، ثم مع 40 مل الفورمالديهايد الجليد الباردة (معدل تدفق 5 مل / دقيقة). تشريح الدماغ وما بعد الإصلاح في نفس تثبيتي لمدة 24 ساعة في 4 درجات مئوية.
  3. نقل أدمغة التوالي إلى 10٪ (24 ساعة في 4 درجات مئوية) و 30٪ سكروز (حتى المصارف الدماغ، تقريبا 48 ساعة). لتجميد، يغرق ببطء أدمغة cryoprotected إلى -25 ° C isopentane حتى عدم وجود فقاعات على الخروج من الأنسجة. تخزين في -80 ° C.
  4. قطع أقسام الاكليلية من 40 ميكرون سمك على مشراح التجمد (درجة حرارة كتلة في -25 إلى -16 ° C). أقسام نقل بالتتابع في حل التجمد التي تحتوي على الآبار من 24 بئر لوحة زراعة الخلايا (انظر الشكل 1). تخزين في -20 ° C.

"الشكل الشكل 1. توضيح تخطيطي لنقل شرائح مبضع للفحص المجهري في لوحة 24-جيدا. ابدأ في A1 ووضع شرائح لاحقة في صف وA، بعد A6 الذهاب إلى الصف التالي وباء وهكذا دواليك. عند الوصول إلى D6، والعودة إلى A1 ومتابعة. هذا الترتيب من شرائح يسمح لتقدير حجم كل n عشر الجزء من الدماغ بأكمله. لتقدير حجم الخلايا حديثي الولادة اتخاذ كل 6 تشرين قسم الدماغ (أي ما يعادل محتوى عمود واحد)، لالمناعي phenotyping اتخاذ كل قسم 12 عشر (ما يعادل محتوى الصفوف 2 بالتناوب من عمود واحد).

3. المناعية

تتم معالجة أقسام التعويم الحر، وعادة في 6 لوحات مجهزة تجهيزا جيدا مع لوحة الناقل وشبكة إدراج: ملاحظة. كاستثناء، ومنع، تتم حضانات الأجسام المضادة ورد فعل ABC في 12- أو 24-جيدا لوحات من دون إدراج شبكة (0،5-1 مل لكل ثالذراع يكفي، اعتمادا على عدد من شرائح التي يجب أن تكون ملطخة). خلال هذه الخطوات، نقل أقسام بمساعدة فرشاة غرامة (شطف مع كل حل جديد). تتم جميع حضانات مع التحريض المستمر (بحد أقصى 150 دورة في الدقيقة).

  1. المناعية (طريقة ABC)
    1. نقل أقسام من التجمد في TBS وشطف جيدا (مرة واحدة O / N عند 4 درجات مئوية، و 5 مرات في RT لمدة 10 دقيقة لكل منهما) لإزالة التجمد تماما.
    2. احتضان لمدة 30 دقيقة في 1.5٪ H 2 O 2 في TBS-T لإرواء النشاط البيروكسيداز الذاتية. إيلاء الاهتمام لمحتدما وإعادة غمر-أقسام إذا لزم الأمر. شطف 3 مرات في TBS لمدة 15 دقيقة لكل منهما.
    3. اختياري: في هذه الأثناء سخن مجلس الوزراء التدفئة و2 N حمض الهيدروكلوريك إلى 37 درجة مئوية. احتضان أقسام لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في 2 N حمض الهيدروكلوريك لتفسد DNA. بلطف أقسام منفصلة بمساعدة فرشاة.
    4. اختياري: تحييد أقسام لمدة 10 دقيقة في 0.1 M بورات عازلة درجة الحموضة8.5، RT. في حين نقل، مسحة لفترة وجيزة على إدراج شبكة تحتوي على أقسام على منشفة ورقية لإزالة رواسب حمض الهيدروكلوريك. شطف 2 مرات في TBS لمدة 15 دقيقة لكل منهما.
    5. احتضان في TBSplus إلى permeabilize الأنسجة والأجسام المضادة ملزمة لمنع المواقع غير محددة، 1 ساعة على RT.
    6. احتضان في الأجسام المضادة الأولية مخففة في TBSplus، O / N عند 4 درجات مئوية. شطف 3 مرات في TBS لمدة 15 دقيقة لكل منهما.
    7. احتضان في الضد الثانوية المعقدة البيروكسيديز مخففة في TBSplus، 3 ساعة على RT. شطف 3 مرات في TBS لمدة 15 دقيقة لكل منهما. وفي الوقت نفسه ...
    8. إعداد مجمع ABC وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة (1٪ A + 1٪ B في TBS-T). السماح للوقوف لمدة 30 دقيقة في RT قبل الاستخدام. احتضان المقاطع في AB كاشف لمدة 1 ساعة على RT. شطف 3 مرات في TBS لمدة 15 دقيقة لكل منهما.
    9. تجهيز 50 مل 0.5 ملغ / مل DAB في TBS-T في 6- أو 12-جيدا لوحة، وانقسم إلى نصفين وماصة 4 مل أو 2 مل لكل بئر، على التوالي. أقسام نقل إلى DAB الحل (تنبيه! DAB سامة اتبع specifi.ج MSDS المقدمة من قبل المورد، أي ارتداء معطف المختبر وقفازات، واستخدام غطاء الدخان الكيميائي).
    10. إضافة 0.5 مل 1٪ H 2 O 2 إلى 25 مل من محلول DAB المتبقية، ومزيج حجم ماصة ما يعادلها على النحو الوارد أعلاه إلى كل بئر لبدء رد فعل الغلوثانيون. احتضان لمدة 12 دقيقة. شطف 3 مرات في TBS لمدة 15 دقيقة لكل منهما.
    11. جبل أقسام إلى الشرائح في الجيلاتين، والهواء الجاف O / N. ساترة مع دائم المتوسطة المتزايدة.
    12. اختياري: مباين قبل وضع ساترة (انظر القسم 3.5).
      ملاحظة: إذا كان نسبة الإشارة إلى الضوضاء منخفضة بسبب خلفية عالية، كرر H 2 O 2 العلاج بعد الحضانة مع AB كاشف (الخطوة 3.1.8).
  2. متعددة المناعي
    1. واحد في وقت واحد أو متعددة المناعي
      1. نقل أقسام من التجمد في TBS وشطف جيدا (مرة واحدة O / N عند 4 درجات مئوية، و 5 مرات في RT لمدة 10 دقيقة لكل منهما) لإزالة تماما لtifreeze.
      2. اختياري: كما الخطوات 3.1.3 - 3.1.4.
      3. احتضان في TBSplus إلى permeabilize الأنسجة ومنع الأجسام المضادة ملزمة مواقع غير محددة، 1 ساعة على RT.
      4. احتضان في كوكتيل الأجسام المضادة الأولية (مثل الفئران α-BrdU، خنزير غينيا α-DCX، الماعز α-GFP) المخفف في TBSplus، O / N عند 4 درجات مئوية. شطف 3 مرات في TBS لمدة 15 دقيقة لكل منهما.
      5. احتضان في مزيج من الأجسام المضادة الثانوية تألقي مترافق (على سبيل المثال، رودامين الأحمر α-الفئران، اليكسا-647 α-خنزير غينيا،-488 اليكسا α-الماعز، وكلها مستمدة في حمار) المخفف في TBSplus، 3 ساعة على RT أو O / N في 4 درجات مئوية. من الآن على حماية أقسام من الضوء. شطف 3 مرات في TBS لمدة 15 دقيقة لكل منهما.
      6. جبل أقسام إلى الشرائح في الجيلاتين، والهواء الجاف O / N. ساترة مع مائي المتوسطة المتزايدة.
    2. متسلسل المناعي متعددة مع الأجسام المضادة الأولية من الأنواع المضيفة نفسها
      1. كما الخطوات 3.2.1.1 - 3.2.1.3.
      2. احتضان في فايRST الأجسام المضادة الأولية (على سبيل المثال، α مستضد أرنب A)، O / N عند 4 درجات مئوية. شطف 3 مرات في TBS ومرة ​​واحدة في TBS-T لمدة 10 دقيقة لكل منهما.
      3. احتضان في أول الأجسام المضادة تألقي مترافق الثانوية (على سبيل المثال، رودامين الأحمر-حرف عطف حمار α-أرنب)، 3 ساعة RT. من الآن على حماية أقسام من الضوء. شطف 3 مرات في TBS ومرة ​​واحدة في TBS-T لمدة 10 دقيقة لكل منهما.
      4. احتضان في 10٪ مصل طبيعي من نفس المضيف مثل الأجسام المضادة الأولية (مثل مصل الأرنب) لمدة 3 ساعة RT لتشبع paratopes مفتوحة على أول الضد الثانوية. شطف 3 مرات في TBS ومرة ​​واحدة في TBS-T لمدة 10 دقيقة لكل منهما.
      5. احتضان في TBSplus مع 50 ميكروغرام / مل أحادي التكافؤ اللامقترن شظايا فاب موجهة ضد مجموعة من الأجسام المضادة الأولية (على سبيل المثال، α-أرنب مفتش (H + L)) لتغطية الحواتم التي يمكن المعترف بها من قبل الضد الثانوية الثانية، O / N في 4 ° C.
      6. شطف 3 مرات على الأقل في TBS ومرة ​​واحدة في TBS-T لمدة 10 دقيقة لكل منهما. في حين نقل، لفترة وجيزة SWAب يدرج شبكة تحتوي على أقسام على منشفة ورقية لإزالة أي رواسب فاب.
      7. احتضان في الأجسام المضادة الأولية الثاني (على سبيل المثال، أرنب α-المستضد B)، O / N عند 4 درجات مئوية. شطف 3 مرات في TBS ومرة ​​واحدة في TBS-T لمدة 10 دقيقة لكل منهما.
      8. احتضان في ثاني الأجسام المضادة تألقي مترافق الثانوية (على سبيل المثال، اليكسا-488-حرف عطف حمار α-أرنب)، 3 ساعة RT. شطف 3 مرات في TBS لمدة 15 دقيقة لكل منهما، وجبل ساترة على النحو الوارد أعلاه.
        ملاحظة: لتسمية مستضدات مع الأجسام المضادة من الأنواع المضيفة مختلفة إضافتها إلى الخطوة 3.2.2.2 والأجسام المضادة الثانوية منها إلى الخطوة 3.2.2.3.
    3. واحد من الأجسام المضادة الثانوية من الأنواع نفسها كواحدة من الأجسام المضادة الأولية
      ملاحظة: هذا البروتوكول هو مناسبة للالرباعي تلطيخ ضد BrdU أو Ki67 جنبا إلى جنب مع GFAP، nestin-GFP وDCX.
      1. تتبع بدقة بروتوكول الخطوات 3.2.1.1 - 3.2.1.5. حتى هذه النقطة استخدام المصل حمار الوحيد في TBSplus.
      2. احتضان في TBSplus تحتوي على 3٪ مصل الماعز لمدة 1 ساعة على RT. هذا يغطي paratopes مفتوحة على الضد الثانوية-α الماعز. شطف 3 مرات في TBS ومرة ​​واحدة في TBS-T لمدة 10 دقيقة لكل منهما.
      3. احتضان في AMCA-حرف عطف. الماعز α-أرنب مخففة في TBSplus، RT 3 ساعة أو O / N 4 ° C. شطف ثلاث مرات في TBS لمدة 15 دقيقة لكل منهما، وجبل ساترة على النحو الوارد أعلاه.
    4. CldU، إيدو شارك في تلطيخ
      1. شطف، تفسد وتحييد أقسام كما هو موضح في القسم 3.2.1 (الخطوات 3.2.1.1 - 3.2.1.2).
      2. احتضان مع 20 ميكروغرام / مل شظايا فاب اللامقترن α الفأر مفتش (H + L) في TBSplus، 1 ساعة على RT. شطف 4 مرات في TBS ومرة ​​واحدة في TBS-T لمدة 10 دقيقة لكل منهما.
      3. احتضان في كوكتيل الأجسام المضادة الأولية التي تحتوي على الفئران α-BrdU (1: 400، تنقية IgG2) والفأرة α-BrdU (1: 350) المخفف في TBSplus، O / N عند 4 درجات مئوية. شطف 3 مرات في TBS ومرة ​​واحدة في TBS-T لمدة 10 دقيقة لكل منهما.
      4. احتضان في كوكتيل الضد الثانوية التي تحتوي على حمار المعقدة البيروكسيديز α-الفئران (1: 500) وFITC-حرف عطف. حمار α الفأر شظايا فاب (1: 100). شطف 3 مرات في TBS ومرة ​​واحدة في TBS-T لمدة 10 دقيقة لكل منهما.
      5. احتضان في رودامين الأحمر-حرف عطف. Streptavidin، 2 ساعة على RT. شطف 3 مرات في TBS لمدة 15 دقيقة لكل منهما، وجبل ساترة على النحو الوارد أعلاه.
    5. التضخيم من إشارة مضان في الفئران nestin-GFP
      1. إضافة الماعز α-GFP إلى كوكتيل الأجسام المضادة الأولية.
      2. إضافة الضد الثانوية مترافق تألقي مع الخصائص الطيفية مماثلة لGFP (مثل اليكسا 488 حرف عطف الحمار α-الماعز) إلى كوكتيل الضد الثانوية.
  3. استرجاع حاتمة
    1. تنفيذ استرجاع حاتمة بعد الشطف من التجمد. باخرة سخن مع 6- أو 12-جيدا لوحات تحتوي على 0.1 M سيترات عازلة 6.0 درجة الحموضة to 95-99 ° C (حوالي 25 دقيقة).
    2. نقل أقسام في المخزن المؤقت سترات الساخن والبخار لمدة 30 دقيقة (تغطية لوحات مع رقائق الألومنيوم كما البلاستيك لهويات لا للحرارة مقاومة).
    3. وضع على الفور لوحات في حمام الثلج حتى يبرد. وهذا يساعد على حماية التشكل الأنسجة، والتي هي ذات أهمية خاصة عند العمل مع أقسام الدماغ من الحيوانات بعد الولادة.
    4. شطف 3 مرات في TBS لمدة 10 دقيقة كل لشطف خارج وتحييد سترات ومواصلة تلطيخ.
  4. الماوس الأجسام المضادة في الأنسجة الماوس
    1. إضافة 20 ميكروغرام / مل أحادي التكافؤ شظايا فاب α الفأر مفتش (H + L، نفس الأنواع المضيفة من الأجسام المضادة الثانوية) إلى الخطوة حجب الأولى (على سبيل المثال، خطوة 3.1.5 أو 3.2.1.3).
    2. شطف 4 مرات في TBS ومرة ​​واحدة في TBS-T لمدة 10 دقيقة لكل منهما، والمضي قدما في البروتوكول المعني.
  5. بنفسجية الكريزيل counterstaining
    1. سخن حل بنفسجية الكريزيل إلى 60 درجة مئوية (في جرة الزجاج). احتضان الشرائح في حل الساخن لمدة 3 دقائق.
    2. شطف في عبد القدير. دست. ويذوى 2 مرات لمدة 1 دقيقة في كل من 70٪، 96٪ و 100٪ الأيزوبروبانول. واضح عن 5-6 دقائق في الزيلين أو بديلا الزيلين وساترة مع دائم المتوسطة المتزايدة متوافق.

4. تحليل البيانات

  1. عدد الخلايا حديثي الولادة ملطخة الغلوثانيون في كل قسم ال 6 على طول كامل مدى rostrocaudal من التلفيف المسنن. استخدام المجهر الضوئي في 400X التكبير.
  2. مضاعفة أعداد الخلايا الناتجة مع الفاصل تقاطع للحصول على تقدير الأعداد الإجمالية للخلايا حديثي الولادة.
  3. صورة مضان صفت أقسام مع المجهر ليزر متحد البؤر مجهزة الليزر المناسبة وأنظمة التصفية. خذ مداخن صورة على مواقع عشوائية على طول مدى كامل من التلفيف المسنن في 400X التكبير وتحليلها لا يقل عن 50 خلايا تم اختيارها عشوائيا من الفائدة لكل نصف الكرة للمشاركة في وضع العلامات مع علامات أخرى.
  4. مضاعفة النسب المئوية الناتجة من الخلايا المسمى المشترك (٪ / 100) مع الأرقام الإجمالية لخلايا حديثي الولادة لحساب مطلقةأرقام من فئات معينة من السكان خلية حديثي الولادة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

طبقنا الأساليب المذكورة أعلاه لتحديد وتوصيف الخلايا حديثي الولادة في بعد الولادة وتعليم الكبار الحصين. لذلك، كنا wildtype وتكوين الخلايا العصبية نقص السيكلين D2 تدق من أصل (Ccnd2 KO) الفئران الموجودة في ظل ظروف المعروفة بتأثيرها على معدل تكوين الخلايا العصبية (أي بيئة المخصب، EE) 13،14. المناعى تلطيخ DAB ضد أي Ki67، BrdU، CldU أو إيدو كشفت باستمرار الاختلافات في أعداد الخلايا بين الأطفال حديثي الولادة wildtype وCcnd2 KO الفئران (الشكل 3) 15. وعلاوة على ذلك، مع حقن متساوي المولية متتالية من CldU وإيدو كنا قادرين على تمييز السكان الخلية ولدوا خلال فترات محددة من EE (الشكل 3C، D). اعتماد القسم 3.2.4 يمكننا أن بنجاح الكشف عن شدة إشارة متساوية والتداخل ممتازة من CldU وإيدو بعد الولادة في وقت واحد على (الشكل 4). يمكن phenotyped BrdU المسمى خلايا حديثي الولادة مع ستان طريقة دارد المناعي إما عن طريق تطبيق في وقت واحد BrdU وNeuN، (الشكل 5)، أو BrdU، GFAP، nestin-GFP والأجسام المضادة DCX (الشكل 6B). هذه التقنية سمحت ناجح نوع الهوية 1، 2A، 2B و 3 الخلايا الاصلية ضمن عينة واحدة (الشكل 6B، D). شارك في وضع العلامات على Ki67 مع علامات السلف يتطلب تطبيق متتابعة من الأجسام المضادة كما أثيرت الأجسام المضادة الأولية ضد Ki67 وGFAP في الأرنب (ينطبق على القسم 3.2.2)، علاوة على ذلك واحد من الأجسام المضادة الأولية (الماعز α-GFP) تم إنتاجها في المضيف نفسه باعتباره واحدا من الأجسام المضادة الثانوية (AMCA حرف عطف الماعز α-أرنب). مزيج من أقسام 3.2.2 و3.2.3 عملت تماما إذا حضنت أقسام للمرة الأولى في Ki67 جنبا إلى جنب مع nestin-GFP الأجسام المضادة، وثانيا في GFAP الضد ولكن ليس العكس (الشكل 6C). يلخص الشكل 2B مخططات الطلب موافقا عليه.

. في غضون صفحة = "دائما"> الشكل 2
الشكل 2. متسلسل المناعي متعددة مع الأجسام المضادة الأولية المستمدة من الأنواع المضيفة نفسها. (A) توضيح تخطيطي. (B) مجموعات الناجحة الأضداد، والترتيب الزمني في المناعي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3. الصور ضوء المجهر من ABC-المناعية لخلايا الكمي لحديثي الولادة في التلفيف المسنن. تصويرها هي مقارنات بين علامات انتشار مختلفة في WT وتكوين الخلايا العصبية نقص الفئران Ccnd2 KO في 100X و400X التكبير. (A) يظهر ز> Ki67-DAB تلطيخ مجموعات من الخلايا المتكاثرة في المنطقة جزئي التحبب من التلفيف المسنن (يوم ما بعد الولادة 35). وتقلص عدد الخلايا المتكاثرة في الفئران Ccnd2 KO بالمقارنة مع الفئران WT. (B) خلايا الوليد في 28 يوما بعد BrdU-الإدارة (مخطط حقن فوق صور) تؤكد معدل انتشار انخفاض في الفئران Ccnd2 KO. (C) CldU-الإدارة خلال الأسبوع 6 من EE (مخطط حقن فوق الصورة) كشفت زيادة في عدد الخلايا حديثي الولادة في التلفيف المسنن من WT لكن أظهرت الفئران لا Ccnd2 KO. (D) عن طريق حقن المخدرات، الإدارة خلال الأسبوع 8 من EE نتائج مماثلة. يمثل شريط نطاق 50 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

fig4.jpg "/>
أدى الشكل 4. المناعي شارك في تلطيخ CldU وإيدو بعد الولادة في وقت واحد من تركيزات متساوي المولية. التضخيم إشارة خلايا CldU وصفت في تداخل ممتازة من CldU وإيدو. يمثل شريط نطاق 20 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
الشكل 5. المناعي شارك في وضع العلامات على NeuN وBrdU. كانت تدار (A) BrdU 6 مرات كل ساعة 8 لمدة 2 أيام متتالية ابتداء من يوم ما بعد الولادة تم التضحية 14. الحيوانات في وقت لاحق 28 يوما. (B) المناعي شارك في وضع العلامات من الخلايا المتكاثرة مع علامة العصبية الناضجة معارض NeuN انخفاض عدد المتكاثرة الخلايا في Ccnd2 KO مقارنة WT الحيوانات. يمثل شريط نطاق 50 ميكرون. (C) عرض موسع لل(B) تظهر الخلايا المسمى المشترك في كل الأنماط الجينية. يمثل شريط نطاق 20 ميكرون. (D) عالية التكبير مثال على / NeuN الخلية المسمى شارك BrdU في التلفيف المسنن. يمثل شريط نطاق 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (6)
الشكل 6. المناعي رباعية شارك في وضع العلامات من علامات انتشار مختلفة مع GFAP، nestin-GFP وDCX لphenotyping الخلايا الحبيبية حديثي الولادة في التلفيف المسنن من الفئران nestin-GFP. كانت تدار (A) BrdU 3 مرات كل 2 ساعة في يوم ما بعد الولادة 70 . تم التضحية الحيوانات في وقت لاحق 2 ساعة. (B) صورة الممثل من تلطيخ المشترك لBrdU، GFAP،nestin-GFP وDCX. (C) صورة التمثيلية للالمناعي الرباعي لKi67، GFAP، nestin-GFP وDCX. (D) تصنيف أنواع الخلايا السلف وفقا لوضع العلامات المناعي بهم. على أساس التعاون التعبير عن علامات مختلفة والميزات المورفولوجية من الخلايا المسمى ويمكن تحديد أربعة أنواع فرعية خلية سلفية متميزة: نوع 1 (GFAP nestin DCX -)، نوع 2A (GFAP nestin DCX - )، ونوع 2B (GFAP nestin DCX +) ونوع 3 (GFAP nestin DCX +). يمثل شريط نطاق 20 ميكرون. (E) نظرة عامة التخطيطي لمراحل مختلفة من الخلايا العصبية الحصين الكبار. ويوضح أنواع 4 السلف الخلية، والخلايا العصبية غير ناضجة والخلايا الحبيبية ناضجة والتعبير مميزة من علامات والقدرة التكاثري بهم. ML - طبقة الخلايا الجزيئية، GCL -طبقة الخلايا الحبيبية، SGL - طبقة الخلايا جزئي التحبب الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 7
الرقم 7. مثال stainings متتابعة ناجحة وغير ناجحة مع اثنين من الأجسام المضادة الأولية التي أثيرت في نفس الأنواع، اعتمادا على سلسلة من الأجسام المضادة الحضانة. وتظهر الميكروسكوب مبائر على نتيجة متتابعة شارك في تلطيخ ضد Ki67 وGFAP مع الأجسام المضادة الأولية على حد سواء المستمدة من الأرانب. في اكتمل (A) المناعية أولا لGFAP تليها تلطيخ ضد Ki67 مما أدى إلى تداخل وضوحا من إشارات اثنين. وعلى وجه الخصوص كانت إشارة Ki67 شاذة وتشبه إشارة من تلطيخ GFAP. (B) تظهر النتائج من الاتجاه المعاكستسلسل تلطيخ مع تلطيخ Ki67 الانتهاء الأول واللاحق تلطيخ ضد GFAP. هنا، وإشارات لكلا مستضدات تشبه نمط التعبير المتوقع: كان مقتصرا إشارة Ki67 إلى نوى داخل المنطقة جزئي التحبب في حين تم العثور على إشارة GFAP cytoplasmatically، بشكل رئيسي في العمليات الخلوية الناتجة من منطقة جزئي التحبب. يمثل شريط نطاق 20 ميكرون. RhX - رودامين X. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 8
تم حقن الشكل 8. خصوصية الأجسام المضادة α-BrdU تستخدم لكشف CldU وإيدو. الفئران إما مع أو مع CldU إيدو (تطبيق غير المتزامن). في (A) أقسام الدماغ من CldU (A1) أو عن طريق حقن المخدرات (A2) حقن الفئران كانت immunostained باستخدام الأجسام المضادة الفئران النقى α-BrdU التي ينبغي على وجه التحديد عبر رد فعل لCldU، ولكن ليس لإيدو. (B) يظهر نتائج من تلطيخ العقول من CldU (B1) أو عن طريق حقن المخدرات (B2) حقن الفئران مع الماوس α-BrdU الأجسام المضادة التي من المتوقع أن عبر تتفاعل مع إيدو، ولكن ليس CldU. يمثل شريط نطاق 20 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الكمي وتحديد المجموعات السكانية الفرعية الخلايا حديثي الولادة هو القضية المركزية في مجال البحوث تكوين الخلايا العصبية الكبار. الجمع بين علامات انتشار الأسلحة النووية والأجسام المضادة ضد البروتينات التي أعرب عنها خلال مراحل معينة من الخلايا العصبية الكبار يسمح كشف المناعى من هذه القطعان. بعض الأجسام المضادة أو مزيج الأجسام المضادة تتطلب الظروف تلطيخ محددة.

وضع العلامات تقسيم الخلايا مع النظير ثيميدين الاصطناعية لا يزال المعيار الذهبي لدراسة الكبار تكوين الخلايا العصبية قرن آمون. لا بد من النظر في بروتوكول الحقن المناسب قبل بدء التجربة. ونحن عادة إدارة 50 مغ / كغ (وزن الجسم، والملكية الفكرية) BrdU، ولكن قد تختلف تركيزات تبعا لمتطلبات التجريبية (تصل إلى 300 ملغ / كغ لحقن البلعة) 8،16. وإذا ليتم حقنه عن طريق حقن المخدرات وCldU بالتسلسل الزمني للتمييز من السكان الخلية وهي ملزمة لحقن تركيزات متساوي المولية ( 16. وثمة عيب آخر هو أن تمسخ DNA مطلوب للكشف المناعى من النظير ثيميدين التي قد تتداخل مع استضداد من الأجسام المضادة أو تقنيات وضع العلامات DNA أخرى (على سبيل المثال، دابي، هويشت 33258). كشف المناعى من علامات انتشار الذاتية مثل Ki67 قد تكون كافية بديل 10،11. ومع ذلك، وهذا يسمح فقط من تسديدة مفاجئة من النشاط التكاثري في وقت نضح، بأثر رجعي الولادة وتاريخها وتحليل مصير مستحيل.

لالمناعية، تتم معالجة أقسام عموما التعويم الحر، وعادة في 6 لوحات مجهزة تجهيزا جيدا مع لوحة الناقل وشبكة إدراج الذي يبسط نقلهم من حل واحد إلى آخر. كاستثناء، ومنع، تتم حضانات الأجسام المضادة ورد فعل ABCفي 12- أو 24-جيدا لوحات من دون إدراج شبكة لتقتصد حلول مكلفة (0.5 1 مل لكل بئر كافية، اعتمادا على عدد من شرائح التي يجب أن تكون ملطخة). خلال هذه الخطوات، نقل أقسام بمساعدة فرشاة الدقيقة التي تحتاج إلى أن تشطف عند تغيير الحلول. منع مقاطع من التجفيف التدريجي وأداء حضانات التي تأخذ> 1 ساعة في غرفة humified. جميع حضانات التي ينبغي القيام به مع الإثارة مستمر (بحد أقصى 150 دورة في الدقيقة). دائما اختبار ومعايرة كل الكثير الأجسام المضادة الجديد. أطول الأوقات الأجسام المضادة الحضانة (تصل إلى 2 أيام في 4 درجات مئوية) قد يحسن تلطيخ. في حالة تتوفر ضد المستضدات تريد تصور في الأنسجة الماوس فإنه من المستحسن لمنع المناعية الذاتية مع أحادي التكافؤ مركزة للغاية شظايا فاب α الفأر (القسم 3.4) فقط الأجسام المضادة الماوس. كلما باستخدام هذه التقنية تمديد الخطوات التالية الشطف. خلاف ذلك، شظايا فاب غير منضم قد ربط الأجسام المضادة الماوس الأساسي الخاص بك. حمض الهيدروكلوريك المعالجة وبوراتمطلوبة تحييد فقط للكشف عن النظير ثيميدين. يؤدي رد الفعل الغلوثانيون 12 دقيقة في النسبة المثلى إشارة إلى الضوضاء مع الظروف والأجسام المضادة تطبيقها في بروتوكول لدينا. كما هو الحال مع أي رد فعل الأنزيمية، ومعدل التفاعل الغلوثانيون يعتمد على عوامل كثيرة (على سبيل المثال، ودرجة الحرارة، ودرجة الحموضة، وتركيز الانزيم والركيزة). وبناء على ذلك، يتعين على أوقات رد الفعل ليكون الأمثل لأي مجموعة الأجسام المضادة الجديد. لتصور الهياكل التشريحية في البقع DAB مع ضعيفة جدا الخلفية (على سبيل المثال، CldU)، يمكن counterstained شرائح. طريقة بنفسجية الكريزيل وصفها في القسم 3.5 النتائج في مباين خافت جدا الذي لا يضر إشارة DAB محددة.

لالمناعي متعددة، استخدم الأجسام المضادة الأولية التي تربى في الأنواع المختلفة أو من isotypes مختلفة واتبع القسم 3.2.1. خلاف ذلك، إجراء immunolabeling متعددة متتابعة الذي تم الأمثل للكشف عن الأجسام المضادة الأولية متعددةمن الأنواع نفس المضيف (أي الماوس أو أرنب، القسم 3.2.2). وقد اخترع المبدأ الأساسي لهذه الطريقة من قبل فيرغسون والزملاء الذين الملون بنجاح علامات مختلفة من العضلات مع اثنين من الماوس الأجسام المضادة الأولية 17. يجب أن تستمد شظايا فاب تستخدم لحظر في خطوة 3.2.2.5 من الأنواع المضيفة نفس الأجسام المضادة الثانوية. هي الأمثل تركيزات والأوقات الحضانة هو موضح في القسم 3.2.2 لأجسام مضادة محددة الموصوفة هنا، ويجب أن يتم تعديلها لأي مزيج الأجسام المضادة الجديد. كن على علم بأن تسلسل حضانة الأجسام المضادة الأولية قد يؤثر بقوة على نتائج (كما هو مبين في الشكل 7A). حيثما ينطبق ذلك، ينبغي للمستضدات الكشف عنها بواسطة الأجسام المضادة الأولية التي هي مستمدة من نفس الأنواع تبين وجود نمط مختلف التعبير الذي يبسط كشف عن عدم كفاية حظر. للقضاء على أي احتمال من الأجسام المضادة عبر رد فعل أو ايجابيات كاذبة فمن إيسنللمحاكمة لتشمل الضوابط المناسبة (أي ضوابط فقط بعد الثانوية الأجسام المضادة. المناعية كاملة لمستضد الأول تليها الحضانة مع الأجسام المضادة الأولية الثانية أو الضد الثانوية الثانية وحدها). 18 ويبين الشكل 2B تركيبات الأجسام المضادة التي عملت بشكل جيد في أيدينا. لالمناعي متعددة كما أنه من المستحسن استخدام الأجسام المضادة الثانوية التي تربى في نفس الأنواع (مثل حمار) ويكون الحد الأدنى عبر التفاعل إلى الأنسجة الخاص بك والمصل البروتينات من الأنواع الأخرى (أي ما قبل كثف). خلاف ذلك القسم 3.2.3 قد تساعد على منع أي بين الأنواع غير متوقعة عبر التفاعل. حدد fluorochromes مع الحد الأدنى من الطيفي الاقتضاء التداخل لنظام الكشف الخاص بك (على سبيل المثال، AMCA، اليكسا فلور 488، رودامين الأحمر، اليكسا فلور 647). إذا كنت بحاجة لمباين النووي، إضافة دابي أو هويشت 33342 (10 ميكروغرام / مل) إلى كوكتيل الضد الثانوية (ثم، لا قرب للأشعة فوق البنفسجية الضد الثانوية يمكن أن يكون لناإد). هذه counterstains النووية لا تعمل إذا الأنسجة تمت معالجتها قبل مع حمض الهيدروكلوريك. وبالمثل، العلاج حمض الهيدروكلوريك قد يضر الكشف عن بعض المستضدات، وبالتالي تأثيرها على الأداء الفردي الأجسام المضادة يحتاج لفحصها. وبمجرد أن الأجسام المضادة الثانوية تألقي مترافق تم تطبيقها أقسام يحفظ بعيدا عن الضوء.

CldU وإيدو يمكن تصور بمساعدة اثنين من الأجسام المضادة BrdU المختلفة التي عبر التفاعل سواء مع CldU (الفئران α-BrdU) أو عن طريق حقن المخدرات (الماوس α-BrdU) 9،19. إذا تم حقن كلا النظير ثيميدين إلى حيوان واحد فمن الضروري للغاية لاستخدام النقى الفئران α-BrdU الأجسام المضادة للكشف عن CldU لأن الأجسام المضادة غير تنقيته عبر يتفاعل لتعاطي المخدرات بالحقن. كما وصفها فيغا وآخرون. 9 تحتاج إشارة CldU أن تضخيم للمناعي شارك في وضع العلامات لتحقيق الكشف يعادل كل النظير ثيميدين. لذلك، بدلا من الأجسام المضادة الثانوية-تألقي مترافق (α-الفئران) يتم إضافة streptavidin مترافق تألقي التالية حضانة في الضد الثانوية المعقدة البيروكسيديز (α-الفئران، القسم 3.2.4). لاستبعاد أي الأجسام المضادة غير مرغوب فيها وتشمل ردود الفعل عبر أقسام التحكم من الفئران التي تلقت إما عن طريق حقن المخدرات أو CldU (بشكل منفصل؛ انظر الشكل 8). للتحقق من كشف مماثل من إيدو وCldU أقسام استخدام من الحيوانات التي حقنت في وقت واحد مع كميات متساوي المولية من CldU وإيدو (انظر الشكل 4).

لدراسة نوع 1 ونوع 2 الخلايا الاصلية ونحن نفضل استخدام nestin-GFP الفئران المعدلة وراثيا 12 كما الأجسام المضادة nestin لم كثير من الأحيان لا توفر نتائج مرضية. الفئران Nestin GFP لديها ميزة تصور موثوق الخلايا الاصلية-nestin إيجابي وخصائصها المورفولوجية في مرحلة تنموية معينة. تحتاج للإشارة GFP إلى أن تضخيم من خلال المناعي غير المباشر مع الأجسام المضادة α GFP. ينبغي أن يقترن الأجسام المضادة الثانوية إلى fluorochrلى بعد مع الخصائص الطيفية مماثلة لGFP. إذا لزم الأمر، الفئران nestin GFP يمكن تهجينها لخطوط الماوس متحولة أخرى للتحقيق في تورط جينات معينة في الخلايا العصبية. الآن، يتم توفير وتحسين الأجسام المضادة nestin التي أجسام الخلايا التسمية، وكذلك العمليات، ويمكن استخدامها كبديل لنهج المعدلة وراثيا (انظر قائمة المواد).

فمن الأهمية بمكان أن تمتثل لتثبيت 24 ساعة لمنع overfixation. الشركاء تفاعل كيميائي من الفورمالديهايد في الأنسجة هي في المقام الأول البروتينات والفورمالديهايد يولد مجموعات hydroxymethyl رد الفعل على سلاسل جانبهم مما يؤدي إلى عبر ربط الأحماض الأمينية المجاورة (عن طريق تشكيل الجسور الميثيلين). قد يتسبب هذا إخفاء للمستضد الحواتم وفقدان مناعية (انظر التعليقات على أجسام مضادة محددة في قائمة المواد). لاسترداد مناعية المفقود، عدة طرق استرجاع حاتمة وجود كسر أن البروتين الناجم عن الفورمالديهايد عبر الروابط عبر البريدxposure للحرارة 20. في هذا البروتوكول، وطريقة عازلة سترات يعمل متفوقة على غيرها للكشف عن تكوين الخلايا العصبية في الحصين بعد الولادة وتعليم الكبار (القسم 3.3). لاحظ أن شرائح من الحيوانات الصغيرة جدا (<P21) قد تصبح هشة للغاية أو مشوهة وتحتاج إلى التعامل معها بعناية خاصة. وعلاوة على ذلك، قد يكون استرجاع حاتمة ضارا لبعض الحواتم وبالتالي ينبغي اختبار الأجسام المضادة الفردية سواء كانت مناسبة لتلطيخ متعددة يتطلب هذا قبل المعالجة.

باختصار، هذا البروتوكول هو مجموعة من التقنيات الأساسية وضعت تسهل تحليل تكوين الخلايا العصبية الحصين الكبار. انها تسمح بشكل خاص على تحديد القاطعة لجميع القطعان السلف الحصين جنبا إلى جنب مع انتشار أو الولادة التي يرجع تاريخها علامة من مقطع واحد. هذه التقنيات يمكن أن تتكيف مع أي مزيج من الأجسام المضادة أو الأنواع الأخرى لدراسة تطوير وتنظيم hippocamالخلايا الاصلية بال استجابة للمؤثرات الخاصة ومشاركتهم في وظائف معينة في الدماغ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Thymidine analog administration
5-Bromo-2′-deoxyuridine, BrdU Sigma-Aldrich B9285 toxic (mutagenic, teratogenic)
5-Chloro-2′-deoxyuridine, CldU Sigma-Aldrich C6891 toxic (mutagenic, teratogenic)
5-Chloro-2′-deoxyuridine, CldU MP Biomedicals 2105478 toxic (mutagenic, teratogenic)
5-Iodo-2′-deoxyuridine, IdU MP Biomedicals 2100357 toxic (mutagenic, teratogenic)
Tissue preparation
Isoflurane-Actavis Piramal Healthcare 700211
Paraformaldehyde powder (PFA) Riedel-De Häen 16005 toxic, flammable
Perfusion pump PD5206 Heidolph Instruments 523-52060-00
Masterflex Tygon lab tubing, Ø 0.8 mm Thermo Fischer Scientific 06409-13
Feeding needle, straight, 21 G, 1.75 mm olive tip, 40 mm Agnthos 1036
Freezing microtome Microm HM 400 Thermo Fischer Scientific
24-well Cell culture multiwell plates Greiner Bio-One 662160
Immunohistochemistry
Tefal vitacuisine steamer Tefal VS 4001
Netwell 24 mm polyester mesh membrane inserts Corning 3479 pre-loaded in 6-well culture plates
Netwell 15 mm polyester mesh membrane inserts Corning 3477 pre-loaded in 12-well culture plates
Netwell plastic 6-well carrier kit Corning 3521 for 24 mm polyester mesh membrane inserts
Netwell plastic 12-well carrier kit Corning 3520 for 15 mm polyester mesh membrane inserts
Vectastain Elite ABC kit Vector Laboratories PK-6100
DAB (3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate) Sigma-Aldrich D-5637 carcinogenic, light sensitive
Fluoromount-G SouthernBiotech 0100-01
Primary antibodies
Rabbit IgG1 α-Ki67 Novocastra/ Leica Biosystems NCL-L-Ki67MM1 DAB 1:400/IF 1:100; requires epitope retrieval
Rabbit α-GFAP, AS-3-GF Synaptic Systems 173 002 1:500
Goat IgG (H+L) α-GFP Acris Antibodies R1091P 1:300
Mouse IgG1 α-nestin Abcam ab6142 1:200; requires epitope retrieval
Guinea pig IgG (H+L) α-Doublecortin Merck Millipore AB2253 1:500
Rat IgG2a α-BrdU (ascites) AbD Serotec/ Bio-Rad OBT0030CX for detection of BrdU; DAB 1:500/IF 1:400
Rat IgG2a α-BrdU (purified) AbD Serotec/ Bio-Rad OBT0030   for detection of CldU; DAB 1:500/IF 1:250-400
Mouse IgG1 α-NeuN Merck Millipore MAB377 1:500
mouse IgG1κ α-BrdU BD Biosciences 347580 For detection of IdU; DAB 1:500/IF 1:350
Secondary antibodies
Donkey α-guinea pig IgG (H+L)-Biotin Dianova 711-065-152 1:500
Donkey α-rat IgG (H+L)-Biotin Dianova 712-065-150 1:500
Donkey α-mouse IgG (H+L)-Biotin Dianova 715-065-151 1:500
Goat α-rat IgG (H+L)-Alexa Fluor 488 Molecular Probes A11006 1:250
Donkey α-goat IgG (H+L)-Alexa Fluor 488 Molecular Probes A11055 1:250
Donkey α-mouse IgG (H+L)-FITC, Fab-Fragment Dianova 715-097-003 1:100
Donkey α-mouse IgG (H+L)-Alexa Fluor 647 Dianova 715-605-151 1:250
Donkey α-guinea pig IgG (H+L)-Alexa Fluor 647 Dianova 706-605-148 1:250
Donkey α-rat IgG (H+L)-Rhodamine Red-X Dianova 712-295-150 1:250
Donkey α-rabbit IgG (H+L)-Rhodamine Red-X Dianova 711-295-152 1:250
Donkey α-guinea pig IgG (H+L)-Rhodamine Red-X Dianova 706-296-148 1:250
Streptavidin-rhodamine Red-X Dianova 016-290-084 1:500
Goat α-rabbit IgG (H+L)-AMCA Dianova 111-155-144 1:250, works only with rabbit α-GFAP
Hoechst 33342 Molecular Probes H3570 1:1000
DAPI Molecular Probes D1306 1:1000
Blocking
Fab-fragment donkey α-mouse IgG (H+L) Dianova 715-007-003 1:20
Fab-fragment donkey α-rabbit IgG (H+L) Dianova 711-007-003 1:20
Normal donkey serum Merck Millipore S30
Normal rabbit serum Dianova 011-000-010
Normal goat serum Dianova 005-000-001
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A7906
Histology
Cresyl violet Sigma-Aldrich C5042
Neo-Clear Merck Millipore 109843 non-toxic xylene substitute
Neo-Mount Merck Millipore 109016 permanent mounting medium
Microscopy
Axioskop 2 Carl Zeiss Microscopy
LSM 710 Carl Zeiss Microscopy

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kempermann, G., Jessberger, S., Steiner, B., Kronenberg, G. Milestones of neuronal development in the adult hippocampus. Trends Neurosci. 27, (8), 447-452 (2004).
  2. Ge, S., Sailor, K. A., Ming, G. L., Song, H. Synaptic integration and plasticity of new neurons in the adult hippocampus. J Physiol. 586, (16), 3759-3765 (2008).
  3. Ge, S., Yang, C. H., Hsu, K. S., Ming, G. L., Song, H. A critical period for enhanced synaptic plasticity in newly generated neurons of the adult brain. Neuron. 54, (4), 559-566 (2007).
  4. Castilla-Ortega, E., Pedraza, C., Estivill-Torrus, G., Santin, L. J. When is adult hippocampal neurogenesis necessary for learning? evidence from animal research. Rev Neurosci. 22, (3), 267-283 (2011).
  5. Deng, W., Aimone, J. B., Gage, F. H. New neurons and new memories: how does adult hippocampal neurogenesis affect learning and memory. Nat Rev Neurosci. 11, (5), 339-350 (2010).
  6. Encinas, J. M., Enikolopov, G. Identifying and quantitating neural stem and progenitor cells in the adult brain. Methods Cell Biol. 85, 243-272 (2008).
  7. Burns, K. A., Kuan, C. Y. Low doses of bromo- and iododeoxyuridine produce near-saturation labeling of adult proliferative populations in the dentate gyrus. Eur J Neurosci. 21, (3), 803-807 (2005).
  8. Cameron, H. A., McKay, R. D. Adult neurogenesis produces a large pool of new granule cells in the dentate gyrus. J Comp Neurol. 435, (4), 406-417 (2001).
  9. Vega, C. J., Peterson, D. A. Stem cell proliferative history in tissue revealed by temporal halogenated thymidine analog discrimination. Nat Methods. 2, (3), 167-169 (2005).
  10. Scholzen, T., Gerdes, J. The Ki-67 protein: from the known and the unknown. J Cell Physiol. 182, (3), 311-322 (2000).
  11. Brown, D. C., Gatter, K. C. Ki67 protein: the immaculate deception. Histopathology. 40, (1), 2-11 (2002).
  12. Yamaguchi, M., Saito, H., Suzuki, M., Mori, K. Visualization of neurogenesis in the central nervous system using nestin promoter-GFP transgenic mice. Neuroreport. 11, (9), 1991-1996 (2000).
  13. Kempermann, G., Kuhn, H. G., Gage, F. H. More hippocampal neurons in adult mice living in an enriched environment. Nature. 386, (6624), 493-495 (1997).
  14. Sicinski, P., et al. Cyclin D2 is an FSH-responsive gene involved in gonadal cell proliferation and oncogenesis. Nature. 384, (6608), 470-474 (1996).
  15. Ansorg, A., Witte, O. W., Urbach, A. Age-dependent kinetics of dentate gyrus neurogenesis in the absence of cyclin D2. BMC Neurosci. 13, 46 (2012).
  16. Taupin, P. BrdU immunohistochemistry for studying adult neurogenesis: paradigms, pitfalls, limitations, and validation. Brain Res Rev. 53, (1), 198-214 (2007).
  17. Lewis Carl, S. A., Gillete-Ferguson, I., Ferguson, D. G. An indirect immunofluorescence procedure for staining the same cryosection with two mouse monoclonal primary antibodies. J Histochem Cytochem. 41, (8), 1273-1278 (1993).
  18. Burry, R. W. Controls for immunocytochemistry: an update. J Histochem Cytochem. 59, (1), 6-12 (2011).
  19. Tuttle, A. H., et al. Immunofluorescent detection of two thymidine analogues (CldU and IdU) in primary tissue. J Vis Exp. (46), 6-12 (2010).
  20. Miller, R. T., Swanson, P. E., Wick, M. R. Fixation and epitope retrieval in diagnostic immunohistochemistry: a concise review with practical considerations. Appl Immunohistochem. Mol Morphol. 8, (3), 228-235 (2000).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics