אימונוהיסטוכימיה ותיוג מרובה עם נוגדנים ממיני Host אותו ללימוד למבוגרים בהיפוקמפוס נוירוגנזה

* These authors contributed equally
Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Ansorg, A., Bornkessel, K., Witte, O. W., Urbach, A. Immunohistochemistry and Multiple Labeling with Antibodies from the Same Host Species to Study Adult Hippocampal Neurogenesis. J. Vis. Exp. (98), e52551, doi:10.3791/52551 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

neurogenesis למבוגרים הוא תהליך שבו תאי עצב חדשים נוצרים מתאי גזע עצביים מופעלים באמצעות תת אב ביניים מחויבים יותר ויותר פיקוח הדוק, רב-שלבים. כל אחד מאלה מבטא תת קבוצה של סמנים מולקולריים ספציפיים ש, יחד עם קריטריונים מורפולוגיים ספציפיים, יכול לשמש לזיהוי. בדרך כלל, טכניקות immunofluorescent מיושמות מעורבות נוגדנים תת ספציפיים בשילוב עם סמני התפשטות exo- או אנדוגני. אנחנו במסמך זה מתארים immunolabeling שיטות לאיתור והכימות של כל שלבי neurogenesis היפוקמפוס המבוגר. אלה מהווים היישום של אנלוגים thymidine, זלוף transcardial, עיבוד רקמות, אחזור epitope מושרה חום, אימונוהיסטוכימיה ABC, immunofluorescence העקיף מרובה, מיקרוסקופיה confocal וכימות תא. יתר על כן אנו מציגים פרוטוקול immunofluorescence מרובה רציף העוקף בעיות usually נובע מהצורך בשימוש בנוגדנים העיקריים שהועלו באותו מין המארח. זה מאפשר זיהוי מדויק של כל תת אב היפוקמפוס יחד עם סמן התפשטות בתוך קטע אחד. טכניקות אלה הן כלי רב עוצמה כדי ללמוד את הרגולציה של תת אב שונה במקביל, מעורבותם בפתולוגיות מוח ותפקידם בתפקודי מוח ספציפיים.

Introduction

שני אזורים במוח constitutively ליצור נוירונים חדשים לאורך כל חיים, אזור subventricular של חדרים לרוחב ואזור subgranular (SGZ) של gyrus בהיפוקמפוס המשונן (DG). נוירונים היילוד נובעים מהתאים עצביים ולעבור את שלבים שונים של פיתוח מורפולוגיים ופיזיולוגי לפני שהגיע לבגרות 1,2. מתא החלוקה לאט רדיאלי כמו גליה-גזע (סוג 1) שלבים רצופים של מעבר הגברה ותאי ביניים להתעורר. תת מובחן יותר (2 א ו -2 ב סוג הסוג) יש צורה לא סדירה עם תהליכים קצרים, משיקים. הם מייצרים neuroblasts (סוג 3) שיוצא בהדרגה את מחזור התא להפוך נוירונים בוגרים (עם דנדריטים מושטים אל השכבה המולקולרית) ולבסוף להשתלב ברשת בהיפוקמפוס תאי גרגיר כבוגר. בשל המאפיינים הפיסיולוגיים שלהם בפרט תאים אלה מספקים מעגלים עם פלסטיות 3 הצעותיה המשופרותטינג תפקיד ייחודי בתפקוד בהיפוקמפוס. למעשה, מחקרים בעשור האחרון נוצרו ראיות משמעותיות שneurogenesis למבוגרים תורמים לזיכרון מרחבי, הפרדת דפוס והתנהגות 4,5 רגשית.

neurogenesis למבוגרים ניתן ללמוד באמצעות גישות שונות. אנלוגים thymidine לשלב DNA במהלך S-השלב של מחזור התא ולאפשר ניתוח היכרויות לידה, כימות וגורלם של תאים שזה עתה נולד 6-8. יישום רציף של אנלוגים thymidine השונים (לדוגמא: IdU, CldU, edu או) יכול לשמש כדי לחקור את מחזור תא או אוכלוסיות תאים נולדו בנקודות זמן שונות במהלך ניסוי 9. אלטרנטיבה, סמן אנדוגני להתפשטות תאים הוא Ki67. זה בא לידי הביטוי בחלוקת תאים במהלך כל השלבים של מחזור התא (G1, S, G2, M) למעט שלב המנוחה (G0) ותחילת G1 10,11. כדי לנתח את הפנוטיפ של אוכלוסיות תאים שזה עתה נולדו במבוגרי dentatכמה סמנים מולקולריים בשלב מסוים gyrus הדואר יכולים לשמש כגון GFAP, nestin, DCX וNeuN 1,6. GFAP הוא סמן של האסטרוציטים בוגרים אלא גם בא לידי ביטוי בתאים כמו גליה-רדיאלי במוח הקדמי המבוגר. Nestin הוא סיבי ביניים ספציפיים לתאים כמו גליה-רדיאלי ובתאי ביניים מוקדמים. DCX הוא חלבון microtubule הקשורים בא לידי ביטוי באבות ביניים, neuroblasts ותאי עצב לא בוגרים. בהתבסס על הביטוי (שיתוף) של שלושת סמנים אלה ותכונות מורפולוגיות של התאים שכותרתו ניתן לזהות ארבעה תת תא אב נפרד: סוג 1 (GFAP +, + nestin, DCX -), 2 א הסוג (GFAP -, nestin + , DCX -), 2b הסוג (GFAP -, + nestin, DCX +) וסוג 3 (GFAP -, nestin -, DCX +) 1. Co-תיוג של DCX יחד עם NeuN, המתבטא בתאי עצב postmitotic, מאפשר הבידול של immaturדואר (DCX +, NeuN +) ובוגר (DCX -, NeuN +) נוירונים גרגיר.

הסמנים שהוזכרו לעיל משמשים לעתים קרובות לשיתוף תיוג immunofluorescent ומיקרוסקופיה confocal לאחר מכן לנתח את המספר וזהותם של תאים שזה עתה נולד. זה בדרך כלל דורש נוגדנים ממיני מארח שונים כדי למנוע נוגדן רצוי תגובה צולבת. עם זאת, הרוב המכריע של נוגדנים ראשוניים מתאימים למחקר neurogenesis גדלים גם בארנבות או עכברים (למשל, עכבר α-BrdU, עכבר α-NeuN, ארנב α-Ki67, α-GFAP ארנב). זה מוביל למגבלות חמורות במספר ובשילוב של אנטיגנים שיכולים להיות מוערך בפרוסה אחת. זה בתורו לא רק מגדיל את מאמץ הצביעה, כstainings מרובה צריכה להתבצע, אלא גם עלול לפגוע באמינות של תוצאות. יתר על כן, כמה אנטיגנים רגישים למיסוך פורמלין מושרה קיבעון epitope (למשל, Ki67, Nestin). אנחנו במסמך זה מתארים את השינויים מפרוטוקולי immunolabeling היחיד ו מרובה הקלאסיים (למשל, שליפת epitope, immunostaining רציף מרובה, שימוש בעכברי nestin-GFP מהונדסים 12) שלהתגבר על רבים מנושאים אלה. בפרט, פרוטוקול immunofluorescence מרובה רציף מאפשר צביעה נגד עד ארבעה אנטיגנים שונים, גם אם חלק מהנוגדנים נגזר מאותו המארח. זה מאפשר זיהוי סימולטני של סוג 1, 2 א הסוג, 2b הסוג וסוג תאי 3 אב, כמו גם פעילות השגשוג שלהם בתוך קטע אחד.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הערה: כל הנהלים הקשורים בעלי חיים המתגוררים בוצעו בהתאם להנחיה אירופית 86/609 הנחיות / EEC על הטיפול ושימוש בחיות מעבדה ואושרו על ידי ועדת האתיקה המקומית (Thuringer Landesamt für Lebensmittelsicherheit und Verbraucherschutz).

1. הזרקת Intraperitoneal של אנלוגים תימידין

  1. לשקול בעלי חיים היום לפני ההזרקה. לחשב את כמות האנלוגית thymidine חובה לכל הזריקות מתוכננות ביום הבא, כמו גם כרכי הזרקה בודדים מותאם למשקל של 10 מ"ג / מיליליטר פתרון מניות.
  2. הכן פתרון מניות thymidine / מיליליטר 10 מ"ג. (זהירות! אנלוגים תימידין רעילים. בצע את גיליונות הספציפיים בטיחות חומרים (MSDS) המסופקים על ידי הספקים, כלומר, לובשת חלוק מעבדה וכפפות, להשתמש מנדף הכימי).
    1. קח אנלוגי thymidine מהמקפיא ולהביא אותו לRT, כ. 21 ° C. שוקל 10 מ"ג ולהוסיףתמיסת מלח סטרילית (לBrdU וCldU) או 0.04 N NaOH (בתמיסת מלח סטרילית; לIdU), מערבולת. הנח ללפחות 10 - 15 דקות באמבט 50 ° C מים ומערבולת כל 2-3 דקות כדי לפזר את האבקה.
      הערה: פתרונות שימוש לתקופה של עד 24 שעות, כאשר הם מאוחסנים בRT ובמשך כמה שבועות ב -20 ° C. הגן על פתרונות מהאור (כיסוי בנייר אלומיניום). בדוק תמיד למשקעים ולפזר מחדש במידת צורך.
  3. לרסן את העכבר בעורפו וintraperitoneally להזריק מתאים, נפח מותאם למשקל של פתרון מניות (בRT) באמצעות מזרק מינון עדין עם מחט G 30.
    הערה: במקרה CldU וIdU צריכים להיות מנוהלים ברצף באותו בעלי החיים, לשקול להזריק ריכוזי equimolar (למשל, 42.5 מ"ג / קילוגרם CldU ו57.5 מ"ג / קילוגרם IdU, אשר תואם את 50 מ"ג / קילוגרם BrdU). לכן, להתאים את כרכי ההזרקה של פתרונות 10 מ"ג / מיליליטר המניות בהתאם.

2. רקמות הכנה

  1. Prepaמחדש פורמלדהיד 4% בpH חיץ פוספט 0.1 M 7.4 ביום שלפני זלוף. חנות ב 4 מעלות צלזיוס.
  2. Transcardially perfuse עכברים המורדמים העמוקה (isoflurane 3.5%) באמצעות החדר השמאלי עם PBS 10 מיליליטר קר כקרח, ולאחר מכן עם 40 מיליליטר פורמלדהיד קר כקרח (קצב זרימה 5 מיליליטר / דקה). מנתחים את המוח ופוסט-תיקון באותו מקבע למשך 24 שעות על 4 מעלות צלזיוס.
  3. העבר את המוח ברציפות ל -10% (24 שעות על 4 מעלות צלזיוס) וסוכרוז 30% (עד כיורים המוח, כ. 48 שעות). להקפאה, לצלול לאט מוח cryoprotected לאיזופנטאן -25 ° C עד אין בועות לצאת מהרקמות. חנות ב -80 מעלות צלזיוס.
  4. לחתוך קטעי העטרה של 40 מיקרומטר עובי על microtome הקפאה (טמפרטורת בלוק ב-25 ל -16 מעלות צלזיוס). העברת חלקים ברצף לפתרון נוזל לרדיאטור המכיל בארות של צלחת תרבית תאי 24 גם (ראו איור 1). חנות ב -20 מעלות צלזיוס.

"איור איור 1. איור סכמטי של העברת פרוסות microtome לתוך צלחת 24 גם. התחל בA1 ומניח פרוסות לאחר מכן לשורה, לאחר A6 ללכת לשורה הבאה B וכן הלאה. כאשר הגיע D6, לחזור לA1 ולהמשיך. הסדר זה ​​של פרוסות מאפשר כימות של כל n th הסעיף של כל מוח. לכימות של תאים שזה עתה נולדו לקחת כל 6 ה סעיף המוח (שווה ערך לתוכן של עמודה אחת), לphenotyping immunofluorescence לנקוט בכל סעיף ה- 12 (שווה ערך לתוכן של 2 שורות לסירוגין של עמודה אחת).

3. Immunostaining

הערה: סעיפים מעובדים בחינם צפו, בדרך כלל 6 צלחות מצוידות היטב עם צלחת ספק והרשת מוסיף. כחריג, חסימה, incubations נוגדן ותגובת ABC נעשים ב12- או 24 גם צלחות בלי מוסיף רשת (0.5-1 מיליליטר לwell מספיק, תלוי במספר של פרוסות שצריכות להיות מוכתמים). במהלך השלבים הבאים, להעביר חלקים בעזרת מכחול דק (לשטוף עם כל פתרון חדש). כל incubations נעשים עם תסיסה מתמשכת (מקסימום 150 סל"ד).

  1. אימונוהיסטוכימיה (שיטת ABC)
    1. העבר את החלקים מנוזל לרדיאטור לTBS ולשטוף היטב (פעם אחת O / N ב 4 ° C, 5 פעמים ב RT במשך 10 דקות כל אחד) כדי להסיר נוזל לרדיאטור לחלוטין.
    2. דגירה למשך 30 דקות בשיעור של 1.5% H 2 O 2 בTBS-T כדי להרוות את פעילות peroxidase אנדוגני. שים לב למבעבע ומחדש לצלול חלקים במידת צורך. לשטוף 3 פעמים בTBS במשך 15 דקות כל אחד.
    3. אופציונאלי: בינתיים מחממים ארון חימום ו- 2 N HCl עד 37 מעלות צלזיוס. סעיפי דגירה למשך 30 דקות ב 37 ° C ב 2 N HCl לפגל DNA. בעדינות חלקים נפרדים בעזרת מברשת.
    4. אופציונאלי: לנטרל סעיפים במשך 10 דקות בpH 0.1 M חיץ borate8.5, RT. בעת העברה, ספוגית בקצרה מוסיף רשת המכיל את הסעיפים על מגבת נייר כדי להסיר שאריות HCl. לשטוף 2 פעמים ב TBS במשך 15 דקות כל אחד.
    5. דגירה בTBSplus לpermeabilize הרקמה ולחסום אתרי נוגדן מחייב נוקבים, שעה 1 בRT.
    6. דגירה בנוגדן ראשוני בדילול מלא בTBSplus, O / N ב 4 ° C. לשטוף 3 פעמים בTBS במשך 15 דקות כל אחד.
    7. דגירה בנוגדנים משני biotinylated המדולל בTBSplus, 3 שעות ב RT. לשטוף 3 פעמים בTBS במשך 15 דקות כל אחד. בינתיים ...
    8. הכן מורכב ABC על פי הפרוטוקול של היצרן (1% + B 1% בTBS-T). אפשר לעמוד למשך 30 דקות ב RT לפני השימוש. סעיפי דגירה במגיבה AB עבור שעה 1 ב RT. לשטוף 3 פעמים בTBS במשך 15 דקות כל אחד.
    9. הכן 50 מיליליטר 0.5 מ"ג / מיליליטר DAB בTBS-T ל6- או 12 גם צלחת, מחולק לשני חצאים ו- 4 מיליליטר פיפטה או 2 מיליליטר לכל טוב, בהתאמה. העברת חלקים לפתרון DAB (זהירות! DAB הוא רעיל. בצע הספציפיג MSDS הניתן על ידי הספק, כלומר, לובשים חלוק מעבדה וכפפות, להשתמש מנדף כימי).
    10. הוסף 0.5 מיליליטר 1% H 2 O 2 לפתרון DAB 25 מיליליטר שנותר, לערבב וכרכים פיפטה שווי ערך כאמור לכל אחד ולהתחיל תגובת peroxidase. דגירה של 12 דקות. לשטוף 3 פעמים בTBS במשך 15 דקות כל אחד.
    11. חלקי הר לשקופיות בג'לטין, O אוויר היבש / N. Coverslip עם הרכבה בינונית קבוע.
    12. אופציונאלי: Counterstain לפני הצבת coverslip (ראה סעיף 3.5).
      הערה: אם יחס אות לרעש נמוך בגלל רקע גבוה, לחזור על טיפול H 2 O 2 לאחר הדגירה עם מגיב AB (צעד 3.1.8).
  2. מרובה-immunofluorescence
    1. immunofluorescence בודד או מרובה בו זמנית
      1. העבר את החלקים מנוזל לרדיאטור לTBS ולשטוף היטב (פעם אחת O / N ב 4 ° C, 5 פעמים ב RT במשך 10 דקות כל אחד) כדי להסיר לחלוטיןtifreeze.
      2. אופציונאלי: כצעדי 3.1.3 - 3.1.4.
      3. דגירה בTBSplus לpermeabilize הרקמה ולחסום אתרי נוגדן מחייב נוקבים, שעה 1 בRT.
      4. דגירה בקוקטייל נוגדן ראשוני (למשל, α-BrdU עכברוש, חזיר הים α-DCX, α-GFP העז) בדילול מלא בTBSplus, O / N ב 4 מעלות צלזיוס. לשטוף 3 פעמים בTBS במשך 15 דקות כל אחד.
      5. דגירה בקוקטייל של נוגדנים משני fluorochrome מצומדות (למשל, Rhodamine האדום α-חולדה, Alexa-647 α-שפן ניסיונות, Alexa-488 α-עז; נגזר כולם בחמור) מדוללים בTBSplus, 3 שעות בRT או O / N ב 4 מעלות צלזיוס. מעתה להגן על חלקים מהאור. לשטוף 3 פעמים בTBS במשך 15 דקות כל אחד.
      6. חלקי הר לשקופיות בג'לטין, O אוויר היבש / N. Coverslip עם מדיום הרכבה המימי.
    2. immunofluorescence מרובה רציף עם נוגדנים עיקריים מאותו מין מארח
      1. כצעדי 3.2.1.1 - 3.2.1.3.
      2. דגירה בfiראשון נוגדן ראשוני (למשל, α-אנטיגן ארנב), O / N ב 4 מעלות צלזיוס. לשטוף 3 פעמים בTBS ופעם אחת בTBS-T במשך 10 דקות כל אחד.
      3. דגירה בנוגדן הראשון fluorochrome מצומדות המשני (לדוגמא, Rhodamine אדום-conj. חמור α-ארנבת), 3 RT שעות. מעתה להגן על חלקים מהאור. לשטוף 3 פעמים בTBS ופעם אחת בTBS-T במשך 10 דקות כל אחד.
      4. דגירה בסרום 10% נורמלים ממארח ​​שהנוגדנים הראשוניים (למשל, סרום ארנבת) לRT 3 שעות כדי להרוות paratopes הפתוח בנוגדנים משני הראשונים. לשטוף 3 פעמים בTBS ופעם אחת בTBS-T במשך 10 דקות כל אחד.
      5. דגירה בTBSplus עם 50 מיקרוגרם / מיליליטר שברי Fab חד ערכי unconjugated המכוון נגד שורה של הנוגדנים הראשוניים (למשל, IgG α-הארנב (L + H)) כדי לכסות epitopes שיכול להיות מוכרת על ידי הנוגדן השני המשני, O / N ב 4 ° C.
      6. יש לשטוף לפחות 3 פעמים בTBS ופעם אחת בTBS-T במשך 10 דקות כל אחד. בעת העברה, SWA בקצרהב מוסיף הרשת המכיל את הסעיפים על מגבת נייר כדי להסיר כל שאריות Fab.
      7. דגירה בנוגדן השני עיקרי (לדוגמא, ארנב α-אנטיגן B), O / N ב 4 ° C. לשטוף 3 פעמים בTBS ופעם אחת בTBS-T במשך 10 דקות כל אחד.
      8. דגירה בנוגדן שני fluorochrome מצומדות המשני (לדוגמא, Alexa-488-conj. חמור α-ארנבת), 3 RT שעות. לשטוף 3 פעמים בTBS במשך 15 דקות כל אחד, הר וcoverslip כאמור לעיל.
        הערה: כדי לתייג אנטיגנים עם נוגדנים ממינים שונים מארח להוסיף אותם לצעד 3.2.2.2 והנוגדנים משני המתאימים לשלב 3.2.2.3.
    3. אחד משני הנוגדנים מאותו מין כאחד מהנוגדנים הראשוניים
      הערה: פרוטוקול זה מתאים לחדר לארבעה מכתים נגד BrdU או Ki67 יחד עם GFAP, nestin-GFP וDCX.
      1. לעקוב בקפדנות פרוטוקול הצעדים 3.2.1.1 - 3.2.1.5. עד לנקודה זו להשתמש בסרום חמור רק בTBSplus.
      2. דגירה בTBSplus המכיל 3% עזים בסרום עבור שעה 1 ב RT. זה מכסה paratopes הפתוח בנוגדנים משני α-עז. לשטוף 3 פעמים בTBS ופעם אחת בTBS-T במשך 10 דקות כל אחד.
      3. דגירה בAMCA-conj. העז α-הארנב המדולל בTBSplus, RT 3 שעות או O / 4 N ° C. לשטוף שלוש פעמים בTBS במשך 15 דקות כל אחד, הר וcoverslip כאמור לעיל.
    4. שיתוף מכתים CldU, IdU
      1. יש לשטוף, לפגל ולנטרל את החלקים כאמור בסעיף 3.2.1 (שלבים 3.2.1.1 - 3.2.1.2).
      2. דגירה עם 20 מיקרוגרם / ברי Fab unconjugated מיליליטר α-עכבר IgG (H + L) בTBSplus, שעת 1 בRT. יש לשטוף 4 פעמים בTBS ופעם אחת בTBS-T במשך 10 דקות כל אחד.
      3. דגירה בקוקטייל המכיל נוגדן ראשוני α-BrdU חולדה (1: 400; מטוהר IgG2) וα-BrdU עכבר (1: 350) מדולל בTBSplus, O / N ב 4 מעלות צלזיוס. לשטוף 3 פעמים בTBS ופעם אחת בTBS-T במשך 10 דקות כל אחד.
      4. דגירה בקוקטייל נוגדנים משני המכילה חמור biotinylated α-חולדה (1: 500) וFITC-conj. α-העכבר החמור שברי Fab (1: 100). לשטוף 3 פעמים בTBS ופעם אחת בTBS-T במשך 10 דקות כל אחד.
      5. דגירה בRhodamine האדום-conj. Streptavidin, שעה 2 ב RT. לשטוף 3 פעמים בTBS במשך 15 דקות כל אחד, הר וcoverslip כאמור לעיל.
    5. הגברה של אות הקרינה בעכברי nestin-GFP
      1. להוסיף העז α-GFP לקוקטייל הנוגדן הראשוני.
      2. הוסף נוגדנים משני מצומדות fluorochrome עם מאפיינים דומים לרוח רפאים GFP (כגון conj Alexa 488. חמור α-עז) לקוקטייל נוגדנים משני.
  3. אחזור epitope
    1. לבצע שליפת epitope לאחר שטיפת נוזל לרדיאטור. ספינת קיטור מחממים עם 6 או 12 גם צלחות המכילות pH 0.1 חיץ M ציטרט 6.0 to 95-99 מעלות צלזיוס (כ -25 דקות).
    2. העבר את החלקים למאגר ציטראט החם והקיטור למשך 30 דקות (לכסות את הצלחות עם רדיד האלומיניום כl פלסטיקמזהי אינם עמידים בחום).
    3. מייד למקם את הצלחות באמבט קרח כדי להתקרר. זה עוזר להגן על מורפולוגיה רקמות, אשר היא בעלת חשיבות מיוחדת בעבודה עם חלקים במוח של בעלי חיים שלאחר לידה.
    4. לשטוף 3 פעמים בTBS במשך 10 דקות כל אחד לשטוף החוצה ולנטרל את ציטראט ולהמשיך מכתים.
  4. עכבר נוגדנים ברקמת עכבר
    1. הוסף 20 מיקרוגרם / מיליליטר חד ערכי שברי Fab α-העכבר IgG (H + L; אותו מארח-מינים מ נוגדנים משני) לצעד החסימה הראשון (למשל, צעד 3.1.5 או 3.2.1.3).
    2. יש לשטוף 4 פעמים בTBS ופעם אחת בTBS-T במשך 10 דקות כל אחד, ולהמשיך בפרוטוקול המתאים.
  5. counterstaining הסגול Cresyl
    1. פתרון מחממים סגול cresyl עד 60 ° C (בצנצנת זכוכית). דגירה שקופיות בפתרון החם במשך 3 דקות.
    2. יש לשטוף בaq. dest. ולייבש 2 פעמים 1 דקות כל אחד ב -70%, 96% ו -100% isopropanol. ברור ל5 - 6 דקות בקסילן או תחליף קסילן וcoverslip עם הרכבה בינונית קבוע תואם.

ניתוח נתונים 4.

  1. ספירת תאים שזה עתה נולדו מוכתם peroxidase בכל סעיף 6 ה לאורך מידת rostrocaudal השלם של הגירוס המשונן. השתמש במיקרוסקופ אור בהגדלה 400X.
  2. הכפל את מספרי תא וכתוצאה מכך עם מרווח הצומת, כדי לקבל הערכה של מספרים כולל של תאים שזה עתה נולד.
  3. תמונת הקרינה שכותרתו חלקים עם מיקרוסקופ לייזר confocal מצויד בלייזרים מתאימים ומערכות סינון. קחו ערימות תמונה בעמדות אקראיות לאורך כל היקף gyrus המשונן בהגדלה 400X ולנתח לפחות 50 תאים שנבחרו באקראי של ריבית לחצי כדור לשיתוף תיוג עם סמנים אחרים.
  4. להכפיל את האחוזים של תאים שכותרתו שיתוף (% / 100) וכתוצאה מכך עם המספרים הכולל של תאים שזה עתה נולד כדי לחשב מוחלטמספרים של אוכלוסיות תאים ספציפיות שזה עתה נולדו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

אנחנו מוחלים שיטות שתוארו לעיל לכמת ולאפיין תאים שזה עתה נולד בהיפוקמפוס לאחר הלידה והמבוגר. לכן, השתמשנו wildtype וD2 cyclin neurogenesis הלקויה לדפוק את עכברים (Ccnd2 KO) שוכנו בתנאים הידועים להשפיע על השיעור של neurogenesis (כלומר, סביבה מועשרת, EE) 13,14. צביעת DAB immunohistochemical נגד שני Ki67, BrdU, CldU או IdU חשפה באופן עקבי הבדלים במספרים סלולריים שזה עתה נולד בין wildtype והעכברים Ccnd2 KO (איור 3) 15. יתר על כן, עם זריקות equimolar רצופות של CldU וIdU היינו יכול להפלות אוכלוסיות תאים נולדו בתקופות מסוימות של EE (איור 3 ג, ד). אימוץ סעיף 3.2.4 אנו יכולים לזהות בהצלחה עוצמות אות שווה וחפיפה מצוינת של CldU וIdU לאחר הלידה בו זמנית (איור 4). תאים שזה עתה נולד BrdU שכותרתו יכולים להיות phenotyped עם סטן שיטת immunofluorescence dard או על ידי BrdU בו זמנית החלים וNeuN, (איור 5) או BrdU, GFAP, nestin-GFP ונוגדני DCX (איור 6). טכניקה זו אפשרה סוג זיהוי מוצלח 1, 2 א, 2 ב ו -3 תאים בתוך אחת דגימה (איור 6, D). Co-תיוג של Ki67 עם סמני אב נדרש היישום רציף של נוגדנים כנוגדנים עיקריים נגד Ki67 וGFAP הועלו בארנב (חל על סעיף 3.2.2), יתר על כן אחד מהנוגדנים הראשוניים (העז α-GFP) הופק ב אותו מארח כאחד מהנוגדנים משני (AMCA conj. עיזים α-ארנב). שילוב של סעיפים 3.2.2 ו3.2.3 מושלם עבד אם חלקים הודגרו ראשון בKi67 יחד עם נוגדן nestin-GFP, ושנית בנוגדן GFAP אך לא להיפך (איור 6 ג). איור 2 מסכם את תוכניות היישום אושרו.

.within-page = "תמיד"> איור 2
2. immunofluorescence איור Sequential מרובה עם נוגדנים עיקריים הנגזרים מאותו מין המארח. איור סכמטי (). (ב) שילובים מוצלחים של נוגדנים והסדר הכרונולוגי שלהם בimmunofluorescence. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3. תמונות Light מיקרוסקופיה של ABC-אימונוהיסטוכימיה לכימות של תאים שזה עתה נולדו ברכס המשונן. מתואר הן השוואות בין סמנים שונים הפצה בWT ועכברים Ccnd2 KO neurogenesis הלקויה בהגדלה 100X 400X ו. () g צביעת Ki67-DAB> מציגה אשכולות של תאים מתרבים באזור subgranular של gyrus המשונן (היום לאחר לידה 35). מספר התאים מתרבים הוא פחת בעכברי Ccnd2 KO בהשוואה לעכברי WT. (B) יילוד תאים ב 28 ימים לאחר BrdU-ממשל (ערכת הזרקה מעל תמונות) המאשר את קצב ההתפשטות המופחתת בעכברי Ccnd2 KO. (C) CldU-ממשל במהלך השבוע של EE (ערכת הזרקה מעל תמונה) 6 הראה עלייה במספר תאים שזה עתה נולדו ברכס המשונן של WT אבל לא עכברי Ccnd2 KO. (ד) IdU-ממשל במהלך השבוע של EE 8 הראה תוצאות דומות. בר סולם מייצג 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

fig4.jpg "/>
איור שיתוף מכתים 4. Immunofluorescence של CldU וIdU לאחר לידה בו זמנית של ריכוזי equimolar. ההגברה האות של תאי CldU שכותרתו הביאה לחפיפה מצוינת של CldU וIdU. בר סולם מייצג 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
איור שיתוף תיוג 5. Immunofluorescence של NeuN וBrdU. BrdU () היה מנוהל 6 פעמים בכל שעה 8 עבור 2 ימים רצופים החלו ביום הלידה 14. בעלי חיים הוקרבו 28 ימים לאחר מכן. (B) Immunofluorescence שיתוף תיוג של תאים מתרבים עם הסמן העצבי הבוגר NeuN מציג מספר מופחת של מתרבים תאים בCcnd2 KO לעומת Wבעלי החיים T. בר סולם מייצג 50 מיקרומטר. (C) יכול לצפות במוגדל של (B) מראים שכותרתו תאי שיתוף בשני גנוטיפים. בר סולם מייצג 20 מיקרומטר. דוגמא ההגדלה גבוהה של תאי שכותרת שיתוף / NeuN BrdU ברכס המשונן (D). בר סולם מייצג 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 6
איור שיתוף תיוג 6. immunofluorescence לארבעה סמני התפשטות שונים עם GFAP, nestin-GFP וDCX לphenotyping תאי גרגיר יילוד ברכס המשונן של עכברי nestin-GFP. BrdU () היה מנוהל 3 פעמים בכל שעה 2 ביום הלידה 70 . בעלי חיים הוקרבו שעה 2 בהמשך. תמונה (B) נציג של שיתוף צביעה לBrdU, GFAP,nestin-GFP ותמונת DCX. (ג) נציג של immunofluorescence המרובע לKi67, GFAP, nestin-GFP וDCX. (ד) סיווג של סוגי תאי אב על פי תיוג immunofluorescence. בהתבסס על שיתוף הביטוי של סמנים שונים ותכונות מורפולוגיות של התאים שכותרתו ניתן לזהות ארבעה תת תא אב נפרד: סוג 1 (GFAP +, + nestin, DCX -), 2 א הסוג (GFAP -, + nestin, DCX - ), 2b הסוג (GFAP -, + nestin, DCX +) וסוג 3 (GFAP -, nestin -, DCX +). בר סולם מייצג 20 מיקרומטר. (E) סקירה סכמטי של השלבים השונים של neurogenesis בהיפוקמפוס המבוגר. הוא ממחיש את סוגי 4 אב תא, תאי עצב לא בוגרים ותאי גרגיר בוגרים, הביטוי שלהם אופייני לסמנים ויכולת השגשוג שלהם. ML - שכבה מולקולרית של תא, GCL -שכבת תאים גרעינית, SGL -. שכבת תאי subgranular אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 7
איור 7. דוגמא לstainings רציף המוצלח והלא מוצלח עם שני נוגדנים עיקריים שהועלו באותו המין, בהתאם לרצף של דגירה נוגדן. Micrographs confocal להראות את התוצאה של שיתוף צביעה רציפה נגד Ki67 וGFAP עם נוגדנים ראשוניים שני נגזר מארנב. באימונוהיסטוכימיה () הושלמה ראשונה לGFAP אחריו מכתים נגד Ki67 שהוביל לחפיפה בולטת של שני האותות. בפרט אות Ki67 הייתה טיפוסית והייתה דומה לאות של מכתים GFAP. (ב) מראה את התוצאות מהפוכותרצף צביעה עם כתמי Ki67 הושלם צביעה ראשונה ולאחר מכן נגד GFAP. כאן, האותות לשני אנטיגנים דומים לדפוס הביטוי הצפוי: אות Ki67 הוגבלה לגרעינים בתוך אזור subgranular אילו האות GFAP נמצא cytoplasmatically, בעיקר בתהליכים התאיים הנובעים מאזור subgranular. בר סולם מייצג 20 מיקרומטר. RhX - Rhodamine X. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 8
ספציפי איור 8. של נוגדני α-BrdU משמשים לאיתור CldU וIdU. עכברים הוזרקו או עם CldU או עם IdU (יישום שאינו בו זמנית). בעכברים () חלקים במוח של CldU (A1) או IdU (A2) הזריקו היה אימונוגלובולינnostained באמצעות נוגדן עכברוש המטוהר α-BrdU שאמור במיוחד צולבת מגיב לCldU, אך לא לIdU. (ב) מראה את התוצאות ממכתימים את המוח מCldU (B1) או IdU (B2) הזריק עכברים עם העכבר α-BrdU נוגדן שצפויה לחצות להגיב עם IdU, אבל לא CldU. בר סולם מייצג 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כימות וזיהוי של תת-אוכלוסיות של תאים שזה עתה נולדו הוא נושא מרכזי במחקר neurogenesis למבוגרים. שילוב סמני התפשטות ונוגדנים נגד חלבונים הביעו בשלבים מסוימים של neurogenesis המבוגר מאפשר זיהוי immunohistochemical של תת-אוכלוסיות אלה. חלק מהנוגדנים או שילובי נוגדן דורש תנאי מכתים ספציפיים.

תיוג של חלוקת תאים עם אנלוגים thymidine סינטטיים הוא עדיין סטנדרט הזהב ללימוד neurogenesis היפוקמפוס המבוגר. זה חיוני כדי לשקול את פרוטוקול ההזרקה המתאים לפני תחילת הניסוי. אנחנו בדרך כלל לנהל 50 מ"ג BrdU / קילוגרם (משקל גוף, IP), אך ריכוזים עשויים להשתנות בהתאם לדרישות ניסוי (עד 300 מ"ג / קילוגרם להזרקת בולוס) 8,16. אם IdU וCldU לי להיות מוזרק ברצף לאפליה זמנית של אוכלוסיות תאים שהחובה להזריק ריכוזי equimolar ( 16. חסרון נוסף הוא שdenaturation DNA נדרש לגילוי immunohistochemical של אנלוגים thymidine שעלול להפריע לantigenicity של נוגדנים או טכניקות תיוג DNA אחרות (למשל, DAPI, Hoechst 33258). גילוי immunohistochemical של סמני התפשטות אנדוגני כמו Ki67 עשוי להיות 10,11 חלופי הולם. עם זאת, זה רק מאפשר זריקת הצמד של פעילות שגשוג בעת זלוף, היכרויות לידה למפרע וניתוח גורל הם בלתי אפשריות.

לimmunostaining, חלקים בדרך כלל מעובד בחינם צפו, בדרך כלל 6 צלחות מצוידות היטב עם צלחת ספק ורשת מוסיף שמפשט העברתם מפתרון אחד למשנהו. כחריג, חסימה, incubations נוגדן ותגובת ABC נעשיםב12- או 24 גם צלחות בלי מוסיף רשת לחסוך פתרונות יקרים (0.5-1 מ"ל לכל טוב מספיק, תלוי במספר של פרוסות שצריכות להיות מוכתמים). במהלך השלבים הבאים, להעביר חלקים בעזרת מכחול דק שצריך לשטוף כאשר שינוי פתרונות. למנוע קטעים מהייבוש ולבצע incubations שייקח> שעה 1 בתא humified. כל incubations צריך להיעשות עם תסיסה רציפה (סל"ד 150 המקסימום). תמיד לבדוק ולכייל כל מגרש נוגדן חדש. פעמים יותר דגירה נוגדן (עד 2 ימים 4 ° C) עשויות לשפר את הצביעה. במקרה רק נוגדני עכבר זמינים נגד אנטיגנים אתה רוצה לדמיין ברקמת עכבר מומלץ לחסום נוגדנים אנדוגני עם שברי Fab חד ערכי מרוכזים מאוד α-עכבר (סעיף 3.4). בכל פעם שמשתמש בטכניקה זו להאריך את צעדי השטיפה הבאים. אחרת, שברי Fab מאוגד עשויים להיקשר לנוגדן העכבר העיקרי שלך. טיפול מקדים HCl וborateנטרול נדרש רק לצורך זיהוי של אנלוגים thymidine. תגובת peroxidase 12 דקות לגרום ליחס אות לרעש אופטימלי לתנאים ולנוגדנים המיושמים בפרוטוקול שלנו. כמו בכל תגובה אנזימטית, שיעור תגובת peroxidase תלוי בגורמים רבים (למשל, טמפרטורה, pH, ריכוז של אנזים ומצע). כתוצאה מכך, זמני תגובה צריכים להיות מותאמים לכל קבוצת נוגדנים חדשה. כדי להמחיש את המבנים אנטומיים בכתמי DAB עם רקע חלש מאוד (לדוגמא, CldU), ניתן counterstained פרוסות. השיטה הסגולה cresyl מתואר בסעיף 3.5 תוצאות בcounterstain קלוש מאוד שאינו פוגע באות DAB הספציפית.

לimmunofluorescence מרובה, להשתמש בנוגדנים עיקריים שהועלו במינים שונים או של isotypes שונה ולעקוב אחר סעיף 3.2.1. אחרת, לבצע immunolabeling מרובה רציף שעבר אופטימיזציה כדי לזהות נוגדנים עיקריים מרוביםמאותו מין המארח (כלומר, עכבר או ארנבת; סעיף 3.2.2). העיקרון הבסיסי של שיטה זו הומצא על ידי פרגוסון ועמיתים שמוכתמים בהצלחה סמני שרירים שונים עם נוגדנים ראשוניים שני עכבר 17. שברי Fab המשמשים לחסימה בשלב 3.2.2.5 צריכים להיגזר מאותו המין כמארח הנוגדנים משני. הריכוזים וזמני דגירה שתוארו בסעיף 3.2.2 מותאמים לנוגדנים הספציפיים מתוארים לעיל וצריכים להיות מותאמים לכל שילוב נוגדן חדש. להיות מודע לכך שהרצף של דגירה נוגדן ראשונית עשוי מאוד להשפיע על התוצאות (כפי שצוין באיור 7 א). בכל מקום שהחלים, אנטיגנים זוהו על ידי הנוגדנים העיקריים הנגזרים מאותו המין צריכים להראות דפוס ביטוי שונה אשר מפשט את זיהוי של חסימה מספקת. לחסל כל אפשרות של נוגדן תגובה צולבת או שקר-חיובי זה essential לכלול בקרות מתאימות (כלומר, בקרות רק על-תיכוניות-נוגדן; אימונוהיסטוכימיה מלאה לאנטיגן הראשון ואחריו דגירה עם נוגדן שני ראשוני או משני נוגדנים שני בלבד). 18 איור 2 מציג שילובי נוגדן שעבדו היטב בידיים שלנו. לimmunofluorescence מרובה הוא כן, מומלץ להשתמש נוגדנים משני שגדלים באותו המין (למשל, חמור) ויש לי תגובה צולבת מינימאלית לרקמות שלך וסרום חלבונים ממינים אחרים (כלומר, לפני adsorbed). אחרת סעיף 3.2.3 עשוי לעזור כדי למנוע כל interspecies לא צפוי תגובה צולבת. בחר fluorochromes עם מתאים חפיפה ספקטרלית מינימאלית למערכת זיהוי שלך (לדוגמא, AMCA, Alexa פלואוריד 488, Rhodamine אדום, אלקסה פלואוריד 647). אם דרושה counterstain גרעיני, להוסיף DAPI או Hoechst 33342 (10 מיקרוגרם / מיליליטר) לקוקטייל נוגדנים משני (אז, לא קרוב UV נוגדנים משני יכול להיות לנוed). counterstains הגרעיני אלה לא עובד אם כבר מראש שטופלו רקמות עם HCl. בדומה לכך, טיפול HCl עלול לפגוע בזיהוי של כמה אנטיגנים ולכן השפעתה על ביצועי נוגדן אדם צריכה להיבדק. ברגע שהנוגדנים משני fluorochrome מצומדות יושמו סעיפים להגן מפני אור.

ניתן דמיינו CldU וIdU בעזרת שני נוגדני BrdU שונים שצלב להגיב-גם עם CldU (עכברוש α-BrdU) או IdU (עכבר α-BrdU) 9,19. אם שני אנלוגים thymidine כבר הוזרקו לחיה אחת זה הוא חיוני כדי להשתמש בנוגדן העכברוש α-BrdU המטוהר כדי לזהות CldU כי הנוגדנים מטוהרים שאינם חוצה מגיבים לIdU. כפי שתואר על ידי אל וגה et. 9 אות CldU צריכה להיות מוגברת לשיתוף תיוג immunofluorescent להשיג זיהוי מקביל של שני אנלוגים thymidine. לכן, במקום נוגדנים משני fluorochrome מצומדות (α-עכברוש) streptavidin מצומדות fluorochrome מתווסף הבאים דגירה בנוגדנים משני biotinylated (α-חולדה; סעיף 3.2.4). כדי לא לכלול כל נוגדן רצוי תגובות צולבות כוללות סעיפי שליטה מעכברים שקיבלו או IdU או CldU (בנפרד; ראה איור 8). כדי לוודא זיהוי מקביל של סעיפי שימוש IdU וCldU מבעלי החיים שהוזרקו בו-זמנית עם כמויות equimolar של CldU וIdU (ראה איור 4).

ללמוד מסוג 1 וסוג 2 תאים אנחנו מעדיפים להשתמש בעכברים הטרנסגניים nestin-GFP 12 נוגדני nestin לעתים קרובות לא ספקו תוצאות משביעות רצון. יש עכברים Nestin-GFP היתרון של אמינות חזותית ותאי nestin חיובי ותכונות המורפולוגיות שלהם בשלב התפתחות מסוים. GFP-האות צריכה להיות מוגברת באמצעות immunofluorescence העקיף עם נוגדן α-GFP. הנוגדנים משני צריכים להיות מצמידים את fluorochrשת עם מאפיינים דומים לרוח רפאים GFP. במידת הצורך, ניתן הכליאו עכברי nestin-GFP לקווי עכבר מוטציה נוספים, לחקור את מעורבותם של גנים מסוימים בneurogenesis. עד עכשיו, נוגדני nestin משופרים מסופקים גופי תא תווית שכמו גם תהליכים והוא יכול לשמש כאלטרנטיבה לגישה המהונדס (ראו רשימת חומר).

זה קריטי כדי לעמוד בקיבעון 24 שעות כדי למנוע overfixation. שותפי התגובה הכימית של פורמלדהיד ברקמה הם בעיקר חלבונים ופורמלדהיד יוצר קבוצות hydroxymethyl תגובה על שרשרות הצד שלהם מובילות לcross-linking של חומצות אמינו סמוכות (על ידי ההיווצרות של גשרים מתילן). הדבר עלול לגרום למיסוך של אנטיגן-epitopes ואובדן immunoreactivity (ראה הערות לנוגדנים ספציפיים ברשימת חומרים). כדי לשחזר immunoreactivity האבוד, כמה שיטות אחזור epitope קיימות ש- קשרים צולבים חלבון הנוצר על-פורמלדהיד הפסקה באמצעות דוארxposure כדי לחמם 20. בפרוטוקול זה, שיטת חיץ ציטראט עובדת מעולה לאחרים לצורך זיהוי של neurogenesis בהיפוקמפוס לאחר הלידה והמבוגר (סעיף 3.3). שים לב שפרוסות של בעלי חיים צעירים מאוד (<P21) עשויות להיות מאוד שבירות או מעוותים וצריכה להיות מטופל בזהירות מיוחדת. יתר על כן, אחזור epitope עלולה להזיק לכמה אפיטופים ולכן יש לבדוק נוגדנים בודדים אם הם מתאימים לצביעה מרובה הדורשת טיפול מקדים זה.

לסיכום, פרוטוקול זה הוא אוסף של טכניקות בסיסיות והרחיבו המאפשרות הניתוח של neurogenesis בהיפוקמפוס המבוגר. זה במיוחד מאפשר זיהוי חד-משמעי של כל תת-אוכלוסיות אב היפוקמפוס יחד עם התפשטות או סמן לידה היכרויות מסעיף אחד. ניתן להתאים את הטכניקות הללו לכל שילוב של נוגדנים או למינים אחרים ללמוד פיתוח והסדרה של hippocamתאי אב חבר בתגובה לגירויים מסוימים ומעורבותם בתפקודי מוח בפרט.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Thymidine analog administration
5-Bromo-2′-deoxyuridine, BrdU Sigma-Aldrich B9285 toxic (mutagenic, teratogenic)
5-Chloro-2′-deoxyuridine, CldU Sigma-Aldrich C6891 toxic (mutagenic, teratogenic)
5-Chloro-2′-deoxyuridine, CldU MP Biomedicals 2105478 toxic (mutagenic, teratogenic)
5-Iodo-2′-deoxyuridine, IdU MP Biomedicals 2100357 toxic (mutagenic, teratogenic)
Tissue preparation
Isoflurane-Actavis Piramal Healthcare 700211
Paraformaldehyde powder (PFA) Riedel-De Häen 16005 toxic, flammable
Perfusion pump PD5206 Heidolph Instruments 523-52060-00
Masterflex Tygon lab tubing, Ø 0.8 mm Thermo Fischer Scientific 06409-13
Feeding needle, straight, 21 G, 1.75 mm olive tip, 40 mm Agnthos 1036
Freezing microtome Microm HM 400 Thermo Fischer Scientific
24-well Cell culture multiwell plates Greiner Bio-One 662160
Immunohistochemistry
Tefal vitacuisine steamer Tefal VS 4001
Netwell 24 mm polyester mesh membrane inserts Corning 3479 pre-loaded in 6-well culture plates
Netwell 15 mm polyester mesh membrane inserts Corning 3477 pre-loaded in 12-well culture plates
Netwell plastic 6-well carrier kit Corning 3521 for 24 mm polyester mesh membrane inserts
Netwell plastic 12-well carrier kit Corning 3520 for 15 mm polyester mesh membrane inserts
Vectastain Elite ABC kit Vector Laboratories PK-6100
DAB (3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate) Sigma-Aldrich D-5637 carcinogenic, light sensitive
Fluoromount-G SouthernBiotech 0100-01
Primary antibodies
Rabbit IgG1 α-Ki67 Novocastra/ Leica Biosystems NCL-L-Ki67MM1 DAB 1:400/IF 1:100; requires epitope retrieval
Rabbit α-GFAP, AS-3-GF Synaptic Systems 173 002 1:500
Goat IgG (H+L) α-GFP Acris Antibodies R1091P 1:300
Mouse IgG1 α-nestin Abcam ab6142 1:200; requires epitope retrieval
Guinea pig IgG (H+L) α-Doublecortin Merck Millipore AB2253 1:500
Rat IgG2a α-BrdU (ascites) AbD Serotec/ Bio-Rad OBT0030CX for detection of BrdU; DAB 1:500/IF 1:400
Rat IgG2a α-BrdU (purified) AbD Serotec/ Bio-Rad OBT0030   for detection of CldU; DAB 1:500/IF 1:250-400
Mouse IgG1 α-NeuN Merck Millipore MAB377 1:500
mouse IgG1κ α-BrdU BD Biosciences 347580 For detection of IdU; DAB 1:500/IF 1:350
Secondary antibodies
Donkey α-guinea pig IgG (H+L)-Biotin Dianova 711-065-152 1:500
Donkey α-rat IgG (H+L)-Biotin Dianova 712-065-150 1:500
Donkey α-mouse IgG (H+L)-Biotin Dianova 715-065-151 1:500
Goat α-rat IgG (H+L)-Alexa Fluor 488 Molecular Probes A11006 1:250
Donkey α-goat IgG (H+L)-Alexa Fluor 488 Molecular Probes A11055 1:250
Donkey α-mouse IgG (H+L)-FITC, Fab-Fragment Dianova 715-097-003 1:100
Donkey α-mouse IgG (H+L)-Alexa Fluor 647 Dianova 715-605-151 1:250
Donkey α-guinea pig IgG (H+L)-Alexa Fluor 647 Dianova 706-605-148 1:250
Donkey α-rat IgG (H+L)-Rhodamine Red-X Dianova 712-295-150 1:250
Donkey α-rabbit IgG (H+L)-Rhodamine Red-X Dianova 711-295-152 1:250
Donkey α-guinea pig IgG (H+L)-Rhodamine Red-X Dianova 706-296-148 1:250
Streptavidin-rhodamine Red-X Dianova 016-290-084 1:500
Goat α-rabbit IgG (H+L)-AMCA Dianova 111-155-144 1:250, works only with rabbit α-GFAP
Hoechst 33342 Molecular Probes H3570 1:1000
DAPI Molecular Probes D1306 1:1000
Blocking
Fab-fragment donkey α-mouse IgG (H+L) Dianova 715-007-003 1:20
Fab-fragment donkey α-rabbit IgG (H+L) Dianova 711-007-003 1:20
Normal donkey serum Merck Millipore S30
Normal rabbit serum Dianova 011-000-010
Normal goat serum Dianova 005-000-001
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A7906
Histology
Cresyl violet Sigma-Aldrich C5042
Neo-Clear Merck Millipore 109843 non-toxic xylene substitute
Neo-Mount Merck Millipore 109016 permanent mounting medium
Microscopy
Axioskop 2 Carl Zeiss Microscopy
LSM 710 Carl Zeiss Microscopy

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kempermann, G., Jessberger, S., Steiner, B., Kronenberg, G. Milestones of neuronal development in the adult hippocampus. Trends Neurosci. 27, (8), 447-452 (2004).
  2. Ge, S., Sailor, K. A., Ming, G. L., Song, H. Synaptic integration and plasticity of new neurons in the adult hippocampus. J Physiol. 586, (16), 3759-3765 (2008).
  3. Ge, S., Yang, C. H., Hsu, K. S., Ming, G. L., Song, H. A critical period for enhanced synaptic plasticity in newly generated neurons of the adult brain. Neuron. 54, (4), 559-566 (2007).
  4. Castilla-Ortega, E., Pedraza, C., Estivill-Torrus, G., Santin, L. J. When is adult hippocampal neurogenesis necessary for learning? evidence from animal research. Rev Neurosci. 22, (3), 267-283 (2011).
  5. Deng, W., Aimone, J. B., Gage, F. H. New neurons and new memories: how does adult hippocampal neurogenesis affect learning and memory. Nat Rev Neurosci. 11, (5), 339-350 (2010).
  6. Encinas, J. M., Enikolopov, G. Identifying and quantitating neural stem and progenitor cells in the adult brain. Methods Cell Biol. 85, 243-272 (2008).
  7. Burns, K. A., Kuan, C. Y. Low doses of bromo- and iododeoxyuridine produce near-saturation labeling of adult proliferative populations in the dentate gyrus. Eur J Neurosci. 21, (3), 803-807 (2005).
  8. Cameron, H. A., McKay, R. D. Adult neurogenesis produces a large pool of new granule cells in the dentate gyrus. J Comp Neurol. 435, (4), 406-417 (2001).
  9. Vega, C. J., Peterson, D. A. Stem cell proliferative history in tissue revealed by temporal halogenated thymidine analog discrimination. Nat Methods. 2, (3), 167-169 (2005).
  10. Scholzen, T., Gerdes, J. The Ki-67 protein: from the known and the unknown. J Cell Physiol. 182, (3), 311-322 (2000).
  11. Brown, D. C., Gatter, K. C. Ki67 protein: the immaculate deception. Histopathology. 40, (1), 2-11 (2002).
  12. Yamaguchi, M., Saito, H., Suzuki, M., Mori, K. Visualization of neurogenesis in the central nervous system using nestin promoter-GFP transgenic mice. Neuroreport. 11, (9), 1991-1996 (2000).
  13. Kempermann, G., Kuhn, H. G., Gage, F. H. More hippocampal neurons in adult mice living in an enriched environment. Nature. 386, (6624), 493-495 (1997).
  14. Sicinski, P., et al. Cyclin D2 is an FSH-responsive gene involved in gonadal cell proliferation and oncogenesis. Nature. 384, (6608), 470-474 (1996).
  15. Ansorg, A., Witte, O. W., Urbach, A. Age-dependent kinetics of dentate gyrus neurogenesis in the absence of cyclin D2. BMC Neurosci. 13, 46 (2012).
  16. Taupin, P. BrdU immunohistochemistry for studying adult neurogenesis: paradigms, pitfalls, limitations, and validation. Brain Res Rev. 53, (1), 198-214 (2007).
  17. Lewis Carl, S. A., Gillete-Ferguson, I., Ferguson, D. G. An indirect immunofluorescence procedure for staining the same cryosection with two mouse monoclonal primary antibodies. J Histochem Cytochem. 41, (8), 1273-1278 (1993).
  18. Burry, R. W. Controls for immunocytochemistry: an update. J Histochem Cytochem. 59, (1), 6-12 (2011).
  19. Tuttle, A. H., et al. Immunofluorescent detection of two thymidine analogues (CldU and IdU) in primary tissue. J Vis Exp. (46), 6-12 (2010).
  20. Miller, R. T., Swanson, P. E., Wick, M. R. Fixation and epitope retrieval in diagnostic immunohistochemistry: a concise review with practical considerations. Appl Immunohistochem. Mol Morphol. 8, (3), 228-235 (2000).

Comments

1 Comment

  1. Dear authors, could you please specify what exactly TBSplus and TBS-T are made of?
    thanks
    Alex

    Reply
    Posted by: Alessandro F.
    July 22, 2019 - 6:55 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics