Novel Atomic Force Microscopy Based Biopanning för Isolering av morfologi Särskilda reagenser mot TDP-43 varianter i amyotrofisk lateralskleros

1School for Engineering of Matter, Transport and Energy, Arizona State University, 2Department of Neurology, Georgetown University Medical Center, 3Department of Pathology, Georgetown University Medical Center
Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Williams, S. M., Venkataraman, L., Tian, H., Khan, G., Harris, B. T., Sierks, M. R. Novel Atomic Force Microscopy Based Biopanning for Isolation of Morphology Specific Reagents against TDP-43 Variants in Amyotrophic Lateral Sclerosis. J. Vis. Exp. (96), e52584, doi:10.3791/52584 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Eftersom proteinvarianter spelar avgörande roller i många sjukdomar inklusive TDP-43 i amyotrofisk lateralskleros (ALS), alfa-synuklein vid Parkinsons sjukdom och beta-amyloid och tau i Alzheimers sjukdom, är det oerhört viktigt att utveckla morfologi specifika reagens som selektivt kan rikta dessa sjukdomsspecifika proteinvarianter för att studera den roll som dessa varianter i sjukdomspatologi och för potentiella diagnostiska och terapeutiska tillämpningar. Vi har utvecklat nya atomkraftsmikroskopi (AFM) baserade biopanning tekniker som möjliggör isolering av reagens som selektivt känner igen sjukdomsspecifika proteinvarianter. Det finns två viktiga faser inblandade i processen, de negativa och positiva vaskfaserna. Under den negativa panorering fasen, är fager som är reaktiva till off-målantigener elimineras genom flera omgångar av subtraktiv vask utnyttjar en serie noggrant utvalda off-target antigener. En nyckelfunktion i den negativapanorering fasen utnyttjar AFM avbildning att övervaka processen och bekräfta att alla oönskade fagpartiklar avlägsnas. För den positiva vaskfasen målantigenen intressanta fast på en glimmer yta och bundna fager elueras och screenas för att identifiera fager som selektivt binder målantigenet. Målproteinet varianten behöver inte renas tillhandahålla lämpliga negativa vask kontroller har använts. Även målprotein varianter som är endast närvarande i mycket låga koncentrationer i komplexa biologiska material kan utnyttjas i positiv vasksteget. Genom tillämpning av denna teknik, förvärvade vi antikroppar mot proteinvarianter av TDP-43 som selektivt finns i human ALS hjärnvävnad. Vi förväntar oss att detta protokoll bör tillämpas på generera reagens som selektivt binder proteinvarianter som finns i ett stort antal olika biologiska processer och sjukdomar.

Introduction

Förekomsten av proteinvarianter har varit inblandad som en faktor i utvecklingen av många sjukdomar inklusive neurodegenerativa sjukdomar som Alzheimers, Parkinsons, ALS och frontotemporal demens (FTD) 1,2,3,4,5,6,7,8,9 , 10,11. Oligomera former av proteiner beta-amyloid och alfa-synuklein tros vara den giftiga arten ansvarar för Alzheimers och Parkinsons, respektive 2,3,4,5. Aggregat av TAR-DNA-bindande protein 43 (TDP-43) har varit kopplade till ALS och FTD 12,13,14. Reagenser Därför såsom antikroppar som selektivt kan rikta de olika proteinvarianter kan vara kraftfulla verktyg för att fungera som diagnostiska markörer och potentiella läkemedel. I denna studie har vi fokuserat på att utveckla reagens som selektivt binder varianter av TDP-43 protein inblandad i ALS, men tekniken beskrivs i detta dokument bör gälla för isolering av reagens mot ett brett spektrum av protein varianter.

Cytoplasmisk aggregering av TDP-43 har identifierats som en patologisk funktion i ALS 15,16,17,18,19. Typiskt TDP-43 finns i kärnan av alla celler från en normal individ, även om det tenderar att röra sig mellan cytosolen och kärnan 15,17. Men i ALS aggregerade former av TDP-43 detekteras i cytoplasman av utvalda nervceller och glia med lägre koncentrationer som finns i kärnan tyder rörelse TDP-43 från kärnan till cytoplasman under sjukdomsförloppet 16,20. Medan aggregering av TDP-43 återfinns i de flesta ALS-fallen, tar det inte hänsyn till alla fall sedan 1% -2% av de totala ALS fall (eller 15% -20% av familjära ALS-fallen) är kopplade till mutationer i superoxiddismutas 1 (SOD1) -genen 15,17. På grund av den viktiga roll som TDP-43 i de allra flesta ALS-fallen, här fokuserar vi på att utveckla antikroppsbaserade reagens som selektivt kan binda till TDP-43 varianter som ärnärvarande i human ALS hjärnvävnad utnyttja våra romanen AFM baserade biopanning tekniker.

Inledningsvis behöver vi en varierad repertoar av antikroppsbindande domäner. Vi kombinerade tre olika fagdisplay enda kedja variabel domän antikroppsfragment (scFv) bibliotek, (Tomlinson I och J och lakan biblioteken 21). Den panorering Processen är uppdelad i negativa och positiva vaskfaserna. Fager från biblioteken först utsätts för negativa panorering processen under vilken fagerna reaktiv till flera off-målantigener exkluderas. Efter slutförandet av varje omgång av negativ vask mot var off-målantigen, är processen övervakas av AFM avbildning för att säkerställa att all fagbindning off-målantigener har avlägsnats. Först efter att ha kontrollerat med AFM avbildning att alla reaktiva fager avlägsnas går vi vidare till nästa mål. Att isolera reagenser mot TDP-43 varianter inblandade i ALS vi utnyttjade följande negativa panorering antigener: 1) BSA för att avlägsna fag som binder svagt eller icke-specifikt till proteiner; 2) aggregerad alfa-synuklein att avlägsna fag som binder till generiska strukturella element av aggregerade proteiner; 3) mänskliga hjärnan vävnadshomogen att avlägsna fag som binder till alla proteiner eller andra komponenter som finns i obduktionsprover av friska människor hjärnvävnad; 4) immunoprecipiterade TDP-43 från friska mänskliga hjärnan att avlägsna fag som binder till alla TDP-43 former i samband med friska mänskliga hjärnan; och 5) immunoprecipiterade TDP-43 isolerad från FTD hjärnhomogenater att avlägsna fag som binder TDP-43 varianter associerade med icke-ALS patologi. Efter avlägsnande av all fag reaktiv till alla off-målantigener, sedan fortsatte vi till den positiva panorering under vilken antikroppsfragment som binder antigenet av intresse är isolerade, i detta fall TDP-43 immunoprecipiterade från human ALS hjärnvävnad. Dessa isolerade antikroppar kan vara reaktiv till aggregerade eller modifierade former av TDP-43.

"> Konventionell fag biopanning fokuserar främst på den positiva vaskfasen 22,23. Vanligtvis målet av intresse är immobiliserad, tillade fagbiblioteket och bundna fager elueras. Fagerna förstärks sedan och läggs till målet igen. Denna förstärkning och inkubation process brukar upprepas flera gånger för att öka andelen positiva bindande fag. Även variationer av denna process har använts i stor utsträckning för att isolera antikroppsreagens mot ett brett spektrum av målantigener, kräver de i allmänhet stora mängder renat målantigen 24,25,26, 27, medan vår process kräver endast spårmängder av målantigenet. Protokollet som beskrivs här kan användas för att isolera reagens som selektivt binder mål-antigener som är närvarande i mycket låga koncentrationer, utan behovet av rening, och panorering kan utföras direkt mot antigen närvarande i komplexa vävnadsprover. Användningen av uttömmande negativa vaskprotokoll som verifieratsfrån AFM garanterar att kloner isolerade mot den positiva antigenet selektivt bör binda målet även när de inte renas eller berikas.

Kasturirangan och kollegor (2003) har genomfört en liknande negativ och positiv biopanning process för att isolera antikroppar reaktiva till oligomerisk beta-amyloid använder nanogram koncentration av målet 5. Här vi expandera på denna process för att möjliggöra generering av reagens som selektivt binder sjukdomsspecifik protein varianter direkt från vävnadsprover mänskliga. I framtida studier avser vi att ytterligare undersöka inte bara det diagnostiska värdet av reagenserna isolerade här men också bedöma deras terapeutiska relevans för behandling ALS.

Sammantaget bör vår roman AFM baserade biopanning teknik tillämpas på isolering av någon sjukdom specifikt protein varianten i allt biologiskt material utan behov av proteinrening eller modifiering, även när målantigenen concentrations är extremt låga.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. fagproduktion

  1. Utför alla fag produktions- och biopanning processer i en biosäkerhet skåp. Producera fager partiklar från de olika biblioteken (Tomlinson I och J bibliotek och lakan biblioteks 21) för biopanning processen med hjälp av tillverkarens instruktioner (http://www.lifesciences.sourcebioscience.com/media/143421/tomlinsonij.pdf).
    OBS: Vi använder flera bibliotek i vår vaskprocess för att öka mångfalden av antikropparna som finns.
  2. I korthet är kulturbakterier lager av de tre biblioteken i 200 ml av 2 x YT innehållande 1% glukos och 100 ug / ml ampicillin på en skakapparat vid 37 ° C tills OD 600 0,4.
  3. Lägg 8 x 10 11 av KM13 hjälparfag till 200 ml av Tomlinson I- och J-bibliotek och 8 x 10 11 av VCSM13 hjälparfag till 200 ml av arken biblioteket. Inkubera biblioteks prover med hjälparfag för 30 min vid 37 ° C utan skakning.
  4. Centrifugerakulturer vid 3000 xg under 10 min och återsuspendera cellpelleten i 200 ml 2 x YT med 0,1% glukos, 100 ug / ml ampicillin och 50 | ig / ml kanamycin.
  5. Inkubera kulturer O / N vid 30 ° C under skakning och sedan spinna under 30 minuter vid 3300 xg följande dag.
  6. Lägg 50 ml polyetylenglykol (PEG) 8000 i 2,5 M NaCl till de 200 ml av supernatanten från vardera av biblioteken och inkubera på is under 1 h. Efter PEG-utfällning, snurra lösningarna igen under 30 min vid 3300 x g.
  7. Lägg 1-2 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS) till cellpelleten (beroende på storleken av pelleten) och överföring till mikrocentrifugrör.
  8. Inkubera fagpartiklar på is under 1 h vid 37 ° C med tillfällig blandning innan centrifugering under 10 min vid 11600 x g. Samla upp supernatanten och förvara vid -80 ° C.
  9. Före frysning, överföra en liten volym av fagpartiklarna från de tre biblioteken till en annan mikrocentrifugrör och titrera varje bibliotekindividuellt med TG1 celler för att bestämma koncentrationen. Nedan följer en beskrivning av titern process för ett bibliotek.
    1. Väx TG1-celler till OD 600 av 0,4. Lägg 990 l PBS till 6 mikrocentrifugrör.
    2. Till det första röret till 10 pl av fagpartiklarna. Efter blandning bort 10 pl från röret en och lägga till röret 2. Upprepa detta steg för de återstående fyra rören.
    3. Tillsätt 200 pl TG1 celler till 6 rör och tillsätt 10 ìl av var och en av de sex fag späd till dessa rör. Tillåt fagpartiklarna att infektera i 30 min utan skakning vid 37 ° C.
    4. Plate 100 pl av cellerna unto Luria-Bertani-agarplattor med 100 | ig / ml ampicillin (LBA). Inkubera O / N vid 37 ° C och sedan bestämma pfu / ml med hjälp av antalet synliga kolonier.

2. Negativ Biopanning Process

OBS: Undvik alltför många frysning upptining av fager hela biopanning processen. Ideally, är det bäst att genomföra så många av de negativa vask steg som möjligt på en dag. Efter slutförandet av rundor av negativ eller positiv panorering mot varandra inrikta det är viktigt att spara en del av fag i händelse av förorening vid varje steg.

  1. 12 rundor av Negative panorering mot bovint serumalbumin (BSA)
    1. Lägg 4 ml av 1 mg / ml BSA-lösning i PBS till 12 immunotubes och inkubera O / N vid 4 ° C.
    2. Kombinera 1 x 10 12 fagpartiklar från vardera av de tre biblioteken (avsätta en liten mängd av denna fag blandning för framtida verifiering av den negativa panorering processen).
    3. Kassera BSA-lösningen från det första röret och tvätta röret 2-3 gånger med PBS för att avlägsna eventuellt obundet BSA.
    4. Tillsätt de kombinerade fagbibliotek till detta första rör, inkubera under 30 min vid RT på rotator och samla de obundna fager.
    5. Upprepa steg 2.1.3 med den andra immunotube och lägg fag samlats från steg 2.1.4 till denna immunotube. Upprepa steg 2.1.4.
    6. Upprepa steg 2.1.3-2.1.4 med de återstående 10 tuber av BSA-lösning och den obundna fag samlas efter varje inkubation.
    7. För att verifiera avlägsnande av alla BSA fag bindemedel använder AFM. Lägg 10 pl av fagen från steg 2.1.2 och 10 ul av den återstående fag efter steg 2.1.7 separat till 10 pg / ml av BSA bundet till klyvs glimmer. En kort version av AFM processen beskrivs i avsnitt 8.
    8. Det är viktigt att spara en liten mängd fag efter avslutad de talrika omgångar av negativ vask mot varje mål för att kontrollera framgången med vaskprocessen.
  2. 10 rundor av Negative panorering mot olika former av alfa-synuklein
    OBS: I detta projekt vill vi ta bort fag som kunde binda andra aggregerade former av proteiner såsom alfa-synuklein (monomer, dimer, trimer, etc.) och så vi kommer att eliminera några av dessa fager (målet är att eliminera så många korsreaktiva fager som möjligt). Tillåt renat alfa-synuklein att aggregera i minst 7 dagar så att både monomera och oligomera former är närvarande negativa panorering.
    1. Förbered 4 immunotubes med 500 pg / ml av aggregerat alfa-synuklein i PBS och 4 immunotubes med 100 | ig / ml av aggregerat alfa-synuklein och inkubera O / N vid 4 ° C.
    2. Kassera lösningen från ett av rören med 500 | ig / ml aggregerat alfa-synuklein, tvätta med PBS och till fagbiblioteket uppsamlades efter de 12 omgångarna av negativ vask med BSA.
    3. Inkubera röret under 30 min vid RT på rotator och samla de obundna fager.
    4. Upprepa steg 2.2.3 och 2.2.4 för de återstående rören med 500 | ig / ml aggregerat alfa-synuklein och sedan rören med 100 | ig / ml av aggregerat alfa-synuklein med hjälp av obunden fag uppsamlades varje gång efter steg 2.2.4.
    5. Upprepa steg 2.1.8 med hjälp av fag efter den första av negativ vask mot 500 g / ml aggregerad alfa-synuclein och fagen efter den åttonde omgången av negativ vask mot 100 pg / ml av alfa-synuklein.
    6. För att eliminera alla negativa bindemedel mot alfa-synuklein förbereda två extra immunotubes med 500 pg / ml aggregerad alfa-synuklein och upprepa steg 2.2.2-2.2.4.
  3. 10 rundor av Negative panorering mot Friska Human Brain vävnadshomogenatet
    1. Lägg 1x STEN-buffert (50 mM Tris (pH 7,6), 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 0,2% NP-40, 0,2% BSA, 20 mM PMSF och proteas cocktail hämmare) mot human hjärnvävnad 28. Homogenisera vid 24000 rpm under 1 minut, centrifugera proverna vid 3000 rpm och supernatanten.
    2. Förbered två immunotubes med 2 ml av 50 ^ g / ml av human hjärnvävnad i PBS och 8 immunotubes med 10 | ig / ml av human hjärnvävnad och inkubera O / N vid 4 ° C.
    3. Upprepa steg 2.2.3-2.2.5 först med rören innehållande 50 | ig / ml av human hjärnvävnad och sedan med de som innehåller 10 ^ g / ml av human Bregn vävnad med hjälp av obundna fag samlats in efter det negativa panorering mot alfa-synuklein.
    4. Upprepa steg 2.1.8 med användning av fag efter den första av negativ vaskning mot 50 ug / ml av human hjärnvävnad och fagen efter den tionde omgången av negativ vask mot human hjärnvävnad.
  4. 8 rundor av Negative panorering mot Friska immunprecipiteras TDP-43
    1. Immunoutfälla friska TDP-43 protein från frisk mänsklig hjärnvävnad med hjälp av protokoll som beskrivs i avsnitt 9. På grund av lägre mängd immunoutfällt protein, utföra dessa rundor av negativ vask använder glimmer.
    2. Cleave åtta glimmerytor.
    3. Till den första glimmer lägga ~ 100 pl av 5 pg / ml av den immunoprecipiterade proteinet och inkubera i 5-10 min vid rumstemperatur.
    4. Tvätta glimmer 5 gånger med 0,1% PBS med Tween 20 (PBST).
    5. Lägg ~ 100 | il av fag efter den negativa panorering mot frisk hjärnvävnad och inkubera i 5-10 min vidRT.
    6. Vid halvvägs inkubation av steg 2.4.5, utföra steg 2.4.3 med hjälp av andra glimmer.
    7. Samla fag från steg 2.4.5 och tvätta glimmer 5 gånger med 0,1% PBST.
    8. Tvätta glimmer från steg 2.4.6 och lägga till fag från 2.4.7.
    9. Upprepa steg 2.4.4 till 2.4.9 tills fag negativt panoreras mot alla åtta glimmer med immunoprecipiterade proteinet. Upprepa steg 2.1.7 med hjälp av fag efter den första och åtta omgången av negativ vaskning.
  5. 2 rundor av Negative panorering mot FTD immunprecipiteras TDP-43
    1. Immunoprecipitera TDP-43 protein från hjärnan hos personer med FTD.
    2. Cleave två glimmerytor.
    3. Lägg 50 pl av 10 pg / ml av FTD TDP-43 till en glimmer. Inkubera under 5 min vid RT.
    4. Tvätta glimmer 5 gånger med 0,1% PBST.
    5. Lägg 50 pl av fag samlas efter negativ panorering mot friska TDP-43. Inkubera under fem minuter.
    6. Samla obundna fager.
    7. RepeATS steg 2.5.3 till 2.5.6 med den andra glimmer och den obundna fag samlas i 2.5.6.

3. Positiv panorering mot immunprecipiterades TDP-43 från Individer med ALS

  1. Immunoprecipitera TDP-43 protein från hjärnan hos personer med ALS. Cleave 3 glimmerytor. Lägg 50 pl av 10 pg / ml av ALS TDP-43 till en glimmer. Inkubera under 5 min vid RT. Tvätta glimmer 5 gånger med 0,1% PBST.
  2. Lägg 50 pl av fag samlas efter negativ panorering mot friska TDP-43 till glimmer. Inkubera under fem minuter.
  3. Samla obundna fager. Samlar också de bundna fager som använder tre elueringsmetoder. Det är viktigt att hålla alla insamlade fager i dessa panorering steg separata.
    1. Lägg först till 50 | il trypsin (1 mg / ml i PBS) till varje glimmer och inkubera under inte mer än 10 minuter. Samla lösningen och spara. Därefter tillsätt 50 | il av 100 mM trietylamin (TEA) till varje glimmer och inkubera under inte mer än 10 minuter. Collect lösningen, tillsätt lika volym 1 M Tris-HCl-buffert pH 7,4 och spara.
    2. För det tredje, tillsätt 50 pl av TG1 vid OD 600 av 0,4 direkt till glimmer och inkubera under 30 minuter vid 37 ° C. Lägg även till de fager som samlats in från de två elueringsmetoder i 3.3.1 till 100 pl TG1 vid OD 600 på 0,4 och inkubera i 30 minuter vid 37 ° C.
  4. Upprepa steg 3,1 med en andra glimmer.
  5. Ta den obundna fager samlas i 3.3.2. använda den första glimmer med ALS TDP-43 och lägga till den i andra glimmer med ALS TDP-43. Inkubera under fem minuter.
  6. Upprepa alla steg i 3,3 för dessa andra uppsättningar av glimmer.
  7. Kombinera de TG1-celler infekterade med fagerna som eluerats med trypsin från två ALS TDP-43 glimmer och plattan på LBA-plattor. Upprepa samma process för TEA och TG1 elueras fager från de två ALS TDP-43 glimmer för totalt tre plattor.
    OBS: På grund av TDP-43: s engagemang i både ALS och FTD, några av klonerna isolerade itvå omgångar av positiv vask mot ALS TDP-43 kan vara specifika för detta mål, men en del kan också binda FTD. För att bättre isolera ALS specifika kloner, ta den obundna fag samlas efter 2 omgångar av negativ vask mot FTD TDP-43 (eftersom dessa två omgångar av negativ vask borde ha tagit bort något mål som är reaktiv till FTD TDP-43) och använda dessa fager i ytterligare en runda av positiv vask mot ALS TDP-43 antigen på glimmer (förbereda ALS TDP-43 glimmer som beskrivs ovan i 3.3 och 3.4).
  8. Upprepa alla steg i 3,3 med denna tredje ALS glimmer och platta de infekterade TG1 celler på tre LBA plattor O / N vid 37 ° C. Nästa dag räkna antalet kolonier på de 6 LBA plattor med de potentiella ALS-kloner. Det bör finnas färre kolonier på de tre LBA plattor med de potentiella ALS kloner efter den tredje omgången av positiv vaskning jämfört med de tre LBA plattorna efter de två rundorna av positiv vaskning.

4. Odling och Fag Produktion av potentiella positiva kloner mot ALS Specifik TDP-43

  1. Väx varje koloni från de sex plattorna i 96-brunnars plattor innehållande 100 | il av 2 x YT med 1% glukos och 100 ug / ml ampicillin på en skakapparat vid 37 ° CO / N.
  2. Nästa dag överföra 10 | il från brunnarna innehållande kloner från de tre LBA plattorna efter den tredje omgången av positiv vask med ALS TDP-43 proteinet till mikrocentrifugrör innehållande 1 ml 2 x YT med 1% glukos och 100 ug / ml ampicillin .
  3. Lägg glycerol till alla kulturerna i 96-brunnsplattor till en slutlig koncentration av 15% och frysa plattorna vid -80 ° C. Låt 1 ml odlingar växa under 2-3 h under skakning vid 37 ° C.
  4. Lägg 10 9 av KM13 hjälparfag och tillåta hjälparfag för att infektera under 1 timme vid 37 ° C med skakning. Centrifugera cellerna under 10 min vid 3000 xg, kasta supernatanten och tillsätt 1 ml 2xYT med 0,1% glukos, 100 ug / ml ampicillin och 50 | ig / ml av Kanamycin.
  5. Kultur cellerna O / N vid 30 ° C med skakning. Centrifugera rören vid 3300 xg under 30 minuter, överför supernatanten till nya mikrocentrifugrör och tillsätt 250 | il PEG / NaCl till varje rör.
  6. Inkubera rören på is under en timme. Centrifugera rören igen vid 3300 xg under 30 minuter, kassera supernatanten och tillsätt 100 l PBS till varje rör.
  7. Inkubera rören på is under en timme. Snurra rören under 10 minuter vid 11.600 xg och överför supernatanten till nya rör. Förvara fagerna vid -80 ° C.

5. Sekvensering av potentiella ALS Clones

  1. Upprepa steg 4,2 och låt kulturer växa O / N vid 37 ° C med skakning. Nästa dag utför DNA-plasmid preps av klonerna enligt tillverkarens instruktioner. Sekvensera klonerna med hjälp av lämpliga framåt och bakåt primers.

6. Screening Potentiella positiva kloner mot ALS Specifik TDP-43 Använda Indirekt ELISA

  1. Lägg 100 pl av 2,5 pg / ml av ALS, FTD och frisk mänsklig hjärnvävnad till brunnarna i en hög bindande ELISA-platta för varje potentiell ALS klon. Inkubera plattorna vid 37 ° C under 1 h med långsam skakning.
  2. Tvätta plattorna 3 gånger med 0,1% PBST. Lägg 200 pl av 2% mjölkpulver i PBS till brunnen och inkubera plattorna vid 37 ° C under 1 h med långsam skakning.
  3. Upprepa tvättsteg och därefter lägga till 100 fil av varje fag utspäddes minst 1/100 i PBS till brunnarna. Efter inkubation och tvättstegen, tillsätt 100 | il av en / 1000 anti-M13 HRP till varje brunn. Tvätta plattorna och visualisera med hjälp av ELISA Femto kemiluminiscens substrat kit.

7. scFv Produktion och säkerhetskontroll med Indirekt ELISA

  1. Väx HB 2151 celler till OD 600 av 0,4. Lägg 5 pl av de olika fager till 20 pl av HB 2151-celler. Tillåt fagerna 30 min för att infektera vid 37 ° C utan skakning. Divide LBA plattor i energinäten såatt cirka 20 kloner kan pläteras på varje.
  2. Lägg 5-10 | il av varje fag infekterade bakterier till plattan och inkubera O / N vid 37 ° C. Nästa dag till individuella kolonier till en ml 2xYT med 0,1% glukos och 100 ug / ml ampicillin och skaka vid 37 ° C under 3-4 h tills OD 600 är 0,6.
  3. Lägg ett pl av 1 M isopropyltiogalaktosid (IPTG) till varje rör och inkubera O / N vid 30 ° C med skakning. Snurra rören vid 11.600 xg under 10 min och skörda supernatanten för ELISA-testning.
  4. För ELISA tester följer samma procedurer i avsnitt 6, utom i stället för fag i 6,5 lägga till scFv outspädda och för 6,6 lägga 100 l av 1 / 1,000 9E10 HRP.

8. AFM Process

  1. Lägg 10-20 pl av målantigenet till klyvs glimmer och inkubera i 5-10 min. Tvätta glimmer 5 gånger med vatten. Lägg 10-20 pl av fagerna till glimmer och inkubera i 5-10 min.
  2. Tvätta glimmer 5 gånger igen with vatten och tillåta glimmer lufttorka. Visualisera fagbindning använder AFM 1. Utför AFM avbildning processen med hjälp av AFM knacka läge med en Nanoscope IIIa controller i luft vid RT 29. De kisel AFM sonder har en resonansfrekvens på 300 kHz och en fjäderkonstant av 40 N / m. Använd en avsökningshastighet på 3,05 Hz och en skanningsupplösning på 512 prover / linje.
  3. Bearbeta bilderna från grundplattning av bakgrunden för att säkerställa att alla partikelstorlekar är jämförbara i varje bild. Fag Bredd (inte längden) kan variera från bild till bild på grund av andra partikelstorlekar och skanningsområdet, men det kommer aldrig att äventyra riktigheten i huruvida fag binder till antigenet.
  4. Om det under AFM verifikation för varje uppsättning negativa vask fager är synliga på glimmer, utföra additions rundor tills inga fager upptäcks innan du fortsätter till nästa uppsättning av negativ panorering.

9. Immunoutfällning av målantigenen

  1. Till plase målantigenet (TDP-43), tillsätt 250 | ig av att homogenisera hjärnvävnad (från motoriska cortex), 100 pl av 1/100 utspädning av anti-TDP 43 polyklonal antikropp och 1x STEN buffert till 700 | il total volym till ett Eppendorf röret 28.
  2. Inkubera O / N vid 4 ° C på en rotator. Tvätta A / G agarospärlor med 1x STEN buffert 2-3 gånger och tillsätt 25 ml till vävnaden blandningen. Inkubera vid 4 ° C under 1,5 h på en rotator och centrifugera sedan vid 2,000-4,000 rpm under 1 min.
  3. Avlägsna supernatanten och tvätta pelleten en gång med 1x STEN buffert och 5 gånger med PBS. Lägg 40-60 pl 1x STEN buffert till pelleten och koka i 5 minuter. Efter proverna är cool, centrifug och samla supernatanten. Använd SDS-PAGE och Western blotting för att kontrollera framgången med immunoprecipitation processen 30.

10. Dot Blot-analys

  1. Skär nitrocellulosa papper i små rektanglar för varje klon som kommer att testas. Dot 2 pl ALS, FTD och friska hjärnvävnadsprover unto nitrocellulosa papper och låt den torka helt.
  2. Lägg 1-2 ml 5% mjölkpulver i PBS och låt den skaka i en timme vid RT. Tillsätt 1 ml av 1/100 utspädning av varje fag och låt den skaka O / N vid 4 ° C. Tvätta membranet tre gånger under 10 min vardera med 0,5% PBST.
  3. Tillsätt 1 ml 1/1000-spädning av anti-M13-HRP och låt den skaka i en timme vid RT. Upprepa tvättproceduren och visualiserades med användning av Western kemiluminiscens lösning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I figur 1, demonstrerar den negativa panorering process genom vilken vi bort fagbindning ej åsyftade antigener från vårt bibliotek med hjälp immunotubes schemat. Vi ursprungligen började med BSA eftersom detta är en vanlig blockerande medel och varje fag som skulle reagera ospecifikt med detta mål skulle vara problematiskt i framtida immun. Nästa, vi bort bindemedel till aggregerad alfa-synuklein att eliminera fag som är reaktiva med generiska strukturer av aggregerade proteiner (dvs, en antikropp som skulle vara korsreaktiva för aggregerad alfa-synuklein, TDP-43, Abeta, etc.). AFM Resultaten visade fagbindning efter 1 omgång av negativ vask mot den aggregerade alfa-synuklein (Figur 2A) och ingen bindande efter 8 omgångar (Figur 2B). Vi sedan negativt panorerade mot frisk mänsklig hjärnvävnad för att avlägsna fagbindning de många antigener som finns i friska människor hjämhomogenat. Figur 2C (figur 2D). Eftersom mängden frisk och FTD immunoprecipiterade TDP-43 protein för panorering var låg, med hjälp av glimmer stället immunotubes utnyttjas mindre volym och därmed sänkt totalprotein som konsumeras (Figur 3). Efter åtta omgångar av negativ vask mot friska immunoprecipiterade TDP-43, var fag uppdelad. Halva fag kostnadsfördes två omgångar av negativ vask mot FTD TDP-43. Målet var att eliminera eventuella FTD TDP-43 reaktiva kloner (pga TDP-43: s engagemang i FTD), och samtidigt behålla eventuella ALS TDP-43 specifika kloner.

För den positiva panorering delen (Figur 4), vi anställda också glimmer som substrat för att minimera användningen av material. Vi använde den obundna fag efter FTD TDP-43 negativa panorering mot ALS TDP-43 för att förvärvaALS specifika kloner. Vi också positivt panorerade mot ALS TDP-43 två gånger i händelse av att vi inte fick kloner efter att ha använt den obundna fag från den negativa panorering mot FTD TDP-43. Efter hela panorering processen, våra tre elueringsmetoder gav 154 kloner från två positiva panorering mot ALS TDP-43 (kloner som kan vara reaktiv till ALS och FTD) och 45 potentiella ALS specifika kloner (med obunden fag från FTD TDP- 43 negativ panorering).

För att ytterligare minska de 45 potentiella ALS specifika kloner, är klonerna sekvens och endast klonerna utan några stoppkodoner ansågs vidare, med undantag för en klon som visade upp två gånger. Detta lämnade oss med 23 potentiella ALS specifika kloner. Efter beredning både fag och löslig scFv med dessa kloner, de testas i indirekta ELISA för specificitet till ALS vävnad. Nästan alla av de fager visade en preferens för ALS vävnaden över frisk vävnad (figur 5). Liknande resultat är obtained när man jämför fagbindning till ALS till FTD vävnad (Figur 6). För framtida studier är det viktigt att dessa kloner uttrycker höga utbyten av funktionella scFvs, så vi producerade små partier av de olika scFvs och genomfört liknande indirekta ELISA. Jämförelse av scFv bindning till ALS vävnad till både friska (figur 7) och FTD vävnad (Figur 8) igen visade selektiv bindning till ALS vävnad i nästan alla kloner.

Vi använde en annan immun (dot blöts) för att ytterligare kontrollera bindning till ALS vävnad och även för att utröna vilka kloner är reaktiva i andra immunologiska tillämpningar. Klon 2A bindning till ALS vävnad visas (Figur 9). Alla dessa kloner visade lovande resultat i endera eller båda av fagen och scFv-ELISA. Dessa resultat bekräftar att vår AFM baserad biopanning process är en mycket kraftfull teknik som kan användas för att generera reagens som selektivt binder sjukdomsspecifikt protein varimyror direkt från komplexa källor.

Figur 1
Figur 1. Negativ Biopanning process som utnyttjar Immunotubes. Schematisk demonstrerar den negativa biopanning processen. Fager som är reaktiva till proteiner såsom BSA, aggregerad alfa-synuklein och frisk hjärnvävnad avlägsnas med hjälp immunotubes. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2
Figur 2. Bekräftelse av negativa panorering Resultat. AFM avbildning används för att övervaka de negativa vask åtgärder mot de olika mål för att garantera alla reaktiva fager avlägsnas. Här visar vi några av de AFM resultaten som visarnivå fagbindning före och efter det negativa panorering. (A) Fag bindning kan detekteras till aggregerade alfa-synuklein partiklar efter den första omgången av negativ panorering, men (B) ingen fag är synliga efter 8 omgångar av negativ vask. (C ) Efter den första rundan av negativ vask mot frisk vävnad fagbindning är uppenbart, men (D) ingen bindning detekteras efter 10 omgångar av negativ panorering. Alla bilder är 5 pm. De stora vita strukturerna på AFM-bilder beror oftast på salter som finns i buffertar eller rest PEG från PEG-fällning steget under fagproduktion. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3. Negativ Biopanning Process Använda Mica. Schematisk demonstrera ytterligare negativ biopanning använder glimmer. På grund av det begränsade urvalet glimmer yta används för att först eliminera bindemedel till friska och sedan FTD immunoprecipiterade TDP-43. Innan du fortsätter till de två omgångarna av negativ vask mot FTD TDP-43, är den fag kluvna (i händelse av misslyckade isolering av ALS TDP-43 exklusiva fager under den positiva panorering fasen). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4
Figur 4. ALS Positiv Biopanning Process. Schematisk visar den positiva biopanning processen ALS. De obundna fager efter den negativa panorering mot FTD TDP-43 används i en runda av positiv vask mot ALS TDP-43 att eluera mer ALSTDP-43 specifika kloner. Dessutom är två omgångar av positiv vask mot ALS TDP-43 genomförs med hjälp av glimmer yta och de obundna fager efter negativ panorering mot friska immunoprecipiterade TDP-43 (de bundna fager elueras eftersom dessa fager inte ska binda friska TDP-43, men några kan vara korsreaktiv med både ALS och FTD). Tre elueringstider metoder används (trypsin, TEA och TG1 celler) för att säkerställa alla bundna fager avlägsnas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 5
Figur 5. Fag ELISA Screening av potentiella ALS Clones (ALS kontra HT). Använda homogeniserad human ALS, FTD och frisk hjärnvävnad (HT) prover vi utfört indirekt ELISA använder fag producerad från de olika kloner. Resultaten är representerade som förhållandet till friska vävnadsprover. Resultaten visade att vissa kloner skilja mellan TDP-43 finns i ALS-patienter och de i friska. ALS, FTD och HT vävnader är en blandning av hjärnprover (motor cortex) från tre individer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 6
Figur 6. Fag ELISA Screening av potentiella ALS Clones (ALS kontra FTD). Här visar vi de fag ELISA resultaten av ALS kontra FTD patienter. De flesta av klonerna har en förkärlek för ALS över FTD. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

_upload / 52.584 / 52584fig7highres.jpg "/>
Figur 7. scFv ELISA Screening av potentiella ALS Clones (ALS kontra HT). Använda scFvs framställda av varje klon vi kan konstatera kloner som har en förkärlek för TDP-43 från ALS-patienter över friska. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 8
Figur 8. scFv ELISA Screening av potentiella ALS Clones (ALS kontra FTD). Framgången för vårt vaskprocessen vidare visat när man jämför ALS till FTD för de olika scFv i de indirekta ELISA. Klicka här för att se en större version av denna siffra .

sätt "> Figur 9
Figur 9. Dot blot-analys av potentiella ALS kloner. Använda dotblot istället för ELISA är en annan teknik för att visa specificitet av klonerna för ALS över FTD eller HT. Klon 2A visas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Denna forskning stöds av ett bidrag från NIH: R21AG042066. Vi vill tacka Philip Schulz för hans insatser för att skapa de skärmdump videor.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tomlinson I and J Libraries MRC (Cambridge, England)
Sheets Library MRC (Cambridge, England)
2xYT BD Sciences 244020
Glucose Amresco 0188-2.5KG
Ampicillin Amresco 0339-25G Irritant
KM13 Helper Phage MRC (Cambridge, England)
Kanamycin OmniPur 5880 Irritant
Polyethylene Glycol 8000 OmniPur 6510 Irritant
Sodium Chloride Macron 7647-14-5
Sodium Phosphate Dibasic Amresco 0404-1KG Irritant
Potassium Chloride EMD PX1405-1 Irritant
Potassium Phosphate Monobasic Amresco 0781-500G Irritant
TG1 Cells MRC (Cambridge, England)
Luria-Bertani Agar EMD 1.10283.0500
Bovine Serum Albumin Amresco 0332-100G
STEN buffer Crystalgen Inc. 33429775
Immunotubes Thermo Scientific 470319
Mica Spruce Pine Mica 24365
Tween 20 EMD
Trypsin Sigma T-0303 Irritant
Triethylamine Sigma T-0886 Flammable
Glycerol Amresco 0854-1L Irritant
DNA Plasmid Prep Kit qiagen 27106 Irritant
Non-Fat Milk Powder Carnation
96-Well High Binding ELISA Plate Costar 3590
Anti-M13 HRP GE Healthcare Life Sciences 27-9421-01
ELISA Femto Chemiluminescence Substrate Kit Thermo Scientific 37074
Anti-TDP 43 Polyclonal Antibody ProteinTech 10782-2-AP
A/G Agarose Beads Santa Cruz Biotechnology sc-2003
HB 2151 Cells MRC (Cambridge, England)
Isopropylthiogalactoside Teknova 13325
9e10 HRP Santa Cruz Biotechnology sc-40
Nitrocellulose Membrane Biorad 162-0115 Flammable
Centrifuge Thermo Scientific Sorvall RC 6+
Nanoscope IIIa Atomic Force Microscope Veeco
AFM Probes VistaProbes T300R-10

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hedieh, B., Sharareh, E., Philip, S., Michael, R. S. Isolating recombinant antibodies against specific protein morphologies using atomic force microscopy and phage display technologies. Protein Engineering Design and Selection. 19, 497-502 (2006).
  2. Emadi, S., Barkhordarian, H., Wang, M. S., Schulz, P., Sierks, M. R. Isolation of a Human Single Chain Antibody Fragment Against Oligomeric α-Synuclein that Inhibits Aggregation and Prevents α-Synuclein-induced Toxicity. Journal of Molecular Biology. 368, 1132-1144 (2007).
  3. Emadi, S., Kasturirangan, S., Wang, M. S., Schulz, P., Sierks, M. R. Detecting Morphologically Distinct Oligomeric Forms of α-Synuclein. Journal of Biological Chemistry. 284, 11048-11058 (2009).
  4. Kasturirangan, S., et al. Nanobody specific for oligomeric beta-amyloid stabilizes nontoxic form. Neurobiology of Aging. 33, 1320-1328 (2012).
  5. Kasturirangan, S., et al. Isolation and characterization of antibody fragments selective for specific protein morphologies from nanogram antigen samples. Biotechnology Progress. 29, 463-471 (2013).
  6. Zameer, A., Kasturirangan, S., Emadi, S., Nimmagadda, S. V., Sierks, M. R. Anti-oligomeric Aβ Single-chain Variable Domain Antibody Blocks Aβ-induced Toxicity Against Human Neuroblastoma Cells. Journal of Molecular Biology. 384, 917-928 (2008).
  7. Boddapati, S., Levites, Y., Sierks, M. R. Inhibiting β-Secretase Activity in Alzheimer's Disease Cell Models with Single-Chain Antibodies Specifically Targeting APP. Journal of Molecular Biology. 405, 436-447 (2011).
  8. Boddapati, S., Levites, Y., Suryadi, V., Kasturirangan, S., Sierks, M. R. Bispecific Tandem Single Chain Antibody Simultaneously Inhibits β-Secretase and Promotes α-Secretase Processing of AβPP. Journal of Alzheimer's Disease. 28, 961-969 (2012).
  9. Zhou, C., Emadi, S., Sierks, M. R., Messer, A. A Human Single-Chain Fv Intrabody Blocks Aberrant Cellular Effects of Overexpressed [alpha]-Synuclein. Mol Ther. 10, 1023-1031 (2004).
  10. Vanden Broeck, L., Callaerts, P., Dermaut, B. TDP-43-mediated neurodegeneration: towards a loss-of-function hypothesis. Trends in Molecular Medicine. 20, 66-71 (2014).
  11. Akamatsu, M., et al. A unique mouse model for investigating the properties of amyotrophic lateral sclerosis-associated protein TDP-43, by in utero electroporation. Neuroscience Research. 77, 234-241 (2013).
  12. Keage, H. A., et al. TDP-43 in the Population: Prevalence and Associations with Dementia and Age. Journal of Alzheimer's Disease. 42, 641-650 (2014).
  13. Honda, D., et al. The ALS/FTLD-related RNA-binding proteins TDP-43 and FUS have common downstream RNA targets in cortical neurons. FEBS Open Bio. 4, 1-10 (2014).
  14. Baloh, R. H. TDP-43: the relationship between protein aggregation and neurodegeneration in amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal lobar degeneration. FEBS Journal. 278, 3539-3549 (2011).
  15. Ling, S. -C., Polymenidou, M., Cleveland, D. W. Converging Mechanisms in ALS and FTD: Disrupted RNA and Protein. 79, 416-438 (2013).
  16. Sasaki, S., Takeda, T., Shibata, N., Kobayashi, M. Alterations in subcellular localization of TDP-43 immunoreactivity in the anterior horns in sporadic amyotrophic lateral sclerosis. Neuroscience Letters. 478, 72-76 (2010).
  17. Robertson, J., et al. Lack of TDP-43 abnormalities in mutant SOD1 transgenic mice shows disparity with ALS. Neuroscience Letters. 420, 128-132 (2007).
  18. Shan, X., Vocadlo, D., Krieger, C. Mislocalization of TDP-43 in the G93A mutant SOD1 transgenic mouse model of ALS. Neuroscience Letters. 458, 70-74 (2009).
  19. Yamashita, T., Hideyama, T., Teramoto, S., Kwak, S. The abnormal processing of TDP-43 is not an upstream event of reduced ADAR2 activity in ALS motor neurons. Neuroscience Research. 73, 153-160 (2012).
  20. Dong, H., et al. Curcumin abolishes mutant TDP-43 induced excitability in a motoneuron-like cellular model of ALS. Neuroscience. 272, 141-153 (2014).
  21. Sheets, M. D., et al. Efficient construction of a large nonimmune phage antibody library: The production of high-affinity human single-chain antibodies to protein antigens. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95, 6157-6162 (1998).
  22. Hairul Bahara, N. H., et al. Phage display antibodies for diagnostic applications. Biologicals. 41, 209-216 (2013).
  23. Azzazy, H. M. E., Highsmith, W. E. Jr Phage display technology: clinical applications and recent innovations. Clinical Biochemistry. 35, 425-445 (2002).
  24. Zhang, X., et al. Rapid isolation of single-chain antibodies from a human synthetic phage display library for detection of Bacillus thuringiensis (Bt). Cry1B toxin. Ecotoxicology and Environmental Safety. 81, 84-90 (2012).
  25. Liu, H., et al. Selection and characterization of single-chain recombinant antibodies against spring viraemia of carp virus from mouse phage display library. Journal of Virological Methods. 194, 178-184 (2013).
  26. Cukkemane, N., Bikker, F. J., Nazmi, K., Brand, H. S., Veerman, E. C. I. Identification and characterization of a salivary-pellicle-binding peptide by phage display. Archives of Oral Biology. 59, 448-454 (2014).
  27. Adamson, C. S., et al. Novel single chain antibodies to the prion protein identified by phage display. Virology. 358, 166-177 (2007).
  28. Hebron, M. L., et al. Parkin Ubiquitinates Tar-DNA Binding Protein-43 (TDP-43) and Promotes Its Cytosolic Accumulation via Interaction with Histone Deacetylase 6 (HDAC6). Journal of Biological Chemistry. 288, 4103-4115 (2013).
  29. Wang, M. S., Zameer, A., Emadi, S., Sierks, M. R. Characterizing Antibody Specificity to Different Protein Morphologies by AFM. Langmuir. 25, 912-918 (2008).
  30. Williams, S., Sakic, B., Hoffman, S. A. Circulating brain-reactive autoantibodies and behavioral deficits in the MRL model of CNS lupus. Journal of Neuroimmunology. 218, 73-82 (2010).
  31. Jończyk, E., Kłak, M., Międzybrodzki, R., Górski, A. The influence of external factors on bacteriophages—review. Folia Microbiol. 56, 191-200 (2011).
  32. Hammers, C. M., Stanley, J. R. Antibody Phage Display: Technique and Applications. J Invest Dermatol. 134, e17 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics