Langzeitintravital Multiphotonen Mikroskopie Imaging von Immunzellen in gesunden und kranken Leber Mit CXCR6.Gfp Reporter Mäuse

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Immunology and Infection

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Heymann, F., Niemietz, P. M., Peusquens, J., Ergen, C., Kohlhepp, M., Mossanen, J. C., Schneider, C., Vogt, M., Tolba, R. H., Trautwein, C., Martin, C., Tacke, F. Long Term Intravital Multiphoton Microscopy Imaging of Immune Cells in Healthy and Diseased Liver Using CXCR6.Gfp Reporter Mice. J. Vis. Exp. (97), e52607, doi:10.3791/52607 (2015).

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Abstract

Leberentzündung als Reaktion auf eine Verletzung ist ein hochdynamischer Prozess, der die Infiltration von verschiedenen Subtypen von Leukozyten einschließlich Monozyten, Neutrophile, T-Zellen-Untergruppen, B-Zellen, natürliche Killerzellen (NK) und die NKT-Zellen. Intravitalmikroskopie an der Leber zur Überwachung Immunzellmigration ist besonders herausfordernd aufgrund der hohen Anforderungen an die Probenvorbereitung und die Fixierung, die optische Auflösung und die langfristige Überleben des Tieres. Dennoch könnte die Dynamik von entzündlichen Prozessen sowie zellulären Interaktionsstudien kritische Informationen, um die Initiation, Progression und Regression von entzündlichen Lebererkrankungen besser zu verstehen ist. Daher wurde eine hochempfindliche und zuverlässiges Verfahren eingerichtet, um die Migration und Zell-Zell-Wechselwirkungen von verschiedenen Immunzellen in Mausleber über lange Zeiträume (ca. 6 h), die durch intravitale Zwei-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskopie (TPLSM) in Kombination mit Intensiv studieren Überwachung.

ent "> enthält die vorgesehenen Verfahren eine schonende Zubereitung und stabile Fixierung der Leber mit minimaler Störung des Organs, langfristig intravital Bildgebung mit Mehrfarben-Multiphotonen-Mikroskopie praktisch ohne Bleichen oder phototoxische Effekte über einen Zeitraum von bis zu 6 Stunden, so dass Tracking- spezifischer Leukozytenuntergruppen und stabile Bilderzeugungsbedingungen durch umfangreiche Überwachung Maus Vitalparameter und Stabilisierung der Zirkulation, Temperatur und Gasaustausch.

Lymphozytenmigration auf Leberentzündung untersuchen CXCR6.gfp Knock-in-Mäusen wurden intravitalen Bildgebung der Leber unter Ausgangsbedingungen und nach akuter und chronischer Leberschädigung durch intraperitoneale Injektion (en) von Kohlenstofftetrachlorid (CCl 4) verursacht wird, ausgesetzt.

CXCR6 ein Chemokin-Rezeptor auf Lymphozyten exprimiert, hauptsächlich auf Natural Killer T (NKT) -, natürliche Killer (NK) - und Untergruppen von T-Lymphozyten, wie CD4-T-Zellen, sondern auch Schleimhaut associATED invariant (MAIT) T-Zellen ein. Im Anschluss an die Migrationsmuster und die Positionierung der CXCR6.gfp + Immunzellen erlaubt einen detaillierten Einblick in ihr verändertes Verhalten auf Leberschäden und damit ihre mögliche Beteiligung im Fortschreiten der Krankheit.

Introduction

Die Visualisierung von Zellen und Zellfunktionen in ganzer Organe oder ganze Organismen von großem Interesse für mehr als 50 Jahren, darunter nahezu alle Teile des Körpers 2. Daher sind einige frühe Studien bereits intravital Bildgebung der Leber 3,4 eingesetzt. Es gibt jedoch einige Einschränkungen auf dem neuesten Stand in Bezug auf langzeitstabil hochauflösende Bildgebung von Lebergewebe.

Aufgrund der anatomischen Position der Leber in engem Kontakt mit der Membran und dem Gastrointestinaltrakt 5, das häufigste Problem für mikroskopische intravitalen Bildgebung Bewegung aufgrund der Atmung und, in geringerem Maße, Peristaltik des Verdauungstraktes 6. Im Vergleich zu anderen soliden Organen, ist die Leberchirurgie eine besondere Herausforderung. Aufgrund der dichten mikrovaskuläre Struktur kann chirurgische Manipulation zu massiven hämorrhagische Läsionen führen, Mikrozirkulationsstörungen 7 und auch die Aktivierung der ansässigen immune Zellen, wie Kupffer-Zelle 8. Daher mechanische Fixierung des Gewebes wie anderswo veröffentlicht 6,9 ist wahrscheinlich mit dem Intravitalmikroskopie Abbildungs ​​stören.

In einer gesunden Leber, 10-15% des Gesamtblutvolumens befindet sich innerhalb der Leber Gefäßsystem und das Organ erhält etwa 25% des Gesamtherzleistung 10, wodurch das Organ sehr anfällig für Veränderungen in der Blutzirkulation (zB Blutdruckschwankungen ). Daher werden Störungen in der Leberdurchblutung aufgrund zB Schubspannung, Vertreibung, Verletzungen, die durch eine übermäßige Gewebebehandlung oder zentrale Zirkulation künstliche Veränderungen der Leukozyten Zugverhalten, eingeschränkter Lebersauerstoffversorgung und damit weitere Leberschäden sowie führen, beeinflussen Leber Immunreaktionen als Organkonservierung und die Gesamtlebenszeit des Tieres.

Frühe mikroskopischen Untersuchungen wurden an Intravital Epifluoreszenz mi basiertMikroskopie, aber einige technische Einschränkungen wie Fotobleichung und geringe Eindringtiefe begrenzen den Einsatz dieser Technik für die langfristige Leber-Bildgebung 4,11,12. Mit der Entwicklung der Multiphotonen-Mikroskopie in den 1990er Jahren wurden die Grenzen der Fotobleichung oder Eindringtiefe im Wesentlichen gelöst, wie diese neue Methode technisch in der Lage, um bildgebende Studien in nahezu allen Organen unter realen Situationen 13-15 durchzuführen war. Jedoch sind die Haupt verbleibenden Herausforderungen bezüglich Bildgebung der Leber waren: Atembewegung, Autofluoreszenz von Lebergewebe, die Sicherung unveränderten Durchblutung der Leber-Sinusoiden und besonders stabile Bildgebung für längere Zeiträume von mehreren Stunden 16.

Obwohl mehrere Studien behandelt die Funktion und die Wanderung von verschiedenen Leukozyten in der Leber 17, zB NKT-Zellen 18-20, T-Zellen 21,22, Leber Makrophagen oder Neutrophile 23,24 25, langfristige Multi microscopy Abbildungs ​​noch nicht erfolgreich hergestellt wurde, die Aufgabe noch schwieriger bei Tieren mit akuten oder chronischen Lebererkrankung aufgrund der vorhandenen Schäden und damit eine höhere Anfälligkeit für weitere Schäden 26. Allerdings, Überwachungs- Zugverhalten und zelluläre Funktion von Leukozyten in der Leber und in Echtzeit ermöglicht neue Einblicke in ihre jeweilige Rolle bei Leber Homöostase und Krankheits 27.

Das Chemokinrezeptor CXCR6 an mehreren Lymphozytensubsets, einschließlich natürlicher Killerzellen (NK), NKT-Zellen und einige T-Zell-Populationen 18,28 ausgedrückt. Frühere Studien an Mäusen haben gezeigt, dass CXCR6 und ihre zugehörigen Liganden CXCL16 kann die Patrouillen der NKT-Zellen auf Lebersinusoide während Homöostase steuern. Folglich ist die Verwendung von CXCR6.gfp Mäusen (Tragen einer Knock-in-der Green Fluorescent Protein [GFP] im CXCR6 Locus) ist beschrieben worden, um die Migration von Lymphozyten in verschiedenen Organen, wie Gehirn 29 zu untersuchenund auch Leber 18,20 und zeigt bei Entzündungen erhöht Infiltration CXCR6.gfp Zellen.

Mit dem in dieser Studie zur Verfügung gestellten Verfahren war es möglich, diese Prozesse über einen langen Zeitraum unter stabilisierten Bedingungen zu folgen. Die Intravitalmultiphotonen-basiertes Verfahren erlaubt Bildgebung, die in hohem Maße reproduzierbar mit minimaler Störung des Tieres und der Orgel; optimiert für die langfristige Überleben der Tiere durch umfangreiche Überwachungs gefolgt von genaue Kontrolle der Atmung und Kreislauf; und hoch flexibel und leicht auch auf andere parenchymatösen Organen wie Niere oder Milz erlassen.

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Protocol

HINWEIS: Die Experimente wurden in Übereinstimmung mit den deutschen Rechtsvorschriften über Tierversuche nach dem "Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren" (NIH Veröffentlichung, 8. Auflage, 2011) durchgeführt und der Richtlinie 2010/63 / EU über den Schutz von Tieren für wissenschaftliche Zwecke (Amtsblatt der Europäischen Union, 2010) verwendet. Offizielle Genehmigung wurde von der staatlichen Tierpflege und Verwendung Büro (LANUV Nordrhein-Westfalen, Recklinghausen, Deutschland) gewährt.

HINWEIS: Die Schritte, die für kurzfristige Bildgebungs weggelassen werden können (zB Schnappschüsse, 3-D-Stapel oder auch kurzen Dauer Zeitraffer-Mikroskopie) sind mit einem Stern (*), um die Vorbereitungszeit zu reduzieren und vereinfachen das chirurgische Protokoll markiert. Bildgebung kann auch ohne umfangreiche Überwachung und Umlaufsteuerung ausgeführt wird, wenn jedoch notwendig, die Überlebenszeit merklich verringert werden.

1. Mikroskop-Setup und Pre-Chirurgie Vorbereitung (5-10 kmn)

  1. Switch-System auf (Mikroskop, Netz Lab, Laser, Heizkissen, Klimakammer, Webcam, Spritzenpumpe Gerät, Atemschutzmaske).
  2. Schließen O 2 Versorgung Isofluran Vapor und stellen Isofluran Ebene bis 1,5 Vol% (V / V), eine Verbindung zu einem kleinen Tierbeatmungsgerät.
    1. Für kurzfristige Bildgebung, halten die Anästhesie mit Isofluran nur nach der ersten IP-Narkose (siehe Schritt 2.2). Dann nutzen Sie 2 Vol% (v / v) Isofluran, und halten Sie die Aufnahmezeit weniger als 2 Stunden, um eine stabile Lebermikrozirkulation zu gewährleisten.
  3. Stellen Sie die Atmung zu 120-140 Atemzyklen / min mit einem Volumen von 150 bis 200 & mgr; l.
  4. Einrichten der Maus Agarose Bühne. Bereiten 100 ml 3% (w / v) Agarose, Gießen in eine Schale (ca. 10 cm x 15 cm-Basis) in einem Winkel von 40 °.
  5. Einrichten chirurgischen Arbeitsbereich sammeln die erforderliche Messtechnik. Um mikrobielle Infektion zu verhindern, Desinfektion Instrumente mit einer 1% igen Lösung von Sekusept Forte S (9,9% w / v) Glutaral 9,8% w / v, Formaldehyd für 5 min vor dem Experiment (Figur 1A).
  6. Erhalten übrigen Komponenten: Hautdesinfektionsmittel (zB 10% Povidon-Iod-Lösung), Leber-Stufe (Stapeln und Steg) und Agarose-Lösung (3% (w / v) in PBS), Spritzenpumpe mit 5% (w / v) Glucoselösung (G-5), Spritzenpumpe mit Anästhesielösung I (Ketamin 0,1 mg / ml, Xylazin 0,5 mg / ml, Fentanyl 5 ug / ml), Wattestäbchen, n-Butyl-2-Cyanoacrylat und 1x PBS. Setzen Agarose Bühne Gericht in Inkubationskammer zur Vorwärmung.

2. Tracheotomie (10-15 min)

  1. Verwenden C57BL / 6 Mäuse von Haus in Zucht einem Gewicht von 25 bis 28 g. Haus die Mäuse unter spezifischen pathogenfreien Bedingungen in Übereinstimmung mit den Richtlinien FELASA, in einer temperatur- und feuchtigkeitskontrollierten Umgebung mit 12 Stunden Licht / 12 h Dunkel-Zyklus. Lassen Tiere freien Zugang zu Standardmäusen Ernährung (Sniff Standard-Nagerfutter) und Wasser ad libitum.
  2. Betäuben die Maus von initial intraperitoneale (ip) Injektion von 250 ul Anästhesielösung II (Ketamin 0,1 mg / ml, Xylazin 1 mg / ml, Buprenorphin 10 ug / ml).
    1. * Für Halt während intravitalen Bildgebung, kontinuierlich zu verabreichen Anästhesielösung I durch kontinuierliche Injektion ip (Ketamin 0,1 mg / ml, Xylazin 0,5 mg / ml, Fentanyl 5 ug / ml) mit einer Spritze Pumpvorrichtung mit einer Fließgeschwindigkeit von 0,2 ml / h in Kombination mit inhalativen Isofluran 0,5 Vol% (v / v).
    2. Überprüfen Reflexe nach 5 min (zB Prise Fuß-Pad mit einer Pinzette), desinfizieren die Haut für Tracheotomie Startvorbereitung, wenn die Maus in der chirurgischen Anästhesie tolerant Zustand.
    3. Anwenden Augenschutzcreme (zB Dexpanthenol 50 mg / g) auf der Hornhaut vor dem Austrocknen (1B) zu verhindern.
  3. Fixieren Sie die Maus auf Vorbereitungstisch auszusetzen Bauchseite mit Klebeband für den Extremitäten; sanft dehnen Hals, in dieser Position zu fixieren, z. B., indem ein Gummiband eingehakt to der Schneidezähne.
    1. Desinfizieren Sie Haut und Fell mit Povidon-Iod-Lösung, durch die Anwendung Desinfektionsmittel mit einem Wattestäbchen.
  4. Mit den ersten Hautschnitt (0,5 bis 1 cm Länge) direkt unter das Kinn (1C)
    1. Sorgfältig sezieren Bindegewebe zwischen Speicheldrüsen (1D).
    2. Vorsichtig aufreißen Muskelschlauch umgebenden Luftröhre (1E, F).
  5. Zeigen chirurgischen Faden unter der Luftröhre zur späteren Belüftungsschlauch Fixierung (1G).
    1. Offene Luftröhre mit Mikroscheren zwischen Knorpelringe Führen eines T-förmigen Einschnitt (Figur 1H)
  6. Zeigen Belüftungsschlauch in die Luftröhre durch den Einschnitt (~ 0,5 cm). Um das Rohr nach vorne schieben, greifen Schwanzende mit kleinen anatomischen Pinzette und vorsichtig voran den Schlauch in die Luftröhre (1I)
  7. Fixieren Sie Rohr mit chirurgischen Faden (zB (Figur 1J, K) zu vermeiden.
  8. Dichtung geschnitten mit Gewebekleber (beispielsweise n-Butyl-2-Cyanoacrylat) (Abbildung 1 l).
  9. Fixieren Sie Rohr an der Spitze mit Klebeband.

3. Laparatomie (15-20 min)

  1. Platzieren Sie die Maus auf Heizkissen zu Unterkühlung zu verhindern. Rasur Bauch, entfernen Sie vorsichtig das Haar aus der Haut. Desinfizieren Sie rasierte Haut und Fell, indem Povidoniod Lösung.
  2. Führen Sie eine kleine Haut unterhalb des Brustbeins mittels chirurgischer Scheren (2A) geschnitten. Erweitern Sie den Schnitt seitlich unterhalb der Rippen für beide Seiten, Kauterisieren alle sichtbaren Blutgefäße, um Blutungen zu verhindern.
  3. Einen kleinen Schnitt an der Linea alba unterhalb des Brustbeins sorgfältig durchzuführen, das Öffnen der Bauchfell (2B). Erweitere Schnitt auf beiden Seiten mit cauterization Blutungen (2C, D) zu verhindern.
  4. Zeigen Maus in Agarose Bühne Schale (2E). Platzieren Stapel in geeigneter Höhe auf beiden Seiten der Maus (in der Regel 12-14 Deckgläschen) (2F).
  5. Zeigen Atemtriggersensor unter Nackenbereich, damit das Mikroskop mit der Atmung zu synchronisieren. Aktivieren Auslöseeinheit (2G).
  6. Zeigen chirurgischen Faden (5-0) durch das Brustbein zu Rippen (2I) zurückzuziehen.
  7. Schneiden Sie vorsichtig Bandanschluss Leber und Zwerchfell (Ligamentum falciforme) sowie Leber und Magen-Darmtrakt mit gebogenen chirurgische Scheren. Schneiden Sie das Ligamentum falciforme bis zur Aorta (2J).

4. Sample Setup (10-15 min)

  1. Platzieren der Maus auf der rechten Seite mit einem Winkel von 45 ° zum einfachen Zugriff auf große Leberlappen.
  2. Fügen Inszenierung Brücke unterhalb der Rippen, für den BauchHöhle. Herstellung einer Brücke mit Hilfe eines Standard-Deckglas mit Klebeband Beschichtung auf scharfe Kanten (Abbildung 2 K) zu decken.
  3. Legen Sie großen Leberlappen auf der Bühne. Vorsichtig rutschen Doppelkugel Stift-Sonde oder eine gepolsterte Spatel unterhalb der Leber und halten Sie die Spitze des Organs mit einem feuchten Wattestäbchen oder Feuchtgewebe. Heben Lappen auf den Objektträger und gelten sanften Widerstand. Lobe gebogen oder gefaltet werden. Geben Sie besonders darauf, nur sanfte Manipulation der Leber (Abbildung 2 l).
  4. Platzieren seitlichen Stütz Einsätze, beispielsweise Stapel von kleinen Deckplättchen (20 mm x 20 mm), der etwa auf gleicher Höhe der Leberlappen daneben Abdecküberzug zu unterstützen.
  5. Legen Sie großen Deckglas (24 mm x 50 mm) an der Leberlappen. Stellen Sie sicher, dass die Deckglas wird möglichst horizontal (Abbildung 2 M) ausgerichtet ist.
    HINWEIS: Das Deckglas sollte in Kontakt mit dem Gewebe, ohne zu quetschen. Überprüfen auf sichtbare Beeinträchtigung des Blutflusses (weiße Gewebe). Wenn MICROCIRCulation gestört ist, fügen Sie weitere Unterstützung Einsätze.
  6. * Platz zwei unabhängige intraperitoneale Katheter (Abbildung 2 N) für langfristige Anästhesie und G-5-Anwendung. Installieren Katheter seitlich im Unterbauch neben den hinteren Gliedmaßen.
    HINWEIS: Die intraperitoneale Katheter können self-made durch Anschluss 27 G Nadeln mit flexiblen Silikonschlauch (Abbildung 3).
  7. * Fixieren Nadel mit einer Schleife von 5-0 chirurgischen Faden auf der Haut, um eine versehentliche Verschiebung zu vermeiden.
  8. * Bringen Sie Spritzenpumpe mit Anästhesie-Lösung I mit dem Katheter 1, Durchflussmenge von 0,2 ml / h; befestigen Spritzenpumpe mit G-5 zum Katheter 2, eingestellt Flussrate von 0,1 ml / h.

5. Maus-Überwachung

  1. * Ort EKG-Elektroden in einen vorderen und hinteren Extremitäten (4A).
  2. * Bringen Sie Ablaufschlauch bis 2 Niveausensor CO.
  3. In externen Temperatursensor, um Heizkissen verbunden (4C).

6. Embedding und Gewebefixierung (5-10 min)

  1. Bereiten 100 ml 3% (w / v) Agarose in 1x PBS. Einbetten Leber, wenn die Temperatur auf 41 ° C unter Verwendung einer 5 ml-Spritze und einer 18 G-Nadel (5A).
  2. Strömen restliche Agarose auf Deckglas oder in der Maus (5B, C). Warten Sie, bis Agarose vollständig verkleistert wird.
  3. Entfernen Sie das überschüssige Agarose mit dem Heidemannspatel, die Vorbereitung einer View groß genug, um die vorbereitet Leberlappen (5D, E) zu scannen.

7. Imaging

  1. Übertragen Sie die Maus in Mikroskop Klimakammer.
  2. Fügen Sie 50-100 ml 1x PBS (vorgewärmt auf 37 ° C).
  3. Bedecken Sie Probenschale zu verhindern Verdampfung (5F).
  4. * Reduzieren inhalative Isofluran bis 0,5 Vol% (v / v).
  5. * Start Monitoring-Software, Aufzeichnung EKG, Herzfrequenz und exspiratorische CO 2.
  6. Starten Bildgebung: la öffnenser Läden, identifizieren Ansicht Interessengebiete definieren obere und untere Grenze für Z-Stapel, und starten Sie Zeitrafferaufnahmen. Nachstellen Z-Stapel, falls erforderlich, Z-Drift zu korrigieren (z. Aufgrund von Änderungen im Blutdruck oder Temperaturschwankungen, Figur (5G).
    HINWEIS: Nach Abschluss der Bildperiode oder wenn der Kreislauf oder Betäubung des Tiers wird instabil, opfern Mäuse durch Genickbruch (ohne Erwachen aus der Narkose).

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Representative Results

Um unsere Intravital TPLSM Ansatz zu validieren, die wir ausgesetzt CXCR6 gfp / + Mäuse Intravital TPLSM Bildgebung. Die Mäuse wurden entweder unbehandelt als Ausgangskontrollen oder auf eine einzelne intraperitoneale Injektion von Tetrachlorkohlenstoff (CCl 4) unterzogen, um akute Leberschäden 20 zu induzieren.

Videosequenzen wurden über einen Zeitraum von 2-5 h auf Grund ihrer grünen Fluoreszenz aufgenommen, und die Zellen wurden über die Zeit verfolgt. Um allgemeine zelluläre Motilität zeigen, wurden alle Spuren, die während des Verfahrens festgestellt wurden als überlagerte Bild (6A) aufgetragen. Während Zellen unter Kontrollbedingungen zeigte Fernwanderung entlang der Lebersinusoide auf die zentrale Vene, 18 Stunden nach der CCl 4 Behandlungs die CXCR6 + / GFP-Zellen zeigten bereits teilweise eingeschränkter Bewegungsmuster. Obwohl einige sich schnell bewegenden Zellen noch in den Lebersinusoide vorhanden, wurden mehrere Schwerpunkte mit Zellen sichtbar, dasswar von zufälligen Migration auf lokale Abtastung verändert, was auf eine chemotaktische Reaktion der Rekrutierung der Zellen zu dem Bereich der Verletzung. Der Effekt war sogar noch nach 36 h ausgesprochen, zeigt eine fast vollständige Festnahme von CXCR6 + Zellen praktisch ohne aktive Migration. Während unter Ausgangsbedingungen die meisten wandernden Zellen hatten variable Migrationsgeschwindigkeiten mit zufälligen Richtungsänderungen, zeigte CCl 4 behandelten Tieren Zellen, die nur langsam kriechen wurden sowie einige frei bewegliche Zellen patrouillieren die Sinuskurven nach 18 Stunden, aber nicht nach 36 Stunden. Verwendung farblich Migrationsbahnen könnten Zellgeschwindigkeit direkt visualisiert werden, um die Wirkung der CCl4-Behandlung zu beurteilen. Die beeinträchtigte Migration war auch in der normalisierten Gleisbild (Figur 6B) sichtbar, die zeigen, dass 18 Stunden nach CCl 4 die Menge des Fern-Wege sowie die durchschnittliche Streckenlänge wurde merklich reduziert, während nach 36 h keine beweglichen Zellen waren detektierbar mehr. Im Einklang with dieser Erkenntnisse die zelluläre Verschiebung, die die Fähigkeit einer Zelle, sich frei Patrouille der Vaskulatur beschreibt, verringert im Laufe der Zeit, was auf ein Einfangen der Zellen 36 Stunden nach der CCl4-Behandlung an der Stelle der Zellschädigung (6C).

Um das Zugverhalten von CXCR6 + / GFP-Zellen in der Leber im Detail zu folgen, wurde die Migrationsgeschwindigkeit der Vertreter einzelner Zellen aufgetragen, um das Niveau ihrer Beweglichkeit im Laufe der Zeit sichtbar zu machen. Wir und andere vorher beschrieben mehrere unterschiedliche Bewegungsmuster von CXCR6 + / GFP-Zellen: Aktiv Zufalls Crawling mit ein Knackwalzmuster, welche Phasen der Zellbeweglichkeit und zeitliche Ruhezustände; Regie zelluläre Rekrutierung mit Zellen Scannen eines interessierenden Bereich, aber immer noch in der Lage, aktive kriechen; Gesamtzell-Festnahme begleitet von Immunzellaktivierung 18,20. Während Mäuse ohne Behandlung zeigte hauptsächlich Zellen, waren frei Motile mit Geschwindigkeiten von bis zu 15 & mgr; m / sec, angezeigt CXCR6 + / GFP-Zellen in Mäusen mit CCl 4 behandelten deutlich reduziert Zellmigration Geschwindigkeit und Teilnahme bereits nach 18 Stunden und volle wandernde Festnahme nach 36 h (7A). Im Einklang mit der Einzelzellanalyse, die statistischen Daten aller Zellen innerhalb einer Sequenz zeigte abnehmGesamtMigrationsGeschwindigkeit nach CCl4 Behandlung (7B), die auch von mittleren Bahngeschwindigkeiten (7C) glichen wurde und verfolgen maximale Migrationsgeschwindigkeiten (Abbildung 7D), die zeigen, dass der Ansatz geeignet ist, Unterschiede in der Zellmigration und die Positionierung bei der Entwicklung einer Lebererkrankung zu beschreiben.

Figur 1
Abb. 1: Tracheotomie der Maus (A) OP-Ausrüstung für die Herstellung verwendet. 1x Standard-pattern Zange, 1x Semken Zange, 1x Dumont No.7 Zangen, Pinzetten Graefe (Wellenschliff, 2x gerade / 1x gebogen), 2x Blair Wundhaken (4 Säulen (stumpf)), zweifache Kugel Stift-Sonde (zB Amalgam Poliermaschine 3PL), Heidemann Spachtel HD2, Nadelhalter (Mathieu oder Halsey), 1x kleine chirurgische Scheren (scharf / stumpf, 1xcurved, 1x geraden), Mikro-Scheren (zB Vannas Frühling Schere), 1x kleines Tier Kauter, Wattestäbchen, Augenschutzsalbe, chirurgische Gewinde, n-Butyl-2-Cyanoacrylatglue. (B), die Augen werden mit einem Augenschutzsalbe geschützt. (C) Initial Hautschnitt für die Luftröhre Vorbereitung. (D) Dissektion des Bindegewebes zwischen Unterkieferspeicheldrüsen. (E) Ausstellung der Luftröhre. (F) Dissection der umgebenden Luftröhre Muskelgewebe. (G) Vermittlung von chirurgischen Faden unter der Luftröhre zur Fixierung der Röhre. (H) Tracheal Schnitt mit Mikroschere zwischen oberen Knorpelspangen. (I) Einfügen von Belüftungsschlauch in die Luftröhre. (J) Platzierung von Schädel chirurgischen Faden zu Rohr an der Haut zu befestigen. (K) Doppelfixierung des Rohres. (I) Dicht chirurgischen Schnitt mit n-Butyl-2-Cyanoacrylat. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

Abbildung 2
Abb. 2: Laparatomie und Leber Zubereitung (A) Anfangshautschnitt wurden Blutgefäße verödet, um starke Blutungen zu verhindern. (B) Eröffnung des Bauchfells unter dem Brustbein. (C) Erweiterung der Bauchschnitt mit Kauter Einheit. (D) Abdichtung der epigastrischen Gefäße. ( g> E) Weiterer Ausbau der Bauch Schnitt unterhalb Rippen. (F) Platzierung von Tier in Agarose Bühne Gericht. (F) Platzierung von Support-Stacks. (G) Platzierung der Atemtriggersensor. (H) Einstellung der Auslöseschwelle für die Atmung synchronisierte Bildgebung. (I) Fixierung an Brustbein Rippen mit chirurgischen Faden zurückzuziehen. (J) Abschalten der Gallenblase von der Membran und Präparation des Ligamentum falciforme. (K) Platzierung der Inszenierung Deckglas. (L) Platzierung von Leberlappen auf der Bühne. (M) Platzierung von Deckglas auf Leberlappen. (N) Platzierung von ip-Katheter für die Langzeitnarkose. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

Abbildung 3 "src =" / files / ftp_upload / 52.607 / 52607fig3.jpg "/>
Abb. 3: Die intraperitoneale Katheter 27 G Nadeln mit flexiblen Silikonschlauch verbunden.

4
Abbildung 4: Überwachung der Maus. (A) Platzierung von EKG-Elektroden (grün, rot, blau Kabel). Nadeln für die EKG-Erfassung werden subkutan gelegt, wie dargestellt. (B) Überwachung des EKG (rot), exspiratorische CO 2 (blau) und Herzfrequenz (rot), die langfristige Progression (links) und eigentliche Messung (rechts). (C) Kühlaggregat für Heizkissen Kontrolle. Temperatur auf 36 ° C eingestellt ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

ve_content "fo: keep-together.within-page =" always "> Abbildung 5
Abbildung 5: Liver Einbettung und Imaging. (A) Einbettung von Leberlappen. 3% Agarose in PBS bei 41 ° C unter dem Deckglas mit einer 2 ml-Spritze mit einer 18G-Nadel injiziert. (B) Leberlappen ist vollständig in Agarose eingebettet, um Bewegungsartefakte zu minimieren. (C) Abdichtung von Bauchfell mit Rest Agarose um eine Austrocknung zu verhindern. (D) Entfernung von Agarose-Abdeckung Mikroskopsichtfeld nach der vollständigen Verkleisterung. (E) Herstellung von Viewfield. F Einstellung der Z-Ebene und Auswertung der Probendurchblutung mittels Lichtmikroskopie. (D) Titelgericht übermäßiger Verdunstung zu verhindern. Abdeckung ist in der Abbildung angehoben, um das Setup zu zeigen. Bitte klicken Sie hier ein, um zu vergrößernVersion dieser Figur.

Figur 6
Abb. 6: Verfolgung von CXCR6 gfp / + Zellen bei chronischen Leberschäden nach CCl4 Injektion Mäuse wurden ip injiziert 0,6 ml / kg CCl 4 in Sonnenblumenöl 18 h oder 36 h vor der Belichtung aufgelöst. Am Tag des Experiments wurden die Mäuse zur intravitalen TPLSM wie beschrieben unterzogen. (A) Standbilder der Zellverfolgung. Tracks aus allen Zeitpunkten wurden überlagert, um zelluläre Motilität und Verschiebung zeigen. Die Bilder wurden mit einem einzigen Strahl Titan Saphire Laser bei 840 nm und eine TPLSM Lupe genommen. Bereiche wurden gescannt unter 3-5 Z-Stapel mit einer Eindringtiefe von 70 um mit einer Abtastrate von ca. 30 Sekunden pro Zyklus. Tracks wurden farbkodiert, um Migrationsgeschwindigkeit zeigen (hellblau: langsam bewegenden oder festsitzende Zellen, lila: bewegliche Zellen). Maßstabsbalken: 100 μ; M. (B), XY-Diagramme der Pfade für ihre Herkunft, die Spur Direktionalität und Streckenlänge (um) normalisiert. (C) Gesamthubraum von Zellen von ihrer Herkunft. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

7
Abbildung 7: Migration Statistiken CXCR6 gfp / + Zellen, gefolgt von intravital TPLSM im Lebergewebe in der Baseline und CCl 4 behandelten Mäusen Zellen wurden für ihre Wanderungsgeschwindigkeit Patrouillen der Leber untersucht.. (A) Vertreter Geschwindigkeit von Einzelzellen über die Zeit verfolgt. Die Empfindlichkeit wurde zu jedem Zeitpunkt gemessen und für jeden Rahmen einzeln. Linien stellen einzelne Zellen. Y-Achsen gemäß maximalen Migrationsgeschwindigkeit skaliert. (B) Statistical Analyse A. Rahmen spezifischen Drehzahlen von allen Zellen wurden gruppiert und in Grundlinie analysiert und CCl 4 behandelten Mäusen. (C) Durchschnittliche Bahngeschwindigkeit wurde pro Spur und Daten aus allen Spuren berechnet wurden für die Analyse zusammengefasst. (D) Höchstgeschwindigkeit jeder Spur wurde aufgezeichnet und analysiert. Alle Experimente wurden in Gruppen von 3 Tieren durchgeführt und die Ergebnisse wurden in zwei unabhängigen Experimenten bestätigt. *** P <0,001 (zweiseitig ungepaarten Student t-Tests). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

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Discussion

Das Ziel unserer Studie war es, eine hoch standardisierte, stabile und reproduzierbare Methode zur intravital TPLSM Bildgebung der Leber zu entwickeln. Intravital Imaging im Allgemeinen hat wertvolle Einblicke in das Zellverhalten unter realen Bedingungen folgenden Referenzfahrt und der Interaktion verschiedener Leukozyten-Populationen in der Entwicklung, Homöostase und Krankheit gegeben. Die etwas schwierig anatomischen Position der Leber, durch die Atemwege und peristaltische Darmbewegung direkt an die Leber sowie ihrer hohen Fragilität im Vergleich zu anderen festen Organen übertragen auferlegt jedoch mehrere Herausforderungen für eine stabile Langzeit intravitalen Bildgebung. In den letzten Jahren haben viele experimentelle Studien an Mäusen die hohe Dynamik von Immunzellinfiltration in verletzten Leber 28 offenbart, mit wichtigen Beiträgen der Wohnsitz oder der Infiltrations Monozyten / Makrophagen 30-32, Neutrophile 33 oder verschiedenen Lymphozytensubpopulationen 34,35. Allerdings most dieser Daten wurden von Endpunktanalysen (zB Mehrfarben-Durchflusszytometrie nach Töten der Tiere) abgeleitet. Bisher nur wenige Studien existieren, der die Dynamik der zellulären Verkehr während Leberentzündung mit multicolor Intravital Imaging. Verwendung inverse Mikroskope umgeht die Notwendigkeit für die Fixierung und Befeuchtung der Leber infolge der festen Haftung des Gewebes an der Glasfläche 24. Da jedoch viele Multi Mikroskope so aufrecht Abbildungssysteme gebaut werden aufwendigere Herstellung und Fixierung Methoden erforderlich, um das Gewebe für die Zeit der Bildgebung zu stabilisieren. Üblicherweise haben Maß Bühnensysteme für Gewebefixierung 6, 36,37 beschrieben worden ist, jedoch mit diesen ist es entscheidend, die Lebermikrozirkulation zu validieren, da schon minimale Druck auf das Gewebe wirkt Sinusblutung auch weitere schwere Auswirkungen auf erkrankten Leber 38 .

Daher waren ad folgende Punkteim Setup dieser Methode, die durch In-vivo-Bildgebung TPLSM erzielten Ergebnisse zu optimieren gekleidet: Die Verbesserung der Qualität der Vorbereitung von Proben Störung minimiert und Störungen der Mikrozirkulation durch die Handhabung Fragen und erhöhte das Überleben der Tiere; Intensivüberwachung und nachträgliche Anpassung der Anästhesie, der Atmung und Stabilisierung der Zirkulation weiter verbessert das Überleben der Tiere und die physiologischen Artefakte minimiert, beispielsweise durch Unwuchten in Blut pH verursacht wird. Kontrollierte Beatmung in Kombination mit getriggerten Bild war notwendig, um Bewegungsartefakte durch Synchronisation des Mikroskops mit den Atmungszyklen zu beseitigen. Die Einbettung der Orgel in Agarose, die physiologische Salzkonzentrationen von Vorteil war, um sanft zu fixieren das Organ nach der Herstellung ohne weitere mechanische Bearbeitung und verhindert auch Austrocknung der Probe. Die meisten Protokolle für Leber Mikroskopie nur unzureichende Methoden zur sta ble, langfristig Anästhesie. Jedoch könnte das Überleben der Tiere signifikant mit dem hier und in Kombination mit der Überwachung vorgesehen Anästhesieprotokoll verbessert war ausreichend, um das Überleben von bis zu 8 Stunden zu gewährleisten. Alternative Verfahren sind in der Regel geeignet, Prozesse innerhalb einer Zeitspanne von bis zu 3 Stunden zu visualisieren, wie neutrophile Eindringen 39, aber es fehlt die Möglichkeit, Bild länger andauernde Prozesse wie Monozyten oder Lymphozyten Invasion 22 oder auch Zellproliferation 6. Das Verständnis der Dynamik der Rekrutierung, Infiltration und zellulären Interaktion während der akuten und chronischen Leberentzündung kann Ihnen detaillierte Einblicke in die Entwicklung und das Fortschreiten der Lebererkrankung. Durch die Nutzung dieser verbesserten Verständnis der Immunpathologie wird es möglich sein, Therapien im Hinblick auf die Bewältigung der Zielzellen von Interesse anstatt zB nicht selektive immunsuppressive Ansätze viel feiner zu gestalten.

ove_content "> Um die Lage, Transmigration und Interaktion von Leukozyten adressieren, werden Bilder mit hoher Qualität für eine genaue 4D Tracking der Zellen in der Leber Vaskulatur und Lebergewebe 18,20,40 benötigt.

Die Methode, die wir bieten hier kann mit üblichen Laborkosten Reagenzien und Geräte angewendet werden, so dass es sowohl einfach zu handhaben und kostengünstig mit minimaler Störung der Probe. Um die physiologischen Bedingungen der Maus für so lange wie möglich aufrecht zu erhalten, ist es notwendig, Feineinstellung der Atemvolumen und Frequenz auf Oxygenierung und Blut CO-2-Ebene. Obwohl aufgrund der kontinuierlichen Infusion von Flüssigkeiten in das Peritoneum ist mindestens ein vorläufiges Angebot, um die Durchblutung, EKG und Herzfrequenzmessungen zu stabilisieren nur eine teilweise Kontrolle über die Stabilisierung der Durchblutung zu ermöglichen. Durch die Implementierung von direkten Kontrolle des Blutdrucks und der zentrale Venen Flüssigkeit Anwendung ist es wahrscheinlich, dass die Lebens parameters kann noch mehr stabilisiert werden, was zu einer weiteren Verbesserung der Stabilität und des Überlebens.

Selbst unter streng kontrollierten Bedingungen, Imaging von Tieren, die zu Leberschäden Modelle häufig in Mäusen wie Acetaminophen induzierten Leberschäden verwendet zogen wurden, bleibt CCl 4 induzierte Leberschäden oder Nahrungs induzierten Fettleber Herausforderung. Durch die wesentliche Funktion der Leber bei Stoffwechselzustand-Steuerung und die zentrale Lage in der Zirkulation, Veränderungen der Leberfunktionsfähigkeit oder die Mikrozirkulation wirkt sich direkt auf langfristige Überleben der Tiere, also die Möglichkeit, die Begrenzung auf lange TPLSM Video-Sequenzen von stark zu erhalten geschädigten Organen, zB mit schweren Blutungen oder zerstört Mikrovaskulatur. Auch in stark veränderten Lebermikroanatomie wie in Modellen mit sehr starken Nekrosen, bleibt es schwierig, Zell-Zell-Interaktionen und lokalen Abschottung der entzündlichen Zellaggregate zu studieren, weil keine standardisierte "Gegenfärbung" zu anatomischen Strukturen (wie Hämatoxylin-Färbung in der Mikroskopie oder in der Immunfluoreszenz-Färbung DAPI) ist für intravitalen TPLSM.The Qualität der durch die Bilderzeugungsprozess weiter erhaltenen Daten abhängig von der Markierungsintensität der Zellen und die mikroskopische Setup.

Sind verschiedene Ansätze zur GFP + -Zellen in der Leber zu visualisieren. Die höchste Fluoreszenz mit sehr niedriger Hintergrundfluoreszenz zwischen 900 und 920 nm Anregungswellenlänge erhalten wird. Die fast vollständige Verlust der Lebergrundfluoreszenz erlaubt keine Untersuchung der Positionierung von Zellen in der Leber, wenn sie nicht mit zusätzlichen Behälter Tracker wie Dextran oder Lectin. Deshalb haben wir beschlossen, die Bild der Migration von Leukozyten bei einer Wellenlänge von 840 nm, was dem besten Verhältnis zwischen der GFP-Signal und detailliert, aber nicht zu hell Leber Hintergrundfluoreszenz.

Zusammengenommen die intravital TPLSM in dieser Studie vorgestellt Bildsystem kann auf ein breites Spektrum von Leber spezifische Intravitalmikroskopie Fragen angewendet werden. Mit diesem Ansatz ist TPLSM Bildgebung in anderen festen Organen, wie Niere, Leber, Blase, Darm oder Pankreas führbar mit nur geringen Modifikationen der chirurgischen Verfahren und Gewebe Staging daher die Bereitstellung einer hoch flexiblen Ansatz langfristig Migrationsprozesse von Zellen zu untersuchen vivo.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anesthetics
Buprenorphine Essex Pharma 997.00.00 Analgeticum, 0.1 mg/kg
Fentanyl Rotex Medica charge: 30819
Fluovac anesthesia system Harvard Apparatus 34-1030
Glucose 5% Braun
ISOFLO (Isoflurane Vapor) vaporiser Eickemeyer 4802885
Isoflurane Forene Abbott B 506
Isotonic (0.9%) NaCl solution DeltaSelect GmbH PZN 00765145
Ketamin 10% ceva Charge: 36217/09
Xylazin 2% medistar Charge: 04-03-9338/23
Consumable supplies
20 ml Syringe BD Plastipak
250 ml Erlenmeyer flask Schott Duran 21 226 36
25 ml Beaker 2x Schott Duran 50-1150
2 ml syringe BD Plastipak
4-0 Vicryl suture Ethicon V7980
Agarose commercially available
Bepanthen Eye and Nose ointment Bayer Vital GmbH 6029009.00.00
Change-A-Tip Deluxe High-Temp Cautery Kit Fine Science Tools Inc. 18010-00
Cotton Gauze swabs Fuhrmann GmbH 32014
Cover Slip 24x50 mm ROTH 1871
Durapore silk tape 3M 1538-1
Feather disposable scalpel Feather 02.001.30.011
Fine Bore Polythene Tubing 0.58 mm ID Smiths medical 800/100/200
Histoacryl Braun 1050052 5x 0.5 ml
Leukoplast BSN Medical Inc.
Microscope Slides ROTH 1879
Poly-Alcohol Haut…farblos Antisepticum Antiseptica GmbH 72PAH200
Sterican needle 18 G x 1 B. Braun 304622
Sterican needle 27 3/4 G x 1 B. Braun 4657705
Tissue paper commercially available
Surgical Instruments
Amalgam burnisher 3PL Gatz 0110?
Blair retractors (4 pronged (blunt)) x2 Storz&Klein S-01134
Dumont No.7 forceps Fine Science Tools Inc. 91197-00
Graefe forceps curved x1 Fine Science Tools Inc. 11151-10
Graefe forceps straight x2 Fine Science Tools Inc. 11050-10
Heidemann spatula HD2 Stoma 2030.00
Needle holder Mathieu Fine Science Tools Inc. 12010-14
Scissor Fine Science Tools Inc. 14074-11
Semken forceps Fine Science Tools Inc. 11008-13
Small surgical scissors curved Fine Science Tools Inc. 14029-10
Small surgical scissors straight Fine Science Tools Inc. 14028-10
Standard pattern forceps Fine Science Tools Inc. 11000-12
Vannas spring scissors Fine Science Tools Inc. 15000-08
Equipment
ECG Trigger Unit Rapid Biomedical 3000003686
MICROCAPSTAR End-Tidal Carbon Dioxide Analyzer AD Instruments
Minivent Typ 845 Harvard Apparatus 73-0043
Multiphoton microscope Trimscope I LaVision
Perfusor Compact B. Braun
PowerLab 8/30 8 channel recorder AD Instruments PL3508
Temperature controlled heating pad Sygonix 26857617
Temperature sensor comercially available
Temperature controlled System for Microscopes -Cube&Box Life Imaging Services

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References

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