동일한 호스트 종에서 항체와 면역 조직 화학 및 다중 라벨은 성인 해마 신경 발생을 연구하기 위해

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Ansorg, A., Bornkessel, K., Witte, O. W., Urbach, A. Immunohistochemistry and Multiple Labeling with Antibodies from the Same Host Species to Study Adult Hippocampal Neurogenesis. J. Vis. Exp. (98), e52551, doi:10.3791/52551 (2015).

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Abstract

성인 신경 새로운 뉴런 점점 커미트 중간 선조 아형을 통해 활성화 된 신경 줄기 세포에서 생성되는 고도로 조절되는 다단계 공정이다. 이들 아형 각각은, 함께, 특정 형태 학적 기준 그들의 식별을 위해 이용 될 수있는 특정 분자 표지의 집합을 표현한다. 일반적으로, 면역 형광 기법은 엑소 또는 내생 증식 마커와 함께 하위 특정 항체를 포함하는 적용됩니다. 우리는 여기에 성인 해마 신경 세포의 모든 단계의 검출과 정량 방법을 immunolabeling에 대해 설명합니다. 이들은 티미 딘 유사체, transcardial 관류, 조직 처리, 열 - 유도 에피토프 검색, 면역 조직 화학 ABC 여러 간접 면역 형광 공 초점 현미경 및 셀 정량의 적용을 포함한다. 또한 우리는 문제 U를 피하는 순차적 여러 면역 형광 프로토콜을 제시sually 같은 숙주 종에서 발생하는 일차 항체를 사용하는 필요성으로부터 발생. 그것은 하나의 섹션 내에서 증식 마커와 함께 모든 해마 전구 부속 유형의 정확한 식별을 할 수 있습니다. 이러한 기술은 병렬로 다른 전구 서브 타입의 조절, 뇌 병변에서의 참여와 특정 뇌 기능에서의 역할을 연구 할 수있는 강력한 도구입니다.

Introduction

두 뇌 영역 구조적으로 생활 전반에 걸쳐 새로운 신경 세포를 생성, 측뇌실의 뇌실 영역과 해마 치아 이랑 (DG)의 subgranular 영역 (SGZ). 신생아 신경 세포는 신경 전구 세포에서 파생 만기 1, 2에 도달하기 전에 형태 학적 및 생리 학적 개발의 여러 단계를 통해 이동합니다. 천천히 나누어 방사형 아교 세포와 같은 줄기 세포 (유형 1)에서 대중 교통의 연속적인 단계는 중간 전구 세포가 발생 증폭. 더 미분화 하위 유형 (유형 2A와 2B 형)는 짧은 접선 프로세스와 불규칙한 형상을 갖는다. 그들은 (수상 돌기는 분자 층으로 확장 포함) 점차적으로 미성숙 신경 세포가되기 위해 세포주기를 종료하고 마지막으로 해마 네트워크 성숙 과립 세포로 통합 neuroblasts (유형 3)을 생성합니다. 특정으로 인해 생리적 특성이 향상된 세포 가소성 sugges으로 회로를 제공한다팅 해마의 기능에 고유 한 역할. 사실, 지난 십 년간의 연구는 성인 신경이 공간 기억, 패턴 분리 및 정서적 행동 4,5에 기여한다는 상당한 증거를 생성합니다.

성인 신경은 서로 다른 접근 방법을 사용하여 공부하실 수 있습니다. 티미 딘 유사체는 세포주기의 S-단계에서 DNA에 통합하는 신생아 세포 6-8의 출생 연대, 정량 운명 분석을 할 수 있습니다. 다른 티미 딘 유사체 (예 CldU, EDU 또는 IDU)을 순차적으로 적용은 세포 또는 전도 (9)의 실험 과정 동안 상이한 시점에서 태어난 세포 집단을 연구하는데 사용될 수있다. 대안으로서, 세포 증식에​​ 대한 내인성 마커 Ki67이다. 이것은 세포주기 (G1, S, G2, M) 상을 제외한 휴지 (G0) 및 10,11 G1의 선두의 단계에서 모든 셀 분할 표현된다. 성인 dentat 신생아 세포 집단의 표현형을 분석하려면전자 이랑 여러 단계 특정 분자 마커는 GFAP, 네 스틴, DCX와 NeuN 1,6로 사용할 수 있습니다. GFAP 성숙한 아스트로 마커뿐만 아니라 성인 전뇌 래디얼 신경교 유사 세포에서 발현된다. 네 스틴은 반경 신경교 유사 세포와 초기 중간 전구 세포에 특이적인 중간 섬유이다. DCX 중간 전구 세포, 미성숙 neuroblasts 뉴런에서 발현 미세 소관 - 연관된 단백질이다. +, 네 스틴 - 입력 2A (GFAP - 1 형 (GFAP +, 네 스틴 +, DCX) :이 세 가지 마커와 네 가지 전구 세포 아형 식별 할 수있는 표지 세포의 형태 학적 특징 (공동) 식을 바탕으로 , DCX -), 2B 형 (GFAP - 네 스틴 +, DCX +) 및 3 형 (GFAP - 네 스틴 - DCX +) 1. 함께 postmitotic 신경 세포로 표현된다 NeuN, DCX와의 공동 라벨링 immatur의 분화를 할 수 있습니다전자 (DCX +, NeuN +)과 성숙 ​​(DCX - NeuN +) 과립 뉴런.

상술 한 마커가 자주 신생 세포의 수 및 정체를 분석 면역 공동 라벨 및 후속 공 초점 현미경에 사용된다. 이는 일반적으로 바람직하지 않은 항체 교차 반응을 방지하기 위해 다른 호스트 종으로부터의 항체를 필요로한다. 그러나, 신경 연구에 적합한 차 항체의 대부분은 중 토끼 나 쥐에서 (예를 들어, 마우스 α-BrdU의 마우스 α-NeuN, 토끼 α-Ki67, 토끼 α-GFAP)을 발생합니다. 이것은 단일 슬라이스로 평가 될 수있는 항원의 수와 조합하여 심각한 한계에 이르게. 이것은 차례로 다수의 염색이 수행 될뿐만 아니라 가지고, 염색 노력을 증가뿐만 아니라, 결과의 신뢰성을 손상시킬 수도있다. 또한, 일부 포르말린 고정 항원 유발 에피토프를 마스킹 (예 Ki67에 취약, 네 스틴). 우리는 여기에 클래식 단일 및 다중 immunolabeling 프로토콜에서 수정을 설명 (예를 들어, 에피토프 검색, 여러 순차적 면역 염색, 네 스틴-GFP 형질 전환 마우스 (12)의 사용)이 많은 문제를 극복. 특히, 다중 순차 면역 프로토콜은 항체의 일부가 동일한 호스트로부터 유도 되더라도 최대 네 개의 상이한 항원에 대해 염색한다. 이 동시 유형 1, 유형 2A, 2B 형 및 3 형 전구 세포의 검출뿐만 아니라 단일 섹션 내에서 증식 활동을 할 수 있습니다.

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Protocol

참고 : 살아있는 동물을 포함한 모든 절차는 EC 지침 6백9분의 86가 / EEC 관리 및 실험 동물의 사용에 대한 지침과 지역 윤리위원회 (링거 Landesamt에 대 한 Lebensmittelsicherheit 싶게 Verbraucherschutz)의 승인에 따라 수행되었다.

티미 딘 유사체 1. 복강 내 주사

  1. 주입하기 전에 동물에게 하루의 무게를. 다음 날뿐만 아니라, 10 ㎎ / ㎖의 스톡 용액의 중량 개별 조정 주입량에 계획된 모든 주사에 필요한 아날로그 티미 딘의 양을 계산한다.
  2. 10 ㎎ / ㎖ 티미 딘 주식 솔루션을 준비합니다. (주의! 티미 딘 유사체 독성이. 화학 흄 후드를 사용, 즉, 공급 업체가 제공하는 특정 물질 안전 보건 자료 (MSDS)를 따라 실험실 코트와 장갑을 착용).
    1. 냉장고에서 티미 딘 아날로그를 타고 약, RT에 가져다. 21 ° C. 10 mg의 무게 추가0.04 N의 NaOH (BrdU의 및 CldU 용) 멸균 식염수 (멸균 식염수에, IDU)에, 소용돌이. 50 ° C의 물을 욕조와 소용돌이에 15 분마다 2 - - 분말을 용해 3 분을 적어도 10를 배치합니다.
      참고 : 최대 24 시간 동안 사용 솔루션은 실온에서 -20 ° C에서 몇 주 동안 저장 될 때. 빛 (알루미늄 호일 커버)에서 솔루션을 보호합니다. 항상 침전물을 확인하고 필요한 경우 재용.
  3. 마우스 목덜미로 억제하고 복강 30 G 바늘 미세 투여 주사기를 사용하여 (RT시) 스톡 용액의 적절한 용적 중량 조정을 주입.
    주 : CldU 경우와 IDU는 동일 동물에서 연속적으로 투여 될 필요가 등몰 농도를 주입 고려 (즉, 50 ㎎ / kg에 해당 BrdU의 42.5 ㎎ / kg CldU 57.5 ㎎ / kg IDU). 따라서, 그에 따라 10 ㎎ / ㎖의 원액을 주입 볼륨을 조정합니다.

2. 조직 준비

  1. 처리장관류 하루전 0.1 M 인산염 완충액 pH 7.4에서 4 % 포름 알데히드 재. 4 ℃에서 보관하십시오.
  2. 로 transcardially 40㎖를 빙냉 포름 알데히드 (유량 5 ㎖ / 분)에이어서, 10 ml의 빙냉 PBS로 좌심실을 통해 깊게 마취 된 쥐 (3.5 %의 이소 플루 란)을 관류. 4 ℃에서 24 시간 동안 동일한 정착액에 두뇌 및 사후 수정을 해부하다.
  3. 연속적으로 10 % (4 ° C에서 24 시간)과 30 %의 자당 (뇌 싱크 때까지, 약. 48 시간)으로 뇌를 전송합니다. 기포가 조직에서 등장하지 않을 때까지 냉동, 천천히 -25 ° C의 이소 펜탄에 cryoprotected 두뇌 잠수함. -80 ° C에서 보관하십시오.
  4. 냉동 마이크로톰에 40 μm의 두께의 관상 섹션 컷 (-25 블록의 온도를 -16 ° C). 24 웰 세포 배양 플레이트의 웰을 함유하는 부동액 순차적으로 수수 부 (도 1 참조). -20 ° C에서 보관하십시오.

"그림 24 웰 플레이트에 마이크로톰 조각을 전송 그림 1. 도식 그림. A1에서 시작 A6는 등 다음 행의 B로 이동 한 후, 행에 다음 조각을 배치합니다. D6에 도달 할 때, A1로 돌아가서 계속합니다. 조각의 이러한 배열은 전체 뇌의 부분 매 n의 정량화 수 있습니다. 신생아 세포의 정량 면역 표현형에 대한 (하나의 컬럼의 2 교대로 행의 내용에 해당) 매 12 번째 절을, (하나의 컬럼의 내용에 해당) 뇌 섹션 번째 매 6을.

3. 면역 염색

참고 : 섹션 6 웰 플레이트 캐리어 플레이트를 장착하고 삽입 메쉬 일반적으로, 무료로 부동 처리됩니다. 예외적으로, 항체 배양 및 ABC 반응은 메쉬 삽입 (w 당 0.5-1 ml의없이 12 또는 24 웰 플레이트에서 수행되는 블로킹엘)은 염색 할 필요가 슬라이스의 수에 따라, 충분하다. 이 단계 동안, 미세 브러시의 도움 (각각의 새로운 솔루션을 씻어)로 섹션을 전송합니다. 모든 배양 연속 교반 (최대 150 RPM)로 수행됩니다.

  1. 면역 조직 화학 (ABC 방법)
    1. 완전히 부동액을 제거하기 (10 분 각각 RT에서 5 회 4 ° C에서 한 번 O / N)를 TBS에 부동액에서 섹션을 이동 충분히 헹군다.
    2. 내인성 퍼 옥시 다제 활성을 종결 TBS-T에서 1.5 %의 H 2 O 2에서 30 분 동안 인큐베이션. 버블 링에주의하고 필요한 경우 섹션을-잠수함 다시. 15 분마다 TBS에서 3 번 씻어.
    3. 옵션 : 한편 가열 캐비닛과 37 ° C 2 N 염산을 예열. DNA를 변성 2 N 염산 37 ° C에서 30 분 동안 섹션을 품어. 브러시의 도움으로 조심스럽게 별도의 섹션.
    4. 선택적 : 0.1 M 보레이트 완충액 pH에서 10 분간 부분 중화8.5, RT. 전송하는 동안, 잠시 염산 남은 것을 제거하기 위해 종이 타월에 섹션을 포함하는 메쉬 삽입을 채취. 15 분마다 TBS에서 2 번 씻어.
    5. 조직을 Permeabilize 하시려면하고 불특정 항체 결합 부위, 실온에서 1 시간을 차단하는 TBSplus에 품어.
    6. 4 ° C에서 TBSplus, O / N에 희석 차 항체에 품어. 15 분마다 TBS에서 3 번 씻어.
    7. TBSplus, 실온에서 3 시간 희석 바이오틴 이차 항체에 품어. 15 분마다 TBS에서 3 번 씻어. 한편 ...
    8. 제조 업체의 프로토콜 (TBS-T에서 1 % + 1 % B)에 따라 ABC 단지를 준비합니다. 사용하기 전에 30 분 동안 실온에서 방치한다. 실온에서 1 시간 동안 AB 시약의 섹션을 품어. 15 분마다 TBS에서 3 번 씻어.
    9. 각각 두 개의 반쪽 피펫 4 ml의 2 ml의 당 우물에 분할, 6 또는 12 웰 플레이트 당 TBS-T에서 50 ml의 0.5 ㎎ / ㎖ DAB를 준비합니다. DAB 용액 (주의로 전송 섹션! DAB 독성이다. 구체적으로 지정을 따라C 즉, 실험실 코트와 장갑을 착용 공급 업체에서 제공하는 MSDS는) 화학 흄 후드를 사용합니다.
    10. 잘 과산화 반응을 시작하는 각 상기와 같이, 나머지 25 ml의 DAB 용액에 0.5 ml의 1 % H 2 O 2를 추가 혼합하여 피펫 동등한 볼륨. 12 분 동안 품어. 15 분마다 TBS에서 3 번 씻어.
    11. 젤라틴 슬라이드 마운트 섹션, 건조 공기의 O / N. 영구 장착 매체 커버 슬립.
    12. 옵션 : 커버 슬립을 배치하기 전에 Counterstain과 (3.5 절 참조).
      주 : 신호 - 대 - 잡음 비율이 높기 때문에 배경이 낮은 경우, AB 시약 (단계 3.1.8)와 인큐베이션 한 후 H 2 O 2 처리를 반복한다.
  2. 다중 면역
    1. 단일 또는 동시에 여러 면역 형광
      1. TBS에 부동액에서 섹션을 전송하고 철저하게 린스 (4 ° C에서 한 번 O / N을, 실온에서 10 분 동안 5 회)을 완전히 제거하기tifreeze.
      2. 옵션 : 3.1.3 단계로 - 3.1.4.
      3. 불특정 항체 결합 부위, 실온에서 1 시간을 조직을 Permeabilize 하시려면 및 차단 TBSplus에 품어.
      4. 차 항체 칵테일에 품어 (예를 들어, 쥐의 α-BrdU의, 기니 돼지-DCX α, 염소 α-GFP) 4 ° C에서 TBSplus, O / N에 희석. 15 분마다 TBS에서 3 번 씻어.
      5. Fluorochrome과 접합 된 이차 항체의 칵테일에 품어 (예를 들면, 로다 민 레드 α-쥐, 알렉사-647 α-기니피그는 알렉사-488은 α-염소, 모든 당나귀에서 유래), TBSplus에 희석 3 시간 RT 또는 O / N에서 4 ° C에서. 지금부터 빛 섹션을 보호합니다. 15 분마다 TBS에서 3 번 씻어.
      6. 젤라틴 슬라이드 마운트 섹션, 건조 공기의 O / N. 수성 매질과 마운팅 커버 슬립.
    2. 동일한 호스트 종에서 차 항체 순차 여러 면역 형광
      1. 3.2.1.3 - 3.2.1.1 단계로.
      2. 인터넷에 품어첫 차 항체 (예를 들면, 토끼 α-항원 A), O / N 4 ° C에서. 10 분마다 TBS-T에서 3 회 TBS에 한 번 씻어.
      3. 첫째 Fluorochrome과 접합 된 이차 항체 (예를 들면, 로다 민 레드 비공. 당나귀 α-토끼), 3 시간의 RT에 품어. 지금부터 빛 섹션을 보호합니다. 10 분마다 TBS-T에서 3 회 TBS에 한 번 씻어.
      4. 첫 번째 차 항체에 열린 paratopes을 포화 3 시간의 RT에 대한 기본 항체와 같은 호스트 (예를 들면, 토끼 혈청)에서 10 % 정상 혈청에 품어. 10 분마다 TBS-T에서 3 회 TBS에 한 번 씻어.
      5. 50 μg의 (예, α - 토끼의 IgG (H + 1)가) 제 2의 2 차 항체, O / N에 의해 인식 될 수있는 에피토프를 덮도록 차 항체의 호스트에 대해 지시 / ㎖ 접합 일가 Fab 단편과 TBSplus 부화 4 ° C.
      6. 10 분마다 TBS-T에 적어도 3 회 TBS에 한 번 씻어. 전송하는 동안, 짧게 SWAB 종이 타월에 섹션을 포함하는 메쉬 삽입은 팹 남은 것를 제거합니다.
      7. 4 ° C에서 두 번째 차 항체 (예를 들면, 토끼 α-항원 B), O / N에 품어. 10 분마다 TBS-T에서 3 회 TBS에 한 번 씻어.
      8. 두 번째 Fluorochrome과 접합 된 이차 항체 (예를 들어, 알렉사-488 비공. 당나귀 α-토끼), 3 시간의 RT에 품어. 15 분마다 3 회 TBS 린스 마운트 상기와 같이 커버 슬립.
        참고 : 다른 호스트 종을 추가로 항체와 항원의 레이블을하려면 3.2.2.2 단계와 각 이차 항체는 3.2.2.3 단계.
    3. 차 항체의 하나로서 같은 종의 차 항체의 하나
      참고 :이 프로토콜은 GFAP, 네 스틴-GFP 및 DCX와 함께 BrdU의 또는 Ki67에 네 번 염색에 적합하다.
      1. 3.2.1.5 -에 따라 엄격하게 프로토콜은 3.2.1.1 단계를 반복합니다. 이 시점까지 TBSplus 만 당나귀 혈청을 사용합니다.
      2. T에 품어RT에서 1 시간 동안 3 % 염소 혈청을 함유 BSplus. 이것은 α-염소 이차 항체에 열려 paratopes을 다룹니다. 10 분마다 TBS-T에서 3 회 TBS에 한 번 씻어.
      3. AMCA 비공에 품어. TBSplus, 3 시간의 RT 또는 O / N 4 ° C에 희석 염소 α-토끼. 15 분마다 TBS 세 번 헹구고 마운트 상기와 같이 커버 슬립.
    4. CldU, IDU 공동 염색
      1. 린스 변성 및 3.2.1 절에 설명 된대로 섹션을 중화 (- 3.2.1.2 3.2.1.1 단계).
      2. α-마우스 TBSplus에서의 IgG (H + L), RT에서 1 시간 20 ㎍ / ml의 접합 팹 조각으로 품어. 10 분마다 TBS-T에서 4 회 TBS에 한 번 씻어.
      3. 4 ° C에서 TBSplus, O / N에 희석 : 마우스 α-BrdU의 (350 1) : (IgG2을 정제 (400) 1) 쥐의 α-BrdU의를 포함하는 일차 항체 칵테일에 품어. 10 분마다 TBS-T에서 3 회 TBS에 한 번 씻어.
      4. 바이오틴 당나귀 포함하는 이차 항체 칵테일에 품어 α를 쥐 (1: 500)과 FITC 비공. 당나귀 α-마우스 Fab 단편 (1 : 100). 10 분마다 TBS-T에서 3 회 TBS에 한 번 씻어.
      5. 로다 민 레드 비공에 품어. 스트렙 타비 딘, 실온에서 2 시간. 15 분마다 3 회 TBS 린스 마운트 상기와 같이 커버 슬립.
    5. 네 스틴 - 생쥐에서 GFP 형광 신호의 증폭
      1. 차 항체 칵테일에 염소 α-GFP를 추가합니다.
      2. (. 이러한 알렉사 488 접속사로서 α-염소 당나귀) GFP와 유사한 분광 특성과 형광 색소 결합 된 이차 항체를 추가 이차 항체 칵테일에.
  3. 에피토프 검색
    1. 부동액을 세척 한 후 에피토프 검색을 수행하십시오. 99 ° C (약 25 분) - 0.1 M 시트 레이트 완충액 pH 6.0 ~ 95를 포함하는 6 또는 12 웰 플레이트 예열 증기선.
    2. (30 분 동안 뜨거운 구연산 버퍼와 증기로 섹션을 전송 플라스틱 리터 알루미늄 호일 접시를 커버ID는 내열되지 않음).
    3. 즉시 식혀 빙욕 플레이트를 배치했다. 이 출생 후의 동물의 뇌 부분 작업을 할 때 특히 중요하다 조직 형태를 보호하는 데 도움이됩니다.
    4. 씻어과 구연산을 중화 및 염색을 계속 10 분 각각 TBS에서 3 번 씻어.
  4. 마우스는 마우스 조직에 항체가
    1. -α 마우스 IgG 20 ㎍ / ml의 일가 Fab 단편 추가 (H + L을, 이차 항체에 비해 동일한 호스트 종)를 첫 번째 차단 단계 (예를 들어, 단계 3.1.5 또는 3.2.1.3).
    2. 10 분마다 TBS-T에서 4 회 TBS에 한 번 씻어, 각각의 프로토콜로 진행합니다.
  5. 크레 실 바이올렛 대조 염색
    1. (유리 항아리에) 60 ° C로 예열 크레 실 바이올렛 솔루션입니다. 3 분 동안 뜨거운 용액에 슬라이드를 품어.
    2. 수성에 씻어. 이명. 및 70 %에 각각 1 분, 96 % 및 100 % 이소프로판올 2 회 탈수. 6 크실렌 분 또는 호환 영구 설치 매체와 크실렌 대체 및 커버 슬립 - 5 지우기.

4. 데이터 분석

  1. 치아 이랑의 전체 rostrocaudal 정도에 따라 매 6 번째 섹션에서 퍼 옥시 다제 스테인드 신생아 세포를 계산합니다. 400 배 배율의 광학 현미경을 사용합니다.
  2. 신생아 세포의 총 수의 추정치를 얻기 위해 교차 간격으로 얻어진 세포 수를 곱한다.
  3. 형광 이미지는 적절한 레이저 시스템 및 필터를 구비 한 공 초점 레이저 현미경으로 라벨링 섹션. 400 배 배율의 치아 이랑의 전체 범위를 따라 임의의 위치에 이미지 스택을 가지고 다른 마커와 공동 라벨링 반구의 지분의 50 무작위로 선택된 세포를 분석 할 수 있습니다.
  4. 절대 계산하는 신생아 세포의 총 수와 공동 표지 된 세포 (/ 100 %)의 비율을 곱하여 얻어진특정 신생아 세포 집단의 숫자.

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Representative Results

우리는 정량화 및 출생 후 성인 해마에서 신생아 세포의 특성을 위에서 설명한 방법을 적용했다. 따라서, 우리는 야생형 및 신경 결핍 사이클린 D2는 신경의 비율 (즉, 농축 환경, EE) 13, 14에 영향을 미치는 것으로 알려진 조건에서 보관 (Ccnd2 KO) 마우스를 내라 사용. Ki67, BrdU의, CldU 또는 이두 중 하나에 대한 면역 조직 화학 DAB 염색은 지속적으로 야생형과 Ccnd2 KO 마우스 (그림 3) (15) 사이의 신생아 세포 수의 차이를 한 것으로 밝혀졌습니다. 또한, CldU 및 이두의 연속 몰 주사와 함께 우리는 EE (그림 3C, D)의 특정 기간 동안 태어난 세포 집단을 구별 할 수 있었다. 섹션 3.2.4을 채택 우리는 성공적으로 동일한 신호 강도 및 동시 전송 (그림 4) 후 CldU 및 이두의 우수한 중복을 감지 할 수있다. BrdU의 표시 신생아 세포 스탠으로 phenotyped 수하나 동시에 적용 BrdU의와 NeuN, (그림 5) 또는 BrdU의, GFAP, 네 스틴-GFP 및 DCX 항체 (그림 6B)에 의해 준의 면역 방법. 이 기술은 성공적인 식별 타입 1, 2A, 2B 및 단일 시험편 (도 6B, D) 내에서 3 선조 세포를 허용했다. Ki67과 GFAP에 대한 일차 항체가 토끼에서 제기 된 바와 같이 전구 마커 Ki67의 공동 라벨링 제조 하였다 또한, 일차 항체의 하나 (염소 α-GFP) (3.2.2 적용) 항체의 순차적 인 응용 프로그램을 필요 이차 항체의 하나 (AMCA 접속사. 염소 α-토끼)와 같은 호스트. 섹션 스틴-GFP 항체와 함께 Ki67 먼저 배양, 둘째 GFAP 항체에 있지만 그 반대의 경우도 마찬가지 (그림 6C가). 그림 2b는 승인 된 응용 프로그램 방식을 요약한다면 섹션 3.2.2과 3.2.3의 조합은 완벽했다.


동일한 호스트 종에서 파생 된 차 항체 그림 2. 순차 여러 면역. (A) 도식 그림. (B) 항체와 면역에서의 시간 순서의 성공적인 조합을 포함 할 수있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
치아 이랑 신생아 세포의 정량 ABC-면역 조직 화학 염색의 그림 3. 광학 현미경 이미지. 묘사는 100X와 400X 배율에서 WT 다른 증식 마커 및 신경 결핍 Ccnd2 KO 마우스의 비교입니다. (A) g> Ki67-DAB 염색은 치아 이랑 (생후 35 일)의 subgranular 영역에서 세포 증식의 클러스터를 보여줍니다. 증식하는 세포의 수는 WT 마우스에 비해 Ccnd2 KO 마우스에서 감소된다. (B) BrdU의 투여 (이미지 위에 분사 방식) Ccnd2 KO 마우스에서 감소 된 증식 속도를 확인하고 28 일 후에 본 신생아 세포를 포함한다. (C) CldU 투여 EE (이미지 위에 분사 방식)의 6 주 동안 WT의 치아 이랑 (dentate gyrus)에서 신생아 세포의 수의 증가를 보여하지만, EE의 8 주 동안하지 Ccnd2 KO 마우스. (D) IDU-행정부는 비슷한 결과를 보여 주었다. 스케일 바는 50 μm의를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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몰 농도의 동시 전달 후 CldU과 이두 그림 4. 면역 형광 공동 염색. CldU 표지 세포의 신호 증폭 CldU 및 이두의 우수한 중첩 결과. 스케일 바는 20 μm의를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5
NeuN과 BrdU의 그림 5. 면역 형광 공동 라벨. (A) BrdU의 2 일 연속 14. 동물 28 일 후 희생 출생 후의 일에서 시작 6 시간마다 8 시간을 투여 하였다. (B) 성숙한 신경 세포 마커로 증식하는 세포의 면역 형광 공동 라벨 NeuN는 증식의 감소 수를 보여줍니다 Ccnd2 KO 세포는 W에 비해T 동물. 스케일 바는 50 μm의. (C) (B)의 확대도 모두 유전자형에 공동 표지 세포를 보여주는 나타냅니다. 스케일 바는 대표 20 μm의. (D) 치아 이랑의 BrdU의 / NeuN 공동 라벨링 된 셀의 높은 배율 예. 스케일 바는 10 μm의를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6
네 스틴-GFP 마우스의 치아 이랑 (dentate gyrus)에서 신생아 과립 세포의 표현형에 대한 GFAP, 네 스틴-GFP 및 DCX와 다른 증식 마커의 그림 6. 쿼드 러플 면역 공동 라벨링. (A)의 BrdU는 출생 후 하루 70에서 3 회 매 2 시간을 투여 하였다 . 동물 2 시간 후 희생되었다. BrdU의, GFAP에 대한 공동 염색 (B) 대표 이미지네 스틴-GFP 및 Ki67, GFAP, 네 스틴-GFP 및 DCX를위한 쿼드 러플 면역 형광 DCX. (C) 대표 이미지입니다. (D) 자신의 면역 형광 라벨에 따라 전구 세포 유형의 분류. 다른 마커와 네 가지 전구 세포 아형 식별 할 수있는 표지 세포의 형태 학적 기능의 공동 발현을 바탕으로 : - 입력 2A (GFAP - 네 스틴 +, DCX 1 형 (GFAP +, 네 스틴 +, DCX) - ), 2B 형 (GFAP - 네 스틴 +, DCX +) 및 3 형 (GFAP - 네 스틴 - DCX +). 스케일 바는 20 μm의를 나타냅니다. (E) 성인 해마 신경 세포의 다른 단계의 개요도합니다. 그것은 4 전구 세포 유형, 미성숙과 성숙 뉴런 과립 세포 마커의 발현 그들의 특성 및 증식 능력을 나타낸다. ML - 분자 세포 층, GCL -과립 세포층, SGL -. subgranular 세포층 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 7
그림 7, 같은 종에서 제기 항체 배양의 순서에 따라 두 가지 기본 항체 성공적인 비 성공적인 순차적의 염색 예. 공 초점 현미경은 모두 차 항체 Ki67과 GFAP에 대한 순차적 인 공동 염색의 결과를 보여 토끼에서 유래. 에서는 (A) 면역 먼저 두 신호의 현저한 오버랩되었다 Ki67에 대해 염색 하였다 GFAP에 대해 완료되었다. 특히 Ki67 신호 비정형이고 GFAP 염색 신호를 닮았다. (B) 반대의 결과를 나타낸다Ki67 염색과 염색 순서는 GFAP에 대한 첫 번째 및 후속 염색을 완료했다. 여기서, 두 항원 신호는 예상 발현 패턴을 닮았다 : GFAP 신호가 주로 subgranular 영역에서 발생하는 세포 과정에서 발견 된 반면 cytoplasmatically Ki67 신호 subgranular 존 내의 핵 제한되었다. 스케일 바는 20 μm의를 나타냅니다. RHX - 로다 민 (X)는 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 8
CldU와 IDU. 마우스를 검출하기 위해 사용 된 BrdU-α 항체의 특이성도 8 CldU 또는 IDU (비 동시 애플리케이션) 중 하나와 주사 하였다. (A) CldU (A1) 또는 IDU (A2)의 머리 부 주입 마우스에서 글로불린이었다nostained 마우스 α-BrdU의 쥐를 주입 구체적으로 CldU에 교차 반응해야 정제 된 쥐의 α-BrdU의 항체를 사용하지만 이두에. (B) CldU (B1) 또는 IDU (B2)에서 머리를 염색의 결과를 보여줍니다 예상되는 항체 CldU을 IDU와 크로스 - 반응,하지만. 스케일 바는 20 μm의를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

정량화와 신생아 세포의 개체군의 식별은 성인 신경 연구의 중심 문제입니다. 성인 신경의 특정 단계에서 발현 된 단백질에 대한 증식 마커 및 항체를 결합하는 것은 이러한 개체군의 면역 검출 할 수있다. 항체 또는 항체 조합 중 일부는 특정 염색 조건을 필요로한다.

합성 티미 딘 유사체로 세포를 분할의 레이블은 아직 성인 해마의 신경 발생 연구를위한 황금 표준입니다. 이 실험을 시작하기 전에 적절한 주입 프로토콜을 고려하는 것이 중요하다. 우리가 일반적으로 50 ㎎ / kg (체중, IP)의 BrdU를 관리하지만, 농도는 실험 조건에 따라 다를 수 8,16 하였다 (300 mg까지 / 볼 루스 주사 kg). 이두와 CldU는 세포 인구의 시간적 차별에 대해 순차적으로 주입하는 경우는 (몰 농도를 주입하는 필수입니다 (16)를 받고 손상된 세포를 라벨 수 있습니다. 또 다른 단점은 DNA 변성 항체 또는 다른 DNA 라벨링 기술 항원 방해 할 수 티미 딘 유사체의 면역 검출에 요구된다는 점이다 (예 : DAPI, 훽스트 33258). Ki67 같은 내인성 증식 마커의 발현 정도를 면역 조직 화학 법은 적절한 대안 10,11 일 수있다. 그러나 이것은 단지 관류시에 증식 활동의 스냅 샷을 허용, 소급 출생 데이트 운명 분석은 불가능하다.

면역 염색의 경우, 섹션은 일반적으로 캐리어 플레이트가 장착 6 웰 플레이트에 일반적으로, 무료로 부동을 처리하고 다른 하나의 솔루션에서 자신의 전송을 간단하게 삽입 메쉬있다. 예외적으로, 차단 항체 배양 및 ABC 반응이 완료됩니다메쉬를 삽입하지 않고, 12 또는 24 웰 플레이트 비싼 솔루션을 절약하기 위해서는 (0.5 내지 1 ml에 잘 스테인드되어야하는 슬라이스의 수에 따라 충분한 당). 이 단계 동안, 솔루션을 변경할 때 세척해야하는 미세 브러시의 도움으로 섹션을 전송합니다. 건조 아웃 섹션을 방지하고 humified 실에서> 1 시간을 배양을 수행합니다. 모든 배양 연속 교반 (최대 150 RPM)으로 수행되어야한다. 항상 테스트하고 각각의 새로운 항체를 많이 적정한다. 긴 항체 배양 시간 (4 ° C에서 2 일)는 염색을 향상시킬 수 있습니다. 경우에만 마우스 항체는 고농도의 일가 Fab 단편 α-마우스 (3.4 절) 내인성 면역 글로불린을 차단하는 것이 좋습니다 당신은 마우스 조직에 시각화하고자하는 항원에 대한 사용할 수 있습니다. 이 기술을 사용 할 때마다 다음 헹굼 단계를 확장 할 수 있습니다. 그렇지 않으면, 언 바운드 팹 조각은 기본 마우스 항체에 결합 할 수 있습니다. 염산 전처리 및 붕산중화는 티미 딘 유사체의 검출을 위해 필요합니다. 12 분 과산화 반응은 우리의 프로토콜에인가 조건으로 항체와 최적의 신호 대 잡음 비율을 초래한다. 어떤 효소 반응과 마찬가지로, 퍼 옥시 다제 반응의 속도는 많은 요인에 의존한다 (예를 들어, 온도, pH, 효소와 기질의 농도). 따라서, 반응 시간은 새로운 항체 세트에 대해 최적화 될 필요가있다. (예를 들어, CldU) 매우 약한 배경으로 DAB 얼룩의 해부학 적 구조를 시각화하기 위해 슬라이스는 대조 할 수 있습니다. 크레 실 바이올렛 방법은 특정 DAB 신호를 손상시키지 않고 매우 희미한 Counterstain과 섹션 3.5에서 설명 된 결과.

여러 면역 들어, 다른 종 또는 다른 아이소 타입의 제기 일차 항체를 사용하여 섹션 3.2.1을 따르십시오. 그렇지 않으면, 여러 차 항체를 검출하기 위해 최적화 된 다중 순차 immunolabeling 수행동일한 호스트 종 (; 섹션 3.2.2 즉, 마우스 또는 토끼)에서. 이 방법의 기본 원리가 성공적으로 두 마우스 차 항체 (17) 다른 근육 마커를 염색 퍼거슨 감독과 동료들에 의해 발명되었다. 단계 3.2.2.5 블로킹에 사용되는 Fab 단편은 이차 항체와 같은 호스트 종으로부터 유래한다. 3.2.2 절에 설명 된 농도 및 배양 시간은 본원에 기술 된 특정 항체에 최적화되어 모든 새로운 항체 조합에 대해 조정되어야한다. (그림 7a에 표시됨) 일차 항체 배양의 순서가 강하게 결과에 영향을 미칠 수 있음을 유의하십시오. 적용 가능한 어느 곳에서나 같은 종으로부터 유래 된 항체에 의해 검출 된 차 항원 불충분 블로킹의 검출을 단순화 상이한 발현 양상을 보여 주어야한다. 항체 교차 반응 또는 가양의 가능성을 제거하기 위해서는 에센입니다은 최초 적절한 컨트롤 (즉, 전용 이차 항체 제어, 둘째 차 항체 또는 단독으로 제 2의 2 차 항체 인큐베이션 처음 항원에 대한 완전한 면역 조직 화학)를 포함 할 수 있습니다. 18도 2b는 우리 손에 잘 작동 항체 조합을 보여줍니다. 여러 면역 형광의 경우는 같은 종에서 제기되는 이차 항체 (예를 들어, 당나귀)를 사용하여 조직에 최소한의 교차 반응성을 가지고 다른 종 (즉, 사전 흡착)에서 단백질을 혈청하는 것도 좋습니다. 그렇지 않으면 섹션 3.2.3 예상치 못한 종간에게 교차 반응을 방지하는 데 도움이 될 수 있습니다. 당신의 감지 시스템에 최소한의 스펙트럼 오버랩 적절한와 형광 색소를 선택합니다 (예를 들어, AMCA, 알렉사 형석 488, 로다 민 레드, 알렉사 형석 647). 핵 Counterstain과가 필요한 경우, 다음 이차 항체 칵테일 (에 DAPI 또는 훽스트 33342 (10 ㎍ / ㎖) 추가, 아니 거의 UV 이차 항체는 우리가 될 수 있습니다ED). 조직이 HCl로 사전 처리 된 경우 이러한 핵 counterstains가 작동하지 않습니다. 마찬가지로, 염산 치료는 특정 항원의 검출을 손상시킬 수 있으며, 따라서 개별 항체 성능에 미치는 영향을 시험 할 필요가있다. Fluorochrome과 접합 된 이차 항체되면 빛으로부터 보호 섹션을 적용하고있다.

CldU과 이두가 교차 반응 두 개의 서로 다른 BrdU의 항체의 도움으로 시각화 할 수 있습니다 CldU (쥐 α-BrdU의) 또는 IDU (마우스 α-BrdU의) 9,19-와. 두 티미 딘 유사체는 하나 동물 내로 주입 된 경우에는 비 정제 항체는 IDU에 가교 반응하기 때문에 CldU을 검출하도록 정제 된 쥐 α-BrdU의 항체를 사용하는 것이 절대적으로 필수적이다. 베가 동부 등에 의해 설명 된 바와 같이. 9 CldU 신호 모두 티미 딘 유사체의 등가 검출을 달성하는 면역 공동 라벨 증폭 할 필요가있다. 따라서, 대신 Fluorochrome과 접합 된 이차 항체 (의 α-쥐) 형광 색소 결합 된 스트렙 타비 딘은 바이오틴 이차 항체 (α-쥐에서 배양 한 다음 추가됩니다 섹션 3.2.4). 교차 반응이 IDU 또는 CldU를받은 쥐에서 제어 섹션을 포함 원하지 않는 항체를 제외하려면 (별도; 그림 8 참조). 동시에 CldU와 IDU 몰량 주사했다 IDU 동물 사용 및 CldU 부 당량 검출을 확인하기 위해 (도 4 참조).

이 전구 세포를 1 형을 공부하고 입력하기 위해 우리는 네 스틴 항체가 자주 만족스러운 결과를 제공하지 않았다로 네 스틴-GFP 형질 전환 마우스 (12)를 사용하는 것을 선호합니다. 스틴-GFP 마우스 확실 특정 발달 단계에서 네 스틴 - 양성 전구 세포 및 형태 적 특징을 시각화하는 이점을 갖는다. GFP 신호는 α-GFP 항체와 간접 면역 형광을 통해 증폭 될 필요가있다. 이차 항체 결합 fluorochr되어야GFP와 유사한 스펙트럼 특성을 가진 오메. 필요한 경우, 네 스틴-GFP 마우스에게 신경에서 특정 유전자의 관련을 조사하기 위해 다른 돌연변이 마우스 선 교배 될 수있다. 지금까지, 향상된 스틴 항체는 라벨 균체뿐만 아니라 프로세스를 제공하고 (자재 목록 참조) 형질 전환 방법에 대한 대안으로서 사용될 수있다.

그것은 overfixation을 방지하기 위해 24 시간 고정을 준수하는 것이 중요합니다. 조직에서의 포름 알데히드의 화학 반응 파트너는 주로 단백질과 포름 알데히드 (메틸렌 브릿지의 형성에 의해)에 인접한 아미노산의 가교 선도 측쇄에 반응성 하이드 록시 그룹을 생성한다. 이것은 (자료 목록의 특정 항체에 대한 의견을 참조) 항원 - 항원과 면역의 손실 마스킹의 원인이 될 수 있습니다. 손실 된 면역 반응을 복구하려면 몇 가지 에피토프 검색 방법은 전자를 통해 그 휴식 포름 알데히드에 의한 단백질 상호 연계를 존재xposure (20)를 가열한다. 이 프로토콜에서는, 구연산 버퍼 방법은 출생 후 성인 해마에서 신경 세포의 검출 (3.3)에 대한 다른 사람에게 우수한 작동합니다. 아주 어린 동물의 슬라이스 (<P21)가 매우 약하거나 왜곡 될 특별한 취급시주의해야 할 수도 있습니다. 또한, 에피토프 검색은 어떤 항원에 대한 해로운 따라서 각각의 항체들이이 전처리를 필요로 여러 염색에 적합 여부를 테스트해야 할 수 있습니다.

요약하면,이 프로토콜은 성인 해마 신경의 분석을 용이하게 정교 기본 및 기술의 집합이다. 그것은 특히 단일 섹션에서 증식 또는 출생 데이트 마커와 함께 모든 해마 전구 개체군의 명확한 식별을 할 수 있습니다. 이러한 기술의 발달 hippocam 및 규제 공부 항체 또는 다른 종에 대한 임의의 조합에 적용 할 수있다특정 자극에 특히 뇌 기능에 그들의 참여에 대응 친구 전구 세포.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Thymidine analog administration
5-Bromo-2′-deoxyuridine, BrdU Sigma-Aldrich B9285 toxic (mutagenic, teratogenic)
5-Chloro-2′-deoxyuridine, CldU Sigma-Aldrich C6891 toxic (mutagenic, teratogenic)
5-Chloro-2′-deoxyuridine, CldU MP Biomedicals 2105478 toxic (mutagenic, teratogenic)
5-Iodo-2′-deoxyuridine, IdU MP Biomedicals 2100357 toxic (mutagenic, teratogenic)
Tissue preparation
Isoflurane-Actavis Piramal Healthcare 700211
Paraformaldehyde powder (PFA) Riedel-De Häen 16005 toxic, flammable
Perfusion pump PD5206 Heidolph Instruments 523-52060-00
Masterflex Tygon lab tubing, Ø 0.8 mm Thermo Fischer Scientific 06409-13
Feeding needle, straight, 21 G, 1.75 mm olive tip, 40 mm Agnthos 1036
Freezing microtome Microm HM 400 Thermo Fischer Scientific
24-well Cell culture multiwell plates Greiner Bio-One 662160
Immunohistochemistry
Tefal vitacuisine steamer Tefal VS 4001
Netwell 24 mm polyester mesh membrane inserts Corning 3479 pre-loaded in 6-well culture plates
Netwell 15 mm polyester mesh membrane inserts Corning 3477 pre-loaded in 12-well culture plates
Netwell plastic 6-well carrier kit Corning 3521 for 24 mm polyester mesh membrane inserts
Netwell plastic 12-well carrier kit Corning 3520 for 15 mm polyester mesh membrane inserts
Vectastain Elite ABC kit Vector Laboratories PK-6100
DAB (3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate) Sigma-Aldrich D-5637 carcinogenic, light sensitive
Fluoromount-G SouthernBiotech 0100-01
Primary antibodies
Rabbit IgG1 α-Ki67 Novocastra/ Leica Biosystems NCL-L-Ki67MM1 DAB 1:400/IF 1:100; requires epitope retrieval
Rabbit α-GFAP, AS-3-GF Synaptic Systems 173 002 1:500
Goat IgG (H+L) α-GFP Acris Antibodies R1091P 1:300
Mouse IgG1 α-nestin Abcam ab6142 1:200; requires epitope retrieval
Guinea pig IgG (H+L) α-Doublecortin Merck Millipore AB2253 1:500
Rat IgG2a α-BrdU (ascites) AbD Serotec/ Bio-Rad OBT0030CX for detection of BrdU; DAB 1:500/IF 1:400
Rat IgG2a α-BrdU (purified) AbD Serotec/ Bio-Rad OBT0030   for detection of CldU; DAB 1:500/IF 1:250-400
Mouse IgG1 α-NeuN Merck Millipore MAB377 1:500
mouse IgG1κ α-BrdU BD Biosciences 347580 For detection of IdU; DAB 1:500/IF 1:350
Secondary antibodies
Donkey α-guinea pig IgG (H+L)-Biotin Dianova 711-065-152 1:500
Donkey α-rat IgG (H+L)-Biotin Dianova 712-065-150 1:500
Donkey α-mouse IgG (H+L)-Biotin Dianova 715-065-151 1:500
Goat α-rat IgG (H+L)-Alexa Fluor 488 Molecular Probes A11006 1:250
Donkey α-goat IgG (H+L)-Alexa Fluor 488 Molecular Probes A11055 1:250
Donkey α-mouse IgG (H+L)-FITC, Fab-Fragment Dianova 715-097-003 1:100
Donkey α-mouse IgG (H+L)-Alexa Fluor 647 Dianova 715-605-151 1:250
Donkey α-guinea pig IgG (H+L)-Alexa Fluor 647 Dianova 706-605-148 1:250
Donkey α-rat IgG (H+L)-Rhodamine Red-X Dianova 712-295-150 1:250
Donkey α-rabbit IgG (H+L)-Rhodamine Red-X Dianova 711-295-152 1:250
Donkey α-guinea pig IgG (H+L)-Rhodamine Red-X Dianova 706-296-148 1:250
Streptavidin-rhodamine Red-X Dianova 016-290-084 1:500
Goat α-rabbit IgG (H+L)-AMCA Dianova 111-155-144 1:250, works only with rabbit α-GFAP
Hoechst 33342 Molecular Probes H3570 1:1000
DAPI Molecular Probes D1306 1:1000
Blocking
Fab-fragment donkey α-mouse IgG (H+L) Dianova 715-007-003 1:20
Fab-fragment donkey α-rabbit IgG (H+L) Dianova 711-007-003 1:20
Normal donkey serum Merck Millipore S30
Normal rabbit serum Dianova 011-000-010
Normal goat serum Dianova 005-000-001
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A7906
Histology
Cresyl violet Sigma-Aldrich C5042
Neo-Clear Merck Millipore 109843 non-toxic xylene substitute
Neo-Mount Merck Millipore 109016 permanent mounting medium
Microscopy
Axioskop 2 Carl Zeiss Microscopy
LSM 710 Carl Zeiss Microscopy

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References

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