Met behulp van de electroretinogram om Function beoordelen in het knaagdier Retina en de beschermende effecten van Remote Limb Ischemische preconditionering

1Discipline of Physiology and Bosch Institute, Sydney Medical School, University of Sydney
Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Brandli, A., Stone, J. Using the Electroretinogram to Assess Function in the Rodent Retina and the Protective Effects of Remote Limb Ischemic Preconditioning. J. Vis. Exp. (100), e52658, doi:10.3791/52658 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

De ERG is een elektrische potentiaal van het netvlies opgewekt in reactie op licht, en opgenomen van het corneale oppervlak van het oog. Wanneer opnameomstandigheden zorgvuldig beheer kan de ERG worden gebruikt in een verscheidenheid van manieren om de retinale functie bepalen. Hier beschrijven we hoe de "flash ERG, de potentiaal gegenereerd wanneer de retina wordt blootgesteld aan een korte, heldere flits gepresenteerd in een Ganzfeld achtergrond opnemen. De Ganzfeld verspreidt het licht homogeen en de lichtflits het hele netvlies bereikt ongeveer gelijkmatig. Als de retina wordt donker aangepast voor de opname, en de donkere aanpassing wordt gehandhaafd als het dier is voorbereid voor het opnemen, de ERG verkregen wordt opgewekt door zowel staafjes en kegeltjes fotoreceptoren.

De donker aangepaste flash ERG heeft een karakteristieke golfvorm, die is op twee manieren geanalyseerd. Ten eerste zijn vroege en late onderdelen van de ERG golfvorm onderscheiden, en met betrekking tot de sequentie van neuronal activering in de retina. De eerste component is een korte vertraging neergaande potentiaal, de a-wave (figuur 1). Dit wordt gevolgd door een opgaande potentiaal, de zogenaamde b-wave. De stijgende fase van de b-golf toont oscillaties, die worden beschouwd als een afzonderlijke component (oscillerende potentials of OP's). De a-golf wordt geacht zullen worden door fotoreceptoren, de b-golf door cellen van de binnenste kernlaag, en OP's door amacrine cellen 1.

Op basis van de prikkelsterkte, reacties op erg zwak flitsen zogenaamde scotopische drempel respons mogelijk. De scotopic drempelwaarde respons wordt verstaan ​​worden gegenereerd uit de retinale ganglioncellen 2-4. Ten tweede kan de flitser ERG worden gescheiden door lichte aanpassing, of door een twee flash protocol hieronder beschreven, in staaf- en-cone gedreven componenten. Onder fotopische omstandigheden, de a-golf is niet detecteerbaar in ratten omdat de kegel bevolking is laag, maar OP's en b-wave zijnduidelijke 5. In primaten, waarvan het netvlies hebben hogere kegel bevolking, zowel staaf- en kegel- paden genereren een detecteerbaar een golf 6.

Twee nuttige maatregelen vaak uit het flash ERG zijn de amplitudes van de a- en b-golven, gemeten zoals in figuur 1, met typische flash responsen getoond in figuur 2. Wanneer de fotoreceptor populatie wordt verminderd, bijvoorbeeld door blootstelling aan licht tot schadelijk licht, alle onderdelen van de ERG verminderd. Neurobeschermende interventies, zoals remote ischemische preconditionering (RIP), kan worden gevalideerd door het behoud van de amplitudes van de a- en b-golven (Figuur 3). Samengevat, de analyse van de ERG een vergelijking mogelijk tussen gezond, licht beschadigd en neuroprotected netvlies.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Dit protocol volgt het dier zorg richtlijnen van de Universiteit van Sydney.

1. Het maken van elektroden

  1. Teken de positieve elektrode (degene die contact cornea) vanaf een korte (5 cm) lengte van platinadraad 1-2 mm in diameter. Mode het in een lus enkele mm in diameter. Sluit deze lus een huidige lood, lang genoeg om de ingangstrap van de versterker bereikt (zie figuur 4).
  2. Construct de negatieve elektrode (die zal gaan in de mond van het dier) met behulp van een Ag / AgCl pellet 1-2 mm in diameter, ook verbonden met een conventie lead (zie figuur 4).
  3. Als een referentie-elektrode (die in romp van het dier gaat), een schone injectienaald (23 G), ook verbonden met een leiding van geschikte lengte (zie figuur 4).
  4. Idealiter gebruik drie-lood kabels die door de fabrikanten instrument, om de drie elektroden te verbinden (positieve U94; hoornvlies, negatieve → mond, verwijzing → stuit) naar de versterker.

2. Aansluiting en kalibratie van Licht Stimulus en ERG Set-up

  1. Maak (of zoek) een opname laboratorium, die donker kan worden gemaakt. Uit te rusten met een of beide van een over-the-bank lichtrode gemaakt of een rood hoofd-lamp.
  2. Gebruik een luxmeter die rood licht verlichtingssterkte bereiken van het oog van de rat tijdens de installatie te bevestigen niet meer dan 1 lux.
    Opmerking: een grijsfilter kan worden gebruikt om de helderheid van de lamp te verminderen en de bron van de lamp licht moeten specifiek uitstralen rood licht. Dark aanpassing zal worden aangetast als lichtbronnen uitstoten lager (zichtbaar) golflengten.
  3. Afdichten van alle strooilicht invoeren van de opname laboratorium (dit vereist vaak volharding met ondoorzichtige tape) en bereiden een grijsfilter (dit kan worden gekocht in platen) groot genoeg is om op te passen, en zo zwak, een computerscherm, je zal hebben in de lab.
    Opmerking: Stray licht enhet licht van het scherm voldoende zijn om donkere aanpassing van het oog rat schaden.
  4. Sluit de versterker data-acquisitie hardware. Verbind positieve, negatieve en verwijzing leidt naar de versterker. Zorg ervoor dat de computer en de LED Ganzfeld voedingseenheid zijn aangesloten op een grond bron.
    Opmerking: Sommige laboratoria hebben zich gespecialiseerd aarding punten, aangesloten op een bouwgrond; een waterleiding is een effectief alternatief.
  5. Kalibreren van de LED-lichtbron met een research-kwaliteit radiometer. Bevestig sensor van de meter in de stand van de ogen van het dier zal worden gevestigd tijdens een experiment.
  6. Programmeer de Ganzfeld LEDs naar een full-field ERG protocol met stapsgewijze verhogingen van de flits van energie, flash duur, flash herhaling en tijd tussen de flitsen rennen, genaamd interstimuls interval (ISI), de instellingen. Voor een voorbeeld full-field-protocol zie tabel 1.
    Opmerking: De full-field ERG flitsen toenemen van repetitieve dim flitsen naar brechts knippert in een stapsgewijze manier. De twee flash-programma is een vervolg op de full-field-protocol en maakt isolatie van staafjes en kegeltjes reacties.

3. Dag Voorafgaand aan ERG Experimenteren

  1. Dark passen Sprague-Dawley ratten gedurende 12 uur voor de opname. Het is handig om deze in de opname laboratorium, nadat strooilicht is geëlimineerd.

4. Dag van de ERG Experimentation

  1. Schik voor het dier zachtjes verwarmd tijdens het opnemen zijn. We maken gebruik van een lichte metalen platform gebouwd, zodat het hoofd van het dier kan rusten op het juiste moment bij de ingang van de Ganzfeld. Het platform heeft ingebouwde buis waardoorheen we pompen water voorverwarmd tot 40 ° C in een waterbad.
    Opmerking: Gebleken is dat dit blijft de kerntemperatuur van het dier bij 37 ° C.
  2. Weeg de rat onder donkere omstandigheden. Gewicht opnemen en maken correcte ketamine (60 mg / kg) en xylazine (5 mg / kg) dosis. Restrain de rat genTLY en injecteer verdoving intraperitoneaal.
  3. Let op de tijd van de injectie. Zodra het dier bewusteloos is (meestal binnen 5 min) Controleer de diepte van de anesthesie door licht te knijpen een voet pad, om te zien of een reflex reactie aanwezig is. Het is het beste om te wachten tot deze reflex is afwezig of zwak is, alvorens verder te gaan.
  4. Breng een enkele druppel atropine en een andere van proxmethacaine aan hoornvlies.
  5. Snijd een 10 cm lengte van de zwarte draad. Maak een lus met een simpele knoop en zet de lus over de evenaar van het oog. Draai het iets; het effect is om de oogbol iets naar voren trekken, met minimale druk. Dit houdt het hoornvlies duidelijk uit de oogleden.
  6. Breng carbomeer oogdruppels op de cornea oppervlak. Zorgen carbomer blijft aan hoornvlies en niet morsen op de oogleden of het gezicht.
  7. Plaats absorberend beddengoed bovenop verwarmde platform.
  8. Positie rat op het beddengoed, met het hoofd in de aanbevolen plaats in de opening van de Ganzfeld.
  9. Int Inserternal temperatuursonde in het rectum. Secure temperatuursensor in de positie door taping sonde aan op de staart.
  10. Plaats de referentie-elektrode (de 23 G-naald) subcutaan in het achterste been, en verbinding maken met versterker.
  11. Plaats de negatieve elektrode (Ag / AgCl pellet) stevig in de mond. Om dit te voorkomen uitglijden uit de mond, brengt de verbindende leiden tot een stabiele ondergrond.
  12. Plaats de positieve elektrode in het midden van de cornea. Met behulp van een micromanipulator, ervoor te zorgen dat de elektrode raakt het hoornvlies voorzichtig.
  13. Controleer de lichaamstemperatuur is bij 37,0-37,5 ° C.
  14. Zodra het dier goed is gepositioneerd en elektroden zijn in de plaats, draperen de hele setup (Ganzfeld en dier) met een ondoorzichtig materiaal (naar donker aanpassing behouden). We maken gebruik van een zachte zwarte doek.
  15. In de acquisitie software ingesteld op een 2 KHz sampling rate met een collectie tijd van 100-1000 msec met 5 msec van pre-collectie sampling. Stel de band pass filters om 1-1,000Hz en ervoor te zorgen dat de bemonstering wordt geactiveerd om de periode van ~ 250 msec na een flits proeven.
  16. Controleer de opname baseline. Het moet vrij zijn van externe ruis, maar tonen enkele versterker lawaai en een respiratoire oscillatie.
  17. Als de basislijn toont externe ruis, begint het oplossen van problemen. De meeste problemen zijn gerelateerd aan afwijkingen in elektrodepositie of aarding. Gebruik een kooi van Faraday om ervoor te zorgen opnames zijn vrij van externe ruis.
  18. Voer een proefflits, 0,4 log scot cd.sm -2. Een ERG golfvorm gelijk aan figuur 2A moeten verschijnen. In ons laboratorium typische antwoorden voor een 0,4 log scot cd.sm -2 flash zijn (a-wave: -474 ± 39 mV en b-golf: 1512 ± 160 mV, n = 11).
  19. Laat dier dark opnieuw aan te passen voor 10 min. Het is handig om de 10 min om de basislijn opnieuw te controleren.
  20. Na de bevestiging van stabiele signaal te beginnen opnemen.
  21. Aan het einde van de opname sessie, controleer dan of het lichaam temperature werd gehandhaafd. Verwijder elektroden. Reapply carbomeer polymeer hoornvliezen. Laat het dier te herstellen op een warmte-pad totdat het is volledig mobiel en actief, voordat hij terugkeerde naar stallen.

5. Remote ischemie

  1. Voer remote ischemie in ofwel wakker of verdoofd knaagdieren.
  2. Als het dier is verdoofd, leg het op een verwarmd platform (boven) en zet de bloeddrukmeter manchet over het bovenste deel van de achterste ledematen, uit de buurt van de knie.
  3. Wanneer de dieren worden gebruikt om verschillende handelingen is het mogelijk om deze procedure uit te voeren zonder verdoving; Dit vereist twee personen. Een persoon weerhoudt het dier voorzichtig en de tweede past de bloeddrukmeter manchet en exploiteert de bloeddrukmeter.
  4. Voor wakkere dieren, gebruik dan een stuk handdoek ~ 15 cm x 30-50 cm om voorzichtig wikkel de dieren, met één achterbeen gratis. Leg het dier op zijn rug op (bijvoorbeeld) de linker onderarm, met zijn hoofd verscholen tussen arm en de romp van de houder, en plaatsde manchet zoals zojuist beschreven.
  5. Leeglopen van de manchet en zorgen voor de luchtdruk gesloten is. Pomp de manchet 160 mmHg in dieren verdoofd en op 180 mmHg in wakkere dieren. Dit overschrijdt systolische druk (meestal 140 mmHg en 160 mmHg respectievelijk).
  6. Handhaaf die belasting met gebruikmaking van de handbediende pomp.
  7. Na de geplande tijd voor ischemie (we gebruiken 2 periodes van 5 minuten, gescheiden door 5 min reperfusie), laten leeglopen van de manchet druk door de luchtdruk ventiel los te draaien.
  8. Bevestig het effect op afstand ischemie met huidtemperatuur probe bevestigd aan de voetzool. Skin temperatuur daalt meestal 32-30 ° C, meer dan 5 minuten en herstelt op reperfusie.

6. Licht Schade

  1. Zorg ervoor dat de ratten zijn in een donker aangepaste nachts, voordat het licht schade procedure.
  2. Op het juiste moment na ischemie van de ledematen (in onze experimenten zonder vertraging), wordt elk dier afzonderlijk in een plexiglas dozen, wi geplaatstth water en voedsel in de vloer op basis van containers.
    Opmerking: Licht-geïnduceerde schade kan alleen in albino dieren worden uitgevoerd.
  3. Schakel op een pre-gekalibreerde 1000 lux wit licht op een standaard tijd (meestal 09:00) en deze toestand gedurende 24 uur behouden.

7. ERG Data Extraction en Analyse

  1. Verwerven gemiddeld golfvormen van de ERG. Eventueel corrigeren voor een niet-nul basislijn, door aftrekking.
  2. Meet de amplitude van een golf (ingediend op gemiddelde tot hogere stimulus intensiteit), als het spanningsverschil tussen de basislijn en de eerste (<30 msec latentie) goot (figuur 1).
  3. Meet de b-golf amplitude als het spanningsverschil tussen de top van het a-golf en de positieve van de volgende golven, gewoonlijk optreedt bij een latentie van 80-100 msec (figuur 1).
  4. Isoleer oscillerende potentialen via een Fourier transformatie om gegevens 60-235 Hz filter, met een 90 Hz transitie band
  5. De impliciete tijd (latency) van de a- en b-golf pieken kan ook een nuttige maatregel (figuur 1) zijn. Gebruik de twee flitsen om de staaf reactie te isoleren. Trek de conus response (flash 2) vanaf het gemengde respons (flash 1) aan de stang response isoleren (Figuur 2).
  6. Normaliseren individuele lichtintensiteit een-wave en b-golf amplitudes (post-behandeling / post-behandeling-baseline) of gemiddeld voor de behandeling groepen. Intensiteit-respons curves plot de groep amplitudes en opstaan ​​tegen flash energie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Het protocol kan worden gebruikt om visuele functie van knaagdieren retina in vivo meten. De een-golf, een maat voor de afdrukband functie en de b-golf, een maatregel van innerlijke netvlies functie worden geannoteerd in figuur 1.

De staaf gedomineerde ERG signaal toeneemt met de toenemende licht stimulus, zoals weergegeven in figuur 2A. De a-golf blijkt bij ~ 0,4 log scot cd.sm -2 en de amplitude van de a-golf neemt toe tot verzadiging 2,5 log scot cd.sm -2 (niet getoond). De twin flash paradigma gebruikt om mixed ERG signaal gescheiden in kegel en rod isolaat respons, zoals in figuur 2B.

Deze ERG opnametechniek kan worden om neurobeschermende acties controleren. Basislijnregistratie voltooide een week voor lichtschade worden gezien in figuur 3A. Lichte schade verminderd zowel een golf en b-golf amplitudes, aangetoond in Figure 3B. Remote ischemische voorconditionering kon het verlies van ERG amplitude verminderen, zoals te zien in figuur 3C. De afstandsbediening ischemie techniek is afhankelijk van de juiste toepassing van de tourniquet boven de "knie". Onjuiste toepassing van de tourniquet niet verhindert lichte schade aan het netvlies, zoals te zien in figuur 3D.

Figuur 1
Figuur 1: Meting van de a-wave en b-golven van een donker aangepaste ERG De getoonde is opgenomen van het hoornvlies van een donker aangepaste oog op een heldere flits van licht gegeven op het moment getoond t0 trace.. De amplitude van een golf wordt gemeten vanaf de basislijn tot de eerste trog (rode pijl). De amplitude van de b-golf wordt gemeten vanaf de trog van een golf aan de volgende positieve piek (blauwe pijl). Impliciete tijd (latentie) wordt gemeten vanaf de stimulusartefact (t0) tot op het punt van de rente op het spoor, zoals het dieptepunt van de a-golf (vierkante haken). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2: Ontwikkeling van donker aangepaste ERG met toenemende flash kracht en de scheiding van staafjes en kegeltjes respons De getoonde worden opgenomen van het hoornvlies van een donker aangepaste oog op het verhogen van lichtflitsen sporen.. De een-golf verschijnt helderder intensiteiten. (A) Vergelijking van 1,4-0,4 log scot cd.sm -2, is de piek b-wave verzadigd maar de a-golf blijft groeien. In (B), worden de twee flitsen bedekt. De twee 2,0 log scot cd.sm -2 flitsen worden gescheiden door een 500 msec ISI. De eerste flits genereert een gemengderespons (zwart), en de tweede flits genereert een alleen-conus respons (stippellijn). Aftrekken van de kegel respons levert de geïsoleerde staaf respons (grijs). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3
Figuur 3: De ERG verschaft een maat voor de functie van retina Representatieve golfvormen opnieuw wordt getoond (A) normale retina, (B) retina beschadigd door licht, (C) geconditioneerde retina van RIP en vervolgens wordt blootgesteld aan de schadelijke licht en. (D) netvlies ineffectief geconditioneerd door RIP en vervolgens blootgesteld aan schadelijke licht. Dezelfde flash energie werd gebruikt voor elke record (2,0 log cd.sm -2). Voor de goede orde in D de druk manchetop de achterpoot werd verkeerd geplaatst en ischemie werd niet vastgesteld. Lichte schade vermindert de amplitude van de ERG (B) en TNO vermindert de vermindering. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4
Figuur 4:. Sluit ERG elektroden De elektroden te bouwen getoond, links naar rechts; de positieve elektrode contact met de cornea, de negatieve elektrode in de mond en de referentie-elektrode die bestaat uit een krokodilleklem verbonden met een naald die vervolgens wordt ingebracht in de staart subcutaan worden geplaatst. Klik hier om een grotere versie te bekijken van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De donker aangepaste flash ERG hierboven beschreven is een betrouwbare methode voor het beoordelen van de retinale functie bij ratten. Zowel de een-wave en b-golf werden gereduceerd met lichte schade. Remote ischemische preconditionering getemperd licht schade veroorzaakte reducties in de een-wave en b-golf. Dit behoud van retinale functie suggereert dat remote ischemische preconditionering heeft geïnduceerde neuroprotectie, die lijkt op andere vormen van beschermende preconditionering zoals hypoxie, ischemie en lichaamsbeweging 8-10. De ERG geregistreerde signaal wordt bepaald door drie soorten factoren - de recording setup parameters van het licht stimulus, en de toestand van het dier.

Opnemen setup

De ERG is verminderd in amplitude wanneer elektroden verkeerd worden geplaatst of de voorbereiding is onvolledig geaard 11. Correcte aarding van de nabijgelegen elektrische apparatuur is belangrijk, om ruis in de opname te verminderen; als veel lawaai blijft een Faraday cage worden gebruikt. De positieve elektrode moet stevig worden geplaatst in het midden van de cornea met een bevestiging van de stand gecontroleerd alvorens de ERG full-protocolveld en aan het einde. Het is belangrijk dat deze elektrodecontacten alleen het hoornvlies; contact opnemen met het ooglid of zelfs snorharen kan amplitude verminderen. Een losse katoenen draad is gebruikt in dit protocol om te voorkomen dat de oogleden van het aanraken van de positieve elektrode. Sommige onderzoekers hebben contactlenzen ontwikkeld met de positieve elektrode ingesloten betrouwbaar contact en het voorkomen van ooglid raken 12 waarborgen.

Het licht stimulus opgezet

De stimulator we hebben gebruikt biedt een breed spectrum wit licht, van LED bronnen. Andere lichtbronnen zijn geschikt als licht stimuli zoals xenon strobe verlichting en halogeenverlichting, zie Weymouth en Vingrys vergelijkingen tussen licht stimuli 11. Het voordeel van LED-licht, maar ikis dat de duur van elke flits en de energie zijn gemakkelijk te programmeren en snel reset over een breed scala van lichtintensiteiten. We hebben een reeks van flitsen van gesorteerde energie, die in het donker aangepaste knaagdieren variëren van drempel (produceren van een just-detecteerbare respons) aan het verzadigen (produceren van een maximale respons) ontwikkeld.

Door trial and error, hebben we interstimulus intervallen (ISI) die ervoor zorgen dat de amplitude van de reactie op een flash onafhankelijk van een voorafgaande flits van dezelfde intensiteit ingesteld. Hoe helderder de flitser, hoe langer de ISI hiervoor benodigde onafhankelijkheid.

Ook door vallen en opstaan ​​hebben we een minimum aantal antwoorden nodig op elke energie om een ​​schone signaal vastgesteld. Gemiddeld meer reacties zullen altijd zorgen voor een schoner signaal. We gebruiken minima zodat de energie serie snel worden gedaan (in ons protocol 11 min); snelle voltooiing vermindert variëren door wijzigingen in anesthetische toestand en allows tijd voor andere variabelen te bestuderen, indien nodig.

Staat van het dier

Verschillende parameters van de fysiologie van het dier zijn belangrijk voor het optimaliseren en standaardiseren van de ERG opnamen verkregen.

Temperatuur

De a-golfsignaal wordt gegenereerd uit de licht-geïnduceerde activering van een G-proteïne gekoppelde fototransductiecascade in het buitenste segment; de dynamiek van deze cascade zijn, net als alle enzymatische reacties, afhankelijk van de temperatuur 13,14. Knaagdieren onder narcose zijn gevoelig voor onderkoeling en vereisen externe verhitting tot een kerntemperatuur van 37,5 ° C gedurende de registratietijd behouden. Bij lichaamstemperatuur daalt meer dan 1-2 ° C, de a-golf en B-wave amplitudes verminderen en de latencies 15 verhogen.

Anesthesie

Stabiele ERG opnames nodig het dier bewegingloos zijn. Neuromusculaire blokkers en anaesthetic agenten worden gebruikt in ERG experimenten een bewusteloos en bewegingloos toestand te bereiken. Er zijn nog maar vijf meldingen van wakker ERG opnames bij ratten 16-20. In deze studies elektroden chirurgisch vooraf geïmplanteerd in de schedel en twee van deze studies het effect van anesthesie getest op de ERG 17,20.

De meest gebruikte anestheticum ERG-opnamen een combinatie van ketamine en xylazine geweest (in onze experimenten 60 mg / kg ketamine en 5 mg / kg xylazine wordt gebruikt). Dit beïnvloedt de ERG minder dan gasvormige anesthesie zoals isofluraan en halothaan, en is relatief niet-toxisch bleek, met een hoge recovery rates 17,21,22. Deze benadering houdt het dier onbeweeglijk ~ 40 min; een halve dosis kan worden gebruikt om opnameomstandigheden verlengen eenzelfde periode. De studie van Chang direct vergeleken de ERG met en zonder verdoving en toonde aan dat ketamine-xylazine doet meetbaar verstoren de amplitude en latencies van a- en b-golven 17. De meeste onderzoekers standaardiseren verdoving voorwaarden en test experimentele parameters; enig effect van anesthetica kan niet geheel worden uitgesloten.

Oculaire milieu

De fysiologie van het oog onderhoud behoeft, te optimaliseren en te standaardiseren ERG opname. De leerlingen moeten een standaard formaat te zijn; Dit wordt bereikt met een mydriatisch, toegepast oogdruppels, om maximale uitzetting te bereiken. In knaagdieren is atropine of fenylefrine gebruikt 23. De hydratatie van het hoornvlies wordt gehandhaafd door toepassing van een carbomeer polymeer vóór opnames; Dit stabiliseert ook elektrische geleidbaarheid tussen de positieve elektrode en cornea. Als het hoornvlies uitgedroogd raakt, kan de cornea littekens en cataractvorming optreden 24. Cataract komt vaker voor bij 25 muizen en verschillende methoden voor het behoud corneale hydratatie zijn toegepast bij muizen ERG opnames, zoals een constante stroom van waterig fluïdum ofcustom-made contact stijl elektroden die val hydratatie op het hoornvlies 12.

Adaptieve staat van retina

Dit is een belangrijke variabele. De hierboven verschafte protocol is ontworpen dat het netvlies donker aangepaste, tot de meest gevoelige toestand. Idealiter gepigmenteerde ratten vereiste 3 h dark behuizing volledig donker aangepaste, terwijl niet-gepigmenteerde dieren zoals Sprague Dawley ratten, is een minimum van 5 uur 26. Het is standaard praktijk voor scotopic ERG opnames voor dieren 's nachts aan te passen voor 12 uur. Gedeeltelijke of volledige aanpassing aan licht kan snel en gemakkelijk worden bereikt door het draaien op een standaard intensiteit achtergrond licht in het Ganzfeld stimulator. Na lichte aanpassing echter vol donkere aanpassing duurt uren te bereiken; vandaar de suggestie van de uiterste voorzichtigheid om ervoor te zorgen dat de ogen niet per ongeluk worden blootgesteld aan licht voor de opname.

De ERG opnametechniek beperkt door debovengenoemde factoren (dat wil zeggen, ERG & stimulus set-up) en de vaardigheid van de onderzoeker bij ERG testen. Onervaren onderzoekers waarschijnlijk variabele ERG opnames te hebben. Variantie kan worden verminderd door het creëren van groot genoeg steekproefomvang te vergelijken uitkomsten, zoals verlagingen of winsten in visuele functie. Als alternatief kan ERG opnames worden genormaliseerd tussen basislijn opnames en na de behandeling opnames. De genormaliseerde gegevens kunnen vervolgens gegroepeerd en geanalyseerd. Bij de presentatie van ERG data, is het gebruikelijk om gegevens te groeperen en representatieve golfvormen tonen.

Als alle bovenstaande zorgvuldig gecontroleerd, de amplitude van de ERG is een maat voor de bedrijfstoestand van de retina. De ERG is consistent in amplitude verminderd met depletie van de fotoreceptor laag veroorzaakt door licht beschadigd of genetisch geïnduceerde degeneratie 27,28. Omgekeerd, het beschermende effect van een interventie zoals RIP kan worden gedetecteerd in de AMPLitude van de ERG 29. De ERG is ook gebruikt in het aantonen van de beschermende effecten van ischemische preconditionering, hypoxische preconditionering, lichaamsbeweging en dieet saffraan op het netvlies 8-10,30.

Groeiende kennis van de dynamica van de fototransductiecascade van rhodopsine, en de synaptische verbindingen van de retina, heeft het ontwikkelen van modellen van ERG opwekking en geavanceerde ERG golfvormanalyse gestimuleerd kan echter kinetische modellering op basis van bekende fysiologische gebeurtenissen fototransductie in fotoreceptoren en ons begrip van innerlijke netvlies circuits 31. Bijvoorbeeld, worden de a-golf kinetische modellen gebaseerd op de biochemische stappen die tijdens fototransductie en aanbrengen model vergelijking mogelijk van modelparameters, zoals peak responsen tijdsvertragingen en gevoeligheid 14.

Het nadeel van het modelleren is dat het berust op aannames over retinale circuitry, en kan slechts informatief als veronderstellingen zijn toegestaan. In het licht van dit nadeel, is de een-golf kinetisch model is onlangs bekritiseerd voor te simpel een-wave dynamiek 32. In fotoreceptor degeneratie studies is ERG golfvormanalyse typisch niet uitgevoerd voor een andere reden. Fotoreceptor degeneratie is vaak ernstig, resulterend in dramatische verliezen in de visuele functie en bijgevolg is nadere analyse van een golf en b-golf parameters niet gerechtvaardigd 8,9,27,30. Ongeacht, is ERG modellering van de een-wave en b-golf is aangenomen als standaard praktijk in veel knaagdieren studies en gedetailleerde informatie over ERG modellering, voor een golf, b-golf en OP's kan worden gevonden in studies van Hood, en beoordeling artikelen van Weymouth en Vingrys, Frishman en Wachtmeister 11,32-34.

Samengevat, presenteerde het donker aangepaste ERG methode kan meetbare verschillen tussen retinale degeneratie met en zonder neuroprotectieve interventies s opnemenuch als remote ischemische preconditionering. De elementen essentieel voor betrouwbare ERG opnames zijn beschreven. De ERG metingen van fotoreceptor en binnenste retina functie bruikbaar voor onderzoekers die op degeneratie van de retina en de effecten van verschillende genetische, biofarmaceutische en farmacologische interventies visuele functie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Jonathan Stone is de directeur van CSCM Pty Ltd

Acknowledgements

De auteurs zijn dankbaar voor de hulp van mevrouw Sharon Spana in knaagdieren controle, handling en experimenten. PhD financiële steun is verstrekt door de Universiteit van Sydney en de Australian Research Centre for Excellence in Vision.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PC computer
Powerlab, 4 channel acquistion hardware AD Instruments PL 35044 Acquistion of ERG
Animal Bio Amp AD Instruments FE 136 Amplifier for ERG
Lab chart AD Instruments Signal collection software
Ganzfield Photometric solutions FS-250A Light stimulus
Ganzfield operating system Photometric solutions
Research Radiometer International light technologies ILT-1700 calibrate light series
Lux meter LX-1010B check red light illumanation
Excel Microsoft
Lead wires AD Instruments Connect postive, negative ground electrodes to amplifier
Lead wires - alligator AD Instruments ground ganzfield and acquistion hardware to computer
Platinum wire 95% A&E metals postive electrode
Mouth electrode Ag/AgCl Pellet SDR E205 negative electode
26 G needle BD ground electode
Water pump
Water bath
Tubing
Homeothermic blanket system with flexible probe Harvard Appartus 507222F
Atropine 1% w/v Bausch & Lomb topical mydriasis
Proxmethycaine 0.5% w/v Bausch & Lomb topical anaesthetic
Visco tears eye drops Novartis carbomer polymer
Thread retract eye lid
Tweezers
Reusable adhesive Blu tac Dim red headlamp. Affix electrodes
Absorbent bedding
Ketamil - ketamine 100 mg/ml - 50 ml Troy Laboratories Pty Ltd dissociative
Xylium - Xylazine 100 mg/ml - 50 ml Troy Laboratories Pty Ltd muscle relaxant
Scale

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Arden, G. B., Heckenlively, J. Principles and practice of clinical electrophysiology of vision. MIT Press. 139-183 (2006).
  2. Bui, B. V., Fortune, B. Ganglion cell contributions to the rat full-field electroretinogram. Journal of Physiology-London. 555, (1), 153-173 (2004).
  3. Fortune, B., et al. Selective ganglion cell functional loss in rats with experimental glaucoma. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45, (6), 1854-1862 (2004).
  4. Alarcon-Martinez, L., et al. Short and long term axotomy-induced ERG changes in albino and pigmented rats. Molecular Vision. 15, (254-255), 2373-2383 (2009).
  5. Lyubarsky, A. L., et al. Functionally rodless mice: transgenic models for the investigation of cone function in retinal disease and therapy. Vision Research. 42, (4), 401-415 (2002).
  6. Bush, R. A., Sieving, P. A. A PROXIMAL RETINAL COMPONENT IN THE PRIMATE PHOTOPIC ERG A-WAVE. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 35, (2), 635-645 (1994).
  7. Liu, K., et al. Development of the electroretinographic oscillatory potentials in normal and ROP rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47, (12), 5447-5452 (2006).
  8. Casson, R. J., Wood, J. P. M., Melena, J., Chidlow, G., Osborne, N. N. The effect of ischemic preconditioning on light-induced photoreceptor injury. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44, (3), 1348-1354 (2003).
  9. Lawson, E. C., et al. Aerobic Exercise Protects Retinal Function and Structure from Light-Induced Retinal Degeneration. Journal of Neuroscience. 34, (7), 2406-2412 (2014).
  10. Grimm, C., et al. HIF-1-induced erythropoietin in the hypoxic retina protects against light-induced retinal degeneration. Nature Medicine. 8, (7), 718-724 (2002).
  11. Weymouth, A. E., Vingrys, A. J. Rodent electroretinography: Methods for extraction and interpretation of rod and cone responses. Progress in Retinal and Eye Research. 27, (1), 1-44 (2008).
  12. Bayer, A. U., Cook, P., Brodie, S. E., Maag, K. P., Mittag, T. Evaluation of different recording parameters to establish a standard for flash electroretinography in rodents. Vision Research. 41, (17), 2173-2185 (2001).
  13. Pugh, E. N., Lamb, T. D. AMPLIFICATION AND KINETICS OF THE ACTIVATION STEPS IN PHOTOTRANSDUCTION. Biochimica Et Biophysica Acta. 1141, (2-3), 111-149 (1993).
  14. Breton, M. E., Schueller, A. W., Lamb, T. D., Pugh, E. N. ANALYSIS OF ERG A-WAVE AMPLIFICATION AND KINETICS IN TERMS OF THE G-PROTEIN CASCADE OF PHOTOTRANSDUCTION. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 35, (1), 295-309 (1994).
  15. Mizota, A., Adachi-Usami, E. Effect of body temperature on electroretinogram of mice. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 43, (12), 3754-3757 (2002).
  16. Szabo-Salfay, O., et al. The electroretinogram and visual evoked potential of freely moving rats. Brain Research Bulletin. 56, (1), 7-14 (2001).
  17. Charng, J., et al. Conscious Wireless Electroretinogram and Visual Evoked Potentials in Rats. Plos One. 8, (9), (2013).
  18. Galambos, R., Juhasz, G., Kekesi, A. K., Nyitrai, G., Szilagyi, N. NATURAL SLEEP MODIFIES THE RAT ELECTRORETINOGRAM. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, (11), 5153-5157 (1994).
  19. Galambos, R., Szabo-Salfay, O., Szatmar, E., Szilagyi, N., Juhasz, G. Sleep modifies retinal ganglion cell responses in the normal rat. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, (4), 2083-2088 (2001).
  20. Guarino, I., Loizzo, S., Lopez, L., Fadda, A., Loizzo, A. A chronic implant to record electroretinogram, visual evoked potentials and oscillatory potentials in awake, freely moving rats for pharmacological studies. Neural Plasticity. 11, (3-4), 241-250 (2004).
  21. Huang, J. C., Salt, T. E., Voaden, M. J., Marshall, J. NON-COMPETITIVE NMDA-RECEPTOR ANTAGONISTS AND ANOXIC DEGENERATION OF THE ERG B-WAVE IN-VITRO. Eye (London). 5, (4), 476-480 (1991).
  22. Sasovetz, D. KETAMINE HYDROCHLORIDE - EFFECTIVE GENERAL ANESTHETIC FOR USE IN ELECTRORETINOGRAPHY. Annals of Ophthalmology. 10, (11), 1510-1514 (1978).
  23. Mojumder, D. K., Wensel, T. G. Topical Mydriatics Affect Light-Evoked Retinal Responses in Anesthetized Mice). Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51, (1), 567-576 (2010).
  24. Fraunfel, F. t, Burns, R. P. ACUTE REVERSIBLE LENS OPACITY - CAUSED BY DRUGS, COLD, ANOXIA, ASPHYXIA, STRESS, DEATH AND DEHYDRATION. Experimental Eye Research. 10, (1), 19 (1970).
  25. Calderone, L., Grimes, P., Shalev, M. ACUTE REVERSIBLE CATARACT INDUCED BY XYLAZINE AND BY KETAMINE-XYLAZINE ANESTHESIA IN RATS AND MICE. Experimental Eye Research. 42, (4), 331-337 (1986).
  26. Behn, D., et al. Dark adaptation is faster in pigmented than albino rats. Documenta Ophthalmologica. 106, (2), 153-159 (2003).
  27. Sugawara, T., Sieving, P. A., Bush, R. A. Quantitative relationship of the scotopic and photopic ERG to photoreceptor cell loss in light damaged rats. Experimental Eye Research. 70, (5), 693-705 (2000).
  28. Machida, S., et al. P23H rhodopsin transgenic rat: Correlation of retinal function with histopathology. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41, (10), 3200-3209 (2000).
  29. Brandli, A., Stone, J. Remote Ischemia Influences the Responsiveness of the Retina. Observations in the Rat. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55, (4), 2088-2096 (2014).
  30. Maccarone, R., Di Marco, S., Bisti, S. Saffron supplement maintains morphology and function after exposure to damaging light in mammalian retina. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49, (3), 1254-1261 (2008).
  31. Hood, D. C., Birch, D. G. Assessing abnormal rod photoreceptor activity with the a-wave of the electroretinogram: Applications and methods. Documenta Ophthalmologica. 92, (4), 253-267 (1996).
  32. Robson, J. G., Frishman, L. J. The rod-driven a-wave of the dark-adapted mammalian electroretinogram. Progress in Retinal and Eye Research. 39, 1-22 (2014).
  33. Hood, D. C., Birch, D. G. A COMPUTATIONAL MODEL OF THE AMPLITUDE AND IMPLICIT TIME OF THE B-WAVE OF THE HUMAN ERG. Visual Neuroscience. 8, (2), 107-126 (1992).
  34. Wachtmeister, L. Oscillatory potentials in the retina: what do they reveal. Progress in Retinal and Eye Research. 17, (4), 485-521 (1998).

Comments

3 Comments

  1. The article is very helpful to setup ERG to discriminate cone and rod electrical contributions. Could you please, let me know how can I access TABLE1 that it is mentioned in the article.

    Reply
    Posted by: Marcelo N.
    April 14, 2016 - 2:00 PM
  2. Hi Marcelo,

    Below is a link to table 1 as a pdf file. Not the voltages used were based on our calibration, and you may need to adjust your voltage settings to reach equivalent light intensities.
    http://tiny.cc/he5vay

    Reply
    Posted by: Alice B.
    April 17, 2016 - 10:18 PM
  3. Thank you very much.

    Reply
    Posted by: Marcelo N.
    April 18, 2016 - 10:19 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics