Мозаика данио рерио Трансгенез для функционального геномного анализа потенциальных совместных генов в опухолевых патогенеза

Developmental Biology
 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Ung, C. Y., Guo, F., Zhang, X., Zhu, Z., Zhu, S. Mosaic Zebrafish Transgenesis for Functional Genomic Analysis of Candidate Cooperative Genes in Tumor Pathogenesis. J. Vis. Exp. (97), e52567, doi:10.3791/52567 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Раки прогрессирующих заболеваний отмечены накоплением патологических мутаций, делеций и прибыли хромосом с течением времени. Эти генетические аномалии могут влиять несколько клеточные процессы, начиная от клеточного цикла, клеточной гибели, энергетический метаболизм и сборки цитоскелета, чтобы подчеркнуть реакции, такие как гипоксии. Таким образом, канцерогенез отражает коллективные действия нескольких генетических аберраций по всему спектру биологических процессов. Последние интегративные геномные научно-исследовательские работы, в том числе весь секвенирование генома, ExoME последовательности, направленной последовательности, глубокой последовательности и генома исследования ассоциации, определили рост числа новых генетических изменений во всех существу типов опухолей 1-4. Во многих случаях, генетические повреждения происходят вместе в неслучайной образом 5-8, что свидетельствует об их сотрудничество в патогенезе заболевания. Пройдя онкогенных роли большого массива аберрантно экспрессируются гены в результате Fрум эти геномные повреждения необходимо разработать новые терапевтические стратегии и понять ответов опухолевых клеток к этим агентам, но это оказалось сложной задачей, требующей очень надежные модели животных систем для проведения высокой пропускной функциональной геномного анализа в VIVO.

Хотя млекопитающие, особенно грызуны, являются предпочтительными модели в биологии рака, данио начал привлекать большое внимание. Костистых данио (Dario rerio) был использован в качестве модельного организма для изучения развития с 1960 года и впервые был применен к изучению патогенеза опухолей в 1982 году 9-11. Простота обслуживания, малого размера тела и высокой плодовитостью сделать данио надежную модель для крупномасштабных вперед генетических экранов для выявления мутаций, которые придают аномальные и патологические фенотипы 10. Оптической прозрачности данио эмбрионов Еще одной ключевой особенностью поддержку более широкого использования этой модели рака, аэто позволяет в естественных изображений, которые будут проводиться, чтобы найти развитие опухоли в режиме реального времени 9, приложение, которое довольно сложно грызунов 12. Недавний анализ сравнительной геномике данио референсный геном (Zv9) показал, 26206 белок-кодирующих генов, с 71% из них человека ортологи, из которых 82% соотнесены с генами, ассоциированных с заболеваниями в онлайн Законы Менделя в Man (OMIM) базы данных 13, 14. Следовательно, данио был использован для моделирования различных типов рака человека, в том числе 8 нейробластомы, Т-клеточный острый лимфобластный лейкоз (Т-ОЛЛ) 15,16, 17,18 меланомы, саркомы Юинга 19, рабдомиосаркома 20,21, карциномы поджелудочной железы 22, гепатоцеллюлярной карциномы 23 и миелоидный злокачественных опухолей 24,25, и была выбрана в качестве модели рака для ксенотрансплантации изучает 11,26.

Стабильный трансгенныхподход у рыбок данио часто используется для изучения влияния амплитудно-оф-функции генов в нормальном развитии или патогенеза заболевания 27,28. Для разработки такой модели (фиг.1А), один вводит конструкцию ДНК, содержащую ген интерес обусловлен тканеспецифического промотора в эмбрионы дикого типа один-клеток. Три-четыре месяца после инъекции, когда введенный эмбрионы достигают половой зрелости, они ауткроссной дикого типа рыбы для выявления тех, показывающих интеграции ДНК-конструкции в их зародышевой линии, которые лицензируются их как основателя рыбы. Многие факторы, такие как число копий и интеграции сайта трансгена, влияет на экспрессию трансгена в стабильных трансгенных линий. Таким образом, разработка трансгенного модели опухоли, несколько стабильных трансгенных линий экспрессирующих онкоген единого должны быть сгенерированы первым и подвергают скринингу на линии, экспрессирующих трансген на уровне, что может привести к индукции опухолей. Однако, если избыточная экспрессия кандидата Oncogene является токсичным для половых клеток, трудно генерировать стабильный трансгенной линии непосредственно с гиперэкспрессией трансген 29. Таким образом, этот подход может быть трудоемким, с высоким риском неудачи создать подходящую модель рака.

Здесь мы покажем альтернативную стратегию, основанную на мозаика переходный трансгенеза (рис 1б), что обеспечивает уникальные преимущества по сравнению с традиционными стабильной трансгенеза для функционального геномного исследования в естественных условиях. При таком подходе один или более трансгенные конструкты вводятся в стадии один-клеток трансгенных или дикого типа эмбрионов. Инъецированные конструкции ДНК, содержащие трансгены, то мозаично и случайным образом объединены в первичном впрыскиваемого рыбы, в результате чего смешанных генотипов в пределах нескольких клеточных популяций в отдельных рыб 30. Кроме того, совместной инъекции многократного ДНК-конструкций в эмбрионах один-клеток приводит к интеграции совместно в одной и той же клетке в случайных местах, позволяя один, чтобы TRAсе клетки с экспрессией трансгенов и исследовать взаимодействия различных генов во время патогенеза заболевания в мозаичных животных 31. В качестве доказательства принципе, мы временно сверхэкспрессируется мутационно активированный алк (F1174L) с гена-репортера mCherry в периферической симпатической нервной системы (PSNS) под контролем допамина бета-гидроксилазы (d βh), промотор дикого типа рыбы и трансгенных рыб с гиперэкспрессией MYCN. ALK, который кодирует рецептор тирозинкиназы, является наиболее часто мутированным геном в нейробластомы высокого риска 5-7,32,33. алк (F1174L), в качестве одного из наиболее частых и сильных соматических мутаций активации, является чрезмерно представлены в MYCN- усиливается пациентов нейробластомы высокого риска, а синергетический эффект с MYCN гиперэкспрессией ускорить нейробластомы туморогенез в обоих стабильных трансгенных мышей и трансгенных данио моделей 8,34,35. По мозаикипереходный сверхэкспрессия алк (F1174L) с mCherry в MYCN трансгенной рыбы, мы воспроизводятся ускорение начала опухоли наблюдалось в стабильной гиперэкспрессией трансгенных рыб как алк (F1174L) и MYCN, предполагая, что мозаики стратегия трансгенез могут быть использованы, чтобы быстро и эффективно оценить относительный вклад нескольких онкогенов в инициации опухоли в естественных условиях.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Все данио исследования и содержанием животных были проведены в соответствии с Mayo Clinic Институт IACUC утвержденных протокол № A41213.

1. ДНК-конструкции для Трансгенез

  1. Амплификации 5,2 т.п.н. допамина бета-гидроксилазы (d βh) промоторной области 8 с помощью клона CH211-270H11 ВАС (от BacPac ресурсов центра (BPRC)) в качестве матричной ДНК. Используйте соответствующей системы ПЦР для длительного и точного ПЦР-амплификации длинных ДНК-матриц и следующие программы цикла для ПЦР: 94 ° С в течение 2 мин, 10 циклов (94 ° С, 15 сек, 50 ° С, 30 сек, 68 ° С, 8 мин), а затем 30 циклов (94 ° С, 15 сек, 53 ° С, 30 сек, 68 ° C, 8 мин), 68 ° С, 4 мин (прямой праймер 5'-GGGGACAACTTTGTATAGAAAAGTTGGCGTACTCCCCCTTTTTAGG-3 ' и обратный праймер 5'-GGGGACTGCTTTTTTGTACAAACTTGTGTTGCTTTGTCGTCTTTTGA-3 ').
  2. Создайте D βh -pDONRP4-P1R входа CLONE 8 с использованием коммерческого рекомбинантного клонирование системы, такие как многосайтовой шлюз. Смешайте 1 мкл очищенного dβh продукта ПЦР (172 нг / мкл), 1 мкл (150 нг / мкл) pDONRP4-P1R доноров вектора (вместе с другими векторы шлюз щедрые подарки от доктора Чи-Бин Chien, Univ. Юта) , 4 мкл ТЕ-буфера (рН 8,0) с 2 мкл ВР Clonase ферментной смеси, инкубирование в течение 1 ч при 25 ° С, а затем преобразовать в один выстрел TOP10 компетентный E. палочка в соответствии с протоколом производителя.
  3. Создание d βh: EGFP-MYCN трансгенных построить 8 с использованием рекомбинантного клонирование системы, упомянутые в шаге 1.2. Смешайте 1 мкл каждого входа клона (150 нг / мкл), включая 5,2-кб dβh промотора (dβh -pDONR P4-P1R конструкта), EGFP хватает стоп-кодон (PME-EGFP постройки), и человек MYCN кДНК (щедрый подарок от доктора Hogarty в детской больнице Пенсильвании, MYCN-pDONRP2R-P3 конструкция), 1 мкл (150 нг / мкл) модифицированного вектора назначения, содержащего сайты узнавания I-SCEI (щедрый подарок от д-ра К. Grabher, Технологического института Карлсруэ, Карлсруэ, Германия), 4 мкл ТЕ-буфера ( рН 8,0) с 2 мкл LR Clonase ферментной смеси, инкубирование в течение 1 ч при 25 ° С, а затем преобразовать к химически компетентную E. палочка, таких как Один выстрел топ-10 и следовал протоколу производителя.
  4. Сделать MITF: MITF трансгенных построить 8 расщеплением PNP-MITF вектор с NotI и SalI рестриктаз в течение 2 ч при комнатной температуре, и субклонированием выпущен 2,65 Кб (щедрый подарок от доктора Д. Raible, Univ Вашингтона). ДНК-фрагмент, содержащий промотор MITF и кодирующую последовательность гена данио Mitf в NotI и MluI участков модифицированной pBluescript вектора, содержащей фланкирующие сайты узнавания I-SCEI (щедрым подарком от д-ра Hui Feнг, Бостонский университет), используя ДНК-лигазы Т4 в соответствии с протоколом производителя.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для повышения эффективности генерации стабильных MYCN экспрессирующие линии, d βh: EGFP-MYCN и MITF:. MITF конструкции ДНК coinjected в эмбрионы этап перламутра одноклеточных Перламутр обозначает тип мутантного рыбы, лишенные нервного гребня полученных меланофоров в процессе развития 36. Таким образом, появление пигментных клеток в инъецированных эмбрионов предполагает включение MITF: MITF конструкции ДНК в геном. Было показано, что две или три coinjected конструкции ДНК могут быть коинтегрированы в геноме рыбы 31. Таким образом, пигментация, вызванные MITF выражения может служить маркером для интеграции dβh: EGFP-MYCN трансгена и для облегчения идентификации MYCN стабильной трансгенной линии.
  5. Смешайте D βh: EGFP-MYCN и MITF: MITF ДНКконструкции в соотношении 3: 1 в общем объеме реакции 15 мкл с 1 мкл I-SCEI фермента и 0,75 мкл буфера. Убедитесь, что общая сумма ДНК в реакции не превышает 750 нг.
  6. Провести пищеварение I-SCEI при комнатной температуре 4 ч или O / N. На второй день, Я-SceI- расщепляли ДНК готовы к микроинъекции или можно хранить при -20 ° С для инъекций в будущем. Хранить фермент I-SCEI при -80 ° С в небольших аликвот, чтобы сохранить свою эффективность фермента.
  7. Субклона человека ALKF1174L и ген ALK дикого типа из вектора pCDNA3 (щедрый подарок от доктора Георгия в Дана-Фарбер институт рака) 7 в EcoRI и NotI сайтов вектора pENTRY1A (щедрый подарок от д-ра К. Grabher, Технологический институт Карлсруэ, Карлсруэ, Германия) с использованием ДНК-лигазы Т4 в соответствии с протоколом производителя.
  8. Создайте D βh: ALKF1174L </ EM> или dβh: ALKWT трансгенные конструкции с использованием рекомбинантной системы, как указано в Протоколе 1.2. Короче говоря, объединить три клонов входа, dβh -pDONRP4-P1R, ALKF1174L- pENTRY1A (или ALKWT -pENTRY1A) и P3E-поли, в модифицированный вектор адресат, содержащий сайты узнавания I-SCEI (щедрый подарок от д-ра К. Grabher, Карлсруэ Технологический институт Карлсруэ, Германия), с использованием LR Clonase смеси ферментов, в соответствии с протоколом производителя.
  9. Смешайте d βh: ALKF1174L (или dβh: ALKWT) и dβh: mCherry ДНК-конструкции в соотношении 3: 1 и линеаризации их с I-SCEI фермента, как описано в протоколе 1,5-1,6.

2. Микроинъекция

  1. Используйте стеклянные микропипетки с диаметром 1,0 мм для всех инъекций 37. Оторвать наконечник из стекла микропипеток с лезвием бритвы перед инъекцией. Калибровка объем впрыска нагнетающимчисле H 2 O в каплю минерального масла. Измерьте диаметр полученных капель и регулировать давление microinjector (или длительность импульса давления), чтобы гарантировать, что объем впрыска составляет менее 10% от общего объема клеток из одной клетки стадии эмбрионов.
  2. Добавить еще 0,5 мкл свежей I-SCEI фермента (5 ед / мкл) в 5 мкл инъекционного раствора, содержащего ДНК-конструкций непосредственно перед впрыском повысить эффективность трансгенеза 38. Вводят 50-80 мкг линеаризованных конструкций ДНК в цитоплазму эмбрионов один-клеток стадии. Чтобы обеспечить успех инъекции, смешать образец с 0,25% фенола красного для визуализации. Если клетки становятся красными после инъекции, это означает, микроинъекции успешно. Для обеспечения высокой скорости успеха для создания трансгенных рыб, мы, как правило, вводят так много как 500 эмбрионов.
  3. Для создания трансгенных рыб, стабильно экспрессирующих MYCN, coinject линеаризованной D βh: EGFP-MycN и MITF: MITF конструкции ДНК (в соотношении 3: 1) в эмбрионы пигментации мутанта перламутра рыбок данио на стадии одной клетки. Выражение MITF служит в качестве репортера для интеграции трансгенных конструкций в рыбной генома.
  4. Для мозаики гиперэкспрессией ALK в дикого типа или MYCN трансгенных эмбрионов, совместно вводить линеаризованную D βh: ALK F1174L (или dβh: ALKWT) с dβh: mCherry ДНК-конструкции (в соотношении 3: 1) в одной ячейке эмбрионы в результате разведение F1 гетерозиготной TG (dβh: EGFP-MYCN) трансгенных рыб дикого типа AB рыбы. Таким образом, половина потомства являются трансгенными для MCYN и половина дикого типа.

3. Экран для стабильных или Мозаика трансгенных рыб

  1. Для повышения эффективности идентификации устойчивых MYCN экспрессирующие линий, обезболить, прежде всего, инъекционные эмбрионов перламутра с Tricaine (0,02%) вт дней 3-5 после оплодотворения и экрана для пигментации. Трансфер эмбрионов с пигментацией на новую чашку Петри со свежей яичной воды и поднять их до половой зрелости, для дальнейшего скрининга основателя рыбы, которые несут D βh: EGFP-MYCN трансген в зародышевых клетках.
  2. Чтобы определить его учредителями с передачи зародышевой линии EGFP-MYCN, скрещивания пигментированной F0 взрослых рыб дикого типа AB рыбы и экран для EGFP-положительных эмбрионов на 1-2 дней после оплодотворения для дальнейшего генотипирования. Поместите одну EGFP-положительных F1 эмбриона в ПЦР-пробирку и удалить всю жидкость. Добавить 50 мкл GDNA буфера для экстракции, который содержит 12,5 мкл 4х буфера для лизиса, 35 мкл H 2 O и 2,5 мкл протеиназы К (10 мг / мл), одного эмбриона. Инкубируют реакционную смесь в течение 2-3 ч при 55 ° С, а затем 10 мин инкубации при 98ºC для инактивации протеиназы К. Для 50 мл буфера для лизиса 4x, добавить 500 мкл 1 М Трис (рН 8,4), 2,5 мл 1М KCl тО 47 мл H 2 O. ПРИМЕЧАНИЕ: После F0 MYCN стабильной трансгенных рыб разводят дикого типа AB рыбы, все потомство пигментированные. Таким образом, пигментация не может служить маркером для идентификации MYCN- положительного рыбы. В то время как в трансгенных рыб MYCN, EGFP-MYCN слитый белок экспрессируется в сети PSN, в том числе симпатических нейронов в верхних шейных ганглиев и последовательного сегментной ганглии симпатической цепочки и не-PSNS дофаминергических нейронов, таких как продолговатого мозга и черепной ганглии 8. Таким образом, выражение EGFP может служить маркером для идентификации MYCN стабильных трансгенных эмбрионов.
  3. Используйте 2 мкл гДНК, извлеченные из окрашенного эмбриона F1 в качестве матрицы, праймеры MYCN -test F1: 5'-CTG СТТ GAG AAC GAG CTG TG-3 '; MYCN -R3: 5'-AGG CAT ВКТ ТТГ AGG УВД AG-3 ', и следующая программа остроумиеч ГХ-RICH PCR System: 1 цикл 95 ° С в течение 3 мин, 25 циклов при 95 ° С в течение 30 сек, 58 ° C в течение 30 сек и 72 ° С в течение 3 мин. Как правило, мы генотипу 14-16 пигментные эмбрионов из одной спаривания, чтобы подтвердить наличие интегрированного MYCN трансгена в пигментных эмбрионов, более чем на 6 основатель рыба с гиперэкспрессией MITF и MYCN были определены с помощью этого метода.
  4. Поднимите оставшуюся часть эмбрионов F1 EGFP-положительные. Ребро ролик и генотип их на 2-3-месячного возраста с использованием вышеуказанного протокола для дальнейшего подтверждения интеграции трансгена в MYCN рыбы. Порода F1 MYCN стабильной трансгенных рыб дикого типа AB рыбы. Co-инъекции линеаризованному D βh: ALK F1174L (или dβh: ALKWT) с dβh: mCherry ДНК-конструкции в одноклеточных зародышей, как описано в протоколе 2.4.
  5. Сортировать MYCN экспрессирующие эмбрионов в эксперименте, описанном в протоколе 2,4 с помощью стереоскопического Fluorфлуоресценцию микроскоп, откроется окно, прежде всего, инъекционные эмбрионов в дни 1-3 после оплодотворения для выражения EGFP-MYCN в сети PSN. Затем, в течение дней 2-5 после оплодотворения, анестезию эмбрионов с Tricaine (0,02%) и сортировать эти MYCN- положительные или отрицательные эмбрионы раз на основе экспрессии mCherry в PSNS с использованием флуоресцентного микроскопа стереоскопического. Выражение mCherry служит в качестве маркера для коэкспрессии ALK в тканях мозаика первичной инъекции животных.
    ПРИМЕЧАНИЕ: ~ 600 потомство в результате селекции MYCN стабильной трансгенных рыб дикого типа рыбы вводили в группе из линеаризованных конструкций ДНК, в том числе г βh: ALK F1174L и dβh: mCherry, dβh: ALKWT и dβh: mCherry или dβh : mCherry один, соответственно. Мозаика выражение mCherry можно наблюдать в 70-90% от введенного в первую очередь рыбы. Половина до однойтретий введенного рыбы выжили через стадии личинки на опухоли часов.
  6. Поднимите все mCherry + MYCN + и mCherry + MYCN - эмбрионы в соответствии со стандартными протоколами от рыбок данио книги 39 и следить за опухоли начало, начиная с 5 недель после оплодотворения.

4. Опухоль Часы в мозаичных трансгенных рыб

  1. Монитор mCherry- положительный первую очередь вводят рыбу раз в 2 недели, начиная с 5 недель после оплодотворения доказательств опухоли начала.
  2. Обезболить рыбу с Tricaine (0,02%) и на экране на наличие mCherry - и EGFP экспрессирующие опухоли в сети PSN под Nikon СМЗ-1500 стереоскопическое флуоресцентного микроскопа, оснащенного цифровым взгляд DS-U1 камеры.
  3. Чтобы подтвердить, что опухоли выражают ли ALK трансген, изолировать mCherry- и EGFP-положительных масс для ALK генотипирования ПЦР.
  4. Использование ПЦР, усиливают геномной ДНКэкстрагируют из развитых опухолей со следующими праймерами: ALK P7: 5'-AGG CCA GGT CGG GTC ААТ ГХ-3 'и ALK P18: 5'-TGT CTT CAG GCT GAT GTT ГХ-3' и реакционную следующие ПЦР: 1 цикл 94 ° С в течение 5 мин, 30 циклов (94 ° C в течение 30 сек, 55 ° C в течение 30 сек и 72 ° С в течение 60 сек). Затем, последовательность ПЦР-продукт с ALK P7 грунтовки для дальнейшего подтверждения существования мутанта или дикого типа ALK в mCherry-позитивных опухолей.

Representative Results

Для исследования ли избыточная экспрессия мутационно активированного ALK F1174L или дикого типа ALK могли бы сотрудничать с MYCN индукции нейробластомы, мы сверхэкспрессируется либо активированного человеческого ALK или дикого типа человека ALK под контролем d βh промотора в сети PSN трансгенных рыб с гиперэкспрессией MYCN. Любой из следующих конструкций, dβh - ALKF1174L или dβh - ALKWT, были coinjected с dβh - mCherry в одну клетку дикого типа или MYCN трансгенных эмбрионов (Рисунок 2А) 8. Выражение mCherry служил в качестве маркера для коэкспрессии ALK в тканях мозаика первичной инъекции животных. Все ожидаемых генотипов были представлены в закачиваемой рыб: (1) MYCN экспрессирующие рыба с мозаичным коэкспрессии активированного ALKF1174L и mCherry MYCN экспрессирующие рыба с мозаичным коэкспрессии дикого типа ALK и mCherry, Места для MYCN; мозаики ALKWT; (3) MYCN экспрессирующие рыбу с мозаичным выражения mCherry, обозначенный MYCN; мозаика mCherry; (4) дикого типа рыбы с мозаичным коэкспрессии активированного ALKF1174L и mCherry, назначенного Вт; мозаики ALKmut; и (5) дикого типа рыбы с мозаичным коэкспрессии дикого типа ALK и mCherry, назначенного WT; мозаика ALKWT. Часы опухоль, то выполняется каждые 2 недели от 5 недель после оплодотворения (WPF), на общую сумму 492 вводили животным.

Восемь GFP + / mCherry + опухолей возник в интерреналовой железы, человеческий надпочечников эквивалент, по 9 WPF в MYCN экспрессирующие рыбы coinjected с d βh - ALKF1174 L и dβh - mCherry (рис 2B и 3). Эти опухоли были histoloчески, иммуногистохимическое и ультраструктурному сравнима с человеческой нейробластомы (данные могут быть найдены в справочнике 8). В отличие от опухоли не обнаружено не было на 9-недельного возраста в MYCN экспрессирующие рыбы coinjected с dβh - ALKWT и dβh - mCherry (рис 2С и 3, р = 0,002) или вводят dβh - mCherry в одиночку (рис 2D и 3, р = 0,007). Опухоли возникали как в MYCN; мозаика ALKWT и MYCN; мозаика mCherry рыба с той же скоростью индукции после 12-недельного возраста. Кроме того, нейробластомы не были обнаружены в любой дикого типа рыбы coinjected либо дикого типа и ALK mCherry или ALKF1174L и mCherry трансгенов в течение 15 недель мониторинга. Взятые вместе, эти результаты показывают, что мозаика избыточная экспрессия мутационно активированного ALK ускоряет MYCN индуцированной опухоли Onset, независимо от сайта интеграции в отдельных мозаичных животных, и что избыточная экспрессия дикого типа ALK на уровнях, приводимых в действие dβh промоутер, кажется, не сотрудничать с MYCN гиперэкспрессией, чтобы вызвать нейробластомы в этой модели системы.

Рисунок 1
Рисунок 1: Схема контур обычной стабильной и мозаичных переходных данио трансгенных стратегий в исследовании кооперативных взносов кандидата в онкогены к туморогенезу () Стабильный трансгенных стратегия.. Линеаризованная трансгенной ДНК-конструкцию, содержащую кандидат онкогена вводят в стадии один-клеток дикого типа или перламутра мутантных эмбрионов данио рерио, где трансген может быть интегрирован в геном рыбы наугад геномной локусов. Интегрирование трансгена в зародышевых клеток требуется для Generatioп стабильной трансгенной линии. В первую очередь вводили эмбрионы занять от 3 ​​до 4 месяцев для достижения половой зрелости (F0 поколения рыбы), которые будут ауткроссной с дикого типа или перламутра мутанта рыб для выявления основателя рыбы с передачей трансген зародышевой линии. Полученный отпрыск основателя рыбы, называется F1 поколения, несут гетерозиготных аллелей трансгена в геном. Для оценки совместных эффекты двух кандидатов онкогенов, таких как ген "а" и ген "B", в туморогенеза, мы скрестил F1 потомство двух стабильных трансгенных линий с гиперэкспрессией эти трансгены, только четверть потомства, несущих сложные трансгенов. Из-за относительно низкой эффективности генерации стабильных трансгенных линий, этот подход не представляется возможным для высокой пропускной функциональных геномных анализов. (B) Мозаика переходный трансгенных стратегия. Как и в стабильной трансгенеза, линеаризованной трансгенная со ДНК nstructs, содержащие гены-кандидаты могут быть введены в эмбрионы дикого типа Stage One-клеток. Поскольку трансген не должны быть интегрированы в геном половых клеток, много времени и усилий могут быть сохранены в процессе определения Основатель рыбы. Кроме того, если трансгенные линии рыба с гиперэкспрессией один из кандидатов онкогенов доступны (в нашем случае, MYCN трансгенных рыб были разработаны), линеаризованных трансгенные конструкции ДНК, содержащие другие гены-кандидаты могут быть введены в эмбрионы этап трансгенных одноклеточных изучить их сотрудничество в канцерогенез. До трех трансгенных конструкций может быть coinjected и коэкспрессируются в первую очередь введенного рыбы 31; Таким образом, взаимодействие кандидатов онкогенов в туморогенеза может быть оценена в первую очередь введенного рыбы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

"SRC =" / файлы / ftp_upload / 52567 / 52567fig2.jpg "/>
Рисунок 2: Мозаика Выражение активированного ALK Ускоряет Возникновение MYCN индуцированной нейробластомы 8 Модифицированный фигуру с разрешения Elsevier (ссылка 3466510609819).. () Подход для построения мозаики трансгенеза. (BF) 2-дневных личинок, прежде всего, введенных эмбрионов. Боковые виды стабильной экспрессии EGFP в дофаминергических нейронов, в том числе черепно-мозговой ганглиев (CG, наконечники стрел) в объединенных флюоресценции светлое изображений (верхние панели). Боковые виды мозаики выражения mCherry (нижние панели) в черепной ганглиев (CG, наконечники стрел), продолговатого (MO, стрелки). Некоторые эктопическая экспрессия mCherry наблюдается в не-PSNS и без дофаминергических нейронов. (G - K), 7-недельного возраста, прежде всего, вводили рыбы.(B, G) MYCN экспрессирующие рыба coinjected с d βh - ALKF1174L и dβh - mCherry строит (MYCN; мозаика ALKmut). EGFP - и mCherry -положительных опухоли возникали у 7 недель (белые пустые стрелки в г). (C, H) ​​MYCN экспрессирующие рыбу coinjected с dβh - ALKWT и dβh - mCherry конструкций (MYCN; мозаика ALKWT). (D, I) MYCN экспрессирующие рыбу вводят с dβh - mCherry построить в одиночку (MYCN; мозаика mCherry). (E, J) дикого типа (WT) рыбу coinjected с dβh - ALKF1174L и dβh - mCherry строит (WT; мозаика ALKmut). (F, K) дикого типа (WT) рыба coinjected с dβh - ALKWT и dβh - mCherRy конструкции (вес; мозаика ALKWT). Нейробластомы не наблюдалось в MYCN экспрессирующие рыбу coinjected с dβh-ALKWT и dβh - mCherry или dβh - mCherry в одиночестве 7 WPF, или в любом из братьев и сестер, которые не наследуют MYCN трансген и вводили либо гена ALKWT или Ген ALKF1174L. Шкала баров, 100 мкм B - F и 1 мм в G - K. Nikon СМЗ-1500 стереоскопическое флуоресцентный микроскоп оснащен цифровым взгляд DS-U1 камеры и Leica MZ10F стереоскопического флуоресцентный микроскоп оснащен цифровой камерой Leica DFC 345FX были использованы для захвата флуоресцентные images.The полученные изображения были обработаны и скомпилированы с Adobe Photoshop и Illustrator CS3 программное обеспечение (Adobe). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версиюиз этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3: Начало нейробластомы в MYCN трансгенных рыб или дикого типа (WT) Рыба, как Мозаика Coinjected с ДНК-конструкций. Печатается с разрешения Elsevier (ссылка 3466510609819) d βh - ALKF1174 L и dβh - mCherry (мозаика ALKmut);. Dβh - ALKWT и dβh - mCherry (мозаика ALKWT); или dβh - mCherry (мозаика mCherry) один 8. Разница между началом опухоли на 9 WPF в MYCN экспрессирующие рыбы coinjected с dβh - ALKF1174 L и dβh - mCherr у (MYCN; мозаики ALKmut) и что в соответствии MYCN coinjected с dβh - ALKWT dβh - mCherry (MYCN; мозаика ALKWT) или dβh - mCherry в одиночку (MYCN; мозаика mCherry) является значимым на р = 0,002 и р = 0,007, соответственно, на два-белохвоста точного критерия Фишера.

Discussion

В этом представительном исследовании мы использовали переходный соинжекцию и экспрессии, активированного ALK с геном-репортером mCherry в MYCN экспрессирующие трансгенных рыб, чтобы показать, что эти гены сотрудничать заметно ускорить начало нейробластомы, в соответствии с нашим предыдущим нахождения в соединение, стабильное трансгенных рыб coexpressing активированы ALK и MYCN 8. Эта мозаика трансгенной подход имеет несколько различных преимуществ по сравнению с обычным способом. Самое главное, это дает возможность быстрого рассмотрения последствий coexpressing кандидатов онкогенов в первую очередь вводили животным (F0 поколения) без необходимости стабильных трансгенных животных, таких как устранение чрезмерной затраты времени и труда, как правило, участвует в разведении и идентификации ALK экспрессирующие стабильным трансгенных рыб. Мы также исследовали влияние повышенной экспрессией дикого типа ALK, с или без MYCN надвыражение, о возбуждении опухоли. Результаты показывают, что переходный сверхэкспрессия дикого типа ALK в нашей модели рыбы не достаточно, чтобы инициировать образование опухолей нейробластомы, независимо от статуса MYCN онкогена. Было бы интересно попробовать себя в будущем ли переходный коэкспрессия как активированный ALK и MYCN в рыбе дикого типа может вызвать раннее начало туморогенеза в первую очередь введенного рыбы. Это исследование позволит более точно имитировать реальную контекст болезни, в которой соматические изменения обоих генов сосуществуют в подгруппе высокого риска нейробластомы пациентов 5.

Важным элементом дизайна мозаики переходного трансгенных стратегии является включение гена-репортера для совместной инъекции с любыми кандидатов онкогенов интересов, который помогает в скрининге для животных с успешной интеграции трансгенов среди первично введенных эмбрионов данио рерио и мониторинг положительного рыбы для TumoR возникновения и прогрессирования. Для повышения эффективности трансгенеза, мы применили meganuclease-опосредованной трансгенных подход I-SCEI, что значительно увеличивает равномерную промотора в зависимости от экспрессии трансгенов с 26% из главным вводили эмбрионов, не meganuclease до 76% введенных эмбрионов с meganuclease 38 , Хотя использование meganuclease-опосредованной трансгенных подхода I-SCEI повысила эффективность трансгенеза Примечательно, процент от введенного эмбрионов положительно для трансгенов до сих пор остается значительно ниже 100%. Таким образом, выражение coinjected гена-репортера может служить в качестве маркера для идентификации инъекционные эмбрионов с успешной интеграции кандидатов трансгенов перед дальнейшей мониторинга рыбы для начала опухолей. В отличие от этого, Tol2 транспозонов-опосредованной трансгенных подход стал популярным генетический инструмент в модельных позвоночных и успешно используется для трансгенеза, инсерционного мутагенеза, ген ловушкипинг, и усилитель захвата 40,41. Соинжекцию из Tol2 транспозонов с транспозазы мРНК в оплодотворенных эмбрионов может способствовать раннему события интеграции, повышает эффективность хромосомной интеграции и усиливает успешную передачу зародышевой линии трансгена 42. Тем не менее, из-за "вырезать и вставить" механизма транспозиции ДНК, одна копия трансгена интегрирован в хромосому на вставки локуса 42. Таким образом, coinjected гены-кандидаты, скорее всего, интегрированный по отдельности в рыбной генома на разных сайтах, что может привести к экспрессии генов-кандидатов в различных клетках и более сложное, переходных и мозаики паттерна экспрессии coinjected генов в первую очередь введенного рыбы.

В целом, данное исследование поддерживает дальнейшее использование мозаики трансгенеза как быстрое средство для оценки совместных, возможно, синергетический, отношения между несколькими онкогенов в высоком-гоroughput образом, задача, которую трудно встретить с другими моделями животных, в том числе грызунов. До сих пор эта стратегия успешно применяется также в трансгенных данио, чтобы идентифицировать гены, которые подавляют активированного RAS -индуцированное начало рабдомиосаркома 31 и изменения радиочувствительности MYC-индуцированной Т-клеток острого лимфобластного лейкоза 31. Кроме того, Лангенау др, 15 показали, что сочетание в подход-инжекции с теплового шока-индуцируемый трансгенного подхода может индуцировать экспрессию трансгена путем теплового шока в первую очередь впрыскиваемого рыбы, которые были бы очень полезны в изучении совместных роли онкогенов в опухолевых прогрессирование, так как позволяет экспрессию гена, чтобы быть включен после первичной опухоли устанавливается. Совсем недавно, Langenau и его коллеги разработали первый иммунитетом данио модель путем охвата ген RAG2 с инженерных цинка палец нуклеаз 43. Потеряфункцией RAG2 разрешается надежную и долгосрочную приживление многих тканях и раковых клеток 43, то преимущество, что может быть полезным в трансплантации гетерогенных раковые клетки, которые сверхэкспрессируют кандидатов трансгенов и оценки влияния мозаики экспрессии трансгена на самообновлению мощности, лечебный отзывы и темпы роста этих раковых клеток.

Наконец, мозаика трансгенез предлагает еще одну уникальную преимущество над стабильной трансгенеза. В стабильных трансгенных животных, трансгены интегрированы в геном каждой клетки в организме и наследственные из поколения в поколение 27. Тем не менее, многие раковые заболевания возникают из генетических изменений в соматических клетках, а не наследуемыми мутациями в зародышевых клетках 44. Таким образом, мозаики интеграции трансгена в первичной инъекции рыбу и смешанные генотипы в пределах клеток популяций отдельных мозаичных трансгенных рыб будет лучше повторять тысе соматические дефекты, обнаруженные у пациентов и позволит избежать искусственного позиционное эффект, вызванный одном месте вставки в стабильном трансгенной линии. С другой стороны, мозаицизм и небольшая популяция клеток со сверхэкспрессией трансгены в первую очередь впрыскиваемого рыбы делает механистического исследования сложнее.

Таким образом, мозаика трансгенной стратегия обеспечивает надежный инструмент для быстрого и эффективного оценке вклада кооперативного онкогенов в инициации и распространения опухоли. Это достижение, как ожидается, генерировать семенной информацию о взаимодействии между кандидатами онкогенов, которые срочно необходимо для дальнейшего продуктивного исследования онкогенных механизмов и путей и для разработки эффективной адресной терапии. Повышение эффективности коинтеграцию более трех coinjected конструкций ДНК откроет возможность для рассмотрения сложных взаимоотношений между одновременно выраженных мультигенных комбинаций в различных типах банкиССВ. Задачи на будущее будет изменить мозаики трансгенных стратегию для размещения каких-либо геномной или эпигенетические изменения, которые могли бы сыграть свою роль в опухолевый процесс, а не ограничить его использование мутаций, которые изменяют только белок-кодирующих или генов сверхэкспрессируются, приобрели или усиливается. Недавно улучшенные методы редактирования генома, такие как активатора транскрипции, как эффекторных нуклеаз (Таленс) 45 и кластерных регулярно interspaced коротких палиндромных повторов (CRISPR) / CRISPR-ассоциированный (CAS) систем 46, стали широко использоваться более быстро и эффективно изменить эндогенные гены в различных типах клеток и организмов 46. Такие методы позволят нам выполнять целевые, высокоэффективные модификации генома и экспрессии генов в данио модели системы и, чтобы лучше понять механизм (ы), лежащие в основе роли геномных или эпигенетических изменений в патогенезе опухолей. Это, в свою очередь, могут стимулировать йе развитие новых молекулярных терапии для целого ряда раковых заболеваний.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Expand Long Template PCR System  Roche Applied Science, IN 11681834001
pCR-TOPO vector  Invitrogen, CA 451641
T4 DNA ligase New England Biolabs, MA M0202M
Gateway LR Clonase II enzyme
Mix
Invitrogen, CA 11791-100
Gateway® BP Clonase® II enzyme mix Invitrogen, CA 11789-020
GC-RICH PCR System  Roche Applied Science, IN 12 140 306 001
Meganuclease I-SceI  New England Biolabs, MA R0694S
Nikon SMZ-1500 stereoscopic fluorescence microscope  Nikon, NY
Nikon digital sight DS-U1 camera Nikon, NY

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tenesa, A., Dunlop, M. G. New insights into the aetiology of colorectal cancer from genome-wide association studies. Nat Rev Genet. 10, (6), 353-358 (2009).
  2. Maher, B. Exome sequencing takes centre stage in cancer profiling. Nature. 459, (7244), 146-147 (2009).
  3. Meyerson, M., Gabriel, S., Getz, G. Advances in understanding cancer genomes through second-generation sequencing. Nat Rev Genet. 11, (10), 685-696 (2010).
  4. Chung, C. C., Chanock, S. J. Current status of genome-wide association studies in cancer. Hum Genet. 130, (1), 59-78 (2011).
  5. Mosse, Y. P., et al. Identification of ALK as a major familial neuroblastoma predisposition gene. Nature. 455, (7215), 930-935 (2008).
  6. Janoueix-Lerosey, I., et al. Somatic and germline activating mutations of the ALK kinase receptor in neuroblastoma. Nature. 455, (7215), 967-970 (2008).
  7. George, R. E., et al. Activating mutations in ALK provide a therapeutic target in neuroblastoma. Nature. 455, (7215), 975-978 (2008).
  8. Zhu, S., et al. Activated ALK Collaborates with MYCN in Neuroblastoma Pathogenesis. Cancer Cell. 21, (3), 362-373 (2012).
  9. White, R., Rose, K., Zon, L. Zebrafish cancer: the state of the art and the path forward. Nat Rev Cancer. 13, (9), 624-636 (2013).
  10. Amatruda, J. F., Patton, E. E. Genetic models of cancer in zebrafish. Int Rev Cell Mol Biol. 271, 1-34 (2008).
  11. Konantz, M., et al. Zebrafish xenografts as a tool for in vivo studies on human cancer. Ann N Y Acad Sci. 1266, 124-137 (2012).
  12. Ellenbroek, S. I., van Rheenen, J. Imaging hallmarks of cancer in living mice. Nat Rev Cancer. 14, (6), 406-418 (2014).
  13. Kettleborough, R. N., et al. A systematic genome-wide analysis of zebrafish protein-coding gene function. Nature. 496, (7446), 494-497 (2013).
  14. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496, (7446), 498-503 (2013).
  15. Langenau, D. M., et al. Myc-induced T cell leukemia in transgenic zebrafish. Science. 299, (5608), 887-890 (2003).
  16. Feng, H., et al. T-lymphoblastic lymphoma cells express high levels of BCL2, S1P1, and ICAM1, leading to a blockade of tumor cell intravasation. Cancer Cell. 18, (4), 353-366 (2010).
  17. Patton, E. E., et al. BRAF mutations are sufficient to promote nevi formation and cooperate with p53 in the genesis of melanoma. Current biology : CB. 15, (3), 249-254 (2005).
  18. Santoriello, C., Anelli, V., Alghisi, E., Mione, M. Highly penetrant melanoma in a zebrafish model is independent of ErbB3b signaling. Pigment Cell Melanoma Res. 25, (2), 287-289 (2012).
  19. Leacock, S. W., et al. A zebrafish transgenic model of Ewing's sarcoma reveals conserved mediators of EWS-FLI1 tumorigenesis. Dis Model Mech. 5, (1), 95-106 (2012).
  20. Le, X., et al. Heat shock-inducible Cre/Lox approaches to induce diverse types of tumors and hyperplasia in transgenic zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, (22), 9410-9415 (2007).
  21. Langenau, D. M., et al. Effects of RAS on the genesis of embryonal rhabdomyosarcoma. Genes & development. 21, (11), 1382-1395 (2007).
  22. Park, S. W., et al. Oncogenic KRAS induces progenitor cell expansion and malignant transformation in zebrafish exocrine pancreas. Gastroenterology. 134, (7), 2080-2090 (2008).
  23. Zheng, W., et al. Xmrk, kras and myc transgenic zebrafish liver cancer models share molecular signatures with subsets of human hepatocellular carcinoma. PLoS One. 9, (3), e91179 (2014).
  24. Forrester, A. M., et al. NUP98-HOXA9-transgenic zebrafish develop a myeloproliferative neoplasm and provide new insight into mechanisms of myeloid leukaemogenesis. British journal of haematology. 155, (2), 167-181 (2011).
  25. Alghisi, E., et al. Targeting oncogene expression to endothelial cells induces proliferation of the myelo-erythroid lineage by repressing the Notch pathway. Leukemia. 27, (11), 2229-2241 (2013).
  26. Veinotte, C. J., Dellaire, G., Berman, J. N. Hooking the big one: the potential of zebrafish xenotransplantation to reform cancer drug screening in the genomic era. Dis Model Mech. 7, (7), 745-754 (2014).
  27. Patton, E. E., Zon, L. I. The art and design of genetic screens: zebrafish. Nat Rev Genet. 2, (12), 956-966 (2001).
  28. Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8, (5), 353-367 (2007).
  29. Igoucheva, O., Alexeev, V., Yoon, K. Differential cellular responses to exogenous DNA in mammalian cells and its effect on oligonucleotide-directed gene modification. Gene Ther. 13, (3), 266-275 (2006).
  30. Koster, R. W., Fraser, S. E. Tracing transgene expression in living zebrafish embryos. Dev Biol. 233, (2), 329-346 (2001).
  31. Langenau, D. M., et al. Co-injection strategies to modify radiation sensitivity and tumor initiation in transgenic Zebrafish. Oncogene. 27, (30), 4242-4248 (2008).
  32. Chen, Y., et al. Oncogenic mutations of ALK kinase in neuroblastoma. Nature. 455, (7215), 971-974 (2008).
  33. Pugh, T. J., et al. The genetic landscape of high-risk neuroblastoma. Nature genetics. (2013).
  34. Berry, T., et al. The ALK(F1174L) mutation potentiates the oncogenic activity of MYCN in neuroblastoma. Cancer Cell. 22, (1), 117-130 (2012).
  35. Heukamp, L. C., et al. Targeted expression of mutated ALK induces neuroblastoma in transgenic mice. Sci Transl Med. 4, (141), 141ra191 (2012).
  36. Lister, J. A., Robertson, C. P., Lepage, T., Johnson, S. L., Raible, D. W. nacre encodes a zebrafish microphthalmia-related protein that regulates neural-crest-derived pigment cell fate. Development. 126, (17), 3757-3767 (1999).
  37. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
  38. Thermes, V., et al. I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish. Mech Dev. 118, (1-2), 91-98 (2002).
  39. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203, (3), 253-310 (1995).
  40. Urasaki, A., Asakawa, K., Kawakami, K. Efficient transposition of the Tol2 transposable element from a single-copy donor in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, (50), 19827-19832 (2008).
  41. Caneparo, L., Pantazis, P., Dempsey, W., Fraser, S. E. Intercellular bridges in vertebrate gastrulation. PLoS One. 6, (5), e20230 (2011).
  42. Ivics, Z., Izsvak, Z. The expanding universe of transposon technologies for gene and cell engineering. Mob DNA. 1, (1), 25 (2010).
  43. Tang, Q., et al. Optimized cell transplantation using adult rag2 mutant zebrafish. Nat Methods. 11, (8), 821-824 (2014).
  44. Watson, I. R., Takahashi, K., Futreal, P. A., Chin, L. Emerging patterns of somatic mutations in cancer. Nat Rev Genet. 14, (10), 703-718 (2013).
  45. Sander, J. D., et al. Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs. Nat Biotechnol. 29, (8), 697-698 (2011).
  46. Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat Biotechnol. 32, (4), 347-355 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics