Brug af elektroretinogrammet at vurdere Funktion i gnaver Retina og beskyttende virkninger af fjernbetjening Limb iskæmisk prækonditionering

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Brandli, A., Stone, J. Using the Electroretinogram to Assess Function in the Rodent Retina and the Protective Effects of Remote Limb Ischemic Preconditioning. J. Vis. Exp. (100), e52658, doi:10.3791/52658 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

ERG er et elektrisk potentiale genereret af nethinden som reaktion på lys og registreres fra hornhindens overflade af øjet. Når betingelserne for optagelse styres omhyggeligt, kan ERG anvendes i en række forskellige måder at vurdere retinal funktion. Her beskrev vi, hvordan at registrere »flash ERG«, potentialet genereres, når nethinden udsættes for en kort, lyse flash præsenteret i en Ganzfeld baggrund. Den Ganzfeld spreder lyset homogent og lysglimt når hele nethinden ca. ensartet. Hvis nethinden er mørkt tilpasset før optagelse, og den mørke-tilpasning opretholdes som dyret er forberedt til optagelse, ERG opnåede genereres af både stang og kegle fotoreceptorer.

Den mørke-tilpassede flash ERG har en karakteristisk bølgeform, som er blevet analyseret på to måder. For det første har tidlige og sene komponenter af ERG bølgeform blevet adskilt og knyttet til sekvensen af ​​neuronal aktivering i nethinden. Den tidligste komponent er en kort latenstid negativt gående potentiale, a-wave (figur 1). Dette efterfølges af en positivt gående potentiale, kaldet b-bølgen. Den stigende fase af b-bølgen viser svingninger, som betragtes som et separat element (oscillerende potentialer eller OP). A-bølge anses at blive genereret af fotoreceptorer, b-bølgen af celler i det indre nukleare lag og OP ved amacrine celler 1.

Baseret på stimulus styrke, reaktioner på blinker meget dim betegnet er muligt scotopic reaktionstærskel. Den scotopic tærskel respons forstås at blive genereret fra retinale ganglieceller 2-4. For det andet kan flash ERG være adskilt af lys tilpasning, eller af en to flash protokol beskrevet nedenfor, til stang- og kegle-drevne komponenter. Under fotopiske forhold, a-bølge ikke påvises i rotter, fordi keglen befolkning er lav, men OP og en b-bølge erklar 5. I primater, hvis nethinder har højere kegle populationer, både stang- og kegle- veje genererer et påviseligt en-bølge 6.

To nyttige foranstaltninger ofte udvundet fra flash-ERG er amplituderne af a- og b-bølgerne, målt som i figur 1, med typiske flash responser vist i figur 2. Når fotoreceptor befolkning er reduceret, for eksempel ved udsættelse for et skadeligt niveau lyse lys, er alle komponenter af ERG reduceret. Neuroprotektive interventioner, såsom remote iskæmisk konditionering (RIP), kan godkendes af bevarelsen af amplituder af a- og b-bølger (Figur 3). Sammenfattende analyse af ERG muliggør sammenligninger mellem sund, lys beskadiget og neuroprotected nethinden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Denne protokol følger retningslinjerne fra University of Sydney dyr pleje.

1. Making Elektroder

  1. Konstruere den positive elektrode (den, der vil kontakte hornhinden) fra en kort (5 cm) længde af platintråd 1-2 mm i diameter. Mode den ind i en løkke nogle få mm i diameter. Forbind denne løkke til en konventionel bly, længe nok til at nå input fase af forstærkeren (se figur 4).
  2. Konstruere den negative elektrode (som vil gå i dyrets mund) under anvendelse af en Ag / AgCl pelletere 1-2 mm i diameter, også forbundet til en konvention bly (se figur 4).
  3. Som en referenceelektrode (som vil gå i dyrets bagdel), anvendes en ren kanyle (23 G), også er forbundet til en føring på passende længde (se figur 4).
  4. Ideelt set bruge tre-bly, som instrumentfabrikanterne kabler til at forbinde de tre elektroder (positiv U94; hornhinde, negativ → mund, henvises → bagdel) til forstærkeren.

2. Tilslutning og kalibrering af Light Stimulus og ERG Set-up

  1. Opret (eller finde) en lille optagelse laboratorium, som kan gøres mørkt. Udstyre med enten en over-the-bænken lys lavet rød eller en rød hoved-lampe eller begge dele.
  2. Brug en lux meter for at bekræfte, at rødt lys belysning nå rottens øje under opsætningen ikke overstiger 1 lux.
    Bemærk: En neutral densitetsfilter kan anvendes til at reducere lampens lysstyrke og kilden til lampe skal specifikt udsende rødt lys. Mørk tilpasning vil blive kompromitteret, hvis lyskilder udsender lavere (synlige) bølgelængder.
  3. Lukke alle falsk lys ind i optagelsen laboratorium (dette kræver ofte vedholdenhed med uigennemsigtig tape) og forberede en neutral tæthed filter (dette kan købes i ark) stor nok til at passe over, og så dim, enhver computer skærm, du vil have i lab.
    Bemærk: Stray lys ogpå baggrund af en skærm er tilstrækkelige til skade mørke tilpasning af rotteøjet.
  4. Tilslut forstærkeren til datafangst hardware. Forbinde positive, negative og referencestoffer fører til forstærkeren. Kontroller, at computeren og LED Ganzfeld strømforsyningen er sluttet korrekt til en jordvarme.
    Bemærk: Nogle laboratorier har specialiseret jordforbindelse punkter, som er forbundet til en bygning jorden; et vandrør er et effektivt alternativ.
  5. Kalibrere LED-lyskilde med et forsknings-kvalitet radiometer. Fastgør måleren sensor i den position, hvor dyrets øje vil blive placeret under et eksperiment.
  6. Program de Ganzfeld lysdioder til at køre en fuld-field ERG protokol med trinvise stigninger i flash energi, flash varighed, flash gentagelse og tid mellem blinker, betegnes interstimuls interval (ISI), indstillinger. For et eksempel fuld-field protokol se tabel 1.
    Bemærk: Den fulde-field ERG blinker stige fra dim blinker gentagne til brigtige blinker i et skridt klog måde. Den dobbelte flash-programmet er en opfølgning af den fulde-field-protokol og muliggør isolering af stang og kegle svar.

3. dag forud for ERG Eksperimenter

  1. Mørk tilpasse Sprague-Dawley rotter i 12 timer, før du optager. Det er praktisk at gøre dette i optagelsen laboratoriet, når falsk lys er blevet elimineret.

4. Dag ERG Eksperimenter

  1. Sørge for dyret at være forsigtigt opvarmet, mens du optager. Vi bruger en letmetal platform bygget således, at dyrets hoved kan hvile på det rigtige tidspunkt ved indgangen til Ganzfeld. Platformen har indbygget rør, hvorigennem vi pumpe vand forvarmet til 40 ° C i et vandbad.
    Bemærk: Erfaringen viser, at dette holder dyrets kernetemperatur ved 37 ° C.
  2. Rotten vejer under mørke forhold. Optag vægt og gøre op korrekt ketamin (60 mg / kg) og xylazin (5 mg / kg) dosis. Begrænse rotte gently og injicere bedøvelsesmiddel intraperitonealt.
  3. Bemærk tidspunktet for injektion. Når dyret er bevidstløst (sædvanligvis inden for 5 min) kontrollere dybden af ​​bedøvelse ved let klemning ene fod pad, for at se om en refleks reaktion er til stede. Det er bedst at vente, indtil denne refleks er fraværende eller svag, før du fortsætter.
  4. Påfør en enkelt dråbe atropin og en anden af ​​proxmethacaine til hornhinden.
  5. Skær en længde på sort tråd 10 cm. Lav en løkke med en simpel knude og glide løkken over ækvator i øjet. Spænd det lidt; effekten er at trække øjeæblet lidt frem, med minimalt tryk. Dette holder hornhinden fremgår øjenlågene.
  6. Anvende carbomer øjendråber til hornhinden overflade. Sørg carbomer forbliver på hornhindens overflade, og ikke spilde på øjenlågene eller ansigtet.
  7. Placer absorberende strøelse ovenpå opvarmet platform.
  8. Position rotte på strøelse, med hovedet i anbefalede sted i åbningen af ​​Ganzfeld.
  9. Indsæt internal temperatursonde i rectum. Sikker temperaturføler i position ved at tape sonde ledning til halen.
  10. Sæt referenceelektrode (23 G nål) subkutant i det bageste ben, og oprette forbindelse til forstærkeren.
  11. Placer den negative elektrode (Ag / AgCl pellet) sikkert i munden. For at forhindre dette glide ud i munden, anbringe den forbindende føre til en stabil overflade.
  12. Placer positive elektrode over midten af ​​hornhinden. Ved hjælp af en mikromanipulator, sikrer, at elektroden rører hornhinden forsigtigt.
  13. Check kropstemperatur er på 37,0-37,5 ° C.
  14. Når dyret er anbragt korrekt og elektroder er på plads, drapere hele opsætningen (Ganzfeld og dyr) med et uigennemsigtigt materiale (for at bevare mørke tilpasning). Vi bruger en blød sort klæde.
  15. I købet software indstillet til en 2 kHz samplingfrekvens med en samling tid på 100-1000 ms med 5 ms af præ-kollektion sampling. Indstil band pass filtre til 1-1000Hz og sikre, at prøveudtagningen er udløst at prøve den periode ~ 250 msek efter en flash.
  16. Kontroller optagelsen baseline. Det bør være fri for uvedkommende støj, men viser nogle forstærker støj og en respiratorisk svingning.
  17. Hvis baseline viser uvedkommende støj, begynder fejlfinding. De fleste problemer er relateret til skred i elektrode position, eller grundstødning. Bruge et Faraday bur for at sikre optagelser er fri for uvedkommende støj.
  18. Kør en test flash, 0,4 log scot cd.sm -2. En ERG bølgeform svarende til fig 2A skal vises. I vores laboratorium typiske svar til en 0,4 log scot cd.sm -2 flash er (a-wave: -474 ± 39 μV og b-bølge: 1.512 ± 160 μV, n = 11).
  19. Tillad dyr til mørk re-tilpasning i 10 min. Det er bekvemt at bruge disse 10 min til recheck grundlinjen.
  20. Efter bekræftelse af stabilt signal starte optagelsen.
  21. Ved slutningen af ​​indspilningen, kontrollere, at kroppen Temperature blev opretholdt. Fjern elektroder. Genanvende carbomer polymer til hornhinder. Lad så dyret kan komme på en varmepude, indtil det er fuldt mobil og aktiv, før han vendte tilbage til stalde.

5. Fjernbetjening Iskæmi

  1. Udfør remote iskæmi i enten vågen eller bedøvede gnavere.
  2. Hvis dyret bedøvet, lægge den på en opvarmet platform (ovenfor) og glide blodtryksmåleren manchetten over den øverste del af det bagben-led, fri af knæet.
  3. Hvis der anvendes dyr til at blive håndteret, er det muligt at udføre denne procedure uden bedøvelse; det kræver to personer. Én person fastholder dyret forsigtigt, og den anden anvender blodtryksmåler manchet og driver blodtryksmåler.
  4. For vågne dyr, bruge et stykke håndklæde ~ 15 cm x 30-50 cm til forsigtigt wrap dyret, med den ene bagben gratis. Læg dyret på ryggen på (sige) venstre underarm, med hovedet gemt mellem indehaverens arm og torso, og stedmanchetten som netop beskrevet.
  5. Tømmes manchetten og sikre lufttrykket ventilen er lukket. Pump manchetten til 160 mmHg i bedøvede dyr, og til 180 mmHg i vågen dyr. Det overstiger systoliske blodtryk (normalt 140 mmHg og 160 mmHg henholdsvis).
  6. Oprethold dette pres efter behov, ved hjælp af den håndholdte pumpe.
  7. Efter den planlagte tid for iskæmi (vi bruger 2 perioder af 5 minutter adskilt af 5 min reperfusion), tømme manchetten presset ved at løsne lufttrykket ventil.
  8. Bekræfter virkningen af ​​fjernbetjeningen iskæmi med en hud temperatursonde knyttet til trædepuden. Hudtemperatur falder typisk 32-30 ° C, i løbet af 5 minutter og genopretter på reperfusion.

6. Let Skader

  1. Sikre, at rotter er i en mørk-tilpasset natten over, før lyset skader procedure.
  2. På et passende tidspunkt efter lemmer iskæmi (i vores eksperimenter uden forsinkelse), er hvert dyr placeret enkeltvis i en plexiglas kasser, with vand og mad i gulv-baserede containere.
    Bemærk: Der kan kun foretages Light-induceret skade i albino dyr.
  3. Tænd en pre-kalibreret 1.000 lux hvidt lys på en standard tid (normalt 9:00), og opretholde denne tilstand i 24 timer.

7. ERG Dataudtræk og analyse

  1. Anskaf gennemsnit bølgeformer for ERG. Hvis det kræves, korrekt for en ikke-nul baseline ved subtraktion.
  2. Måle amplituden af den a-wave (præsenteret ved midten til høje stimulus intensiteter), som spændingsforskellen mellem baseline og den første (<30 msek latency) trug (figur 1).
  3. Mål b-tak-amplitude som spændingsforskel mellem toppen af en bølge og den positive af følgende bølge, typisk forekommer ved en latens på 80-100 msek (figur 1).
  4. Isoler oscillerende potentialer ved hjælp af en Fourier transformation for at filtrere data 60-235 Hz, med en 90 Hz transitionsbånd
  5. Den implicitte tid (latenstid) af a- og b-bølge toppe kan også være et nyttigt mål (figur 1). Brug blinker de to til at isolere stangen respons. Fratræk kegle respons (flash 2) fra blandet reaktion (flash 1) for at isolere stangen respons (figur 2).
  6. Normalisere individuel lysintensitet a-bølge og b-bølge amplituder (efterbehandling / efterbehandling-baseline) eller gennemsnit for behandlingsgrupper. Intensitet-respons kurver plotte gruppe amplituder og fejl mod flash energi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den protokol kan bruges til at måle synsfunktion af gnaver nethinden in vivo. A-bølge, en måling af fotoreceptor funktion, og b-bølge, et mål for den indre nethinde funktion, er kommenteret i figur 1.

Stangen-dominerede ERG signal stiger med stigende lysstimulus, som vist i figur 2A. A-bølge viser sig på ~ 0,4 log scot cd.sm -2 og amplituden af A-bølge øges indtil mætning på 2,5 log scot cd.sm -2 (ikke vist). Den dobbelte flash paradigme er blevet anvendt til at adskille blandet ERG signal til kegle og stang isolat respons, som i figur 2B.

Dette ERG optagelse teknik kan bruges til at kontrollere neurobeskyttende interventioner. Basislinieoptegnelser afsluttet en uge før lysskade ses i figur 3A. Let skade reduceres både a-bølge og b-bølge amplituder, demonstreret i figure 3B. Remote iskæmisk prækonditionering var i stand til at reducere tabet af ERG amplitude, som det ses i figur 3C. Fjernbetjeningen iskæmi Teknikken afhænger af den korrekte anvendelse af årepressen over "knæ". Ukorrekt anvendelse af årepressen forhindrer ikke let beskadigelse af nethinden, som det ses i figur 3D.

Figur 1
Figur 1: Måling af a-bølge og b-bølger fra en mørk tilpasset ERG Den viste registreres fra hornhinden af en mørk-tilpasset øje til en lys lysglimt gives på tidspunktet viste t0 spor.. Amplituden af ​​a-bølgen måles fra baseline til den første rende (rød pil). Amplituden af ​​B-bølgen måles fra truget af en bølge til den følgende positive peak (blå pil). Implicit tid (latenstid) måles fra stimulusartefakt (t0) til interessepunktet på spor, som f.eks truget af a-bølge (firkantet beslag). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2: Udvikling af mørk-tilpasset ERG med stigende flash styrke og adskillelse af stang og kegle svar De viste registreres fra hornhinden af en mørk-tilpasset øje til stigende lysglimt spor.. A-bølgen vises lysere intensiteter. (A) Sammenligning 1,4-0,4 log scot cd.sm -2 har peak b-bølge mættet men a-bølge fortsætter med at vokse. I (B), der blinker de to overlejret. De to 2,0 log scot cd.sm -2 blinker er adskilt af en 500 msek ISI. Den første flash genererer en blandetrespons (sort), og den anden flash genererer en kegle-eneste svar (stiplet linje). Fratrække kegle respons giver den isolerede stang respons (grå). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3: ERG tilvejebringer et mål for funktionen af nethinden Repræsentative bølgeformer er vist her (A) normal retina, (B) retina beskadiget af lys, (C) retina konditioneret ved RIP før de udsættes for de skadelige lys, og. (D) retina ineffektivt betinget af RIP og derefter udsat for skadelige lys. Den samme flash energi blev brugt til hver post (2,0 log cd.sm -2). For posten i D trykmanchettenpå bagben var forkert placeret og iskæmi blev ikke fastlagt. Lys skader reducerer amplituden af ERG (B) og RIP afbøder reduktionen. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4:. Nærbillede ERG elektroder Elektroderne skal bygges, er vist, venstre mod højre; den positive elektrode til at kontakte hornhinden, den negative elektrode, der skal placeres i munden og referenceelektroden, som består af et krokodillenæb forbundet til en nål, der indsættes derefter i krydset subkutant. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den mørke-tilpassede flash ERG fremgangsmåde beskrevet ovenfor er en pålidelig metode til vurdering af nethindens funktion hos rotter. Både a-bølge og b-bølge blev reduceret med lys skader. Remote iskæmisk prækonditionering afbødes lysskade-inducerede reduktioner i a-bølge og b-bølge. Denne bevarelse af nethindens funktion antyder, at remote iskæmisk prækonditionering har fremkaldt neurobeskyttelse, der ligner andre former for beskyttende forkonditionering såsom hypoksi, iskæmi og motion 8-10. ERG-signal registreres bestemmes af tre sæt af faktorer - optagelsen setup, parametre for lys stimulus, og staten af ​​dyret.

Optagelse setup

ERG er reduceret i amplitude, når elektroder forkert placeret eller præparatet ufuldstændigt jordet 11. Korrekt jordforbindelse af elektrisk udstyr i nærheden er vigtig, for at reducere støj i optagelsen; hvis en betydelig støj fortsætter en faraday buret bør anvendes. Den positive elektrode bør være sikkert placeret i midten af ​​cornea med en bekræftelse af positionen kontrolleres før start ERG fuld felt protokol og ved afslutningen. Det er vigtigt, at denne elektrode kontakter kun cornea; kontakt med øjenlåget eller endda whiskers kan reducere signalamplitude. En løs bomuldstråd er blevet anvendt i denne protokol til at forhindre øjenlågene fra rører positive elektrode. Nogle forskere har udviklet kontaktlinser med den positive elektrode indlejret for at sikre pålidelig kontakt og forebyggelse af øjenlåget rørende 12.

Lysstimulus oprettet

Stimulatoren vi har brugt tilvejebringer bredspektret hvidt lys, fra LED-lyskilder. Andre lyskilder er velegnede som lette stimuli såsom xenon strobe belysning og halogenbelysning, se Weymouth og Vingrys for sammenligninger mellem lys stimuli 11. Fordelen ved LED-lys, men jegs, at varigheden af ​​hver flash og sin energi er let programmerbare og hurtigt nulstille over en bred vifte af lysintensiteter. Vi har udviklet et sæt af glimt af gradueret energi, som i mørke-tilpassede gnaver spænder fra tærskel (der producerer en just-påviselig reaktion) til mætte (producerer en maksimal respons).

Ved trial and error, har vi etableret interstimulus intervaller (ISIS), som sikrer, at amplituden af ​​svar på en flash er uafhængig af en forudgående flash af samme intensitet. Den lysere flash, jo længere ISI påkrævet for denne uafhængighed.

Også ved trial and error har vi etableret et minimum antal svar, der kræves ved hvert energi til at give en ren signal. Gennemsnit flere svar vil altid give et renere signal. Vi bruger minima så energien serien kan afsluttes hurtigt (i vores protokol 11 min); hurtig afslutning reducerer variation på grund af ændringer i bedøvelsesmiddel stat og allows tid til andre variable, der skal undersøges, hvis det er nødvendigt.

Tilstand af dyret

Adskillige parametre for dyrets fysiologi er vigtige for at optimere og standardisere de ERG optagelser opnåede.

Temperatur

A-bølge frembringes fra lys-induceret aktivering af en G-protein-koblede lysoverførelsen i det ydre segment; dynamikken i denne kaskade er, ligesom alle enzymatiske reaktioner, temperaturafhængig 13,14. Gnavere under bedøvelse er tilbøjelige til hypotermi og kræver ekstern opvarmning for at opretholde en kernetemperatur på 37,5 ° C under hele optagelsen. Hvis kropstemperaturen falder mere end 1-2 ° C, de a-bølge og b-bølge amplituder falde, og deres latenstider stige 15.

Anæstesi

Stabile ERG optagelser kræver dyret at være ubevægelig. Neuromuskulære blokkere og anaesthetic midler anvendes i ERG eksperimenter for at opnå en bevidstløs og ubevægelig tilstand. Der har kun været fem rapporter om vågen ERG optagelser i rotter 16-20. I disse undersøgelser elektroder blev kirurgisk præ-implanteret i kraniet og to af disse undersøgelser testede virkningen af anæstesi på ERG 17,20.

Den mest almindelige bedøvelse under ERG optagelser har været en kombination af ketamin og xylazin (i vore forsøg 60 mg / kg af ketamin og 5 mg / kg xylazin anvendes). Dette påvirker ERG mindre end gasformige anæstesi sådan isofluran og halotan, og har vist sig relativt ugiftigt, med høje genanvendelsesprocenter 17,21,22. Denne fremgangsmåde holder dyret immobile for ~ 40 min; en halv dosis kan bruges til at udvide optageforhold i en tilsvarende periode. Undersøgelsen af ​​Chang sammenlignes direkte ERG med og uden bedøvelse og viste, at ketamin-xylazin målbart betyder forstyrre amplitude og ventetid af a- og b-waves 17. De fleste forskere standardisere bedøvende betingelser og derefter teste eksperimentelle parametre; vis effekt af bedøvelsesmidler kan ikke helt udelukkes.

Øjets omgivelser

Fysiologi øjet kræver vedligeholdelse, for at optimere og standardisere ERG optagelse. Eleverne skal være en standard størrelse; dette opnås med en mydriatisk, påføres som øjendråber, for at opnå maksimal dilatation. Hos gnavere er atropin eller phenylephrin brugt 23. Den hydrering af hornhinden opretholdes ved anvendelse af en carbomer polymer før optagelser; dette også stabiliserer elektriske konduktans mellem den positive elektrode og hornhinden. Hvis hornhinden bliver dehydreret, kan corneal ardannelse og kataraktdannelse forekomme 24. Kataraktdannelse er mere almindelig hos mus 25, og forskellige metoder til opretholdelse af hornhindens hydrering er blevet anvendt i muse ERG optagelser, herunder en konstant strøm af vandig væske ellerskræddersyede kontakt stil elektroder, der fælde hydrering ved hornhindens overflade 12.

Adaptiv tilstand af nethinden

Dette er en vigtig variabel. Den ovenfor anførte protokol er designet til at sikre, at nethinden er mørk-tilpasset, dens mest følsomme tilstand. Ideelt, pigmenterede rotter krævede 3 timer af mørke boliger at være fuldt mørk-tilpasset mens ikke-pigmenterede dyr, såsom Sprague Dawley-rotter, kræver et minimum af 5 timer 26. Det er almindelig praksis for scotopic ERG optagelser til at tilpasse dyrene natten i 12 timer. Delvis eller fuld tilpasning til lys kan nemt og hurtigt ved at dreje på en standard intensitet baggrund lys i Ganzfeld stimulator. Efter let tilpasning dog fuld mørke tilpasning tager timer at opnå; dermed antydning af ekstrem forsigtighed for at sikre, at øjnene ikke udsættes uheld for lys før optagelse.

ERG optagelse teknik er begrænset afOvenstående bestemmende faktorer (dvs. ERG & stimulus set-up) og beherskelse af forsker ved ERG test. Uerfarne forskere er tilbøjelige til at have variabel ERG optagelser. Varians kan reduceres ved at skabe tilstrækkeligt store stikprøver til at sammenligne resultater, såsom reduktioner eller gevinster i visuel funktion. Alternativt kan ERG optagelser normaliseres mellem baseline optagelser og efter behandling optagelser. De normaliserede data kan derefter grupperes og analyseret. Ved fremlæggelsen ERG data, er det almindelig praksis at vise gruppens data og repræsentative kurver.

Når alle ovenstående er omhyggeligt kontrolleret, amplituden af ​​ERG er et mål for den funktionelle tilstand af nethinden. ERG er konsekvent reduceret i amplitude ved nedbrydningen af fotoreceptorlaget forårsaget af lys skade eller genetisk induceret degeneration 27,28. Omvendt den beskyttende virkning af en intervention såsom RIP kan detekteres i AMPLitude af ERG 29. ERG er også blevet brugt i at demonstrere de beskyttende virkninger af iskæmisk konditionering, hypoksisk konditionering, motion og kost safran på nethinden 8-10,30.

Voksende kendskab til dynamikken i fototransduktion kaskade af rhodopsin, og de synaptiske forbindelser i nethinden, har tilskyndet til udvikling af modeller af ERG generation, og sofistikeret ERG bølgeform analyse er mulig selvom kinetisk modellering baseret på kendte fysiologiske begivenheder fototransduktion i fotoreceptorer og vores forståelse af den indre nethinde kredsløb 31. For eksempel er a-bølge kinetiske modeller baseret på de biokemiske trin, der opstår under fototransduktion og montering af modellen muliggør sammenligninger af model parametre som peak reaktioner, timing forsinkelser og følsomhed 14.

Ulempen ved modellering er, at den bygger på antagelser om retinal circuitry, og kan kun være så informativ som antagelserne tillader. I lyset af denne ulempe har en bølge kinetisk model for nylig blevet kritiseret for oversimplificerer a-bølge dynamik 32. I fotoreceptordegenerering undersøgelser, er ERG bølgeform analyse typisk ikke udføres af en anden grund. Fotoreceptordegenerering ofte svær, hvilket resulterer i dramatiske tab i visuel funktion, og dermed er yderligere analyse af a-bølge og b-bølge-parametre ikke berettiget 8,9,27,30. Uanset, har ERG modellering af a-bølge og b-bølge er vedtaget som standard praksis i mange gnavere og detaljerede oplysninger om ERG modellering, for a-bølge, kan findes b-bølge og OP i undersøgelser af Hood, og gennemgang artikler af Weymouth og Vingrys, Frishman og Wachtmeister 11,32-34.

Sammenfattende præsenterede den mørke-tilpassede ERG-metoden kan optage målbare forskelle mellem retinal degeneration med og uden neuroprotektive interventioner sn sådan som remote iskæmisk konditionering. De væsentlige elementer til pålidelige ERG optagelser er blevet beskrevet. De ERG målinger af fotoreceptorer og indre nethinde funktion er nyttige for forskere studerer degenerationer i nethinden, og virkningerne af forskellige genetiske, biofarmaceutiske og farmakologiske interventioner på visuel funktion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Jonathan Stone er direktør for CSCM Pty Ltd

Acknowledgements

Forfatterne er taknemmelige for den hjælp fra fru Sharon Spana i gnavere overvågning, håndtering og eksperimentering. Ph.d. finansieringsstøtte er leveret af University of Sydney og australske Forskningscenter for Excellence i Vision.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PC computer
Powerlab, 4 channel acquistion hardware AD Instruments PL 35044 Acquistion of ERG
Animal Bio Amp AD Instruments FE 136 Amplifier for ERG
Lab chart AD Instruments Signal collection software
Ganzfield Photometric solutions FS-250A Light stimulus
Ganzfield operating system Photometric solutions
Research Radiometer International light technologies ILT-1700 calibrate light series
Lux meter LX-1010B check red light illumanation
Excel Microsoft
Lead wires AD Instruments Connect postive, negative ground electrodes to amplifier
Lead wires - alligator AD Instruments ground ganzfield and acquistion hardware to computer
Platinum wire 95% A&E metals postive electrode
Mouth electrode Ag/AgCl Pellet SDR E205 negative electode
26 G needle BD ground electode
Water pump
Water bath
Tubing
Homeothermic blanket system with flexible probe Harvard Appartus 507222F
Atropine 1% w/v Bausch & Lomb topical mydriasis
Proxmethycaine 0.5% w/v Bausch & Lomb topical anaesthetic
Visco tears eye drops Novartis carbomer polymer
Thread retract eye lid
Tweezers
Reusable adhesive Blu tac Dim red headlamp. Affix electrodes
Absorbent bedding
Ketamil - ketamine 100 mg/ml - 50 ml Troy Laboratories Pty Ltd dissociative
Xylium - Xylazine 100 mg/ml - 50 ml Troy Laboratories Pty Ltd muscle relaxant
Scale

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Arden, G. B., Heckenlively, J. Principles and practice of clinical electrophysiology of vision. MIT Press. 139-183 (2006).
  2. Bui, B. V., Fortune, B. Ganglion cell contributions to the rat full-field electroretinogram. Journal of Physiology-London. 555, (1), 153-173 (2004).
  3. Fortune, B., et al. Selective ganglion cell functional loss in rats with experimental glaucoma. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45, (6), 1854-1862 (2004).
  4. Alarcon-Martinez, L., et al. Short and long term axotomy-induced ERG changes in albino and pigmented rats. Molecular Vision. 15, (254-255), 2373-2383 (2009).
  5. Lyubarsky, A. L., et al. Functionally rodless mice: transgenic models for the investigation of cone function in retinal disease and therapy. Vision Research. 42, (4), 401-415 (2002).
  6. Bush, R. A., Sieving, P. A. A PROXIMAL RETINAL COMPONENT IN THE PRIMATE PHOTOPIC ERG A-WAVE. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 35, (2), 635-645 (1994).
  7. Liu, K., et al. Development of the electroretinographic oscillatory potentials in normal and ROP rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47, (12), 5447-5452 (2006).
  8. Casson, R. J., Wood, J. P. M., Melena, J., Chidlow, G., Osborne, N. N. The effect of ischemic preconditioning on light-induced photoreceptor injury. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44, (3), 1348-1354 (2003).
  9. Lawson, E. C., et al. Aerobic Exercise Protects Retinal Function and Structure from Light-Induced Retinal Degeneration. Journal of Neuroscience. 34, (7), 2406-2412 (2014).
  10. Grimm, C., et al. HIF-1-induced erythropoietin in the hypoxic retina protects against light-induced retinal degeneration. Nature Medicine. 8, (7), 718-724 (2002).
  11. Weymouth, A. E., Vingrys, A. J. Rodent electroretinography: Methods for extraction and interpretation of rod and cone responses. Progress in Retinal and Eye Research. 27, (1), 1-44 (2008).
  12. Bayer, A. U., Cook, P., Brodie, S. E., Maag, K. P., Mittag, T. Evaluation of different recording parameters to establish a standard for flash electroretinography in rodents. Vision Research. 41, (17), 2173-2185 (2001).
  13. Pugh, E. N., Lamb, T. D. AMPLIFICATION AND KINETICS OF THE ACTIVATION STEPS IN PHOTOTRANSDUCTION. Biochimica Et Biophysica Acta. 1141, (2-3), 111-149 (1993).
  14. Breton, M. E., Schueller, A. W., Lamb, T. D., Pugh, E. N. ANALYSIS OF ERG A-WAVE AMPLIFICATION AND KINETICS IN TERMS OF THE G-PROTEIN CASCADE OF PHOTOTRANSDUCTION. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 35, (1), 295-309 (1994).
  15. Mizota, A., Adachi-Usami, E. Effect of body temperature on electroretinogram of mice. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 43, (12), 3754-3757 (2002).
  16. Szabo-Salfay, O., et al. The electroretinogram and visual evoked potential of freely moving rats. Brain Research Bulletin. 56, (1), 7-14 (2001).
  17. Charng, J., et al. Conscious Wireless Electroretinogram and Visual Evoked Potentials in Rats. Plos One. 8, (9), (2013).
  18. Galambos, R., Juhasz, G., Kekesi, A. K., Nyitrai, G., Szilagyi, N. NATURAL SLEEP MODIFIES THE RAT ELECTRORETINOGRAM. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, (11), 5153-5157 (1994).
  19. Galambos, R., Szabo-Salfay, O., Szatmar, E., Szilagyi, N., Juhasz, G. Sleep modifies retinal ganglion cell responses in the normal rat. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, (4), 2083-2088 (2001).
  20. Guarino, I., Loizzo, S., Lopez, L., Fadda, A., Loizzo, A. A chronic implant to record electroretinogram, visual evoked potentials and oscillatory potentials in awake, freely moving rats for pharmacological studies. Neural Plasticity. 11, (3-4), 241-250 (2004).
  21. Huang, J. C., Salt, T. E., Voaden, M. J., Marshall, J. NON-COMPETITIVE NMDA-RECEPTOR ANTAGONISTS AND ANOXIC DEGENERATION OF THE ERG B-WAVE IN-VITRO. Eye (London). 5, (4), 476-480 (1991).
  22. Sasovetz, D. KETAMINE HYDROCHLORIDE - EFFECTIVE GENERAL ANESTHETIC FOR USE IN ELECTRORETINOGRAPHY. Annals of Ophthalmology. 10, (11), 1510-1514 (1978).
  23. Mojumder, D. K., Wensel, T. G. Topical Mydriatics Affect Light-Evoked Retinal Responses in Anesthetized Mice). Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51, (1), 567-576 (2010).
  24. Fraunfel, F. t, Burns, R. P. ACUTE REVERSIBLE LENS OPACITY - CAUSED BY DRUGS, COLD, ANOXIA, ASPHYXIA, STRESS, DEATH AND DEHYDRATION. Experimental Eye Research. 10, (1), 19 (1970).
  25. Calderone, L., Grimes, P., Shalev, M. ACUTE REVERSIBLE CATARACT INDUCED BY XYLAZINE AND BY KETAMINE-XYLAZINE ANESTHESIA IN RATS AND MICE. Experimental Eye Research. 42, (4), 331-337 (1986).
  26. Behn, D., et al. Dark adaptation is faster in pigmented than albino rats. Documenta Ophthalmologica. 106, (2), 153-159 (2003).
  27. Sugawara, T., Sieving, P. A., Bush, R. A. Quantitative relationship of the scotopic and photopic ERG to photoreceptor cell loss in light damaged rats. Experimental Eye Research. 70, (5), 693-705 (2000).
  28. Machida, S., et al. P23H rhodopsin transgenic rat: Correlation of retinal function with histopathology. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41, (10), 3200-3209 (2000).
  29. Brandli, A., Stone, J. Remote Ischemia Influences the Responsiveness of the Retina. Observations in the Rat. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55, (4), 2088-2096 (2014).
  30. Maccarone, R., Di Marco, S., Bisti, S. Saffron supplement maintains morphology and function after exposure to damaging light in mammalian retina. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49, (3), 1254-1261 (2008).
  31. Hood, D. C., Birch, D. G. Assessing abnormal rod photoreceptor activity with the a-wave of the electroretinogram: Applications and methods. Documenta Ophthalmologica. 92, (4), 253-267 (1996).
  32. Robson, J. G., Frishman, L. J. The rod-driven a-wave of the dark-adapted mammalian electroretinogram. Progress in Retinal and Eye Research. 39, 1-22 (2014).
  33. Hood, D. C., Birch, D. G. A COMPUTATIONAL MODEL OF THE AMPLITUDE AND IMPLICIT TIME OF THE B-WAVE OF THE HUMAN ERG. Visual Neuroscience. 8, (2), 107-126 (1992).
  34. Wachtmeister, L. Oscillatory potentials in the retina: what do they reveal. Progress in Retinal and Eye Research. 17, (4), 485-521 (1998).

Comments

3 Comments

  1. The article is very helpful to setup ERG to discriminate cone and rod electrical contributions. Could you please, let me know how can I access TABLE1 that it is mentioned in the article.

    Reply
    Posted by: Marcelo N.
    April 14, 2016 - 2:00 PM
  2. Hi Marcelo,

    Below is a link to table 1 as a pdf file. Not the voltages used were based on our calibration, and you may need to adjust your voltage settings to reach equivalent light intensities.
    http://tiny.cc/he5vay

    Reply
    Posted by: Alice B.
    April 17, 2016 - 10:18 PM
  3. Thank you very much.

    Reply
    Posted by: Marcelo N.
    April 18, 2016 - 10:19 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics