CXCR6.Gfp 기자 마우스를 사용하여 건강하고 병에 걸린 간에서 면역 세포의 장기 생체 내에 다중 광자 현미경 이미징

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Immunology and Infection

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Heymann, F., Niemietz, P. M., Peusquens, J., Ergen, C., Kohlhepp, M., Mossanen, J. C., Schneider, C., Vogt, M., Tolba, R. H., Trautwein, C., Martin, C., Tacke, F. Long Term Intravital Multiphoton Microscopy Imaging of Immune Cells in Healthy and Diseased Liver Using CXCR6.Gfp Reporter Mice. J. Vis. Exp. (97), e52607, doi:10.3791/52607 (2015).

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Abstract

부상에 대한 응답으로서 간염은 단핵구, 호중구, T 세포의 서브 세트, B 세포, 자연 살해 (NK) 및 NKT 세포의 구별을 포함한 백혈구 아형의 침입을 수반하는 매우 동적 인 과정이다. 면역 세포의 이동을 모니터링하기위한 생체 내에 간 현미경 인해 시료 전처리 및 고정, 광학 해상도 및 장기 생존 동물에 대한 높은 요구에 특히 도전적이다. 그러나, 염증 과정뿐만 아니라, 셀룰러 상호 작용 연구 역학 잘 염증성 간 질환의 개시, 진행 및 회귀 이해에 중요한 정보를 제공 할 수있다. 따라서, 매우 민감하고 신뢰할 수있는 방법은 집중 치료와 함께 마이그레이션 및 생체 내에 두 광자 레이저 스캐닝 현미경 (TPLSM)에 의해 오랜 기간 (약 6 시간)을 마우스 간에서 다른 면역 세포의 세포 - 세포 상호 작용을 연구하기 위해 설립되었습니다 모니터링.

이비인후과 "> 제공 방법은 부드러운 준비 및 기관의 최소 섭동과 간의 안정적인 고정을 포함하며, 장기간 생체 내에 촬상 추적을 허용하는, 최대 6 시간의 기간 동안 사실상 광표백 또는 광독성 효과 다색 다 광자 현미경을 사용하여 마우스 중요한 매개 변수와 순환, 온도, 가스 교환의 안정화의 광범위한 모니터링에 의한 안정적인 영상 조건, 특정 백혈구 하위 집합.

CXCR6.gfp 간염시 림프구 마이그레이션을 조사하기 위해 넉 - 생쥐 기준선 조건 하에서 사염화탄소 복강 내 주사 발 CCL (4)에 의해 유도되는 급성 및 만성 간 손상 후 생체 내에 간 촬상을 실시한다.

천연 킬러 (NK) - - 또한 그러한 CD4 T 세포로서 T 림프구 서브 세트했지만 점막 associ CXCR6 주로 자연 살해 T (NKT)에 림프구상에서 발현 케모카인 수용체이며ated의 불변 (MAIT) T 세포 하나. 간 손상에 따라 자신의 변화된 행동에 대한 상세한 통찰력과 질병의 진행에 따라서 잠재적 인 참여를 허용 CXCR6.gfp + 면역 세포의 이주 패턴과 위치에 따라.

Introduction

세포 및 전체 기관의 세포 기능 또는 전체 유기체의 시각화는 본체 (2)의 거의 모든 부분을 포함, 50 년 이상 큰 관심이었다. 따라서 일부 초기 연구는 이미 간 3,4의 생체 내에 이미지를 고용했다. 그러나, 다음과 같은 몇 가지 제한 사항이 간 조직의 장기 안정적인 고해상도 영상에 관한 최신 상태로 존재한다.

다이어프램 인해 위장관 5 밀착 간 해부학 위치로, 미세한 생체 내에 이미징을위한 가장 일반적인 문제는 장관 (6)의 낮은 정도, 연동 운동 호흡 때문이며. 고형 장기에 비해, 간 수술 특히 도전적이다. 때문에 조밀 한 미세 혈관 구조에, 수술 조작, 대규모 출혈성 병변 거주자의 장애 미세 7도 활성화를 이끌 수 있습니까이러한 쿠퍼 세포 (8)과 같은 mmune 세포. 따라서, 조직의 기계적인 고정화 -6,9-가 생체 내에 현미경 이미징에 간섭 가능성이 다른 공표.

건강한 간에서, 총 혈액량 10~15 %가 간 혈관 내에 존재하고, 기관은 순환의 변화 (예를 들면, 혈압 변동에 매우 민감 장기 렌더링 전체 심 박출량 (10)의 약 25 %를 ). 따라서, 과도한 조직 처리 또는 중앙 집중식 순환에 의해 예를 들면, 전단 응력, 변위, 부상으로 간 혈액 흐름의 중단뿐만 아니라 간 면역 반응에 영향을 미치는, 백혈구 철새 행동의 인공 변경, 손상된 간 산소 때문에 더 간 손상으로 이어질 것 장기 보존과 동물의 전체 수명 등.

초기 현미경 연구는 생체 내에 표면 형광 마일 기반으로했다croscopy 있으나, 이러한 포토 블리치 낮은 침투 깊이와 같은 여러 기술적 인 제약은 장기 간 촬상 4,11,12 본 기술의 사용을 제한한다. 이 새로운 방법은 실생활 13-15에서 거의 모든 장기에 영상 연구를 수행 할 기술적으로 가능했다으로 1990 년대에 다 광자 현미경의 발달과 함께, 사진 표백 또는 침투 깊이의 한계는 주로 해결되었다. 그러나, 간 영상에 대하여 주 남은 과제였다 : 몇 시간 이상 16 시간 동안 사인 곡선의 불변 간 혈류, 특히 안정된 촬상 확보 호흡 운동, 간 조직의자가 형광이.

여러 연구는 간에서 17 예, NKT 세포 18-20, 21, 22 T 세포, 대 식세포 간 23,24 또는 25 호중구, 장기 광자 m 함수를 다양한 백혈구의 이동을 해결되지만icroscopy 영상은 아직 성공적으로 인해 추가 손상 (26)에 대한 기존의 손상 때문에 더 높은 감수성에 작업이 훨씬 더 도전 급성 또는 만성 간 질환 동물에서 설립되지 않았다. 그러나, 실시간으로 간에서 백혈구의 철새 행동과 세포 기능을 모니터링 간 항상성과 질병 (27)에서의 특정 역할에 새로운 통찰력을 할 수 있습니다.

케모카인 수용체 CXCR6 자연 킬러 (NK) 세포, NKT 세포 및 일부 T 세포를 포함한 여러 18,28 개체군 림프구 서브 세트 상에 발현된다. 마우스에서의 연구는 이전 CXCR6와 동족 리간드 CXCL16 항상성 동안 간 정​​현파에 NKT 세포의 순찰을 제어 할 수 있음을 나타내었다. 결과적으로, (CXCR6 궤적에 녹색 형광 단백질 [GFP]의 노크에 들고) CXCR6.gfp 마우스의 사용은 뇌 29 등의 각종 장기에 림프구의 이동을 조사 설명 하였지만또한 간 (18, 20)는, 염증에 CXCR6.gfp 세포의 침윤을 증가 게재.

본 연구에서 제공된 방법에 안정화 된 조건 하에서 장기간에 걸쳐 이러한 프로세스를 수행 할 수 있었다. 생체 내에 광자 기반의 절차는 동물과 기관의 최소한의 교란과 높은 재현성했다 이미징을 허용; 호흡과 순환의 가까운 제어 다음에 광범위한 모니터링하여 장기 동물의 생존을 위해 최적화; 매우 유연하고 쉽게는 신장이나 비장 등의 실질 장기로도 채택한다.

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Protocol

참고 : 실험 (NIH 간행물, 8 판, 2011) '관리 및 사용 실험 동물의를위한 안내서'다음 동물 연구에 적용되는 독일 법규에 따라 수행하고, 동물의 보호에 관한 지침 63분의 2,010 / EU 과학적인 목적 (유럽 연합의 공식 저널, 2010)에 사용됩니다. 공식 권한은 정부의 동물 관리 및 사용 사무실 (LANUV 노르 트라 인베스트 팔렌, 레 클링 하우젠, 독일)에서 수여되었다.

주 : 단기 촬상 생략 할 수있는 단계는 제조 시간을 단축하고 수술 프로토콜을 간단하게 별표 (*)로 표시된다 (예를 들면도 촬영, 3-D 스택 또는 짧은 기간 경과 현미경 스냅). 그러나 필요한 생존 시간이 현저히 감소 될 경우 이미징 또한 광범위한 모니터링 및 제어를 순환시키지 않고 수행 될 수있다.

1. 현미경의 설치 및 사전 수술 준비 (5 ~ 10 마일N)

  1. (현미경, 전력 연구소, 레이저, 전기 패드, 기후 챔버, 웹 캠, 주사기 펌프 장치, 인공 호흡기)에 스위치 시스템.
  2. 1.5 부피 %에 O 2 아이소 플루 란 증기를 공급하고 설정 아이소 플루 란 수준을 연결합니다 (V는 / V), 작은 동물 인공 호흡기에 연결합니다.
    1. 단기 이미징, 초기 IP 마취 유도 후 이소 플루 란을 이용하여 마취를 유지한다 (단계 2.2 참조). 이어서 안정 간 미세 순환을 보장하는 2 부피 % (v / v)의 아이소 플루 란을 사용하고, 2 시간 미만 촬상 시간을 유지한다.
  3. 150 ~ 200 μL의 볼륨 120-140 호흡 사이클 / 분에 호흡을 설정합니다.
  4. 마우스 아가로 오스 단계를 설정합니다. 40 °의 각도에서 접시 (약 10cm X 15cm베이스)로 쏟아져, 3 % (w / v) 아가로 오스 100 ㎖를 준비한다.
  5. 필요한 장비를 수집하는 수술 작업 영역을 설정합니다. 미생물 감염을 방지하기 위해, Sekusept 포르테 S의 1 % 용액 (사용 악기를 9.9 % / V w 소독), Glutaral V / w 9.8 %, 실험 (그림 1A 전에 5 분 동안 포름 알데히드).
  6. 나머지 구성 요소를 얻 피부 소독제 (예를 들면, 10 %, 포비돈 요오드 용액), 간 스테이지 (스택 및 다리), 아가로 오스 용액 (3 % (w / v)의 PBS)에서 5 %, 주사기 펌프 (W / V) 포도당 용액을 마취 용액 I (케타민 0.1 ㎎ / ㎖, 크 실라 0.5 ㎎ / ㎖, 펜타닐 5 ㎍ / ㎖), 면봉, N- 부틸 -2- Cyanoacrylat, 1X PBS와 함께 (G-5), 시린지 펌프. 예열 배양 챔버에 아가로 오스 단계 접시를 넣어.

2. 기관 절개술 (10 ~ 15 분)

  1. 25-28g 무게 하우스 사육에서 C57BL / 6 마​​우스를 사용합니다. 하우스 12 시간 조명 / 12 시간 어두운주기와 온도 -에서 FELASA의 지침에 따라, 습도 제어 환경에서 무균 조건 하에서 마우스. 동물에게 표준 마우스 다이어트 (냄새를 맡아 표준 설치류 다이어트)와 물을 자유 섭취에 무료로 액세스 할 수 있습니다.
  2. 초기화하여 마우스를 마취원점이라 복강 내 마취 솔루션 II 250 μL (케타민 0.1 ㎎ / ㎖, 크 실라 1 ㎎ / ㎖, 부 프레 놀핀 10 ㎍ / ml)에의 (IP) 주입.
    1. * 생체 내에 촬상 동안 유지비를 들어, 연속적으로 연속 IP 주입하여 마취 용액 I를 관리 (케타민 0.1 ㎎ / ㎖, 크 실라 0.5 ㎎ / ㎖, 펜타닐 5 ㎍ / mL)을 0.2 ㎖ / hr의 유량으로 주사기 펌프 장치를 이용 inhalative 이소 플루 란 0.5 부피 % 조합 (v / v)로.
    2. , 기관 절개술을 위해 피부를 소독, 5 분 (집게로 예를 들어 핀치 발 패드) 후 반사를 확인 마우스가 수술 허용 마취 상태에있는 경우 준비를 시작합니다.
    3. (그림 1B)를 건조로부터 각막을 방지하기 위해 눈 보호 크림 (예를 들어, Dexpanthenol 50 ㎎ / g)을 적용합니다.
  3. 사지에 대한 접착 테이프를 사용하여 복부 측면을 노출 준비 테이블에 마우스를 흥분시키는; 부드럽게,이 위치에 고정하세요 예. 목을 잡아 늘, 고무 밴드를 사용하여 t을 푹앞니 오.
    1. 면봉으로 소독을 적용하여, 포비돈 요오드 용액을 이용하여 피부와 모피를 소독.
  4. 직접 턱 아래에 초기 피부 인하 (0.5 cm 길이)을 수행 (그림 1C)
    1. 조심스럽게 침샘 (그림 1D) 사이의 결합 조직을 해부하다.
    2. 조심스럽게 개방 근육 튜브 주위 기관 (그림 1E, F)를 눈물.
  5. 나중에 환기 튜브 고정 (그림 1G)에 대한 기관 아래 수술 스레드를 놓습니다.
    1. T 자형 절개를 수행 연골 고리 사이에 마이크로 가위로 열기 기관 (그림 1H)
  6. 절개 (~ 0.5 cm)를 통해 기관에 환기 튜브를 놓습니다. 앞으로 튜브를 밀어 작은 해부 집게로 꼬리 끝을 잡고 부드럽게 기관지에 튜브를 사전에 (그림 1I)
  7. 수술 스레드와 튜브를 흥분시키는 (예 : (그림 1J, K)을 방지하기 위해 피부에 튜브의 두 번째 두개골 고정을 수행합니다.
  8. 조직 접착제 (예를 들면, n- 부틸 -2- Cyanoacrylat) (그림 1L)와 인감 잘라.
  9. 접착 테이프를 사용하여 머리에 튜브를 흥분시키는.

3. Laparatomy (15 ~ 20 분)

  1. 저체온증을 방지하기 위해 가열 패드에 마우스를 놓습니다. 복부를 면도 조심스럽게 피부에서 머리를 제거합니다. 포비돈 요오드 용액을 사용하여 면도 모피 소독.
  2. 수술 가위 (그림 2A)를 사용하여 흉골 아래로 잘라 작은 피부를 수행합니다. 출혈을 방지하기 위해 모든 눈에 보이는 혈관을 소작, 측면 양쪽에 갈비뼈 아래 컷을 확장합니다.
  3. 조심스럽게 복막 (그림 2B)를 열고, 흉골 아래의 원격 교육 알바에 작은 상처를 수행합니다. cauteriz를 사용하여 양쪽에 상처를 확장ATION (그림 2C, D)를 출혈 방지합니다.
  4. 아가로 오스 단계 접시 (그림 2E)에 마우스를 놓습니다. 마우스 (일반적으로 12 ~ 14 커버 슬립) (그림 2 층)의 양쪽에 적절한 높이의 스택을 놓습니다.
  5. 호흡과 현미경을 동기화하는 등 위쪽 아래 호흡 트리거 센서를 놓습니다. 트리거 장치 (그림 2G)를 활성화합니다.
  6. 리브 (그림 2I)을 철회 흉골을 통해 수술 스레드 (5-0) 놓습니다.
  7. 조심스럽게 곡선 수술 가위를 사용하여 간, 다이어프램 (낫 모양의 인대)를 연결하는 인대뿐만 아니라 간, 위장관를 잘라. 대동맥 (그림 2J)까지 낫 모양의 인대를 잘라.

4. 샘플 설정 (10 ~ 15 분)

  1. 큰 간 엽에 쉽게 액세스 할 수 있도록 45 °의 각도로 오른쪽 마우스를 놓습니다.
  2. 복부를 덮고, 갈비뼈 아래 준비 브리지 추가공동. 예리한 에지 (도 2K)을 덮도록 접착 테이프 코팅 표준 커버 슬립을 사용하여 다리 제조.
  3. 무대에서 큰 간 로브를 놓습니다. 조심스럽게 이중 볼 스타일러스 프로브 또는 간 아래 패딩 주걱을 미끄러 젖은 면봉이나 물티슈를 사용하여 기관의 상단을 누르고 있습니다. 슬라이드에 로브를 들어 올리고 부드러운 드래그을 적용합니다. 로브가 휘거나 접을 수 있습니다. 간 (그림 2L) 만 부드러운 조작에 각별한주의를 제공합니다.
  4. 예를 들어, 작은 커버 슬립 (20mm X 20mm), 옆에있는 간 엽의 거의 동일한 높이의 더미 커버 슬립을 지원하기 위해 측면 지원 지분을 놓습니다.
  5. 간 엽에 큰 커버 슬립 (24mm × 50 mm)를 놓습니다. 그 커버 슬립을 확인하는 것은 가능합니다 (그림 2M)으로 수평으로 배향된다.
    주 : 커버 슬립을 압박하지 않고 조직과 접촉해야한다. 장애인 혈액의 흐름 (흰색 조직)의 흔적이 없는지 확인합니다. microcirc 경우위험률이 중단되고, 추가로 지분을 지원하고 추가 할 수 있습니다.
  6. * 장기 마취 및 G-5 응용 프로그램에 대 한 장소 두 개의 독립적 인 복강 내 카테터 (그림 2N). 다음 뒷다리로 하복부에 횡 방향으로 카테터를 설치합니다.
    참고 : 복강 내 카테터는 자체 제작 유연한 실리콘 튜브 (그림 3)과 27 G 바늘을 연결하여 할 수 있습니다.
  7. * 피부에 5-0 수술 스레드의 루프를 흥분시키는 바늘 실수 변위를 방지 할 수 있습니다.
  8. * I 1 카테터 마취 용액과 주사기 펌프를 장착, 0.2 ㎖ / 시간으로 설정 유량; 0.1 ㎖ / 시간에 카테터 2 G-5 주사기 펌프, 설정 유량을 연결합니다.

5. 마우스 모니터링

  1. * 장소 ECG 전면에 전극과 뒷다리 사지 (그림 4A).
  2. * 2 레벨 센서를 공동 만료 튜브를 연결합니다.
  3. (그림 4C 열 패드에 연결된 외부 온도 센서를 추가).

6. 임베딩 및 조직 고정 (5 ~ 10 분)

  1. 3 % 1X PBS에서 (w / v) 아가로 오스 100 ㎖를 준비합니다. 온도가 5 ML의 주사기와 18 G 바늘 (그림 5A)를 사용하여 41 ° C 일 때 간을 포함합니다.
  2. 커버 슬립에 마우스 (그림 5B, C)의 주위에 남아있는 아가로 오스를 붓고. 아가로 오스가 완전히 호화 때까지 기다립니다.
  3. 준비 간 엽 (그림 5D, E)를 스캔하기에 충분한 viewfield 큰 준비, 하이 데르 주걱을 사용하여 초과 아가로 오스를 제거합니다.

7. 영상

  1. 현미경 기후 챔버에 마우스를 전송합니다.
  2. 1X PBS의 50 ~ 100 ML을 추가 (37 ° C에 예열).
  3. 증발 (그림 5 층)을 방지하기 위해 샘플 접시를 커버.
  4. * 0.5 권 %로 inhalative 이소 플루 란을 감소 (v / v)로.
  5. *, ECG 모니터링 소프트웨어, 심박수 및 호기 CO 2 녹화를 시작.
  6. 영상을 시작합니다 라 열산이 셔터는 관심보기 필드를 식별 Z-스택에 대한 상부 및 하부 경계를 정의하고, 시간 경과 녹화를 시작합니다. Z-드리프트를 해결하기 위해 필요한 경우 (Z-스택을 다시 조정 예. 때문에 혈액의 압력 또는 온도 변화, 그림 (5 세대)의 변화.
    주 : 동물의 순환 또는 마취 영상주기의 경우 또는 완성이 불안정하게되면 (마취로부터 각성)없이 경추 탈구하여 쥐를 희생.

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Representative Results

우리의 생체 내에 TPLSM 접근 방식의 유효성을 확인하기 위해, 우리는 생체 내에 TPLSM 이미징에 CXCR6의 GFP / + 마우스를 실시. 마우스를 어느 기준선 대조군으로 방치 또는 급성 간 손상 유도 20 사염화탄소 단일 복강 내 주사 (사염화탄소)을 실시 하였다.

녹색 형광 인해 비디오 시퀀스는 2-5 시간의 기간 동안 수행 한 후, 세포는 시간이 지남에 따라 추적 하였다. 일반적으로 세포의 운동성을 표시하려면 절차를 수행하는 동안 감지 된 모든 트랙이 중첩 이미지 (그림 6A)으로 그려졌다. 기준선 조건 하에서 세포 중심 정맥 향해 간 정현파 따라 장거리 이동을 보였지만, 18 시간 처리 후 사염화탄소 CXCR6 + / GFP 세포는 이미 부분적으로 손상된 움직임 패턴을 나타내었다. 일부 빠르게 움직이는 세포가 여전히 간 정현파에 존재했지만, 몇 가지 초점 영역은 세포를 볼 수 있다고부상의 면적에 세포를 모집 화성 반응을 나타내는 로컬 주사 랜덤 이주로 변경했다. 효과는 더욱 사실상 활성 이주 CXCR6 + 세포의 거의 완전한 구속을 보여주는, 36 시간 후 발음했다. 기준 조건에서 대부분의 이주 세포가 임의의 방향 변화에 변수 마이그레이션 속도를 가지고 있지만, 사염화탄소 처리 된 동물은 어떤 자유롭게 운동성이있는 세포는 18 시간이 아닌 한 지 36 시간 후 사인 곡선을 순찰로 천천히뿐만 아니라 크롤링 된 세포를 보였다. 컬러 코딩 이주 트랙 사용하여 세포 속도는 사염화탄소 처리의 효과를 평가하기 위해 직접적으로 가시화 될 수있다. 36 시간 후에 아무 운동성 세포는 어떤 검출 가능한 없었지만 손상 마이그레이션, 18 시간 사염화탄소 후 장거리의 양뿐만 아니라 평균 트랙 길이는 현저하게 감소되었을 추적 보여주는도 정규화 트랙 도면 (도 6b)에서 볼 수 있었다 더. w 줄에이러한 발견 i 번째 자유롭게 맥관 순회 셀의 기능을 설명 셀룰러 변위는, 36 시간 간세포 손상 (도 6C)의 부위에서 사염화탄소 치료 후 세포의 포착을 나타내는, 시간이 지남에 따라 감소 하였다.

보다 상세히 간에서 CXCR6 + / GFP 세포 이동성 동작을 수행하기 위해, 각 셀의 대표 이동 속도는 시간이 지남에 따라 운동의 수준을 가시화 할 플롯 하였다. 우리와 다른 사람은 이전에 CXCR6 + / GFP 세포의 여러 가지 별개의 움직임 패턴을 설명 : 활동 무작위 크롤링을 부착 휴대 운동성 및 시간 대기 상태의 위상을 보여주는 패턴을 롤링; 활성 크롤링 할 수있는 여전히 관심의 영역하지만를 스캔 세포와 세포 모집을 지시; 면역 세포 활성화 18,20 동반 총 셀룰러 체포. 처리없이 마우스는 주로했다 세포를 보였다 자유롭게 모티르와 속도를 15 μm의 / 초까지, 사염화탄소로 처리 된 마우스에서 CXCR6 + / GFP 세포가 현저하게 36 시간 (그림 7A) 후 세포의 이동 속도와 부분 체포 이미 후 18 시간 및 전체 철새 체포 감소 표시됩니다. 단일 세포 분석 라인에서, 시퀀스 내의 모든 세포의 통계 데이터를 최대 이동 속도도 평균 트랙 속도 (그림 7C)에 의해 닮은 된 사염화탄소 처리 (그림 7B), 후 전체 이동 속도를 감소시키고 추적 나타났다 (그림 7D), 접근이 간 질환을 개발 세포 이동 및 위치 결정의 차이를 설명하는 데 적합한 것을 보여주는.

그림 1
도 1 :. 제조에 사용 된 마우스 기관 절개술 (A) 수술 장비. 1X 표준 후두둑N 집게, 1 배 Semken 집게, 1X 뒤몽 7 번 집게, Graefe 씨 집게 (4 갈래 (둔)), 이중 볼 스타일러스 프로브 하이 데르 (예를 들어, 아말감가는 사람 3PL)를 2 배 블레어 견인기 (직선 / 1 배 곡선을 톱니 모양의 2 배) 주걱 HD2, 바늘 홀더 (마티유 또는 할시), 1 배 작은 수술 가위 (날카로운 / 무딘, 1xcurved, 1X 직선), 마이크로 가위 (예를 들어, Vannas 스프링 가위), 1X 작은 동물 cauter, 면봉, 눈 보호 연고, 수술 스레드, N- 부틸 -2- Cyanoacrylatglue. (B) 눈은 눈 보호 연고를 사용하여 보호됩니다. (C)기도 준비를위한 초기 피부를 잘라. submaxillary 침샘 사이의 결합 조직 (D) 해부. 기관의 (E) 박람회. 기관지 주변 근육 조직 (F)의 해부. 튜브의 고정을위한 기관 아래 수술 스레드 (G) 배치. (H) Trache상 연골 고리 사이의 microscissors를 사용하여 알 절개. 기관에 환기 튜브 (I) 삽입. 뇌 수술 스레드 (J) 배치는 피부에 튜브를 해결하기 위해. (K) 튜브의 두 고정. (I) N 부틸 -2- Cyanoacrylat를 사용하여 수술 절개를 씰링. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
그림 2. Laparatomy 간 제조 (A) 초기 피부 절개는 혈관 과다 출혈을 막기 위해 소작 하였다. 흉골 아래에있는 복막의 (B) 열기. 소작 유닛을 이용하여 복막 컷 (C) 익스텐션. 상복부 혈관의 (D) 씰링. ( g> E) 갈비뼈 아래 복강 절개의 추가 확장. 아가로 오스 단계 접시에 동물의 (F) 배치. 지원 스택 (F) 배치. 호흡 트리거 센서 (G) 배치. (H) 호흡 동기화 이미징을위한 트리거 임계 값의 설정. (I) 흉골 고정 수술 스레드를 사용하여 갈비뼈를 철회합니다. 낫 모양의 인대의 다이어프램과 해부에서 담낭의 (J) 단선. 커버 슬립을 준비 중 (K) 배치. (L) 무대에 간 엽의 배치. 간 엽에 커버 슬립의 (M) 배치. (N) 부설 장기 마취의 IP 카테터의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 3 :. 유연한 실리콘 튜브로 연결 복강 카테터 27 G 바늘.

그림 4
그림 4 : 마우스의 모니터링. (A) 부설 ECG 전극 (녹색, 빨간색, 파란색 케이블)의. 같이 ECG 감지 바늘 피하 배치됩니다. ECG (적색)의 (B) 모니터링 장기적인 진행 (왼쪽)과 실제 측정 (오른쪽)를 보여 호기 CO 2 (파란색)와 심장 박동수 (빨간색). (C) 온도 가열 패드를위한 전력 제어 장치를 제어. 온도가 36 ° C로 설정되어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

항상 "> :"유지 - together.within 페이지를 = FO "ve_content 그림 5
그림 5 : 간 삽입 및 이미징. 간 로브 (A) 임베딩. PBS에서 3 % 아가 로즈는 18G 바늘이 ML의 주사기를 이용하여 커버 슬립하에 41 ℃에서 주입된다. (B) 간 로브 완전히 운동 아티팩트를 최소화하기 위해, 아가 로스에 매립된다. 탈수를 방지하기 위해, 아가 로스와 나머지 복막 (C) 씰링. 전체 호화 후보기의 아가로 오스 커버 현미경 필드의 (D) 제거. viewfield의 (E) 준비. Z 레벨 및 광학 현미경을 사용하여 샘​​플 혈액의 흐름 평가 F 조정. (D) 커버 요리 과도한 증발을 방지합니다. 커버 설정을 보여주기 위해 그림에 올려진다. 더 크게 보려면 여기를 클릭하십시오이 그림의 버전입니다.

그림 6
그림 6 :. 사염화탄소 주입 후 만성 간 손상에 CXCR6의 GFP / + 세포의 추적 쥐와 IP를 주입 하였다 0.6 ㎖ / ㎏ 해바라기 오일 18 시간 또는 이미징 전에 36 시간에 용해 사염화탄소. 한 바와 같이 실험 당일, 마우스 생체 내에 TPLSM 행 하였다. (A)는 여전히 세포 추적 이미지. 모든 시점에서 트랙 세포 운동성 및 변위를 보여 중첩되었다. 이미지는 단일 빔 타이탄 사피어 (Saphire) 레이저 840 nm에서와 TPLSM 현미경을 사용하여 촬영 하였다. 분야 스캔 사이클 당 30 초 정도의 샘플링 레이트와 70μm의 침투 깊이와 Z-3-5 스택 복용 스캔 된. (:; 보라색 천천히 움직이는 또는 고착 세포 : 운동성 세포 하늘색) 트랙 이동 속도를 보여주기 위해 색상으로 구분했다. 스케일 바 : 100 μ; m. (B) 트랙 방향성 및 트랙 길이 (μm의)를 보여주는 그들의 기원에 대한 표준화 경로의 XY-다이어그램. 기원에서 세포의 (C) 총 변위. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 7
그림 7 :.베이스 라인과 사염화탄소 처리 생쥐 세포가 간을 순찰 자신의 마이그레이션 속도를 분석 하였다에서 간 조직에서 생체 내에 TPLSM 다음 CXCR6의 GFP / + 세포의 마이그레이션 통계. 단셀 (A) 주제 속도는 시간이 지남에 따라. 속도는 각 시점에서 측정을 개별적으로 각각의 프레임에 대해 플롯 하였다. 선은 개별 셀을 나타냅니다. Y 축 최대 이동 속도에 따라 조정됩니다. (B) 세인트모든 세포에서 A. 프레임 특정 속도 atistical 분석은 그룹화 기준 분석 및 사염화탄소는 쥐를 처리 하였다. (C) 평균 트랙 속도가 모든 트랙에서 트랙과 데이터 당 계산되었다 분석을 위해 그룹화 하였다. 각 트랙의 (D) 최대 속도는 플로팅 분석 하였다. 모든 실험은 3 동물의 그룹에서 수행하고 결과는 두 개의 독립적 인 실험에서 확인되었다. *** P <0.001 (짝이없는 학생 t-test를 두가 꼬리). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

본 연구의 목적은 간 생체 내에 TPLSM 이미징 높은 표준화 안정적이고 재현성있는 방법을 개발하는 것이었다. 일반적으로 생체 내에 이미징은 원점 복귀 및 개발, 항상성과 질병에 다른 백혈구 인구의 상호 작용 다음과 같은 실제 생활 조건에서 세포의 행동에 대한 가치있는 통찰력을 부여하고있다. 그러나, 직접적으로 고형 장기에 비해 간뿐만 아니라 높은 취약성으로 인해 전송되는 호흡기 및 장내 연동 운동에 간 까다로울 해부학 위치가 안정된 장기간 생체 내에 이미징을위한 여러 과제를 부과. 최근 몇 년 동안 쥐에서 많은 실험 연구는 거주자 또는 단핵구 / 대 식세포 30-32, 호중구 (33) 또는 다양한 림프구 아형 (34, 35)을 침투로부터 큰 기여와 함께, 부상 간 28 면역 세포의 침윤의 높은 동적 특성을 계시했다. 그러나, m이러한 데이터의 OST는 엔드 포인트 분석 (예를 들어, 여러 가지 빛깔의이 동물을 희생 한 후 유동 세포 계측법)에서 유래되었다. 지금까지 단지 몇몇 연구는 여러 가지 빛깔의 생체 내에 이미지를 사용하여 간 염증 동안 휴대 전화 트래픽의 역학을 설명하는 존재. 거꾸로 현미경을 사용하여 인해 유리 (24) 아래로 조직의 밀착성에 고정 및 간 보습의 필요성을 우회. 많은 다 광자 현미경 직립 이미징 시스템으로서 구축되어 있기 때문에, 더 정교한 제조 방법 및 정착 화상의 시간 동안 조직을 안정화시키기 위해 필요하다. 일반적으로, 맞춤 제작 스테이징 시스템은 조직 정착 6, 36, 37에 대해 기재되어있다, 그러나 이들로 그것은 조직 심지어 최소 압력 병든 간 (38)에 더 심각한 영향 정현파 혈액 흐름에 영향을 받기 때문에, 간 미세을 검증 중요 .

따라서, 다음의 사항은 광고했다생체 TPLSM 이미징 한 결과 최적화하기 위해이 방법의 설정을 입고 : 미세의 최소화 샘플 교란과 파괴에 의해 준비의 품질 향상으로 인한 문제를 처리하는 방법에 대해 동물의 생존을 증가; 집중 치료 모니터링 및 예를 들어, 마취, 호흡과 순환 더욱 강화 된 동물 생존의 안정화 및 최소화 생리 학적 유물, 이후의 적응은 혈액 pH의 불균형에 의해 발생. 트리거 영상과 함께 제어 호흡은 호흡주기와 현미경의 동기화로 인해 운동 아티팩트를 제거하는 것이 필수적이었다. 생리적 염 농도에서 아가로 오스를 함유하는 장기의 매립 부드럽게 더 기계적 조작없이 제조 후의 장기를 흥분시키는 것이 유익이고 또한 샘플의 탈수를 방지. 간 현미경에 사용되는 대부분의 프로토콜은 역에만 불충분 한 방법을 제공 BLE, 장기 마취. 그러나, 동물의 생존율이 상당히 모니터링과 함께 여기에 제공된 결합 마취 프로토콜을 8 시간으로 생존을 보장하기에 충분 하였다 향상 될 수있다. 다른 방법은 호중구 침윤 39로 일반적으로 최대 3 시간까지의 시간주기 내에서 프로세스를 시각화 적합하지만 이상 이미지 예컨대 단핵구 또는 림프구 침윤 22 또는 세포 증식 6 같은 지속적인 처리를 할 가능성이 없다. 급성 및 만성 간 염증 동안에 채용, 침윤 및 셀룰러 상호 작용의 역학을 이해하는 것은 간 질환의 발생 및 진행에 대한보다 상세한 통찰력을 제공 할 수있다. 이러한 향상된 면역 병리의 이해를 사용하여 관심의 대상 셀을 어드레싱하기보다는 예를 들어 비 선택 방법을 사용하여 면역 억제의 관점에서 훨씬 더 세련 요법을 설계 할 수있을 것이다.

백혈구의 위치, 이주 및 상호 작용을 해결하기 위해 "> ove_content, 고품질 화상이 간 혈관 및 간 조직 내의 18,20,40 셀 4D 정확한 추적을 위해 필요하다.

우리는 여기에서 제공하는 방법은 (는) 모두 쉽게 취급 할 수있게하고 시료의 최소 섭동 효율적인 비용, 일반 실험실 시약 및 장치를 이용하여 적용 할 수있다. 가능한 한 오래 마우스의 생리 학적 상태를 유지하기 위해서는 산소 및 혈액 CO 2 준위도 조절할 호흡량 및 주파수를 미세 조정할 필요가있다. 때문에 복막에 액체의 연속 주입에 있지만 적어도 만 순환의 안정화에 관한 부분 제어 할 수 있도록 순환, 심전도 및 심장 주파수 측정을 안정화 할 수있는 임시 공급이있다. 직접 혈압 조절 및 중앙 정맥 액체 애플리케이션을 구현하여 그 가능성이 중요 parametERS는 안정성 및 생존의 추가적인 향상에 이어지는 더욱 안정화시킬 수있다.

심지어 매우 통제 된 조건 하에서, 일반적으로 아세트 아미노펜에 의한 간 손상으로 마우스에 사용되는 간 손상 모델에 노출 된 동물의 이미징, 사염화탄소에 의한 간 손상 또는식이에 의한 지방간 질환 도전 남아있다. 인해 대사 상태 제어 간과 순환에서의 중심 위치의 필수 기능, 간 기능이나 미세 동물의 직접적인 영향을 장기 생존율 따라서 가능성을 제한 변경 심하게 긴 TPLSM 비디오 시퀀스를 얻는 심각한 출혈 또는 파괴 미세 혈관와 예 : 손상된 장기. 또한, 광범위한 necroses와 모델에 심각하게 변경 간 microanatomy, 그것은, 세포 - 세포 상호 작용과 염증 세포의 집합체의 지역 구획화을 연구하기 어려운 남아 더 스탠 때문에(종래 현미경 또는 면역 형광에 DAPI 염색에서 헤 마토 오염성 등) 해부학 적 구조에 대한 dardized "카운터 염색"상기 촬상 처리에 의해 얻어진 데이터의 생체 내에 TPLSM.The 품질 가능 세포의 표지 강도에 의존 현미경 설정.

다양한 접근이 간에서의 GFP + 세포를 시각화하기 위해 존재한다. 매우 낮은 배경 형광과 함께 가장 높은 형광은 900 및 920 nm의 여기 파장 사이에서 얻어진다. 간 배경 형광의 거의 완전한 손실은 덱스 트란 또는 렉틴과 같은 추가적인 용기 추적기를 사용하지 않을 경우, 간암 세포 내 위치를 조사하는 것을 허용하지 않는다. 따라서 GFP 신호 너무 밝은 상세한 아니지만 간 형광 배경 사이의 최상의 비율을주고, 840 nm의 파장에서 이미지 마이그레이션 백혈구를 정했다.

이와 함께, INTR본 연구에 도입 아비탈 TPLSM 촬상 시스템 간 특정 생체 내에 현미경 질문 넓은 다양성에 적용될 수있다. 이 방법을, 같은 신장, 간, 방광, 장 또는 췌장과 같은 다른 고체 기관에 TPLSM 이미징 따라서 세포의 장기간의 철새 과정을 조사하기 위해 매우 유연한 접근 방식을 제공, 수술 및 조직 준비 만 약간의 수정으로 가능하다 생체.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anesthetics
Buprenorphine Essex Pharma 997.00.00 Analgeticum, 0.1 mg/kg
Fentanyl Rotex Medica charge: 30819
Fluovac anesthesia system Harvard Apparatus 34-1030
Glucose 5% Braun
ISOFLO (Isoflurane Vapor) vaporiser Eickemeyer 4802885
Isoflurane Forene Abbott B 506
Isotonic (0.9%) NaCl solution DeltaSelect GmbH PZN 00765145
Ketamin 10% ceva Charge: 36217/09
Xylazin 2% medistar Charge: 04-03-9338/23
Consumable supplies
20 ml Syringe BD Plastipak
250 ml Erlenmeyer flask Schott Duran 21 226 36
25 ml Beaker 2x Schott Duran 50-1150
2 ml syringe BD Plastipak
4-0 Vicryl suture Ethicon V7980
Agarose commercially available
Bepanthen Eye and Nose ointment Bayer Vital GmbH 6029009.00.00
Change-A-Tip Deluxe High-Temp Cautery Kit Fine Science Tools Inc. 18010-00
Cotton Gauze swabs Fuhrmann GmbH 32014
Cover Slip 24x50 mm ROTH 1871
Durapore silk tape 3M 1538-1
Feather disposable scalpel Feather 02.001.30.011
Fine Bore Polythene Tubing 0.58 mm ID Smiths medical 800/100/200
Histoacryl Braun 1050052 5x 0.5 ml
Leukoplast BSN Medical Inc.
Microscope Slides ROTH 1879
Poly-Alcohol Haut…farblos Antisepticum Antiseptica GmbH 72PAH200
Sterican needle 18 G x 1 B. Braun 304622
Sterican needle 27 3/4 G x 1 B. Braun 4657705
Tissue paper commercially available
Surgical Instruments
Amalgam burnisher 3PL Gatz 0110?
Blair retractors (4 pronged (blunt)) x2 Storz&Klein S-01134
Dumont No.7 forceps Fine Science Tools Inc. 91197-00
Graefe forceps curved x1 Fine Science Tools Inc. 11151-10
Graefe forceps straight x2 Fine Science Tools Inc. 11050-10
Heidemann spatula HD2 Stoma 2030.00
Needle holder Mathieu Fine Science Tools Inc. 12010-14
Scissor Fine Science Tools Inc. 14074-11
Semken forceps Fine Science Tools Inc. 11008-13
Small surgical scissors curved Fine Science Tools Inc. 14029-10
Small surgical scissors straight Fine Science Tools Inc. 14028-10
Standard pattern forceps Fine Science Tools Inc. 11000-12
Vannas spring scissors Fine Science Tools Inc. 15000-08
Equipment
ECG Trigger Unit Rapid Biomedical 3000003686
MICROCAPSTAR End-Tidal Carbon Dioxide Analyzer AD Instruments
Minivent Typ 845 Harvard Apparatus 73-0043
Multiphoton microscope Trimscope I LaVision
Perfusor Compact B. Braun
PowerLab 8/30 8 channel recorder AD Instruments PL3508
Temperature controlled heating pad Sygonix 26857617
Temperature sensor comercially available
Temperature controlled System for Microscopes -Cube&Box Life Imaging Services

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References

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