श्वासनली उपकला कोशिकाओं पर Lymphocytic microparticles और उनके Proapoptotic प्रभाव का पता लगाने के जनरेशन

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Immunology and Infection

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Summary

कोशिका झिल्ली-शेड microparticles (एमपीएस) अलग है और उनके pathophysiological प्रभाव विभिन्न मॉडलों में जांच की जा सकता है कि सक्रिय जैविक पुटिकाओं हैं। यहाँ हम टी lymphocytes (LMPs) से व्युत्पन्न सांसदों पैदा करने के लिए और airway उपकला कोशिकाओं पर उनके proapoptotic प्रभाव का प्रदर्शन करने के लिए एक विधि का वर्णन।

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Yang, C., Xiong, W., Qiu, Q., Tahiri, H., Gagnon, C., Liu, G., Hardy, P. Generation of Lymphocytic Microparticles and Detection of their Proapoptotic Effect on Airway Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (96), e52651, doi:10.3791/52651 (2015).

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Abstract

सेल सेल संचार में कोशिका झिल्ली व्युत्पन्न vesicles के जैविक भूमिकाओं में ब्याज हाल के वर्षों में वृद्धि हुई है। Microparticles (एमपीएस) 1 माइक्रोन 0.1 माइक्रोन से व्यास में लेकर vesicles के ऐसे ही एक प्रकार के होते हैं, और आम तौर पर सक्रियण या apoptosis के दौर से गुजर यूकेरियोटिक कोशिकाओं के प्लाज्मा झिल्ली से बहाया। यहाँ हम डी LMPs एक multistep अंतर centrifugation प्रक्रिया के माध्यम से अलग कर रहे हैं और प्रवाह cytometry का उपयोग विशेषता actinomycin के साथ प्रेरित apoptotic यूके टी कोशिकाओं से टी लिम्फोसाइट व्युत्पन्न microparticles (LMPs) की पीढ़ी का वर्णन है। इस प्रोटोकॉल भी माउस प्राथमिक श्वसन ब्रोन्कियल ऊतक explants से व्युत्पन्न ब्रोन्कियल उपकला कोशिकाओं पर LMPs की proapoptotic प्रभाव का प्रदर्शन करने के लिए एक बगल में कोशिका मृत्यु का पता लगाने विधि प्रस्तुत करता है। इस के साथ साथ वर्णित विधि इन विट्रो में apoptotic लिम्फोसाइटों से LMPs का प्रचुर मात्रा में अलग-थलग करने के लिए एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने की प्रक्रिया प्रदान करते हैं। LMPs व्युत्पन्नइस तरीके में विभिन्न रोग मॉडल की विशेषताओं का मूल्यांकन किया जाता है, और औषध विज्ञान और विष विज्ञान के परीक्षण के लिए किया जा सकता है। Airway के उपकला बाहरी वातावरण और अंतर्निहित ऊतक के बीच एक सुरक्षात्मक शारीरिक और कार्यात्मक बाधा प्रदान करता है यह देखते हुए कि, ब्रोन्कियल ऊतक explants के बजाय अमर उपकला कोशिका लाइनों का उपयोग airway के पथ ऊतक की आवश्यकता होती है जांच के लिए एक प्रभावी मॉडल प्रदान करता है।

Protocol

नोट: पुरुष C57BL / 6 चूहों (5-7 सप्ताह पुराने) चार्ल्स नदी प्रयोगशालाओं इंटरनेशनल, इंक (। सेंट निरंतर, क्यूबेक, कनाडा) से हैं और चू सैंटे जस्टिन पशु की देखभाल समिति द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुसार चालाकी। माउस ब्रोन्कियल ऊतक explants उपकला कोशिकाओं पर LMPs की proapoptotic प्रभाव की जांच के लिए प्राथमिक ब्रोन्कियल उपकला कोशिकाओं का एक अच्छा स्रोत प्रदान करते हैं। इस प्रोटोकॉल LMPs की इन विट्रो पीढ़ी है, साथ ही LMPs इलाज ब्रोन्कियल ऊतक explants पर apoptotic उपकला कोशिकाओं का पता लगाने के लिए एक विधि का वर्णन है। इस प्रोटोकॉल के तीन वर्गों के होते हैं।

1. LMPs उत्पादन और विशेषता

नोट: प्रदूषण को रोकने के लिए इस प्रयोग में इस्तेमाल सभी सामग्री बाँझ या autoclaved हैं कि यह सुनिश्चित करने के लिए। जब तक अन्यथा इंगित, बाँझ शर्त के तहत एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट में आरटी पर सभी चरणों को पूरा करें।

1.1) उत्तेजना और सांसदों का संग्रह9

  1. एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में 10 लाख यूके टी कोशिकाओं के एक विभाज्य पिघलना। 10 एमएल में पतला पूर्व गर्म सीरम मुक्त 200 GX 5 मिनट में एक 15 मिलीलीटर बाँझ ट्यूब और अपकेंद्रित्र में, इस तरह के एक्स विवो रूप हिमेटोपोयटिक मध्यम। पूर्व गर्म मध्यम 5 मिलीलीटर में सतह पर तैरनेवाला और resuspend कोशिकाओं aspirate।
  2. 15 मिलीलीटर पूर्व गर्म हिमेटोपोयटिक ऐसे एक्स विवो के रूप में मध्यम और 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर एक humidified इनक्यूबेटर में 4 दिनों के लिए सेते के साथ (निलंबन की कोशिकाओं के लिए) एक T75 टिशू कल्चर फ्लास्क में कोशिकाओं स्थानांतरण।
  3. चार दिनों के बाद, 100 मिलीलीटर ताजा मध्यम युक्त एक T175 टिशू कल्चर फ्लास्क में सभी संस्कृति मध्यम और कोशिकाओं को हस्तांतरण। वे 2 मिलियन कोशिकाओं / एमएल के एक घनत्व की वृद्धि हुई है, जब तक एक ही परिस्थितियों के बारे में 72 घंटे के लिए कोशिकाओं incubating जारी रखें।
  4. समान रूप से चार T175 बोतल से युक्त 150 मिलीलीटर ताजा मध्यम और कोशिकाओं 2 लाख / मिलीलीटर की एक घनत्व (लगभग 48 घंटा ऊष्मायन) हो गए हैं जब तक सेल संस्कृति जारी रखने के बीच की कोशिकाओं को विभाजित।
  5. 6 कोशिकाओं resuspend।
  6. 0.5 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता में मध्यम करने के लिए (2 मिलीग्राम / एमएल पर DMSO में भंग) डी actinomycin जोड़ें और 24 घंटे के लिए सेते हैं।
  7. 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूबों में सभी संस्कृति के माध्यम से स्थानांतरण और 5 मिनट के लिए 750 XG पर कोशिकाओं नीचे स्पिन। 15 मिनट के बड़े सेल टुकड़े को दूर करने के लिए 1500 XG पर 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब और अपकेंद्रित्र में सतह पर तैरनेवाला स्थानांतरण।
  8. 50 मिनट के लिए 12,000 XG पर एक 250 मिलीलीटर की बोतल और ultracentrifuge में सतह पर तैरनेवाला स्थानांतरण। सतह पर तैरनेवाला त्यागें और छर्रों इकट्ठा।
  9. धो 50 मिनट के लिए 12,000 XG पर centrifugation द्वारा एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में 40 एमएल बाँझ पीबीएस के साथ छर्रों LMPs समृद्ध। दो बार इस चरण को दोहराएँ।
  10. पिछले धोने के सतह पर तैरनेवाला लीजिए; यह वाहन नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा। 1 में LMPs छर्रों निलंबितपीबीएस के मिलीलीटर और एक 1.5 मिलीलीटर बाँझ microtube में हस्तांतरण। विभाज्य और दुकान पृथक LMPs -80 डिग्री सेल्सियस (एकाधिक मुक्त पिघलना चक्र से बचने के लिए)।

FACS विश्लेषण 4 के माध्यम से सांसदों की 1.2) विशेषता

  1. 2 CaCl बिना Annexin बफर के दो नमूने, के साथ एक और एक और तैयार: Hepes 10 मिमी, सोडियम क्लोराइड 140 मिमी, प्लस या माइनस 5 मिमी 2 CaCl।
  2. कणों को दूर करने के लिए 0.22 माइक्रोन फिल्टर का उपयोग कर Annexin बफर और FACS प्रवाह म्यान द्रव फ़िल्टर।
  3. एक FACS ट्यूब में 5 मिमी 2 CaCl साथ Annexin बफर के 44 μl में LMPs की एक μl पतला। 2 CaCl (नकारात्मक नियंत्रण) के बिना Annexin बफर के 44 μl में LMPs की एक μl के साथ एक और ट्यूब तैयार करें।
  4. प्रत्येक ट्यूब में annexinV-Cy5 के 5 μl जोड़ें और मिश्रण अच्छी तरह से। अंधेरे में आरटी पर 15 मिनट के लिए सेते हैं। प्रत्येक ट्यूब में FACS के प्रवाह म्यान तरल पदार्थ के 400 μl के साथ मिश्रण गिराए द्वारा प्रतिक्रिया बंद करो।
  5. 7 माइक्रोन गिनती BEA के 10 μl (200,000 मोती) जोड़ेंप्रत्येक ट्यूब में एक आंतरिक मानक के रूप में डी एस निलंबन एक निरपेक्ष गिनती प्राप्त करने के लिए।
  6. सापेक्ष आकार के द्वार (FSC-एच, पीएमटी E00, पैमाने पर लॉग इन करें) और रिश्तेदार विघटन (एसएससी-एच, पी एम टी 325, लॉग पैमाने) के आकार-calibrated फ्लोरोसेंट मोती का उपयोग प्रवाह पर डॉट साजिश की स्थापना 1 माइक्रोन (गेट 1) और 7 माइक्रोन (गेट 2) में मोती गेट गिनती।
  7. 20,000 गिनती मोती गेट 2 में पहुँच रहे हैं जब तक एक संकेत प्राप्त करके, डॉट भूखंड (पैमाने पर लॉग ऑन करें, पी एम टी 765) Annexin के लिए स्थापित फाटक और FL-4 चैनल का उपयोग FSC-एच / एसएससी-एच भूखंड पर LMPs नमूना विश्लेषण।
  8. 2 CaCl युक्त Annexin बफर में LMPs के सकारात्मक annexinV घटनाओं का निर्धारण करते हैं, और फिर 2 CaCl (नकारात्मक नियंत्रण) के बिना Annexin बफर में LMPs की घटनाओं घटाना।
  9. निम्न समीकरण के आधार पर सांसदों की पूर्ण संख्या की गणना:
    1 समीकरण

सांसद पी के 1.3) निर्धारणrotein एकाग्रता (ब्रैडफोर्ड परख)

  1. 1.25 से 20 माइक्रोग्राम प्रति / मिलीलीटर से एक प्रोटीन मानक के 5 धारावाहिक dilutions तैयार करें। पिपेट दो प्रतियों में एक साफ टेस्ट ट्यूब में प्रत्येक मानक और नमूना समाधान के 800 μl। प्रत्येक ट्यूब ब्रैडफोर्ड डाई अभिकर्मक के 200 μl जोड़ें। मिश्रण अच्छी तरह से, फिर 5 मिनट के लिए आरटी पर सेते हैं।
  2. 595 एनएम पर absorbance के उपाय। मानक वक्र के रेखीय प्रतिगमन का उपयोग कर LMPs के प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण।

2. ब्रोन्कियल ऊतक explants और LMPs उपचार

नोट: बाँझ काम के माहौल पर विशेष ध्यान देना है, और aseptically प्रयोगों निम्नलिखित में इस्तेमाल समाधान और मध्यम तैयार करते हैं। , पूरी चिकित्सा मध्यम तैयार 100 मिलीलीटर ऊतक हीलिंग मध्यम करने के लिए (बर्फ पर thawed) सीरम के साथ ऊतक हीलिंग मध्यम खुराक के एक मिलीलीटर जोड़ें और मिश्रण अच्छी तरह से करने के लिए।

ब्रोन्कियल ऊतक explants के 2.1) की तैयारी

  1. संवर्धन करने से पहले, एक 2 सेमी के 6 क्षेत्रों खरोंचएक स्केलपेल ब्लेड के साथ प्रत्येक 100 मिमी टिशू कल्चर पकवान की सतह के किनारे पर प्रत्येक। कोट प्रत्येक संस्कृति डिश कोटिंग समाधान के 2 मिलीलीटर के साथ 100 मिमी टिशू कल्चर पकवान खरोंच, और 37 डिग्री सेल्सियस पर / एक humidified सीओ 2 इनक्यूबेटर ओ एन पकवान सेते हैं। वैक्यूम अधिशेष समाधान aspirate और ऊतक धुलाई मध्यम की 15 मिलीलीटर के साथ पकवान भरें।
  2. जानवरों की देखभाल आचार समिति द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुसार कंपनी द्वारा दो साँस लेना (5 से 7 सप्ताह पुराने) C57BL / 6 चूहों euthanize।
  3. Aseptically स्केलपेल, ड्यूमॉन्ट सुपर ठीक चिमटी से नोचना, और शल्य चिकित्सा कैंची से फेफड़े के ऊतकों काटना। ध्यान से पैरेन्काइमा और रक्त वाहिकाओं को हटा दें। यदि लागू हो, प्रयोगशाला के लिए परिवहन के लिए ठंडा ऊतक धुलाई माध्यम में फेफड़े के ऊतकों रखें।
  4. इसके अलावा ऊतक धुलाई मध्यम में डूबे हुए श्वसनी काटना और परिधीय फेफड़ों के ऊतकों से 1-2.5 मिमी की एक व्यास के साथ श्वसनी अलग। एक स्केलपेल के साथ ~ 5 मिमी मोटी ब्रोन्कियल छल्ले में स्लाइस ब्रोन्कियल ऊतकों। ब्रोन्कियल टुकड़े उठा और व्यंजनों की खरोंच क्षेत्रों पर उन्हें जगह बाँझ घुमावदार microdissecting संदंश के साथ एक scooping गति का प्रयोग करें।
  5. ऊतक धुलाई मध्यम निकालें, और उन्हें व्यंजन का पालन करने की अनुमति देने के लिए ~ 5 मिनट के लिए आरटी पर टुकड़े सेते हैं।
  6. प्रत्येक पकवान पूरी चिकित्सा के माध्यम के 10 मिलीलीटर जोड़ें और एक नियंत्रित वातावरण मॉड्यूलर इनक्यूबेटर कक्ष में उन्हें जगह है। उच्च ओ 2 गैस मिश्रण (70% ओ 2, 25% एन 2 और 5% सीओ 2) के साथ चैम्बर फ्लश। एक benchtop कक्षीय इनक्यूबेटर में चैम्बर प्लेस और 37 डिग्री सेल्सियस पर इसे हिला। मध्यम टुकड़े से अधिक रहकर प्रवाह करने की अनुमति देने के लिए प्रति मिनट 10 चक्र में 24 घंटे के लिए चैम्बर हिलाएँ।
  7. 24 घंटा ऊष्मायन के बाद, एक चरण विपरीत उल्टे प्रकाश माइक्रोस्कोप के नीचे ऊतक explants निरीक्षण करते हैं। बाद में LMPs उपचार के लिए पूर्ण, ठीक बाल आंदोलन और जीवंत ब्रोन्कियल उपकला साथ ब्रोन्कियल explants का चयन करें।

2.2) LMPs उपचार

  1. के रूप में निम्नानुसार पूरा मध्यम विकास तैयार: पिघलना मध्यम विकास की खुराक बर्फ पर सीरम और fibroblast अवरोध करनेवाला के साथ। सीरम और मध्यम विकास की 100 मिलीलीटर के लिए 200 μl तंतुप्रसू अवरोध करनेवाला के साथ मध्यम विकास की खुराक के 1 मिलीलीटर जोड़ें; अच्छी तरह से मिश्रण। का उपयोग करने से पहले 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर पूरा मध्यम विकास गर्म।
  2. 800 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल की एकाग्रता में एक LMPs स्टॉक तैयार करने के लिए पीबीएस के साथ एक नया बाँझ Eppendorf ट्यूब में पृथक LMPs पतला।
  3. 12 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेट की हर अच्छी तरह से करने के लिए पूरा मध्यम विकास की 0.5 मिलीलीटर जोड़ें।
  4. टिशू कल्चर प्लेट की हर अच्छी तरह से करने के लिए पिछले प्रोटोकॉल (धारा 2.1) से घुमावदार microdissecting संदंश के साथ चयनित ब्रोन्कियल explants के स्थानांतरण।
  5. LMPs उपचार कुओं और नियंत्रण कुओं की पहचान करने के लिए उचित रूप से संस्कृति की थाली लेबल। और 25 μl नियंत्रण वाहन (40 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता के लिए) अच्छी तरह से प्रत्येक LMPs इलाज में 25 μl LMPs शेयर जोड़ें (देखें एलएमपी नियंत्रण कुओं को उत्पादन)।
  6. कोमल झटकों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर एक नियंत्रित वातावरण मॉड्यूलर इनक्यूबेटर कक्ष में ऊष्मायन जारी रखें।
  7. 24 घंटे के बाद, पीबीएस के साथ explants 3 बार धोने और अगले कदम (4% paraformaldehyde के [पीएफए] नियतन) करने के लिए आगे बढ़ें।

3. Histopathological परीक्षा

3.1) अगले कदम के लिए आगे बढ़ने से पहले निम्न समाधानों को तैयार

  1. 137 मिमी NaCl, 2.7 मिमी KCl, 10 मिमी ना 2 HPO 4, 1.76 मिमी के.एच. 2 पीओ 4, 7.4 पीएच मिश्रण से 1x पीबीएस बफर तैयार करें।
  2. 4% पीएफए, सरगर्मी के साथ 60 डिग्री सेल्सियस पर गरम पानी की 400 मिलीलीटर में पीएफए ​​के 20 ग्राम भंग तैयार करने के लिए; समाधान स्पष्ट करने के लिए 10 एम NaOH की कुछ बूँदें जोड़ें। अगला 1x पीबीएस बफर जोड़ने और 7.4 के लिए 500 मिलीलीटर की मात्रा और पीएच को समायोजित करें। फ़िल्टर और विभाज्य; -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
  3. निम्नलिखित निर्जलीकरण या पुनर्जलीकरण अभिकर्मकों तैयार करें; 100%, 90%, 70%, 50% इथेनॉल और xylene।
e_step "> 3.2) explant फिक्सेशन और ऊतक अनुभाग Deparaffinization

  1. 4% पीएफए ​​के 1.5 मिलीलीटर के साथ एक लेबल microcentrifuge ट्यूब में प्रत्येक explant प्लेस और 4 डिग्री सेल्सियस पर हे / एन सेते हैं। 1x पीबीएस के साथ दो बार explants कुल्ला।
  2. एक शराब श्रृंखला के माध्यम से explants निर्जलीकरण (70% इथेनॉल: प्रत्येक 3 बार 30 मिनट, 90% इथेनॉल: प्रत्येक 2 बार 30 मिनट, 100% इथेनॉल: 3 बार 30 मिनट के प्रत्येक; तो xylene: 3 बार 20 मिनट प्रत्येक)। एक धूआं हुड में आरटी पर सभी चरणों को पूरा करें।
  3. एक ओवन में 58 डिग्री सेल्सियस पर आयल में ऊतक explants बैठाना। एक रोटरी सूक्ष्म का उपयोग कर 5 माइक्रोन मोटी ऊतक वर्गों तैयार करें।
  4. एक 56 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में वर्गों फ्लोट, और फिर से लेबल ऊतकीय स्लाइड पर वर्गों माउंट। 1 घंटे के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर मार्गदर्शन धुंधला रैक और शुष्क में स्लाइड्स रखें। स्लाइड आरटी पर शांत करने के लिए अनुमति दें।
  5. आयल को दूर करने के लिए 10 मिनट प्रत्येक के लिए xylene युक्त 4 लगातार दाग बर्तन में रैक डुबकी। वें, तो 100%, 95%: XYLENE दूर करने के लिए एक इथेनॉल श्रृंखला में रैक डुबकीतो 80%, 70%, तो 50% इथेनॉल (हर कदम के लिए 5 मिनट) एन। इथेनॉल दूर करने के लिए 5 मिनट के लिए पानी के नल के साथ रैक कुल्ला।

3.3) hematoxylin और eosin (एच एंड ई) धुंधला

  1. तय ऊतक वर्गों के साथ काम जारी; 15 मिनट के लिए मेयर के Hematoxylin से भरा एक धुंधला डिश में रैक जगह है। 20 मिनट के लिए Hematoxylin दूर करने के लिए पानी के नल के साथ रैक कुल्ला।
  2. 30 सेकंड के लिए 95% इथेनॉल में 30 sec.Place के लिए आसुत जल में रखें। एक मिनट के लिए eosin वाई समाधान धुंधला डिश में रखें। 2 मिनट प्रत्येक के लिए 95% इथेनॉल, 100% इथेनॉल, और xylene के दो परिवर्तन के माध्यम से निर्जलीकरण।
  3. अतिरिक्त eosin निकाल दिया जाता है कि यह सुनिश्चित करने के लिए एक खुर्दबीन के नीचे एक त्वरित जांच करने के। एक गिलास को कवर के साथ कवर तो, प्रत्येक स्लाइड पर बढ़ते मध्यम (फिशर SP15-100) के 2 से 3 बूँदें रखें।

3.4) स्वस्थानी सेल मौत का पता लगाने में: TUNEL के परख

  1. शुरुआत से पहले, proteinase कश्मीर काम कर समाधान तैयार: 20 माइक्रोग्राम प्रति / मिलीलीटर में10 मिमी Tris / एचसीएल, 7.4 पीएच।
  2. खंड 3.2 (explant निर्धारण और ऊतक अनुभाग deparaffinization) के 5 करने के लिए कदम 1 दोहराएँ। विआयनीकृत एच 2 ओ के साथ स्लाइड्स कुल्ला
  3. 10 मिनट के लिए 1x पीबीएस के साथ स्लाइड विसर्जित कर दिया। अतिरिक्त पीबीएस नाली। Proteinase कश्मीर काम कर समाधान के साथ आरटी पर 30 मिनट के लिए ऊतक वर्गों सेते हैं। कुल्ला 1x पीबीएस के साथ दो बार स्लाइड।
  4. कोशिका मृत्यु का पता लगाने किट का निर्देश पुस्तिका में वर्णित के रूप में TUNEL के परख प्रदर्शन करते हैं। बढ़ते माध्यम का उपयोग कर माउंट, और कांच coverslips के साथ स्वयं coverslip।
  5. एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत नमूने का विश्लेषण करें। भूरे रंग में apoptotic कोशिकाओं का विश्लेषण करने के लिए प्रो छवि 4.5 का प्रयोग करें।

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Representative Results

LMPs प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल (FACS) विश्लेषण छंटाई और सांसदों (≤1 माइक्रोन) के 97% Annexin-वी Cy5 सकारात्मक थे जिसमें एक माइक्रोन मोती का उपयोग gated द्वारा Annexin वी धुंधला 10 के साथ विशेषता थे (चित्रा 1 ए और 1 बी)। आमतौर पर, LMPs के बारे में 2.5 मिलीग्राम इस प्रोटोकॉल के बाद प्राप्त किया गया। C57BL से ब्रोन्कियल ऊतक explants / 6 चूहों वाहन और LMPs उपचार के अधीन थे। ब्रोन्कियल वर्गों की histopathological विश्लेषण ब्रोन्कियल उपकला के संरचनात्मक अखंडता पर LMPs के प्रभाव का पता चला। नियंत्रण explants में, ब्रोन्कियल उपकला (2A चित्रा) काफी हद तक undamaged था; हालांकि, LMPs इलाज explants में, सतही उपकला कोशिका परत क्षतिग्रस्त या खो दिया है, और उपकला सेल ऊंचाई और घनत्व (चित्रा 2B) में महत्वपूर्ण घटने वहाँ थे। TUNEL के पॉजिटिव धुंधला (apoptosis के एक मार्कर) और अधिक नियंत्रण की तुलना में LMPs इलाज ब्रोन्कियल उपकला में घोषित किया गया था (

चित्र 1
यूके टी सेल लाइन से निकाली गई सांसदों की cytometry विश्लेषण चित्रा 1. फ्लो। (ए) आगे (एफएससी) और पक्ष तितर बितर (एसएससी) गेट सांसदों के लिए इस्तेमाल किया 1 माइक्रोन मोतियों के साथ विशेषताओं का निर्धारण। सांसदों गेट में घटनाक्रम आगे इलेक्ट्रॉनिक शोर से सत्य घटनाओं भेद करने के लिए Annexin वि Cy5 साथ लेबलिंग के लिए मूल्यांकन किया गया (बी) जिससे सांसदों का पता लगाने की विशिष्टता बढ़ रही है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. ब्रोन्कियल उपकला परत की क्षति LMPs प्रेरित। ब्रोन्कियल epitheli के प्रतिनिधि histopathological छवियों(ए) के नियंत्रण या (बी) LMPs (24 घंटा के लिए 40 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल) के साथ इलाज explants की उम। Explant वर्गों hematoxylin और eosin साथ दाग रहे थे। काला तीर उपकला परत को इंगित करें। सतही और बेसल सेल परतों के बद नुकसान LMPs इलाज ब्रोन्कियल explants (बी) के वर्गों में स्पष्ट है। बढ़ाई 400X, बार = 20 माइक्रोन। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. ब्रोन्कियल उपकला सेल apoptosis LMPs प्रेरित कमानी ब्रांकाई की उपकला परत में apoptotic कोशिकाओं TUNEL के परख से पता चला रहे थे। सकारात्मक दाग कोशिकाओं भूरे रंग में चित्रित कर रहे हैं। नियंत्रण में ब्रोन्कियल उपकला कोशिकाओं के प्रतिनिधि छवियों (ए) (बी) दिखाए जाते हैं। काला तीर उपकला परत को इंगित करें। बढ़ाई 200X (ऊपरी पैनल) और 400X (नीचे पैनल), बार = 20 माइक्रोन। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

सांसदों कहनेवाला पार बात की सक्रिय मध्यस्थों हैं और उनके अध्ययन विज्ञान के कई क्षेत्रों में वादा किया है। 11 यह अध्ययन एक apoptotic टी सेल लाइन से निकाली गई LMPs की इन विट्रो में बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया। इन सांसदों लिम्फोसाइट अणुओं के एक बड़े प्रदर्शनों की सूची को व्यक्त करने और जैविक रूप से सेलुलर और ऊतक homeostasis के नियमन में फंसा रहे हैं। हालांकि, विभिन्न स्रोतों से प्राप्त LMPs जैविक रूप से अलग हो सकता है। 4,9,12,13

LMPs इन विट्रो में उन्हें उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया उत्तेजनाओं और वे प्राप्त कर रहे हैं, जिसमें से सेल के आधार पर विभिन्न गुण प्रदर्शित करते हैं। जैसे, विवो में उत्पन्न LMPs से डेटा के अमर सेल लाइनों से निकाली गई LMPs का उपयोग कर इन विट्रो में प्राप्त आंकड़ों के निष्कर्षों सावधानी के साथ किया जाना चाहिए।

इस प्रोटोकॉल सांसदों के अलगाव के लिए आवश्यक कई centrifugation के चरणों का वर्णन; इसलिए, सीareful हेरफेर इस प्रक्रिया के दौरान सांसदों के नुकसान को कम करने की जरूरत है। -70 डिग्री सेल्सियस पर पृथक LMPs की तस्वीर ठंड की सिफारिश की है; हम इन शर्तों के तहत LMPs की bioactivities लिए 2 साल (अप्रकाशित डेटा) के लिए संरक्षित किया जा सकता है कि मनाया है।

तिथि करने के लिए, प्रवाह cytometry सांसदों के विश्लेषण के लिए "सोने के मानक 'माना जाता है। अनेक रंगों प्रवाह cytometric विश्लेषण विभिन्न सेलुलर मूल से सांसदों की उप-जनसंख्या निर्धारित करने के लिए प्रयोग किया जाता है। फिर भी, वर्तमान व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्रवाह cytometers छोटे आकार के सांसदों आबादी (कम से कम 300 एनएम) का विश्लेषण करने के लिए और सेलुलर मलबे और सांसदों के बीच भेद करने की क्षमता में सीमित कर रहे हैं। इसके अलावा, FACS विश्लेषण (cytofluorimetric विश्लेषण) सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए apoptotic कोशिकाओं की गिनती के लिए TUNEL के परख करने के लिए एक वैकल्पिक तरीका हो सकता है।

यहाँ, हम विवो पूर्व ब्रोन्कियल explants सुसंस्कृत च airway के उपकला कोशिकाओं का एक अच्छा स्रोत प्रदान कर सकते हैं कि पता चलता हैया औषध विज्ञान और विष विज्ञान स्क्रीनिंग। इन ब्रोन्कियल explants उनके मूल शारीरिक वातावरण जैसे लगते हैं, वे निश्चित ब्रोन्कियल या फेफड़ों के रोगों का संकेत दे रास्ते का निर्धारण करने के लिए उपयोगी हो सकता है। हालांकि, सक्षम नहीं उपकला कोशिकाओं पर LMPs की apoptotic प्रभाव पुष्टि करने के लिए होगा ही ब्रोन्कियल explants के उपयोग या / और माध्यमिक से निवासी प्रतिरक्षा कोशिकाओं की सक्रियता के लिए सीधी से हुई है। LMPs के प्रत्यक्ष प्रभाव की जांच करने के लिए, प्राथमिक airway के उपकला कोशिकाओं को इस उद्देश्य के लिए उपयुक्त हो जाएगा।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

विजन स्वास्थ्य अनुसंधान नेटवर्क - इस काम के स्वास्थ्य अनुसंधान (178,918), Fonds डे Recherche एन Sante डु क्यूबेक कनाडा के संस्थानों से अनुदान द्वारा समर्थित है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LMPs production and characterization
CEM T cells  ATCC  CCL-119
X-VIVO 15 medium  Cambrex, Walkersville 04-744Q
Flask T75 Sarstedt 83.1813.502
Flask T175 Sarstedt 83.1812.502
Actinomycin D  Sigma Chemical Co. A9415-2mg
PBS Lifetechnologies 14190-144
0.22 µm filter Sarstedt 83.1826.001
Annexin-VCy5 BD Pharmagen  559933
FACS flow solution BD Bio-sciences 342003
Fluorescent microbeads (1 µm) Molecular Probes  T8880
Polysterene counting beads (7 µm) Bangs laboratories PS06N/6994
Polypropylene FACS tubes Falcon 352058
1 ml pipet Fisher 13-678-11B
5 ml pipet Falcon 357543
25 ml pipet Ultident DL-357551
1.5 ml conical polypropylene micro tube Sarstedt 72.690
15 ml conical polypropylene tube Sarstedt 62.554.205
50 ml conical polypropylene tube Sarstedt 62.547.205
50 ml high speed polypropylene copolymer tube Nalgene 3119-0050
250 ml high speed polypropylene bottle Beckman 356011
Protein assay (Bradford assay) Bio-Rad Laboratories 500-0006
Protein assay standard II Bio-Rad Laboratories 500-0007
Test tube 16 x 100 VWR 47729-576
Test tube 12 x 75 Ultident 170-14100005B
Cell incubator  Mandel Heracell 150
Low speed centrifuge IEC Centra8R
High speed centrifuge Beckman Avanti J8
High speed rotor for 250ml bottle Beckman JLA16.250
High speed rotor for 50ml tube Beckman JA30.50
Fow cytometry  BD Bio-sciences FACS Calibur
Spectrophotometer Beckman Series 600
Bronchial tissue explants and sections 
C57BL/6 mice (5-7 weeks old)   Charles River Laboratories, Inc. 
Mouse Airway PrimaCell™ System: CHI Scientific, Inc. 2-82001
 Rib-Back Carbon Steel Scalpel Blades Becton Dickinson AcuteCare 371310 #10
Scalpel Handle Fine Science Tools Inc.  10003-12 #7
phase-contrast inverted microscope Olympus Optical CO., LTD.    CK2
high O2 gas mixture  VitalAire Canada Inc.
modular incubator chamber Billups-Rothenberg Inc. MIC-101
MaxQ 4000 incubated orbital shaker Barnstead Lab-Line,  SHKA4000-7
12-well tissue culture plate Becton Dickinson and Company 353043
Plastic tissue culture dishes (100 mm) Sarstedt, Inc. 83.1802
Surgical scissors Fine Science Tools Inc.  14060-09 Straight, sharp, 9cm longth
Half-curved Graefe forceps Fine Science Tools Inc.  11052-10
humidified CO2 incubator Mandel Scientific Company Inc.  SVH-51023421
 Histopathological examination 
formalin formaldehyde Sigma-Aldrich, Inc.  HT5011
paraffin Fisher scientific  International, Inc. T555
ethyl alcohol Merck KGaA, Darmstadt EX0278-1
 glutaraldehyde  Sigma-Aldrich, Inc.  G6403
Cacodylate Sigma-Aldrich, Inc.  31533
microscope slides VWR Scientific Inc.  48300-025 25x75 mm
Xylene Fisher scientific  International, Inc. X5-4
Mayer's hematoxylin Sigma-Aldrich, Inc.  MHS16 Funnel with filter paper  
HCl  Fisher scientific  International, Inc.   A144s-500
eosin  Sigma-Aldrich, Inc.  HT110116 Funnel with filter paper  
Permount™ Mounting Medium Thermo Fisher Scientific Inc.  SP15-100
glass coverslip surgipath medical industries, Inc. 84503 24×24 #1 
TUNEL detection kit In Situ Cell Death Detection, POD 11 684 817 910
oven Despatch Industries Inc. LEB-1-20
rotary Microtome Leica Microsystems Inc. RM2145
filter paper Whatman International Ltd. 1003150 #3
Microscope Nikon Imaging Japan Inc. E800
staining dish complete Wheaton Industries, Inc. 900200 including dish, rack, cover
1.5 ml eppendorf tube Sarstedt Inc.  72.69 39x10 mm
Orbital and Reciprocating Water Bath ExpotechUSA ORS200
phosphate buffered saline   GIBCO 14190-144
fume hood Nicram RD Service 3707E

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References

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