À long terme intravitale microscopie multiphotonique imagerie des cellules immunitaires dans sains et malades du foie en utilisant des souris CXCR6.Gfp Reporter

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Immunology and Infection

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Heymann, F., Niemietz, P. M., Peusquens, J., Ergen, C., Kohlhepp, M., Mossanen, J. C., Schneider, C., Vogt, M., Tolba, R. H., Trautwein, C., Martin, C., Tacke, F. Long Term Intravital Multiphoton Microscopy Imaging of Immune Cells in Healthy and Diseased Liver Using CXCR6.Gfp Reporter Mice. J. Vis. Exp. (97), e52607, doi:10.3791/52607 (2015).

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Abstract

inflammation du foie en tant que réponse à une blessure est un processus hautement dynamique impliquant l'infiltration des sous-types distincts de leucocytes, y compris les monocytes, les neutrophiles, les sous-ensembles de cellules T, les cellules B, les cellules tueuses naturelles (NK) et des cellules NKT. Microscopie intravitale du foie pour le suivi de la migration des cellules immunitaires est particulièrement difficile en raison des exigences élevées en ce qui concerne la préparation des échantillons et la fixation, la résolution optique et la survie des animaux à long terme. Pourtant, la dynamique des processus inflammatoires ainsi que des études d'interaction cellulaires pourraient fournir des informations cruciales pour mieux comprendre l'initiation, la progression et la régression de la maladie inflammatoire du foie. Par conséquent, une méthode très sensible et fiable a été créé pour étudier la migration et cellule-cellule-interactions de cellules immunitaires différentes dans le foie de souris sur de longues périodes (environ 6 h) par intravitale deux photons microscopie à balayage laser (TPLSM) en combinaison avec des soins intensifs surveillance.

ent "> Le procédé proposé comprend une préparation douce et la fixation stable du foie avec une perturbation minimale de l'organe; imagerie intravitale à long terme en utilisant multicolore multiphotonique microscopie avec pratiquement pas de photoblanchiment ou des effets phototoxiques sur une période de temps allant jusqu'à 6 heures, ce qui permet un suivi de sous-ensembles de leucocytes spécifiques et des conditions de formation d'image stable en raison de la surveillance des paramètres vitaux extensif de souris et de stabilisation de la circulation, la température et l'échange de gaz.

Pour étudier la migration des lymphocytes à une inflammation du foie CXCR6.gfp souris knock-in ont été soumis à l'imagerie du foie intravitale dans des conditions de base et après des lésions du foie aiguë et chronique induite par injection intraperitoneale (s) de tétrachlorure de carbone (CCl 4).

CXCR6 est un récepteur de chimiokine exprimée sur les lymphocytes, principalement sur tueuses naturelles T (NKT) -, Natural Killer (NK) - et des sous-ensembles de lymphocytes T telles que les cellules T CD4 mais aussi asso muqueusesATED invariant des cellules (MAIT) T 1. Suivant le modèle migratoire et le positionnement de CXCR6.gfp + cellules immunitaires permis un aperçu détaillé dans leur changement de comportement lors d'une lésion du foie et donc leur implication potentielle dans la progression de la maladie.

Introduction

La visualisation des cellules et des fonctions cellulaires dans des organes entiers, voire des organismes entiers a été d'un grand intérêt pour les plus de 50 ans, y compris presque toutes les parties du corps 2. Par conséquent, certaines études antérieures déjà employés imagerie intravitale du foie 3,4. Cependant, plusieurs limitations existent à jour concernant stable à long terme imagerie à haute résolution des tissus du foie.

En raison de la position anatomique du foie en contact étroit avec la membrane et le tractus gastro-intestinal 5, le problème le plus commun pour l'imagerie microscopique intravitale mouvement est due à la respiration et, dans une moindre mesure, péristaltique de l'intestin 6. En comparaison à d'autres organes solides, la chirurgie du foie est particulièrement difficile. En raison de la structure microvasculaire dense, manipulation chirurgicale peut entraîner des lésions hémorragiques massifs, troubles de la microcirculation 7 et également l'activation de résident immune cellules telles que des cellules de Kupffer 8. Par conséquent, la fixation mécanique du tissu telle que publiée ailleurs 6,9 est susceptible d'interférer avec l'imagerie par microscopie intravitale.

Dans un foie en bonne santé, de 10 à 15% du volume total de sang réside dans le système vasculaire du foie, et l'organe reçoit l'ordre de 25% de la production globale cardiaque 10, rendant l'organe très sensible aux variations de la circulation (par exemple, les fluctuations de la pression artérielle ). Par conséquent, les perturbations dans le flux sanguin hépatique due à par exemple, contrainte de cisaillement, de déplacement, de blessure par une manipulation excessive des tissus ou la circulation centralisée seront conduire à des altérations artificielles dans leucocytes comportement migratoire, troubles de l'oxygénation du foie et donc également des dommages au foie, affecter les réponses immunitaires du foie ainsi comme conservation d'organes et de la durée de vie globale de l'animal.

Études microscopiques étaient fondés sur km à épifluorescence intravitalecroscopy, mais plusieurs contraintes techniques telles que le blanchiment photo et une faible profondeur de pénétration limiter l'utilisation de cette technique pour le long terme imagerie du foie 4,11,12. Avec le développement de la microscopie multiphotonique dans les années 1990, les limites de la photo blanchiment ou la profondeur de pénétration ont principalement été résolus, que cette nouvelle méthode était techniquement capable d'effectuer des études d'imagerie dans pratiquement tous les organes dans des situations de la vie réelle de 13 à 15. Toutefois, les principaux défis à relever en ce qui concerne l'imagerie du foie étaient: mouvements de respiration, autofluorescence des tissus du foie, de fixation flux sanguin inchangée dans les sinusoïdes hépatiques, et l'imagerie particulièrement stable pour des périodes de plusieurs heures 16 plus longues.

Bien que plusieurs études ont abordé la fonction et la migration des différents leucocytes dans le foie, par exemple, 17 cellules NKT 18-20, les cellules T 21,22, les macrophages du foie 23,24 ou 25 neutrophiles, long terme multiphotonique mimagerie icroscopy ne avait pas encore été établie avec succès, une tâche encore plus difficile chez les animaux atteints de maladie hépatique aiguë ou chronique en raison des dommages existants et la susceptibilité donc supérieur à 26 autres dommages. Toutefois, le suivi du comportement migratoire et la fonction cellulaire de leucocytes dans le foie en temps réel permet de nouvelles perspectives dans leur rôle particulier dans l'homéostasie du foie et la maladie 27.

Le CXCR6 des récepteurs de chimiokines est exprimé sur plusieurs sous-ensembles de lymphocytes, y compris les cellules tueuses naturelles (NK), les cellules NKT et certaines populations de cellules T 18,28. Des études antérieures sur des souris ont indiqué que CXCR6 et son CXCL16 de ligand apparenté peuvent contrôler les patrouilles des cellules NKT sur sinusoïdes du foie lors de l'homéostasie. Par conséquent, l'utilisation de souris CXCR6.gfp (portant un knock-in de la protéine verte fluorescente [GFP] dans le locus CXCR6) a été décrite pour étudier la migration des lymphocytes dans divers organes tels que le cerveau 29et aussi le foie 18,20, montrant l'infiltration de cellules CXCR6.gfp augmenté sur l'inflammation.

Avec la méthode prévue dans cette étude, il était possible de suivre ces processus sur une longue période de temps dans des conditions stables. La procédure basée multiphotonique intravitale permis imagerie qui était très reproductible avec une perturbation minimale de l'animal et l'organe; optimisé pour la survie des animaux à long terme par une surveillance importante suivie d'un contrôle étroit de la respiration et de la circulation; et très flexible et facile à adopter aussi à d'autres organes parenchymateux tels que le rein ou de la rate.

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Protocol

REMARQUE: Les expériences ont été effectuées en conformité avec la législation allemande régissant les études animales suivantes le «Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire de (la publication NIH, 8e édition, 2011) et la directive 2010/63 / UE sur la protection des animaux utilisé à des fins scientifiques (Journal officiel de l'Union européenne, 2010). Autorisation officielle a été accordée dans le soin des animaux et l'utilisation bureau gouvernemental (LANUV Nordrhein-Westfalen, Recklinghausen, Allemagne).

NOTE: Les mesures qui peuvent être omis pour l'imagerie à court terme (par exemple, des piles Snap Shots 3-D ou aussi courte durée time-lapse microscopie) sont marquées d'un astérisque (*) pour réduire le temps de préparation et de simplifier le protocole chirurgical. L'imagerie peut également être réalisée sans un contrôle étendu de surveillance et de la circulation, si nécessaire, cependant, le temps de survie sera nettement réduite.

1. Configuration de Microscope et pré-chirurgie Préparation (5-10 kmn)

  1. système de commutateur (microscope, puissance Lab, laser, coussin chauffant, chambre climatique, web cam, dispositif de pompe de la seringue, un respirateur).
  2. Connectez O 2 offre à l'isoflurane vapeur et régler le niveau isoflurane à 1,5% en volume (v / v), se connecter à un petit appareil respiratoire des animaux.
    1. Pour court imagerie terme, maintenir l'anesthésie à l'isoflurane seulement après l'induction initiale de l'anesthésie ip (voir l'étape 2.2). Ensuite, utilisez 2 Vol% (v / v) isoflurane, et de garder le temps d'imagerie en dessous de 2 h pour garantir stable microcirculation du foie.
  3. Réglez la respiration à 120-140 cycles / min respiratoires avec un volume de 150 à 200 pi.
  4. Mettre en place l'étape d'agarose de la souris. Préparer 100 ml de 3% (p / v) d'agarose, le verser dans un plat (environ 10 cm x 15 cm base) dans un angle de 40 °.
  5. Mettre en place la zone de travail chirurgical recueillir l'instrumentation nécessaire. Pour prévenir l'infection microbienne, la désinfection d'instruments en utilisant une solution à 1% du Forte Sekusept S (9,9% p / v), Glutaral 9,8% p / v, de formaldéhyde pendant 5 min avant l'expérience (figure 1A).
  6. Obtenir des composants restants: désinfectant de la peau (par exemple, une solution de la povidone iodée 10%), l'étape du foie (piles et pont), une solution d'agarose (3% (p / v) dans du PBS), la pompe à seringue avec 5% (p / v) d'une solution de glucose (G-5), la pompe à seringue avec une solution anesthésique I (Kétamine 0,1 mg / ml, xylazine 0,5 mg / ml, 5 pg de fentanyl / ml), des tampons de coton, le n-butyl-2-Cyanoacrylat et 1x PBS. Mettez plat stade agarose dans la chambre d'incubation pour le préchauffage.

2. trachéotomie (10-15 min)

  1. Utilisez souris C57BL / 6 dans la maison de l'élevage pesant 25-28 g. Maison des souris dans des conditions exempts d'organismes pathogènes spécifiques en conformité avec les lignes directrices FELASA, dans un environnement à température et humidité contrôlées avec un / 12 h cycle d'obscurité 12 heures de lumière. Permettre aux animaux un accès gratuit à un régime standard de souris (Sniff standard rongeurs Diète) et de l'eau ad libitum.
  2. Anesthésier la souris par initial intraperitoneale (ip) d'injection de 250 ul d'une solution anesthésique de kétamine II (0,1 mg / ml, xylazine 1 mg / ml, la buprénorphine 10 ug / ml).
    1. * Pour l'entretien lors de l'imagerie intravitale, administrer en continu la solution anesthésique I par injection ip continu (Kétamine 0,1 mg / ml, xylazine 0,5 mg / ml, le fentanyl 5 ug / ml) en utilisant un appareil de pompage à seringue à un débit de 0,2 ml / h dans par inhalation d'isoflurane combinaison avec 0,5% en volume (v / v).
    2. Vérifiez réflexes après 5 min (par exemple pincée de coussinet plantaire avec une pince), désinfecter la peau pour la trachéotomie, commencer la préparation si la souris est en état ​​d'anesthésie chirurgicale tolérante.
    3. Appliquer une crème de protection oculaire (par exemple, Dexpanthenol 50 mg / g) pour empêcher la cornée de sécher (figure 1B).
  3. Fixer la souris sur la table de préparation exposer face ventrale avec du ruban adhésif pour les extrémités; overstretch doucement le cou, fixer dans cette position, par exemple., en utilisant une bande de caoutchouc accroché to les incisives.
    1. Désinfectez la peau et de la fourrure en utilisant une solution d'iode povidone, en appliquant un désinfectant avec un coton-tige.
  4. Effectuer la découpe de la peau initial (0,5 à 1 cm de longueur) directement sous le menton (figure 1C)
    1. Disséquer soigneusement le tissu conjonctif entre les glandes salivaires (figure 1D).
    2. Détachez avec soin ouverte musculaire tube entourant la trachée (figure 1E, F).
  5. Placez fil chirurgical sous la trachée pour plus tard la fixation du tube de ventilation (figure 1G).
    1. Ouvrir la trachée par des micro-ciseaux entre les anneaux cartilagineux effectuant une incision en forme de T (figure 1H)
  6. Placez le tube de ventilation dans la trachée à travers l'incision (~ 0,5 cm). Pour pousser le tube avant, saisir extrémité caudale avec de petites pinces anatomiques et avancer doucement le tube dans la trachée (Figure 1I)
  7. Fixer tube avec fil chirurgical (par exemple, (figure 1J, K).
  8. coupe du joint avec de la colle de tissu (par exemple, le n-butyl-2-Cyanoacrylat) (Figure 1L).
  9. Fixer le tube à la tête avec du ruban adhésif.

3. laparotomie (15-20 min)

  1. Placez la souris sur coussin chauffant pour prévenir l'hypothermie. Rasez abdomen, retirer délicatement les poils de la peau. Désinfectez la peau et de la fourrure rasée en utilisant une solution de povidone iode.
  2. Effectuer une petite couper la peau en dessous du sternum avec des ciseaux chirurgicaux (figure 2A). Prolonger la coupe latéralement sous les côtes des deux côtés, cautériser tous les vaisseaux sanguins visibles pour prévenir les saignements.
  3. Effectuer avec précaution une petite coupure à la ligne blanche en dessous du sternum, ouverture du péritoine (figure 2B). Prolonger la coupe des deux côtés utilisant cauterization pour prévenir les saignements (figure 2C, D).
  4. Placez la souris dans un plat de scène agarose (figure 2E). Placez des piles de hauteur appropriée des deux côtés de la souris (en général de 12 à 14 des lamelles) (figure 2F).
  5. Placez capteur de déclenchement respiratoire sous le haut du dos pour synchroniser le microscope avec la respiration. Activer unité de déclenchement (figure 2G).
  6. Placez fil chirurgical (5-0) à travers le sternum se rétracter nervures (Figure 2I).
  7. Découpez soigneusement ligament reliant le foie et le diaphragme (ligament falciforme) ainsi que le foie et tractus gastro-intestinal avec des ciseaux chirurgicaux courbes. Couper le ligament falciforme jusqu'à l'aorte (figure 2J).

4. Configuration de l'échantillon (10-15 min)

  1. Placez la souris sur le côté droit avec un angle de 45 ° pour un accès facile à gros lobe du foie.
  2. Ajouter pont en scène sous les côtes, couvrant la abdominalecavité. Fabrication d'un pont en utilisant une lamelle standard avec revêtement adhésif de bande pour couvrir les arêtes vives (Figure 2K).
  3. Placez gros lobe du foie sur scène. Glisser soigneusement double roulement sonde de stylet ou une spatule rembourrée dessous du foie et tenir le haut de l'organe en utilisant un coton-tige humide ou tissu humide. Soulevez lobe sur la diapositive et appliquer glisser en douceur. Lobe peut être plié ou plié. Fournir des soins supplémentaire pour que la manipulation douce du foie (Figure 2L).
  4. Placez piquets de soutien latéral, par exemple, des tas de petites lamelles (20 mm x 20 mm), d'environ la même hauteur du lobe du foie à côté de lui pour soutenir lamelle.
  5. Passer grande lamelle (24 mm x 50 mm) sur le lobe du foie. Veiller à ce que lamelle est orienté aussi horizontale que possible (Figure 2M).
    NOTE: La lamelle doit être en contact avec le tissu sans presser. Vérifiez les signes visibles de la circulation sanguine avec facultés affaiblies (tissu blanc). Si MICROCIRCulation est perturbé, ajouter soutenir davantage enjeux.
  6. * Placez deux cathéters intra-péritonéales indépendants (Figure 2N) pour l'anesthésie à long terme et l'application G-5. Installez cathéters latéralement dans le bas-ventre à côté des membres postérieurs.
    REMARQUE: Les cathéters intra-péritonéales peuvent être self-made en connectant 27 G aiguilles avec un tube de silicone souple (Figure 3).
  7. * Aiguille Fixate avec une boucle de fil chirurgical 5-0 sur la peau pour éviter tout déplacement accidentel.
  8. * Joindre pompe seringue avec une solution d'anesthésie I cathéter 1, réglage du débit à 0,2 ml / h; attacher pompe seringue avec le G-5 à cathéter 2, débit réglé à 0,1 ml / h.

5. Suivi de la souris

  1. * Lieu électrodes ECG dans les extrémités avant et arrière (figure 4A).
  2. * Fixer le tube d'expiration de CO 2 capteur de niveau.
  3. Ajouter capteur de température externe connecté au pad thermique (figure 4C).

6. Embedding et fixation tissulaire (5-10 min)

  1. Préparer 100 ml de 3% (p / v) d'agarose dans du PBS 1X. Incorporer foie lorsque la température est à 41 ° C en utilisant une seringue de 5 ml et une aiguille 18 G (figure 5A).
  2. Verser le reste d'agarose sur lamelle couvre-objet et autour de la souris (figure 5B, C). Attendez jusqu'à ce que l'agarose est complètement gélatinisé.
  3. Enlever l'excès d'agarose en utilisant la spatule Heidemann, la préparation d'un Viewfield suffisamment grande pour balayer le lobe hépatique préparé (figure 5D, E).

7. Imaging

  1. Transférer la souris dans la chambre climatique de microscope.
  2. Ajouter 50 à 100 ml de 1 x PBS (préchauffé à 37 ° C).
  3. Couvrir le plat de l'échantillon pour éviter l'évaporation (figure 5F).
  4. * Diminution par inhalation d'isoflurane à 0,5% en volume (v / v).
  5. * Lancer un logiciel de surveillance, l'enregistrement ECG, la fréquence cardiaque et de CO 2 expiratoire.
  6. Lancer imagerie: ouvrir laser volets, identifier les champs de vue de l'intérêt, définissent la limite supérieure et inférieure pour Z-piles, et commencer l'enregistrement laps de temps. Réajuster Z-piles si nécessaire pour corriger Z-dérive (par ex. En raison de changements dans la pression sanguine ou les fluctuations de température, Figure (5G).
    REMARQUE: Après la fin de la période de formation d'image ou si la circulation ou l'anesthésie des animaux devient instable, sacrifier les souris par dislocation cervicale (sans réveil de l'anesthésie).

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Representative Results

Pour valider notre approche de TPLSM intravitale, nous avons soumis GFP / + souris CXCR6 à l'imagerie intravitale TPLSM. Les souris ont été soit laissées non traitées comme témoins ou de référence soumis à une injection intraperitoneale unique de tétrachlorure de carbone (CCl 4) pour induire des dommages au foie aiguë 20.

Les séquences vidéo ont été prises sur une période de temps de 2 à 5 h, et les cellules ont été retracés au fil du temps en raison de leur fluorescence verte. Pour montrer la motilité cellulaire générale, toutes les pistes qui ont été détectés au cours de la procédure ont été tracés en image superposée (figure 6A). Alors que les cellules dans des conditions de base ont montré longue migration à distance le long des sinusoïdes du foie vers la veine centrale, 18 heures après le traitement CCl 4 cellules + / gfp CXCR6 montré habitudes de déplacement déjà douteux partiellement. Bien que certaines cellules en mouvement rapide étaient encore présents dans les sinusoïdes du foie, plusieurs domaines d'intervention étaient visibles avec des cellules quiavait changé de migration aléatoire de balayage local, indiquant une réponse chimiotactique recruter les cellules de la zone de blessure. L'effet a été encore plus prononcé après 36 heures, montrant une arrestation presque complète des cellules CXCR6 + avec pratiquement aucune migration active. Bien que dans des conditions de base la plupart des cellules migrantes avaient vitesses de migration variables aléatoires avec des changements de direction, CCl 4 animaux traités ont montré des cellules qui ont été lentement rampent ainsi que certaines cellules librement mobiles patrouillent les sinusoïdes, après 18 heures, mais pas après 36 h. Usage des pistes de migration code couleur, la vitesse de la cellule pourrait être visualisé directement pour évaluer l'effet du traitement CCl 4. La migration avec facultés affaiblies a également visibles dans le diagramme de la piste normalisée (figure 6B), montrant que 18 heures après CCl 4 la quantité de longue distance le suivi ainsi que la longueur de piste moyenne a été considérablement réduite, alors qu'après 36 h pas de cellules mobiles étaient détectables toute plus. Conformément wvec ces conclusions, le déplacement cellulaire, qui décrit la capacité d'une cellule à patrouiller librement le système vasculaire, a diminué au fil du temps, indiquant un piégeage des cellules 36 heures après le traitement CCl 4 au site de la lésion hépatocellulaire (Figure 6C).

Pour suivre le comportement migratoire des cellules CXCR6 + / de la GFP dans le foie de façon plus détaillée, la vitesse de migration des cellules individuelles représentatifs a été tracée pour visualiser leur niveau de mobilité au cours du temps. Nous et d'autres précédemment décrit plusieurs types de mouvements distincts de cellules + / gfp CXCR6: exploration aléatoire active avec un collage roulant modèle, montrant les phases de la motilité cellulaire et états de repos temporelles; dirigé recrutement cellulaire avec des cellules balayant une zone d'intérêt, mais encore capable de ramper active; arrêt cellulaire total 18,20 accompagnée immunitaire de l'activation des cellules. Alors que les souris sans traitement principalement montré cellules qui étaient Moti librementle avec des vitesses allant jusqu'à 15 um / sec, les cellules CXCR6 + / de la GFP dans les souris traitées avec CCl 4 affichés nettement réduit la vitesse de migration cellulaire et l'arrestation partielle déjà après 18 h et l'arrestation de migration complète après 36 h (figure 7A). En accord avec l'analyse d'une seule cellule, les données statistiques de toutes les cellules dans une séquence révélé diminution de la vitesse de migration globale après CCl 4 traitements (Figure 7B), qui a également été ressemblait par des vitesses de voie moyenne (Figure 7C) et de suivre les vitesses maximales de migration (Figure 7D), montre que l'approche était appropriée pour décrire les différences dans la migration cellulaire et le positionnement de développer une maladie du foie.

Figure 1
Figure 1:. Trachéotomie de la souris (A) l'équipement chirurgical utilisé pour la préparation. 1x bagout normen, forceps, pinces Semken 1x 1x Dumont No.7, pinces Graefe (dentelé, 2x droite / 1x courbes), les enrouleurs 2x Blair (4 volets (franc)), sonde de stylet double ballon (par exemple, l'amalgame brunissoir 3PL), Heidemann spatule HD2, porte-aiguille (Mathieu ou Halsey), petits ciseaux chirurgicaux 1x (forte / émoussé, 1xcurved, 1x droites), micro-ciseaux (par exemple, Vannas Printemps Ciseaux), 1x petite Cauter animale, tampons de coton, yeux salve de protection, chirurgicale fil, n-butyl-2-Cyanoacrylatglue. (B) les yeux sont protégés en utilisant un onguent protecteur oculaire. (C) de coupe de la peau initiale pour la préparation de la trachée. (D) Dissection du tissu conjonctif entre les glandes salivaires sous-maxillaires. (E) Exposition de la trachée. (F) Dissection du tissu musculaire entourant la trachée. (G) Placement du fil chirurgical sous la trachée pour la fixation du tube. (H) Tracheincision al utilisant microciseaux entre anneaux cartilagineux supérieurs. (I) L'insertion de tube de ventilation dans la trachée. (J) Placement du fil chirurgical crânienne de fixer le tube à la peau. (K) Double fixation du tube. (I) d'étanchéité incision chirurgicale en utilisant du n-butyl-2-Cyanoacrylat. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2:. Laparotomie et le foie préparation (A) initiale incision de la peau, les vaisseaux sanguins ont été cautérisé pour empêcher un saignement excessif. (B) Ouverture du péritoine sous le sternum. (C) Extension de la coupe péritonéale par unité de cautérisation. (D) d'étanchéité des vaisseaux épigastriques. ( g> E) Une nouvelle extension de l'incision péritonéale en dessous des côtes. (F) Placement de l'animal dans le plat de scène agarose. (F) Placement des piles de soutien. (G) Placement du capteur de déclenchement respiratoire. (H) Configuration du seuil de déclenchement pour la respiration synchronisée imagerie. (I) sternum fixation se rétracter nervures avec du fil chirurgical. (J) de déconnexion de la vésicule biliaire à partir de la membrane et la dissection du ligament falciforme. (K) Placement de lamelle mise en scène. (L) Placement du lobe du foie sur scène. (M) Mise en place de la lamelle sur le lobe de foie. (N) Placement de ip cathéter pour anesthésie à long terme. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 3:. Cathéter intrapéritonéale 27 G aiguilles connectés avec des tubes de silicone flexible.

Figure 4
Figure 4: Suivi de la souris. (A) Placement des électrodes ECG (vert, rouge, bleu câbles). Aiguilles pour la détection ECG sont placées sous-cutanée comme indiqué. (B) La surveillance de l'ECG (rouge), expiratoire CO 2 (bleu) et la fréquence cardiaque (rouge) montrant la progression à long terme (à gauche) et la mesure réelle (à droite). (C) contrôlée unité de puissance pour le contrôle de pad thermique Température. La température est réglée à 36 ° C. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

ve_content "fo: keep-together.within-page =" always "> Figure 5
Figure 5: Foie intégration et de l'imagerie. (A) incorporation du lobe de foie. 3% d'agarose dans du PBS est injecté à 41 ° C sous la lamelle en utilisant une seringue de 2 ml avec une aiguille 18G. (B) lobe du foie est entièrement intégré dans agarose pour minimiser des artefacts de mouvement. (C) d'étanchéité du péritoine avec le reste agarose pour prévenir la déshydratation. (D) l'élimination d'agarose champ de vision couvrant microscope après gélatinisation complète. (E) Préparation de Viewfield. Réglage du niveau F-Z et de l'évaluation du flux sanguin de l'échantillon en utilisant la microscopie optique. (D) plat Couvrir pour empêcher l'évaporation excessive. Couvercle est soulevé dans l'image pour montrer la configuration. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une plus grandeversion de ce chiffre.

Figure 6
Figure 6:. Suivi des CXCR6 GFP / + dans les cellules des dommages au foie chronique après injection CCl 4 souris ont été injectées ip avec 0,6 ml / kg CCl 4 dissous dans l'huile de tournesol 18 h ou 36 h avant l'imagerie. Le jour de l'expérience, les souris ont été soumises à TPLSM intravitale comme décrit. (A) des images de suivi cellulaire Still. Pistes de tous les points de temps ont été superposées pour montrer la motilité cellulaire et de déplacement. Les images ont été prises en utilisant un seul faisceau laser Titan Saphire à 840 nm et un microscope TPLSM. Zones ont été scannés prennent 3-5 Z-piles avec une profondeur de pénétration de 70 pm avec un taux d'environ 30 secondes par cycle d'échantillonnage. Pistes étaient codés par couleur pour montrer la vitesse de migration (bleu clair: lent ou des cellules sessiles, le pourpre: cellules mobiles). Barres d'échelle: 100 μ; M. (B) XY diagrammes de chemins normalisées pour leur origine montrant directionnalité de la piste et la longueur de la piste (um). (C) Cylindrée totale de cellules de leur origine. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 7
Figure 7: Les statistiques migratoires de CXCR6 GFP / + cellules suivies par TPLSM intravitale dans le tissu hépatique en référence et CCl 4 Les souris traitées cellules ont été analysées pour leur vitesse de migration patrouiller le foie.. (A) la vitesse Représentant de cellules uniques suivi au fil du temps. Vitesse a été mesurée à chaque point de temps et tracée pour chaque image individuellement. Les lignes représentent des cellules individuelles. Axes Y sont adaptées en fonction de la vitesse maximale de migration. (B) Stanalyse atistical de vitesses spécifiques A. Frame de toutes les cellules ont été regroupées et analysées base et CCl 4 souris traitées. (C) de vitesse sur piste moyenne a été calculée par piste et les données de toutes les pistes ont été regroupés pour l'analyse. (D) la vitesse maximale de chaque piste a été tracée et analysé. Toutes les expériences ont été effectuées dans des groupes de trois animaux et les résultats ont été confirmés dans deux expériences indépendantes. *** P <0,001 (bilatérale non apparié t-test de Student). Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

Le but de notre étude était de développer une méthode très standardisé, stable et reproductible pour l'imagerie intravitale TPLSM du foie. Imagerie intravitale en général a donné de précieuses indications sur le comportement cellulaire dans des conditions réelles suivantes homing et l'interaction des différentes populations de leucocytes dans le développement, l'homéostasie et la maladie. Cependant, la position anatomique peu difficile du foie, en raison de laquelle respiratoire et le mouvement péristaltique intestinal sont transmis directement au foie ainsi que leur grande fragilité par rapport à d'autres organes solides imposé plusieurs défis pour l'imagerie intravitale stable à long terme. Au cours des dernières années, de nombreuses études expérimentales chez la souris ont révélé la nature très dynamique de l'infiltration de cellules immunitaires dans le foie blessé 28, avec des contributions majeures de résident ou infiltration des monocytes / macrophages, les neutrophiles 30-32 33 ou différents sous-ensembles de lymphocytes 34,35. Cependant, most de ces données ont été obtenues à partir d'analyses de point final (par exemple, multicolore cytométrie en flux après avoir sacrifié les animaux). Jusqu'à présent, seuls quelques études existent décrivant la dynamique de trafic cellulaire pendant une inflammation du foie en utilisant l'imagerie intravitale multicolore. Utilisation de microscopes inversés contourne la nécessité pour la fixation et l'hydratation du foie due à l'adhésion ferme du tissu sur le verre de fond 24. Cependant, puisque de nombreux microscopes multiphotonique sont construits comme des systèmes d'imagerie verticaux, les méthodes de préparation et de fixation plus élaborées sont nécessaires pour stabiliser le tissu pendant le temps de formation d'image. Communément, systèmes de classification sur mesure ont été décrits pour la fixation du tissu 6, 36,37, mais avec ceux-ci, il est crucial pour valider la microcirculation du foie, puisque la pression même minime sur le tissu affecte le flux sanguin sinusoïdale avec des effets encore plus graves sur le foie malade 38 .

Par conséquent, les points suivants ont été adhabillé dans la configuration de cette méthode pour optimiser les résultats obtenus par imagerie in vivo de TPLSM: Améliorer la qualité de la préparation par minimisé perturbation de l'échantillon et la perturbation de la microcirculation en raison de la gestion des problèmes et l'augmentation de la survie des animaux; suivi de soins intensifs et à l'adaptation subséquente de l'anesthésie, la respiration et la stabilisation de la circulation encore amélioré la survie des animaux et des objets physiologiques réduites, par exemple, provoquées par des déséquilibres dans le pH sanguin. La respiration contrôlée en combinaison avec l'imagerie déclenchée était essentiel d'éliminer des artefacts de mouvement en raison de la synchronisation du microscope avec les cycles respiratoires. L'insertion de l'organe en agarose contenant des concentrations salines physiologiques a été bénéfique pour fixer l'organe doucement après préparation, sans autre manipulation mécanique et empêche également la déshydratation de l'échantillon. La plupart des protocoles utilisés pour la microscopie du foie fournissent uniquement des méthodes insuffisantes pour sta ble, à long terme anesthésie. Cependant, la survie des animaux pourrait être considérablement améliorée avec le protocole d'anesthésie prévu ici et en combinaison avec le suivi a été suffisante pour garantir la survie jusqu'à 8 h. D'autres méthodes conviennent généralement pour visualiser les processus au sein d'une période de temps allant jusqu'à 3 heures invasion des neutrophiles tel que 39, mais ne ont pas la possibilité de l'image de processus plus durables tels que des monocytes ou des lymphocytes invasion 22 ou même la prolifération cellulaire 6. Comprendre la dynamique de recrutement, l'infiltration et interaction cellulaire pendant l'inflammation hépatique aiguë et chronique peut donner un aperçu plus détaillé dans le développement et la progression de la maladie du foie. En utilisant cette meilleure compréhension de l'immunopathologie, il sera possible de concevoir des thérapies beaucoup plus raffiné en termes de traiter les cellules cibles d'intérêt plutôt que d'utiliser des approches immunosuppresseurs par exemple non-sélectifs.

ove_content "> Pour résoudre le positionnement, la transmigration des leucocytes et l'interaction, des images de haute qualité sont nécessaires pour le suivi de 4D précise des cellules dans le système vasculaire du foie et les tissus hépatiques 18,20,40.

La méthode que nous fournissons ici peut être appliqué en utilisant des réactifs et du matériel de laboratoire communs, rendant à la fois facile à manipuler et efficace avec une perturbation minimale de l'échantillon coûts. Pour maintenir les conditions physiologiques de la souris pour le plus longtemps possible, il est nécessaire de régler avec précision la fréquence et le volume respiratoire pour contrôler l'oxygénation du sang et de niveaux de CO 2. Bien qu'en raison de la perfusion continue de liquides dans le péritoine il existe au moins une alimentation provisoire de stabiliser la circulation, l'ECG et la fréquence cardiaque mesurées seulement permettre un contrôle partiel en ce qui concerne la stabilisation de la circulation. En mettant en œuvre le contrôle de la pression artérielle et l'application directe de liquide veineux central il est probable que l'essentiel PARAMETERS peuvent être stabilisés encore plus, conduisant à une nouvelle amélioration de la stabilité et de la survie.

Même dans des conditions très contrôlées, l'imagerie des animaux qui ont été soumis à des modèles d'endommagement du foie chez les souris couramment utilisés comme l'acétaminophène induit des dommages au foie, CCl 4 des dommages au foie induite ou provoquée maladie du foie gras alimentaire reste difficile. Grâce à la fonction essentielle du foie dans le contrôle métabolique de l'Etat et sa position centrale dans la circulation, des altérations de la fonction du foie ou microcirculation un impact direct sur la survie à long terme des animaux, limitant ainsi la possibilité d'obtenir TPLSM vidéo-longues séquences de très organes endommagés, par exemple avec des hémorragies graves ou microvascularisation détruits. En outre, dans sévèrement altéré microanatomie du foie comme dans les modèles avec de vastes nécroses, il reste difficile d'étudier cellule-cellule-interactions et compartimentation locale d'agrégats de cellules inflammatoires, parce que personne ne standisé "contre-coloration" des structures anatomiques (tels que l'hématoxyline-coloration en microscopie conventionnelle ou coloration DAPI en immunofluorescence) est disponible pour intravitale qualité des données obtenues par le procédé de formation d'image de plus de TPLSM.The dépend de l'intensité de marquage des cellules et la configuration microscopique.

Plusieurs approches existent pour visualiser les cellules GFP + dans le foie. La plus haute fluorescence avec une très faible fluorescence de fond est obtenu entre 900 et 920 nm d'onde d'excitation. La perte presque complète de la fluorescence de fond du foie ne permet pas d'instruction le positionnement des cellules dans le foie, lorsqu'on ne utilise pas suiveurs de navires supplémentaires tels que le dextran ou la lectine. Par conséquent, nous avons décidé de l'image les leucocytes migrent à une longueur d'onde de 840 nm, donnant le meilleur rapport entre le signal de la GFP et détaillée, mais pas trop vif fluorescence de fond du foie.

Pris ensemble, le intravital TPLSM système de formation d'image introduit dans cette étude peut être appliquée à une large variété de questions de microscopie intravitale spécifiques du foie. Avec cette approche, l'imagerie TPLSM dans d'autres organes solides tels que les reins, le foie, la vessie, l'intestin ou du pancréas est possible avec seulement des modifications mineures des procédures chirurgicales et la mise en scène de tissus, fournissant ainsi une approche très souple pour étudier les processus migratoires à long terme de cellules dans vivo.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anesthetics
Buprenorphine Essex Pharma 997.00.00 Analgeticum, 0.1 mg/kg
Fentanyl Rotex Medica charge: 30819
Fluovac anesthesia system Harvard Apparatus 34-1030
Glucose 5% Braun
ISOFLO (Isoflurane Vapor) vaporiser Eickemeyer 4802885
Isoflurane Forene Abbott B 506
Isotonic (0.9%) NaCl solution DeltaSelect GmbH PZN 00765145
Ketamin 10% ceva Charge: 36217/09
Xylazin 2% medistar Charge: 04-03-9338/23
Consumable supplies
20 ml Syringe BD Plastipak
250 ml Erlenmeyer flask Schott Duran 21 226 36
25 ml Beaker 2x Schott Duran 50-1150
2 ml syringe BD Plastipak
4-0 Vicryl suture Ethicon V7980
Agarose commercially available
Bepanthen Eye and Nose ointment Bayer Vital GmbH 6029009.00.00
Change-A-Tip Deluxe High-Temp Cautery Kit Fine Science Tools Inc. 18010-00
Cotton Gauze swabs Fuhrmann GmbH 32014
Cover Slip 24x50 mm ROTH 1871
Durapore silk tape 3M 1538-1
Feather disposable scalpel Feather 02.001.30.011
Fine Bore Polythene Tubing 0.58 mm ID Smiths medical 800/100/200
Histoacryl Braun 1050052 5x 0.5 ml
Leukoplast BSN Medical Inc.
Microscope Slides ROTH 1879
Poly-Alcohol Haut…farblos Antisepticum Antiseptica GmbH 72PAH200
Sterican needle 18 G x 1 B. Braun 304622
Sterican needle 27 3/4 G x 1 B. Braun 4657705
Tissue paper commercially available
Surgical Instruments
Amalgam burnisher 3PL Gatz 0110?
Blair retractors (4 pronged (blunt)) x2 Storz&Klein S-01134
Dumont No.7 forceps Fine Science Tools Inc. 91197-00
Graefe forceps curved x1 Fine Science Tools Inc. 11151-10
Graefe forceps straight x2 Fine Science Tools Inc. 11050-10
Heidemann spatula HD2 Stoma 2030.00
Needle holder Mathieu Fine Science Tools Inc. 12010-14
Scissor Fine Science Tools Inc. 14074-11
Semken forceps Fine Science Tools Inc. 11008-13
Small surgical scissors curved Fine Science Tools Inc. 14029-10
Small surgical scissors straight Fine Science Tools Inc. 14028-10
Standard pattern forceps Fine Science Tools Inc. 11000-12
Vannas spring scissors Fine Science Tools Inc. 15000-08
Equipment
ECG Trigger Unit Rapid Biomedical 3000003686
MICROCAPSTAR End-Tidal Carbon Dioxide Analyzer AD Instruments
Minivent Typ 845 Harvard Apparatus 73-0043
Multiphoton microscope Trimscope I LaVision
Perfusor Compact B. Braun
PowerLab 8/30 8 channel recorder AD Instruments PL3508
Temperature controlled heating pad Sygonix 26857617
Temperature sensor comercially available
Temperature controlled System for Microscopes -Cube&Box Life Imaging Services

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References

  1. Dusseaux, M., et al. Human MAIT cells are xenobiotic-resistant, tissue-targeted, CD161hi IL-17-secreting T cells. Blood. 117, (4), 1250-1259 (2011).
  2. Reese, A. J. The effect of hypoxia on liver secretion studied by intravital fluorescence microscopy. Br J Exp Pathol. 41, 527-535 (1960).
  3. Bhathal, P. S., Christie, G. S. Intravital fluorescence microscopy study of bile ductule proliferation in guinea pigs. Gut. 10, (11), 955 (1969).
  4. Stefenelli, N. Terminal vascular system and microcirculation of the rat liver in intravital microscopy. Wien Klin Wochenschr. 82, (33), 575-578 (1970).
  5. Hori, T., et al. Simple and sure methodology for massive hepatectomy in the mouse. Ann Gastroenterol. 24, (4), 307-318 (2011).
  6. Tanaka, K., et al. Intravital dual-colored visualization of colorectal liver metastasis in living mice using two photon laser scanning microscopy. Microsc Res Tech. 75, (3), 307-315 (2011).
  7. Schemmer, P., Bunzendahl, H., Klar, E., Thurman, R. G. Reperfusion injury is dramatically increased by gentle liver manipulation during harvest. Transpl Int. 13, Suppl 1. S525-S527 (2000).
  8. Schemmer, P., et al. Activated Kupffer cells cause a hypermetabolic state after gentle in situ manipulation of liver in rats. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 280, (6), G1076-G1082 (2001).
  9. Toiyama, Y., et al. Intravital imaging of DSS-induced cecal mucosal damage in GFP-transgenic mice using two-photon microscopy. J Gastroenterol. 45, (5), 544-553 (2010).
  10. Zimmon, D. S. The hepatic vasculature and its response to hepatic injury: a working hypothesis. Yale J Biol Med. 50, (5), 497-506 (1977).
  11. Wong, J., et al. A minimal role for selectins in the recruitment of leukocytes into the inflamed liver microvasculature. J Clin Invest. 99, (11), 2782-2790 (1997).
  12. Bonder, C. S., et al. Essential role for neutrophil recruitment to the liver in concanavalin A-induced hepatitis. J Immunol. 172, (1), 45-53 (2004).
  13. Xu, C., Zipfel, W., Shear, J. B., Williams, R. M., Webb, W. W. Multiphoton fluorescence excitation: new spectral windows for biological nonlinear microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, (20), 10763-10768 (1996).
  14. Centonze, V. E., White, J. G. Multiphoton excitation provides optical sections from deeper within scattering specimens than confocal imaging. Biophys J. 75, (4), 2015-2024 (1998).
  15. Amore, J. D., et al. In vivo multiphoton imaging of a transgenic mouse model of Alzheimer disease reveals marked thioflavine-S-associated alterations in neurite trajectories. J Neuropathol Exp Neurol. 62, (2), 137-145 (2003).
  16. Hickey, M. J., Westhorpe, C. L. V. Imaging inflammatory leukocyte recruitment in kidney, lung and liver--challenges to the multi-step paradigm. Immunol Cell Biol. 91, (4), 281-289 (2013).
  17. McLellan, M. E., Kajdasz, S. T., Hyman, B. T., Bacskai, B. J. In vivo imaging of reactive oxygen species specifically associated with thioflavine S-positive amyloid plaques by multiphoton microscopy. J Neurosci. 23, (6), 2212-2217 (2003).
  18. Geissmann, F., et al. Intravascular Immune Surveillance by CXCR6+ NKT Cells Patrolling Liver Sinusoids. PLoS Biology. 3, (4), (2005).
  19. Velázquez, P., et al. Cutting edge: activation by innate cytokines or microbial antigens can cause arrest of natural killer T cell patrolling of liver sinusoids. J Immunol. 180, (4), 2024-2028 (2008).
  20. Wehr, A., et al. Chemokine receptor CXCR6-dependent hepatic NK T Cell accumulation promotes inflammation and liver fibrosis. J Immunol. 190, (10), 5226-5236 (2013).
  21. Khandoga, A., Hanschen, M., Kessler, J. S., Krombach, F. CD4+ T cells contribute to postischemic liver injury in mice by interacting with sinusoidal endothelium and platelets. Hepatology. 43, (2), 306-315 (2006).
  22. Egen, J. G., et al. Macrophage and T cell dynamics during the development and disintegration of mycobacterial granulomas. Immunity. 28, (2), 271-284 (2008).
  23. Beattie, L., et al. Leishmania donovani-induced expression of signal regulatory protein alpha on Kupffer cells enhances hepatic invariant NKT-cell activation. Eur J Immunol. 40, (1), 117-123 (2010).
  24. Beattie, L., et al. Dynamic imaging of experimental Leishmania donovani-induced hepatic granulomas detects Kupffer cell-restricted antigen presentation to antigen-specific CD8 T cells. PLoS Pathog. 6, (3), e1000805 (2010).
  25. McDonald, B., et al. Intravascular danger signals guide neutrophils to sites of sterile inflammation. Science. 330, (6002), 362-366 (2010).
  26. Vanheule, E., et al. An intravital microscopic study of the hepatic microcirculation in cirrhotic mice models: relationship between fibrosis and angiogenesis. Int J Exp Pathol. 89, (6), 419-432 (2008).
  27. Jenne, C. N., Kubes, P. Immune surveillance by the liver. Nat Immunol. 14, (10), 996-1006 (2013).
  28. Zimmermann, H. W., Tacke, F. Modification of chemokine pathways and immune cell infiltration as a novel therapeutic approach in liver inflammation and fibrosis. Inflamm Allergy Drug Targets. 10, (6), 509-536 (2011).
  29. Kim, J. V., et al. Two-photon laser scanning microscopy imaging of intact spinal cord and cerebral cortex reveals requirement for CXCR6 and neuroinflammation in immune cell infiltration of cortical injury sites. J Immunol Methods. 352, (1-2), 89-100 (2010).
  30. Karlmark, K. R., et al. Hepatic recruitment of the inflammatory Gr1+ monocyte subset upon liver injury promotes hepatic fibrosis. Hepatology. 50, (1), 261-274 (2009).
  31. Heymann, F., et al. Hepatic macrophage migration and differentiation critical for liver fibrosis is mediated by the chemokine receptor C-C motif chemokine receptor 8 in mice. Hepatology. 55, (3), 898-909 (2012).
  32. Ramachandran, P., et al. Differential Ly-6C expression identifies the recruited macrophage phenotype, which orchestrates the regression of murine liver fibrosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, (46), E3186-E3195 (2012).
  33. Moles, A., et al. A TLR2/S100A9/CXCL-2 signaling network is necessary for neutrophil recruitment in acute and chronic liver injury in the mouse. J Hepatol. 60, (4), 782-791 (2014).
  34. Hammerich, L., et al. Chemokine receptor CCR6-dependent accumulation of γδ T cells in injured liver restricts hepatic inflammation and fibrosis. Hepatology. 59, (2), 630-642 (2014).
  35. Syn, W. -K., et al. NKT-associated hedgehog and osteopontin drive fibrogenesis in non-alcoholic fatty liver disease. Gut. 61, (9), 1323-1329 (2012).
  36. McDonald, B., et al. Interaction of CD44 and hyaluronan is the dominant mechanism for neutrophil sequestration in inflamed liver sinusoids. J Exp Med. 205, (4), 915-927 (2008).
  37. Egen, J. G., et al. Intravital imaging reveals limited antigen presentation and T cell effector function in mycobacterial granulomas. Immunity. 34, (5), 807-819 (2011).
  38. Singer, G., Stokes, K. Y., Granger, D. N. Hepatic microcirculation in murine sepsis: role of lymphocytes. Pediatr Surg Int. 24, (1), 13-20 (2008).
  39. Phillipson, M., Kubes, P. The neutrophil in vascular inflammation. Nat Med. 17, (11), 1381-1390 (2011).
  40. Khandoga, A. G., et al. In vivo imaging and quantitative analysis of leukocyte directional migration and polarization in inflamed tissue. PLoS One. 4, (3), e4693 (2009).

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