Mosaic Zebrafish Transgénese para Análise Funcional Genomic de candidatos Genes de cooperação em Tumor Patogênese

Developmental Biology
 

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Ung, C. Y., Guo, F., Zhang, X., Zhu, Z., Zhu, S. Mosaic Zebrafish Transgenesis for Functional Genomic Analysis of Candidate Cooperative Genes in Tumor Pathogenesis. J. Vis. Exp. (97), e52567, doi:10.3791/52567 (2015).

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Abstract

Introduction

Cancros são doenças progressivas marcados pela acumulação de mutações patológicas, exclusões e ganhos de cromossomos ao longo do tempo. Estas anormalidades genéticas pode afectar vários processos celulares que variam do ciclo celular, morte celular, no metabolismo energético e montagem do citoesqueleto de salientar as respostas, tais como a hipoxia. Assim, tumorigenesis reflete as ações coletivas de várias aberrações genéticas em toda uma gama de processos biológicos. Os recentes esforços de integração genômicas de investigação, incluindo a sequenciação do genoma inteiro, exome seqüenciamento, sequenciamento alvejado, o seqüenciamento de profundidade e estudos de associação do genoma, identificaram um número cada vez maior de alterações genéticas novos em praticamente todos os tipos de tumores 1-4. Em muitos casos, as lesões genéticas ocorrem em conjunto de uma maneira não aleatória 5-8, sugerindo a sua cooperação na patogénese da doença. Dissecando os papéis oncogênicos do grande variedade de genes expressos de maneira aberrante resultantes from essas lesões genômicas é necessário elaborar novas estratégias terapêuticas e para entender as respostas das células tumorais para esses agentes, mas isso provou ser uma tarefa difícil, que exige muito robustos sistemas de modelos animais para a realização de análise genômica funcional de alto rendimento em vivo.

Apesar de mamíferos, especialmente roedores, são modelos favorecidas em biologia do câncer, o peixe-zebra começou a atrair atenção considerável. O peixe-zebra teleósteos (Dario rerio) tem sido usada como um organismo modelo para o estudo do desenvolvimento desde os anos 1960 e foi aplicado em primeiro lugar ao estudo da patogénese do tumor, em 1982, 9-11. Facilidade de manutenção, tamanho pequeno corpo, e alta fecundidade fazer o peixe-zebra um modelo robusto para telas genéticos para a frente em larga escala para identificar mutações que conferem fenótipos anormais e patológicas 10. A transparência óptica de embriões de peixes-zebra é outra característica fundamental apoiar uma maior utilização deste modelo de câncer, comoele permite que in vivo de imagens a serem realizadas para localizar o desenvolvimento do tumor em tempo real, 9, um aplicativo que é relativamente difícil em roedores 12. Recente análise genômica comparativa do genoma de referência do peixe-zebra (Zv9) revelou 26.206 genes codificadores de proteínas, com 71% tendo ort�ogos humanos, dos quais 82% são correlacionados com genes associados à doença no Online mendeliana Herança em Man (OMIM) do banco de dados 13, 14. Por conseguinte, o peixe-zebra foi usado para modelar diversos tipos de cancros humanos, incluindo neuroblastoma 8, de células T aguda leucemia linfoblástica (T-ALL), 15,16, 17,18 melanoma, sarcoma de Ewing, 19, 20,21 rabdomiossarcoma, carcinoma pancreático 22, carcinoma hepatocelular e 23 mielóide malignidades 24,25, e foi selecionado como um modelo de câncer para o xenotransplante estuda 11,26.

A transgênico estávelabordagem no peixe-zebra é comumente utilizada para estudar o efeito de ganho-de-função de genes no desenvolvimento normal ou patogénese da doença 27,28. Para desenvolver tal um modelo (Figura 1A), um injecta uma construção de ADN contendo o gene de interesse accionado por um promotor específico de tecido para dentro de uma células de embriões de tipo selvagem. Três a quatro meses após a injeção, quando os embriões injetados atingir a maturidade sexual, eles são outcrossed com o tipo selvagem de peixe para a tela para os que apresentaram integração do DNA construir em sua linha germinativa, o que lhes licencia como fundador peixe. Muitos factores, tais como o número de cópias e sítio de integração do transgene, afectar a expressão do transgene em linhas transgénicas estáveis. Assim, para desenvolver um modelo de tumor transgénico, várias linhas transgénicas estáveis ​​que sobre-expressam um único oncogene tem que ser gerada em primeiro lugar e rastreados para a linha de expressar o transgene a um nível que pode levar à indução de tumores. No entanto, se a sobre-expressão de um candidato oncogene é tóxico para as células germinativas, que é difícil gerar uma linha estável por transgénico que sobre-expressam o transgene directamente 29. Assim, esta abordagem pode ser demorado, com um elevado risco de falha para gerar um modelo de cancro adequado.

Aqui, ilustramos uma estratégia alternativa com base na transgénese transiente mosaico (Figura 1B) que oferece vantagens únicas sobre a transgénese estável tradicional para estudo genómica funcional in vivo. Nesta abordagem, uma ou mais construções de transgenes são injectados no estádio de uma célula de embriões transgénicos ou de tipo selvagem. As construções de DNA injetado contendo transgenes são então mosaically e aleatoriamente integrado no peixes injetados primário, resultando em genótipos mistos dentro de populações de células em vários peixes individuais 30. Além disso, a co-injecção de ADN múltiplas construções de embriões unicelulares leva à co-integração na mesma célula em locais aleatórios, permitindo que um trace as células com expressão de transgenes e explorar as interações de diferentes genes durante a patogênese da doença nos animais mosaico 31. Como prova de princípio, nós transitoriamente superexpressado ALK mutacionalmente ativado (F1174L) com gene repórter mCherry no sistema nervoso simpático periférico (PSNS) sob o controle do hidroxilase dopamina beta (d βh) promotor de tipo selvagem e peixes transgênicos com superexpressão MYCN. ALK, que codifica um receptor da tirosina quinase, é o gene mais frequentemente mutado em alto risco neuroblastoma 5-7,32,33. ALK (F1174L), como uma das mutações somáticas ativadoras mais frequentes e mais potentes, é sobre-representados em MYCN- amplificado pacientes neuroblastoma de alto risco e sinergia com MYCN superexpressão para acelerar neuroblastoma tumorigenesis em ambos os ratinhos transgénicos estáveis ​​e modelos de peixes-zebra transgénicos 8,34,35. Por mosaicosobreexpressão transiente de ALK (F1174L) com mCherry nos peixes transgénicos MYCN, nós recapitulado a aceleração do aparecimento do tumor observada nos peixes transgénicos que sobre-expressam tanto estável ALK (F1174L) e MYCN, sugerindo que a estratégia de transgénese mosaico pode ser utilizado para rapidamente e eficientemente avaliar as contribuições relativas de vários oncogenes na iniciação do tumor in vivo.

Protocol

NOTA: Todos os estudos de peixe-zebra e manutenção dos animais foram feitas de acordo com a Mayo Clinic Institute IACUC-aprovado protocolo # A41213.

1. As construções de ADN para Transgénese

  1. Amplificar uma região do promotor de 5,2 kb da dopamina-beta-hidroxilase (d βh) 8, utilizando o clone de BAC CH211-270H11 (BacPac centro de recursos (BPRC)) como um molde de ADN. Usar um adequado sistema de PCR para a amplificação por PCR de comprimento e precisos de modelos longos de ADN e os seguintes programas do ciclo de PCR: 94 ° C durante 2 min, 10 ciclos de (94 ° C, 15 seg, 50 ° C, 30 seg, 68 ° C, 8 min), seguido por 30 ciclos de (94 ° C, 15 seg, 53 ° C, 30 seg, 68 ° C, 8 min), 68 ° C, 4 min (iniciador directo 5'-GGGGACAACTTTGTATAGAAAAGTTGGCGTACTCCCCCTTTTTAGG-3 ' e iniciador inverso 5'-GGGGACTGCTTTTTTGTACAAACTTGTGTTGCTTTGTCGTCTTTTGA-3 ').
  2. Crie o d βh -pDONRP4-P1r clo entradane 8, utilizando sistema de clonagem recombinante comercial, como a porta de entrada de vários sites. Misture 1 ml de dβh purificada produto de PCR (172 ng / mL), 1 ml (150 ng / mL) pDONRP4-P1r doador vector (juntamente com outros vetores de gateway são generosas doações de Dr. Chi-Bin Chien, Univ. De Utah) , 4 ul de tampão TE (pH 8,0) com 2 ul de mistura de enzimas BP clonase, incubar durante 1 hora a 25 ° C e, em seguida, transformar a One Shot TOP10 competente E. coli de acordo com o protocolo do fabricante.
  3. Gerar o d βh: transgênica EGFP-MYCN construir 8, utilizando sistema de clonagem recombinante mencionado na etapa 1.2. Misture 1 ml de cada clone de entrada (150 ng / L), incluindo um 5.2-kb dβh promotor (dβh -pDONR P4-P1r construção), EGFP faltando um códon de parada (PME-EGFP construção), e humano MYCN cDNA (uma oferta generosa do Dr. Hogarty no Hospital Infantil da Pennsylvania, MYCN-pDONRP2R-P3 construção), 1 ml (150 ng / mL) do vector destino modificado contendo sítios de reconhecimento I-SCEI (uma oferta generosa do Dr. C. Grabher, Karlsruhe Institute of Technology, Karlsruhe, Alemanha), 4 jul de tampão TE ( pH 8,0) com 2 ul de mistura de enzimas clonase LR, incubar durante 1 hora a 25 ° C e, em seguida, transformar a E. quimicamente competente coli, tais como Um tiro top 10 e seguir o protocolo do fabricante.
  4. Adicione MITF: transgénico MITF construir 8 por digestão do vector de PNP-MITF com NotI e SalI enzimas de restrição durante 2 h à temperatura ambiente, e o libertado por subclonagem 2.65-kb (uma generosa oferta do Dr. D. Raible, University of Washington). fragmento de ADN que contém o promotor MITF e a sequência de codificação do gene do peixe-zebra MITF nos locais de um vector pBluescript modificado contendo flanqueiam locais de reconhecimento de I-Scel NotI e MluI (uma oferta generosa do Dr. Hui Feng, Universidade de Boston), utilizando ADN-ligase de T4 de acordo com o protocolo do fabricante.
    NOTA: Para aumentar a eficiência das linhas geradoras MYCN -expressing estáveis, d βh: EGFP-MYCN eo MITF:. Construções de DNA MITF são co-injectado em uma das células de embriões em estágio de nácar Nacre designa um tipo de peixe mutante sem uma crista neural derivado melan�oro 36 durante o desenvolvimento. Assim, o aparecimento de células de pigmento em embriões injectados sugere a integração de MITF: ADN MITF construções no genoma. Demonstrou-se que dois ou três construções de ADN podem ser co-injectado cointegrados no genoma de peixe 31. Assim, a pigmentação causada pela expressão MITF pode servir como um marcador para a integração do dβh: transgene EGFP-MYCN e para facilitar a identificação de MYCN linhagem transgênica estável.
  5. Misturar o d βh: EGFP-MYCN e MITF: ADN MITFconstruções na proporção de 3: 1 num volume total de 15 ul de uma reacção com 1 ml de enzima I-Scel e 0,75 ul de tampão. Certifique-se que a quantidade total de DNA na reação não exceda 750 ng.
  6. Efectua-se a digestão I-Scel à TA durante 4 h ou O / N. No segundo dia, o I-SceI- ADNs digeridos estão prontos para microinjecção ou pode ser armazenado a -20 ° C durante a injecção no futuro. Armazenar a enzima I-Scel a -80 ° C em pequenas aliquotas para manter a eficácia da enzima.
  7. Subclonar o ALKF1174L humana e gene ALK-tipo selvagem do vetor pCDNA3 (a oferta generosa do Dr. George no Dana-Farber Cancer Institute) 7 em sites de um vetor pENTRY1A EcoRI e NotI (a oferta generosa do Dr. C. Grabher, Instituto de Tecnologia Karlsruhe, Karlsruhe, Alemanha), utilizando ADN-ligase de T4 de acordo com o protocolo do fabricante.
  8. Gerar o d βh: ALKF1174L </ Em> ou dβh: construções transgênicas ALKWT que utilizam o sistema recombinante, como mencionado no Protocolo 1.2. Resumidamente, combinar três clones de entrada, dβh -pDONRP4-P1r, ALKF1174L- pENTRY1A (ou ALKWT -pENTRY1A) e P3e-poli, no vector de destino modificado contendo sítios de reconhecimento I-SCEI (uma oferta generosa do Dr. C. Grabher, Karlsruhe Instituto de Tecnologia de Karlsruhe, Alemanha), utilizando LR clonase enzima Mix, de acordo com o protocolo do fabricante.
  9. Misture o d βh: ALKF1174L (ou dβh: ALKWT) e dβh: DNA mCherry constrói em uma proporção de 3: 1 e linearizar lhes com a enzima I-SCEI como descrito no Protocolo 1,5-1,6.

2. Microinjection

  1. Utilize micropipetas de vidro com 1,0 mm de diâmetro para todas as injecções 37. Quebre a ponta dos micropipetas de vidro com uma lâmina de barbear antes da injeção. Calibrar o volume de injeção por injeçãoing H 2 O em uma gota de óleo mineral. Medir o diâmetro das gotículas resultantes e ajustar o microinjector (pressão ou a duração do impulso de pressão) para garantir que o volume da injecção é inferior a 10% do volume total de células de uma célula de embriões de estágio.
  2. Adicionar mais 0,5 ul de fresco enzima I-Scel (5 unidades / ul) em 5 mL de solução de injecção contendo construções de ADN imediatamente antes da injecção para aumentar a eficiência da transgénese 38. Injectar 50-80 pg de construções de ADN linearizado no citoplasma de embriões de estádio de uma célula. Para garantir o sucesso da injeção, misturar a amostra com 0,25% de fenol vermelho para visualização. Se as células ficam vermelhos após a injecção, isso indica a microinjecção é bem sucedido. Para garantir uma elevada taxa de sucesso para a geração de peixes transgénicos, que normalmente injetar até 500 embriões.
  3. Para gerar peixes transgénicos que expressam estavelmente MYCN, coinject linearizado d βh: EGFP-MYCN e MITF: construções de ADN MITF (numa proporção de 3: 1) em embriões de peixe-zebra a pigmentação mutante nácar no estádio de uma célula. A expressão de MITF serve como repórter para a integração das construções transgênicas no genoma dos peixes.
  4. Para a sobre-expressão do mosaico da ALK na de tipo selvagem ou embriões transgénicos MYCN, co-injectar o linearizado d βh: ALK F1174L (ou dβh: ALKWT) com dβh: ADN mCherry constrói (numa proporção de 3: 1) para a célula de um embriões resultantes da criação de F1 heterozigotos Tg (dβh: EGFP-MYCN) peixes transgénicos com o tipo selvagem AB peixes. Assim, metade da prole é transgênica para MCYN e metade são do tipo selvagem.

3. Tela de Peixe Estável ou Mosaic Transgênicos

  1. Para aumentar a eficiência de identificação de linhas MYCN -expressing estáveis, anestesiar os embriões injectados nácar principalmente com tricaína (0,02%) det dias 3-5 de pós-fertilização e tela para a pigmentação. Transferir os embriões com pigmentação para uma nova placa de Petri com água ovo fresco e elevá-las a maturidade sexual para posterior triagem para o peixe fundador, que carregam o d βh: transgene EGFP-MYCN nas células germinativas.
  2. Para identificar o fundador com transmissão germinal de EGFP-MYCN, peixes F0 adulto pigmentada outcross com o tipo selvagem AB peixes e tela de embriões EGFP-positivo em 1-2 dias após a fertilização para posterior genotipagem. Coloque um único embrião F1 EGFP-positivo em um tubo de PCR e retirar todo o líquido. Adicionar 50 ul de tampão de extracção ADNg que contém 12,5 ul de tampão de lise 4x, 35 ul de H2O e 2,5 ul de proteinase K (10 mg / ml) para único embrião. Incubar a mistura reaccional durante 2-3 horas a 55 ° C, seguido de 10 min de incubação a 98 º C para inactivar a proteinase K. Para fazer 50 ml de tampão de lise 4x, adicionar 500 uL de Tris 1M (pH 8,4), 2,5 ml de 1M KCl tde o, 47 ml de H 2 O. NOTA: Depois de F0 MYCN peixes transgénicos estável são criados com o tipo selvagem AB peixe, todos os filhotes são pigmentadas. Assim, pigmentação não pode servir como marcador para a identificação de peixes MYCN- positivo. Enquanto nos peixes transgénicos MYCN, a proteína de fusão de EGFP-MYCN é expresso na PSNS, incluindo os neurónios simpáticos do gânglio cervical superior e segmentar sequencial gânglio da cadeia simpática e dos não-PSNs neurónios dopaminérgicos, tais como a medula oblonga e gânglios cranianos 8. Assim, a expressão da EGFP pode servir como um marcador para identificação dos embriões transgénicos estáveis ​​MYCN.
  3. Utilizar 2 ul de ADNg extraídos a partir do embrião F1 pigmentada como molde, iniciadores MYCN -test F1: 5'-CTG CTT AAC GAG GAG CTG TG-3 '; MYCN -R3: 5'-AGG CAT CGT AGG ATC TTG AG-3 'eo seguinte sagacidade programah, a GC-RICH sistema de PCR: 1 ciclo de 95 ° C durante 3 min, 25 ciclos de 95 ° C durante 30 seg, 58 ° C durante 30 segundos, e 72 ° C durante 3 min. Nós normalmente genotipar 14-16 embriões pigmentados a partir de um único acasalamento para confirmar a presença do transgene integrado em MYCN os embriões pigmentadas, mais do que 6 fundador peixe superexpressando MITF e MYCN foram identificados por este método.
  4. Levante-se o restante dos embriões F1 EGFP-positivo. Clipe Fin e do genótipo-los em 2-3 meses de idade utilizando o protocolo anterior para confirmar ainda mais a integração de MYCN transgene no peixe. Raça F1 MYCN peixes transgénicos estável com o tipo selvagem AB peixe. Co-injetar o d βh linearizado: ALK F1174L (ou dβh: ALKWT) com dβh: DNA mCherry constrói em embriões unicelulares como descrito no Protocolo 2.4.
  5. Ordenar o MYCN -expressing embriões no experimento descrito no Protocolo 2.4 usando um fluor estereoscópicoescence microscópio e examinar os embriões injetados principalmente nos dias 1-3 de pós-fertilização para a expressão de EGFP-MYCN no PSNS. Em seguida, durante 2-5 dias de pós-fertilização, anestesiar os embriões com tricaína (0,02%) e classificar os embriões MYCN- positivas ou negativas novamente com base na expressão de mCherry nas PSNS usando um microscópio estereoscópico de fluorescência. A expressão de mCherry serve como um marcador para a co-expressão da ALK em tecidos dos animais injectados primário mosaico.
    NOTA: ~ 600 prole resultante da criação de peixes transgénicos MYCN estável com o tipo selvagem de peixe por grupo foram injectados com as construções de ADN linearizado, incluindo d βh: ALK F1174L e dβh: mCherry, dβh: ALKWT e dβh: mCherry, ou dβh : mCherry sozinho, respectivamente. Mosaico de expressão mCherry pode ser observado em 70-90% dos peixes primeiramente injectado. Um meio para pontualterço dos peixes injetados sobreviveram através do estágio de larva para o relógio tumor.
  6. Levantar todo o mCherry + MYCN + e + mCherry MYCN - embriões de acordo com os protocolos padrão do livro zebrafish 39 e monitorar início tumor começando às 5 semanas pós-fertilização.

4. Tumor Watch em Mosaic Transgênicos Peixe

  1. Monitorar mCherry- positivo peixes injetados principalmente a cada 2 semanas a partir de 5 semanas pós-fertilização para a evidência de aparecimento de tumores.
  2. Anestesiar peixe com tricaina (0,02%) e tela para a presença de mCherry - e EGFP -expressing tumores nos PSNS sob a Nikon SMZ-1500 fluorescência estereoscópica microscópio equipado com uma mira a câmera digital da DS-U1.
  3. Para confirmar se os tumores que expressam o transgene são ALK, isolar o mCherry- e massas EGFP-ALK positivo para a genotipagem de PCR.
  4. Usando PCR, amplificar o ADN genómicoextraiu-se a partir de tumores desenvolvidos com os seguintes iniciadores: ALK P7: 5'-AGG GGT CCA CGG GTC AAT CG-3 'e ALK P18: 5'-TGT CTT CAG GAT GTT GCT GC-3' e a sequência de reacção de PCR: 1 ciclo de 94 ° C durante 5 min, 30 ciclos de (94 ° C durante 30 seg, 55 ° C durante 30 segundos, e 72 ° C durante 60 seg). Em seguida, a sequência do produto de PCR com o iniciador P7 ALK para confirmar ainda mais a existência de mutante ou de tipo selvagem ALK em tumores mCherry-positivos.

Representative Results

Para investigar se a sobre-expressão de F1174L ALK mutacionalmente activado ou de tipo selvagem ALK pode colaborar com MYCN na indução de neuroblastoma, que sobre-expressa ou activada humana ou ALK-ALK humano do tipo selvagem sob o controlo do promotor d βh no PSNS de peixes transgénicos que sobre-expressam MYCN. Qualquer uma das seguintes construções, dβh - ALKF1174L ou dβh - ALKWT, foram co-injectado com dβh - mCherry em uma célula do tipo selvagem ou embriões transgênicos MYCN (Figura 2A) 8. A expressão de mCherry serviu como um marcador para a co-expressão da ALK em tecidos dos animais injectados primário mosaico. Todos os genótipos esperados foram representados na peixes injetados: (1) MYCN -expressing peixe com coexpression mosaico de ALKF1174L ativado e mCherry MYCN -expressing peixe com coexpression mosaico de tipo selvagem ALK e mCherry, MYCN designado; mosaico ALKWT; (3) MYCN -expressing peixe com expressão mosaico de mCherry, designado MYCN; mosaico mCherry; (4) do tipo selvagem de peixe com coexpression mosaico de ALKF1174L ativado e mCherry, WT designado; mosaico ALKmut; e (5) do tipo selvagem de peixe com coexpression mosaico de tipo selvagem ALK e mCherry, designado WT; mosaico ALKWT. Um relógio de tumor foi então realizada cada 2 semanas 5 semanas de pós-fertilização (WPF) em um total de 492 animais injectados.

Oito GFP + / mCherry + tumores surgiram na glândula interrenal, o ser humano glândula adrenal equivalente, por 9 WPF no MYCN -expressing peixe co-injectado com d βh - ALKF1174 L e dβh - mCherry (Figuras 2B e 3). Estes tumores foram histolodos com fins, de forma imunohistoquímica, ultraestruturalmente e comparável à do neuroblastoma humano (dados podem ser encontrados na referência 8). Pelo contrário, não foram observados tumores por 9 semanas de idade no MYCN -expressing peixe co-injectado com dβh - ALKWT e dβh - mCherry (Figuras 2C e 3, p = 0,002) ou injectados com dβh - mCherry sozinho (Figuras 2D e 3, p = 0,007). Os tumores surgiram tanto no MYCN; mosaico ALKWT e MYCN; mosaico mCherry peixe com a mesma velocidade de indução após 12 semanas de idade. Além disso, neuroblastomas não foram detectadas em qualquer tipo selvagem peixe co-injectado ou com o tipo selvagem ALK e mCherry ou ALKF1174L e mCherry transgenes durante as 15 semanas de acompanhamento. Tomados em conjunto, estes resultados mostram que a superexpressão mosaico de ALK mutacionalmente ativado acelera o MYCN tumor induzidonset, independentemente do local de integração em animais mosaico individuais, e que a sobre-expressão do tipo selvagem ALK nos níveis conduzidos pelo promotor dβh não aparecem para colaborar com MYCN para induzir a superexpressão do neuroblastoma neste sistema modelo.

Figura 1
Figura 1: contorno esquemático de estratégias de peixe-zebra transitórios mosaico transgênicos no estudo das Contribuições Cooperativa de oncogenes candidatos para Tumorigênese estável convencional e (A) estratégia transgênica Estável.. Linearizado transgénico construção de ADN contendo oncogene candidato é injectado no estádio de uma célula de tipo selvagem ou mutantes de peixe-zebra embriões nácar onde o transgene pode ser integrado no genoma do peixe em loci genómico aleatório. Integração do transgene nas células germinais é necessário para a generation da linhagem transgênica estável. Principalmente embriões injetados levar de 3 a 4 meses para atingir a maturidade sexual (geração F0 de peixe), que será outcrossed com o tipo selvagem ou peixe mutante nácar para rastrear o peixe fundador com a transmissão transgene germinal. A prole resultante do fundador peixes, denominado a geração F1, realizar os alelos heterozigotos do transgene no seu genoma. Para avaliar os efeitos de colaboração dos dois candidatos oncogenes, como gene "a" e gene "b", em tumorigenesis, nós criados a progênie F1 de duas linhagens transgênicas estáveis ​​overexpressing estes transgenes, com apenas um quarto dos filhos que carregam os transgenes compostos. Devido à relativamente baixa eficiência de geração de linhagens transgênicas estáveis, esta abordagem não é viável para análises de genômica funcional de alto rendimento. Estratégia transgênica transitória (B) Mosaic. Semelhante à transgénese estável, linearizado co ADN transgénico nstructs contendo genes candidatos podem ser injectados no estádio de uma célula de embriões de tipo selvagem. Uma vez que o transgene não tem de ser integrado no genoma das células germinativas, muito tempo e esforço pode ser guardado no processo de identificar fundador peixe. Alternativamente, se a linha de peixes transgénicos overexpressing um dos oncogenes candidatos está disponível (em nosso caso, peixes transgénicos MYCN foram desenvolvidos), construções de DNA transgênicos linearizadas contendo outros genes candidatos pode ser injetado em um estágio de células de embriões transgênicos para estudar a sua cooperação em tumorigenesis. Até três construções de transgenes pode ser co-injectado e co-expressas no peixe primeiramente injectado 31; Assim, a interação dos oncogenes candidatos em tumorigenesis pode ser apreciada em peixes injetados principalmente. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: Mosaic Expressão da Contato ALK Acelera o início da MYCN induzida Neuroblastoma 8 Modificado figura com a permissão da Elsevier (referência 3466510609819).. (A) Abordagem para a construção de transgênese mosaico. (BF) 2 dias de idade, as larvas de embriões injectados principalmente. Vistas laterais de expressão EGFP estável nos neurônios dopaminérgicos, incluindo gânglios cranianos (GC, pontas de seta) em imagens de fluorescência-brightfield mescladas (painéis superiores). Vistas laterais de expressão mCherry mosaico (painéis inferiores) nos gânglios cranial (CG, pontas de seta), medula oblonga (MO, setas). Alguns expressão mCherry ectópica é observado na não-PSNS e neurônios não-dopaminérgicos. (G - K) 7 semanas de idade peixes injetados principalmente.(B, G) MYCN -expressing peixe co-injectado com d βh - ALKF1174L e dβh - mCherry constrói (MYCN; mosaico ALKmut). EGFP - e mCherry tumores -positivas surgiu em 7 semanas (setas brancas vazias em G). (C, H) ​​MYCN -expressing peixe co-injectado com dβh - ALKWT e dβh - mCherry constrói (MYCN; mosaico ALKWT). (D, I) MYCN -expressing peixes injetados com dβh - mCherry construir sozinho (MYCN; mosaico mCherry). (E, J) do tipo selvagem (WT) peixe co-injectado com dβh - ALKF1174L e dβh - mCherry constrói (WT; mosaico ALKmut). (F, K) do tipo selvagem (WT) peixe co-injectado com dβh - ALKWT e dβh - mCherconstruções ry (WT; mosaico ALKWT). Neuroblastomas não foram observados no MYCN -expressing peixe co-injectado com dβh-ALKWT e dβh - mCherry ou dβh - mCherry sozinho em 7 WPF, ou em qualquer um dos irmãos que não herdarão o transgene MYCN e foram injectados com o gene ou ALKWT o gene ALKF1174L. Barras de escala, 100 um de B - F e um milímetro em G - k. Um microscópio de fluorescência estereoscópico Nikon SMZ-1500 equipado com uma mira a câmera digital da DS-U1 e uma Leica MZ10F fluorescência estereoscópica microscópio equipado com uma câmera digital Leica DFC 345FX foram usadas para capturar o images.The fluorescente imagens adquiridas foram tratados e compilados com o Adobe Photoshop e Illustrator CS3 software (Adobe). Por favor, clique aqui para ver uma versão maiordesta figura.

Figura 3
Figura 3: O início da Neuroblastoma em MYCN transgénico de peixe ou de tipo selvagem (WT) Mosaicos peixes como co-injectado com as construções de DNA. Reproduzido com permissão da Elsevier (referência 3466510609819) d βh - ALKF1174 L e dβh - mCherry (mosaico ALKmut);. Dβh - ALKWT e dβh - mCherry (ALKWT mosaico); ou dβh - mCherry (mosaico mCherry) sozinho 8. A diferença entre o início do tumor por 9 WPF no MYCN -expressing peixe co-injectado com dβh - ALKF1174 L e dβh - mCherr y (MYCN; mosaico ALKmut) e que na linha MYCN co-injectado com dβh - ALKWT dβh - mCherry (MYCN; mosaico ALKWT) ou dβh - mCherry sozinho (MYCN; mosaico mCherry) é significativo a p = 0,002 e p = 0,007, respectivamente, por bicaudal teste exato de Fisher.

Discussion

Neste estudo representativo, foi utilizado co-injecção transiente e co-expressão de LFA activado com o gene repórter mCherry em MYCN -expressing peixes transgénicos para mostrar que estes genes cooperar para acelerar significativamente o aparecimento de neuroblastoma, consistente com a nossa verificação anterior no composto estável coexpress� peixes transgénicos tanto ALK e MYCN 8 activada. Esta abordagem transgénica mosaico possui várias vantagens distintas sobre o método convencional. Mais importante, ele permite examinar rapidamente os efeitos da co-expressam oncogenes candidatos em animais injectados principalmente geração (F0) sem o requisito de animais transgénicos estáveis, tais como a eliminação do excesso de tempo e de trabalho normalmente envolvida na criação e identificação de ALK -expressing estável peixes transgénicos. Também examinamos o efeito da superexpressão de tipo selvagem ALK, com ou sem MYCN sobreexpressão, na iniciação do tumor. Os resultados mostram que a sobreexpressão transitória de tipo selvagem ALK no nosso modelo de peixe não é suficiente para iniciar a tumorigénese do neuroblastoma, independentemente do estado do oncogene MYCN. Seria interessante para testar no futuro se a co-expressão transitória de ambos ALK ativado e MYCN no tipo selvagem de peixe poderia induzir início mais precoce de desenvolvimento de neoplasias no peixe primeiramente injectado. Este estudo seria mais fielmente imitar o âmbito real da doença, na qual alterações somáticas de ambos os genes co-ocorrem num subconjunto de pacientes de alto risco de neuroblastoma 5.

Um elemento importante da estratégia de transgênico transitória mosaico é a inclusão de um gene repórter coinjection com quaisquer oncogenes candidatos de interesse, o que ajuda no rastreamento de animais com integração bem sucedida dos transgenes entre os embriões de peixes-zebra injetados principalmente e para monitorar o peixe positivo para tumor início e progressão. Para aumentar a eficiência da transgénese, foi aplicado a abordagem transgénica I-Scel mediada por meganuclease, o que aumenta significativamente a expressão dependente de promotor uniforme de transgenes a partir de 26% dos embriões injectados principalmente sem meganuclease a 76% dos embriões injectados com 38 meganuclease . Embora o uso da abordagem transgénica mediada por meganuclease I-Scel melhorou a eficiência da transgénese notavelmente, a percentagem de embriões injectados positivamente para os transgenes ainda permanece muito inferior a 100%. Assim, a expressão de um gene repórter co-injectado pode servir como um marcador para identificar os embriões injectados com uma integração bem sucedida de transgenes candidatos antes monitorização ainda mais o peixe para o aparecimento de tumores. Em contraste, uma abordagem transgénica mediada por transposão Tol2 tornou-se uma ferramenta genética popular em vertebrados e modelo tem sido utilizado com sucesso para transgénese, mutagénese de inserção, armadilha de genesPing, e potenciador prendendo 40,41. Co-injecção de transposões Tol2 com ARNm da transposase em embriões fertilizados pode facilitar acontecimentos de integração precoce que aumenta a eficiência de integração cromossómica e potencializa a transmissão da linha germinativa do transgene bem sucedida 42. No entanto, devido ao mecanismo de "cut-and-paste" da transposição DNA, uma única cópia do transgene é integrado ao cromossomo por inserção lócus 42. Assim, os genes candidatos são co-injectado mais provável individualmente integrado no genoma do peixe em locais diferentes, o que poderia levar à expressão de genes candidatos em diferentes células e um padrão de expressão transiente e de mosaico mais complicado de genes co-injectado no peixe primeiramente injectado.

No geral, o estudo atual suporta o uso futuro da transgênese mosaico como um meio rápido para avaliar a colaboração, talvez sinérgica, as relações entre os vários oncogenes em um alto-throughput forma, um desafio que é difícil de se encontrar com outros modelos animais, incluindo roedores. Até o momento, esta estratégia também tem sido aplicado com sucesso em peixes-zebra transgénicos para identificar genes que suprimem o RAS iniciação induzida ativado de rabdomiossarcoma 31 e modificam a sensibilidade à radiação de células T induzida por MYC leucemia linfoblástica aguda 31. Além disso, Langenau et al, 15 demonstraram que a combinação co-injecção com a abordagem uma abordagem transgénica-choque de calor indutível pode induzir a expressão do transgene por choque térmico no peixe primeiramente injectado, o que seria muito útil para explorar as funções de cooperação de oncogenes em tumoral progressão, uma vez que permite a expressão do gene a ser ligado depois de o tumor primário é estabelecido. Muito recentemente, Langenau e seus colegas desenvolveram o primeiro modelo zebrafish imunocomprometidos, visando gene RAG2 com engenharia zinc-finger nucleases 43. Perdada função de enxerto RAG2 permitido robusto e de longo prazo de vários tecidos e células cancerosas 43, uma vantagem que pode ser útil no transplante das células cancerosas que sobre-expressam transgenes heterogéneos candidatos e avaliando o efeito da expressão do transgene em mosaico capacidade de auto-renovação, terapêutico respostas e a taxa de crescimento destas células cancerosas.

Finalmente, transgênese mosaico oferece outra vantagem única sobre transgenia estável. Em animais transgénicos estáveis, os transgenes são integradas no genoma de cada uma das células no corpo e são hereditárias de geração em geração 27. No entanto, muitos cancros surgem a partir de alterações genéticas em células somáticas, em vez de mutações hereditárias em células germinativas 44. Assim, o padrão de mosaico de integração do transgene na primária peixes injetados e os genótipos mistos dentro de populações de células de peixes transgênicos mosaico individuais seria melhor recapitulam the somáticos defeitos encontrados em pacientes e seria evitar o efeito de posicionamento artificial causado por um único local de inserção de uma linha transgénica estável. Por outro lado, a pequena população de mosaicismo e de células que sobre-expressam transgenes em peixes primeiramente injectado faz estudo mecanicista mais difícil.

Em resumo, a estratégia transgênica mosaico oferece uma ferramenta robusta para a avaliação rápida e eficaz da contribuição cooperativa de oncogenes a iniciação do tumor e se espalhar. Este avanço deve gerar informações seminal sobre a interação entre oncogenes candidatos, o que é urgentemente necessária para uma investigação mais aprofundada produtiva de mecanismos oncogênicos e vias e para o desenvolvimento de terapia-alvo eficaz. O aumento da eficiência da co-integração de mais de três construções de ADN co-injectado abriria a oportunidade para a análise das relações complexas entre diferentes multigênicas simultaneamente expressos em vários tipos de lataRCEs. Desafios para o futuro será a de modificar a estratégia transgênica mosaico para acomodar qualquer alteração genômica ou epigenética que pode desempenhar um papel no processo neoplásico, ao invés de limitar o seu uso a mutações que mudam apenas proteína codificante ou a genes são sobre-expressos, adquirida ou amplificado. Recentemente, a melhoria das técnicas de edição de genoma, tais como a transcrição nucleases ativador-like efetoras (TALENS) 45 e agrupados repete palindrômicas curtas regularmente intercaladas (CRISPR) / (CAS) sistemas associados a CRISPR 46, tornaram-se amplamente usado para mais rapidamente e de forma eficiente modificar endógena genes em diferentes tipos de células e organismos 46. Tais técnicas permitem-nos a realizar-alvo, modificações altamente eficientes de seqüência do genoma e expressão gênica no sistema modelo de peixe-zebra e para compreender melhor o mecanismo (s) subjacente ao papel das alterações genômicas ou epigenéticos na patogênese do tumor. Estes, por sua vez, tendem a estimular the desenvolvimento de terapias moleculares para uma variedade de cancros.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Expand Long Template PCR System  Roche Applied Science, IN 11681834001
pCR-TOPO vector  Invitrogen, CA 451641
T4 DNA ligase New England Biolabs, MA M0202M
Gateway LR Clonase II enzyme
Mix
Invitrogen, CA 11791-100
Gateway® BP Clonase® II enzyme mix Invitrogen, CA 11789-020
GC-RICH PCR System  Roche Applied Science, IN 12 140 306 001
Meganuclease I-SceI  New England Biolabs, MA R0694S
Nikon SMZ-1500 stereoscopic fluorescence microscope  Nikon, NY
Nikon digital sight DS-U1 camera Nikon, NY

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