Utilisation de la Électrorétinogramme pour évaluer la fonction dans le Retina rongeurs et les effets protecteurs de la distance préconditionnement ischémique Limb

1Discipline of Physiology and Bosch Institute, Sydney Medical School, University of Sydney
Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Brandli, A., Stone, J. Using the Electroretinogram to Assess Function in the Rodent Retina and the Protective Effects of Remote Limb Ischemic Preconditioning. J. Vis. Exp. (100), e52658, doi:10.3791/52658 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

L'ERG est un potentiel électrique généré par la rétine en réponse à la lumière, et enregistré à partir de la surface de la cornée de l'oeil. Lorsque les conditions d'enregistrement sont gérés avec soin, l'ERG peut être utilisé dans une variété de façons d'évaluer la fonction rétinienne. Ici, nous avons décrit comment enregistrer l''éclair ERG », le potentiel généré lorsque la rétine est exposée à un bref flash lumineux présenté dans un fond de Ganzfeld. Le Ganzfeld disperse la lumière de façon homogène et le flash de lumière atteint la rétine entière près uniformément. Si la rétine est sombre adapté avant l'enregistrement, et l'adaptation à l'obscurité est maintenue tant que l'animal est préparé pour l'enregistrement, l'ERG obtenue est générée par les deux photorécepteurs à bâtonnets et des cônes.

La adaptés à l'obscurité éclair ERG a une forme d'onde caractéristique, qui a été analysée de deux manières. Tout d'abord, précoces et tardives composants de la forme d'onde ERG ont été distingués, et liée à la séquence de neuroneal activation de la rétine. Le premier composant est un court temps de latence devenant négative potentielle, l'un d'onde (Figure 1). Il est suivi par un potentiel positif en cours, appelé b-ondes. La phase de montée de l'onde b montre des oscillations, qui sont considérés comme une composante distincte (des potentiels oscillatoires ou PO). L'un d'onde est considéré être généré par des photorécepteurs, la b-ondes par les cellules de la couche nucléaire interne, et les PO par les cellules amacrines 1.

Sur la base de l'intensité de stimulation, les réponses à éclairs très faibles dits la réponse scotopique de seuil sont possibles. La réponse du seuil scotopique est entendu être générés à partir des cellules ganglionnaires de la rétine 4.2. Deuxièmement, le flash ERG peut être séparé par adaptation à la lumière, ou par un protocole en deux flash décrit ci-dessous, en composants Rodgers et entraîné de cône. Dans des conditions photopiques, l'un d'onde est pas détectable chez les rats, parce que la population de cône est faible, mais les PO et un b-ondes sont5 clair. Chez les primates, dont les rétines ont des populations de cône supérieur, tant de bâtonnet et les voies de cône génèrent un détectable onde-6.

Deux mesures utiles souvent extraites du flash ERG sont les amplitudes de la A et B-ondes, mesurées comme dans la figure 1, avec des réponses flash typiques de la figure 2. Lorsque la population de photorécepteur est réduite, par exemple par l'exposition à dommageable lumineux la lumière, toutes les composantes de l'ERG sont réduits. Interventions neuroprotecteurs, comme à distance préconditionnement ischémique (RIP), peuvent être validés par la préservation des amplitudes de la A et B-ondes (figure 3). En résumé, l'analyse de l'ERG permet des comparaisons entre la santé, la lumière et de la rétine endommagée neuroprotected.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Ce protocole suit les directives de protection des animaux de l'Université de Sydney.

1. réaliser des électrodes

  1. Construire l'électrode positive (celui qui prendra contact avec la cornée) d'un court (5 cm) de longueur de fil de platine de 1-2 mm de diamètre. Façonner dans une boucle de quelques mm de diamètre. Connectez cette boucle à une connexion classique, assez long pour atteindre le stade de votre amplificateur d'entrée (voir Figure 4).
  2. Construire l'électrode négative (qui ira dans la bouche de l'animal) en utilisant un Ag / AgCl culot 1-2 mm de diamètre, également reliée à une avance de convention (voir Figure 4).
  3. Comme une électrode de référence (qui ira dans la croupe de l'animal), utiliser une aiguille hypodermique propre (23 G), également relié à un fil d'une longueur appropriée (voir Figure 4).
  4. Idéalement, utiliser des câbles de trois plomb fournies par les fabricants d'instruments, pour relier les trois électrodes (U positif94; cornée, négative → bouche, référence → croupe) à l'amplificateur.

2. Raccordement et étalonnage du stimulus lumineux et ERG Set-up

  1. Créez (ou localiser) un petit laboratoire d'enregistrement, qui peut être fait sombre. Equipé d'un ou des deux une lumière over-the-banc en rouge ou une lampe frontale rouge.
  2. Utilisez un luxmètre pour confirmer que l'éclairement de la lumière rouge atteindre l'oeil du rat lors de l'installation ne dépasse pas 1 lux.
    Remarque: Un filtre de densité neutre peut être utilisé pour réduire la luminosité de la lampe et la source de lumière de la lampe doit spécifiquement émettre de la lumière rouge. Adaptation à l'obscurité sera compromise si les sources lumineuses émettent plus faibles longueurs d'onde (visibles).
  3. Sceller toute lumière parasite entrer dans le laboratoire d'enregistrement (ce qui nécessite souvent la persistance avec du ruban adhésif opaque) et préparer un filtre de densité neutre (ce qui peut être acheté en feuilles) assez grand pour accueillir plus, et si faible, un écran d'ordinateur que vous aurez dans le laboratoire.
    Note: La lumière parasite etla lumière d'un écran sont suffisantes pour porter atteinte adaptation à l'obscurité de l'oeil de rat.
  4. Branchez l'amplificateur de matériel d'acquisition de données. Branchez, fils négatifs et positifs référence à l'amplificateur. Assurez-vous que l'ordinateur et l'unité d'alimentation de Ganzfeld LED sont bien connectés à une source de masse.
    Remarque: Certains laboratoires sont spécialisés points de mise à la terre, relié à une masse d'un bâtiment; une conduite d'eau est une alternative efficace.
  5. Calibrer la source de lumière LED avec un radiomètre la recherche de qualité. Fixer le capteur de l'appareil de mesure dans la position à laquelle l'oeil de l'animal sera situé au cours d'une expérience.
  6. Programme des LED Ganzfeld Pour exécuter un plein champ protocole ERG avec des augmentations graduelles de l'énergie flash, durée de flash, flash répétition et le temps entre les bouffées, appelé intervalle de interstimuls (ISI), les réglages. Pour un protocole exemple plein champ voir le tableau 1.
    Remarque: Le plein champ ERG clignote augmentent à partir répétitives clignote sombres à bdroite clignote dans un sage manière progressive. Le programme flash double suite au protocole de plein champ et permet d'isoler des réponses des bâtonnets et des cônes.

3. Jour Avant ERG Expérimentation

  1. Adapter foncé rats Sprague-Dawley pendant 12 heures avant l'enregistrement. Il est commode de le faire dans le laboratoire d'enregistrement, une fois la lumière parasite a été éliminée.

4. Jour de l'ERG Expérimentation

  1. Prendre des dispositions pour l'animal d'être chauffé doucement pendant l'enregistrement. Nous utilisons une plate-forme de métal léger construit de telle sorte que la tête de l'animal peut se reposer au point correcte à l'entrée de la Ganzfeld. La plate-forme dispose d'un tube intégré à travers lequel nous pomper l'eau préchauffé à 40 ° C dans un bain d'eau.
    Remarque: L'expérience montre que ce qui maintient la température à coeur de l'animal à 37 ° C.
  2. Peser le rat dans des conditions sombres. Enregistrer le poids et maquillage kétamine correcte (60 mg / kg) et de xylazine (5 mg / kg) la dose. Retenez le rat gently et injecter un anesthésique par voie intrapéritonéale.
  3. Remarque moment de l'injection. Une fois que l'animal est inconscient (généralement dans les 5 min) vérifier la profondeur de l'anesthésie en pinçant légèrement un plot de pied, pour voir si une réponse réflexe est présent. Il est préférable d'attendre jusqu'à ce que ce réflexe est absente ou faible, avant de poursuivre.
  4. Appliquer une seule goutte d'atropine et un autre de proxmethacaine à la cornée.
  5. Couper une longueur de 10 cm de fil noir. Faire une boucle avec un nœud simple et glisser la boucle sur l'équateur de l'œil. Serrer légèrement; l'effet est d'attirer l'œil légèrement vers l'avant, avec une pression minimale. Cela permet de maintenir la cornée claire des paupières.
  6. Appliquer œil carbomère tombe à la surface de la cornée. Assurer carbomère reste sur la surface de la cornée et ne se renverse sur les paupières ou le visage.
  7. Placez la literie absorbante sur le dessus de la plate-forme chauffée.
  8. Position rat sur la literie, avec la tête à l'endroit recommandé à l'ouverture de la Ganzfeld.
  9. Insérer internal sonde de température dans le rectum. Sonde de température sécurisé en position en collant la sonde cordon à la queue.
  10. Insérez l'électrode de référence (l'aiguille 23 G) sous-cutanée dans la patte arrière, et se connecter à un amplificateur.
  11. Placer l'électrode négative (la pastille Ag / AgCl) en toute sécurité dans la bouche. Pour éviter ce glisser hors de la bouche, apposer le câble de raccordement sur une surface stable.
  12. Placez l'électrode positive sur le centre de la cornée. Utilisation d'un micromanipulateur, veiller à ce que l'électrode touche doucement la cornée.
  13. Vérifiez la température du corps est à 37,0 à 37,5 ° C.
  14. Une fois que l'animal est correctement positionné et les électrodes sont en place, le drapé toute configuration (Ganzfeld et animale) avec un matériau opaque (pour préserver adaptation à l'obscurité). Nous utilisons un chiffon doux noir.
  15. Dans le logiciel d'acquisition fixé à un taux d'échantillonnage de 2 kHz avec un temps de collecte de 100-1000 msec avec 5 ms de pré-collecte échantillonnage. Réglez les filtres passe-bande à 1-1,000Hz et veiller à ce que l'échantillonnage est déclenché pour goûter à la période de ~ 250 ms à la suite d'un flash.
  16. Vérifiez la ligne de base de l'enregistrement. Il doit être exempt de bruits parasites, mais montrer un peu de bruit de l'amplificateur et une oscillation respiratoire.
  17. Si la ligne de base montre les bruits parasites, commencer le dépannage. La plupart des problèmes sont liés à des dérapages dans la position de l'électrode, ou d'échouement. Utilisez une cage de Faraday pour assurer des enregistrements sont exemptes de bruit parasite.
  18. Exécuter un flash test, 0,4 log scot cd.sm -2. Une forme d'onde ERG similaire à la figure 2A devrait apparaître. Dans notre laboratoire réponses typiques pour un 0,4 log scot cd.sm -2 Flash sont (a-onde: ± 39 mV -474 et b-ondes: 1512 ± 160 mV, n = 11).
  19. Laisser animal sombre ré-adapter pendant 10 min. Il est commode d'utiliser ces 10 min pour revérifier la ligne de base.
  20. Suite à la confirmation de signal stable commencer l'enregistrement.
  21. À la fin de la session d'enregistrement, vérifiez que le corps temperature été maintenue. Retirer électrodes. Appliquez de nouveau polymère carbomère cornées. Permettre à l'animal de récupérer sur un pad thermique jusqu'à ce qu'il soit entièrement mobile et actif, avant de retourner au logement des animaux.

5. ischémie à distance

  1. Effectuer une ischémie à distance soit en rongeurs éveillés ou anesthésiés.
  2. Si l'animal est anesthésié, le poser sur une plate-forme chauffée (ci-dessus) et glisser le brassard de tensiomètre sur la partie supérieure du membre postérieur, claire du genou.
  3. Si les animaux sont habitués à être manipulés, il est possible d'effectuer cette procédure sans anesthésie; cela nécessite deux personnes. Une personne retient l'animal doucement et le second applique le brassard de tensiomètre et exploite le tensiomètre.
  4. Pour animaux éveillés, utiliser un morceau de serviette ~ 15 cm x 30-50 cm pour envelopper doucement l'animal, avec l'un des membres postérieurs libre. Couchez l'animal sur le dos sur (par exemple) l'avant-bras gauche, avec sa tête coincée entre le bras et le torse, et la place de titulairele brassard que nous venons de décrire.
  5. Dégonfler le brassard et d'assurer la soupape de pression d'air est fermée. Pomper le brassard à 160 mmHg chez les animaux anesthésiés, et à 180 mm Hg chez les animaux éveillés. Cela dépasse la pression systolique (généralement 140 mmHg et 160 mmHg respectivement).
  6. Maintenir ces pressions que nécessaire, à l'aide de la pompe à main.
  7. Après le temps prévu pour l'ischémie (nous utilisons 2 périodes de 5 minutes séparées par 5 min de reperfusion), dégonfler la pression du brassard en desserrant le robinet de pression d'air.
  8. Confirmer l'effet de l'ischémie à distance avec une sonde de température de la peau attachée à la patte. la température de la peau tombe typiquement de 32 à 30 ° C, pendant 5 minutes et récupère sur reperfusion.

6. Light Damage

  1. Veiller à ce que les rats sont dans un avant adaptés à l'obscurité la nuit, la procédure de légers dégâts.
  2. Au moment opportun, suivant une ischémie des membres (dans nos expériences sans retard), chaque animal est placé seul dans une des boîtes en plexiglas, wie de l'eau et de la nourriture dans des contenants à base de sol.
    Remarque: les dommages induits par la lumière ne peut être effectuée chez les animaux albinos.
  3. Allumez une lumière blanche 1000 lux pré-calibré à un temps standard (généralement de 9 h) et maintenir cet état pendant 24 heures.

7. ERG Extraction et analyse des données

  1. Acquérir des formes d'ondes moyennes de l'ERG. Si nécessaire, pour corriger un niveau de référence différent de zéro, par soustraction.
  2. Mesurer l'amplitude de l'onde-(présenté à moyen et à de fortes intensités de relance), comme la différence de tension entre la base et le premier (<30 ms de latence) bac (Figure 1).
  3. Mesurer l'amplitude de l'onde b que la différence de tension entre le pic de l'a-onde et le positif de la vague suivante, survenant généralement à une latence de 80-100 ms (Figure 1).
  4. Isoler les potentiels oscillatoires en utilisant une transformée de Fourier pour filtrer des données 60-235 Hz, avec une bande de transition 90 Hz
  5. Le temps implicite (latence) des A et B-ondes pics peut aussi être une mesure utile (Figure 1). Utilisez les bouffées de jumeaux pour isoler la réponse de la tige. Soustraire la réponse des cônes (flash 2) de la réponse mixte (flash 1) pour isoler la réponse de la tige (Figure 2).
  6. Normaliser l'intensité de la lumière individu une onde et des amplitudes b-ondes (post-traitement / post-traitement de base) ou en moyenne pour les groupes de traitement. Courbes intensité-réponse tracer les amplitudes de groupe et l'erreur contre l'énergie flash.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Le protocole peut être utilisé pour mesurer la fonction visuelle de la rétine rongeur in vivo. L'un-ondes, une mesure de la fonction des photorécepteurs et le b-ondes, une mesure de la fonction de la rétine interne, sont annotés dans la figure 1.

Les ERG augmentations de signaux de tige-dominé avec le stimulus lumineux croissante, comme le montre la figure 2A. L'un d'onde devient apparente à ~ 0,4 log scot cd.sm -2 et l'amplitude des augmentations onde A jusqu'à saturation à 2,5 log scot cd.sm -2 (non représenté). Le paradigme flash double a été utilisé pour séparer signal mixte ERG en cône et tige isolat réponse, comme dans la figure 2B.

Cette technique d'enregistrement ERG peut être utilisé pour vérifier interventions neuroprotecteurs. Enregistrements de base terminé une semaine avant de légers dégâts sont vus à la figure 3A. Légers dégâts réduit à la fois une onde et des amplitudes b-ondes, démontré dans la figureure 3B. Préconditionnement ischémique à distance a permis de réduire la perte de l'ERG amplitude, comme on le voit dans la figure 3C. La technique de l'ischémie à distance dépend de l'application correcte de la garrot au-dessus du «genou». Mauvaise application de la garrot ne l'empêche pas de légers dommages à la rétine, comme on le voit dans la figure 3D.

Figure 1
Figure 1: Mesure de l'un d'onde et b-ondes à partir d'un adapté à l'obscurité ERG La trace représentée est enregistrée à partir de la cornée d'un œil adapté à l'obscurité à un flash lumineux de lumière donnée à l'heure indiquée t0.. L'amplitude de l'onde-est mesurée à partir de la ligne de base à la première auge (flèche rouge). L'amplitude de l'onde b est mesurée à partir du creux de la vague à un pic positif après (flèche bleue). Implicite en temps (temps de latence) est mesurée à partir de la relanceartefact (T0) au point d'intérêt sur ​​la trace, tels que le creux de la vague a-(entre crochets). S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2: le développement de l'ERG adaptés à l'obscurité avec l'augmentation de la force de flash et la séparation des réponses des bâtonnets et des cônes Les traces indiqués sont enregistrées à partir de la cornée d'un œil adapté à l'obscurité à l'augmentation des éclairs de lumière.. L'une vague apparaît à des intensités lumineuses. (A) Comparaison de 1,4 à 0,4 log scot cd.sm -2, le pic de l'onde b est saturé, mais l'un d'onde continue de croître. En (B), les bouffées de jumeaux sont superposées. Les deux 2.0 journal scot cd.sm -2 clignote sont séparés par un 500 msec ISI. Le premier flash génère un mixteréponse (noir), et le second flash génère une réponse de cône seule (ligne pointillée). Soustrayant la réponse des cônes donne la réponse de tige isolée (gris). S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3: L'ERG fournit une mesure de la fonction de la rétine formes d'onde représentatifs sont présentés ici pour (A) la rétine normale, (B) la rétine endommagée par la lumière, (C) rétine conditionné par RIP avant d'être exposé à la lumière dommageable, et. (D) rétine inefficace conditionnée par RIP, puis exposé à la lumière dommageable. La même énergie de flash a été utilisé pour chaque enregistrement (2,0 log cd.sm -2). Pour l'enregistrement dans D le brassard de pressionsur la patte arrière a été mal placé et l'ischémie n'a pas été établi. Dommages à la lumière diminue l'amplitude de l'ERG (B) et RIP atténue la réduction. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4:. Gros plan électrodes ERG Les électrodes à construire sont représentés, de gauche à droite; l'électrode positive pour contacter la cornée, l'électrode négative à être placé dans la bouche et l'électrode de référence qui est constitué d'une pince crocodile connecté à une aiguille qui est ensuite inséré dans la voie sous-cutanée croupe. S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Le flash méthode adaptée à l'obscurité ERG décrit ci-dessus est une méthode fiable pour évaluer la fonction rétinienne chez les rats. Tant l'un d'onde et b-ondes ont été réduites par des dommages de la lumière. Distance préconditionnement ischémique atténué réductions induit des dommages-légers dans le un-ondes et b-ondes. Cette préservation de la fonction rétinienne suggère que le préconditionnement ischémique à distance a induit la neuroprotection, ressemblant à d'autres formes de préconditionnement de protection tels que l'hypoxie, l'ischémie et de l'exercice 8-10. Le signal ERG enregistré est déterminée par trois ensembles de facteurs - la configuration d'enregistrement, les paramètres du stimulus lumineux, et l'état de l'animal.

Configuration de l'enregistrement

L'ERG est réduite en amplitude lorsque les électrodes sont mal placés ou la préparation est mise à la terre incomplète 11. Mise à terre correcte de l'équipement électrique à proximité est important, pour réduire le bruit dans l'enregistrement; si le bruit persiste significative faraday cage doit être utilisé. L'électrode positive doit être positionnée au centre de la cornée avec la confirmation de la position vérifié avant de commencer le protocole plein champ ERG et à l'achèvement. Il est important que cette électrode contacts seulement la cornée; contact avec les paupières ou même des moustaches peuvent réduire l'amplitude du signal. Un fil de coton lâche a été utilisé dans ce protocole visant à prévenir les paupières de toucher l'électrode positive. Certains chercheurs ont mis au point des lentilles de contact avec l'électrode positive intégré pour assurer un contact fiable et la prévention de la paupière touchante 12.

Le stimulus lumineux mis en place

Le stimulateur nous avons utilisé fournit une lumière blanche à large spectre, à partir de sources LED. Autres sources de lumière sont appropriés comme des stimuli lumineux tels que l'éclairage au xénon stroboscopique et un éclairage halogène, voir Weymouth et Vingrys pour les comparaisons entre les stimuli lumineux 11. L'avantage de la lumière LED, cependant, is que la durée de chaque flash et son énergie sont facilement programmable et remis rapidement sur une large gamme d'intensités lumineuses. Nous avons développé une série d'éclairs d'énergie graduée, qui dans la gamme adaptée à l'obscurité rongeur de seuil (produisant une réponse juste détectable) à saturer (produisant une réponse maximale).

Par essais et erreurs, nous avons établi interstimulus intervalles (ISIS) qui assurent que l'amplitude de la réponse à un flash est indépendant d'un flash précédent de la même intensité. Le plus brillant de l'éclair, plus l'ISI nécessaire pour cette indépendance.

Aussi par essais et erreurs, nous avons établi un nombre minimal de réponses nécessaires à chaque énergie pour fournir un signal propre. En moyenne plus de réponses seront toujours fournir un signal plus propre. Nous utilisons des minima de telle sorte que la série d'énergie peut être effectué rapidement (dans notre protocole 11 min); achèvement rapide réduit la variation due à des changements dans l'état d'anesthésie et allows temps pour les autres variables à étudier, si nécessaire.

Etat de l'animal

Plusieurs paramètres de la physiologie de l'animal sont importantes pour optimiser et de normaliser les enregistrements ERG obtenus.

Température

Le signal a-onde est généré à partir de l'activation induite par la lumière d'une protéine G couplée phototransduction cascade dans le segment extérieur; la dynamique de cette cascade sont, comme toutes les réactions enzymatiques, 13,14 dépendant de la température. Les rongeurs sont sujettes sous anesthésie à l'hypothermie et nécessitent un chauffage externe pour maintenir une température interne de 37,5 ° C tout au long de l'enregistrement. Si la température du corps chute de plus de 1-2 ° C, les amplitudes d'onde et un b-ondes diminuent et augmentent leurs latences 15.

Anesthésie

Enregistrements ERG stables exigent que l'animal soit immobile. Bloquants neuromusculaires et anaesthetic agents sont utilisés dans l'expérimentation ERG pour atteindre un état inconscient et immobile. Il n'y a eu que cinq rapports d'enregistrements ERG éveillé chez les rats 16-20. Dans ces études, les électrodes ont été implantés par voie chirurgicale préalable dans le crâne et deux de ces études ont testé l'effet de l'anesthésie sur l'ERG 17,20.

L'anesthésique le plus couramment utilisé pour les enregistrements ERG a été une combinaison de kétamine et de xylazine (dans nos expériences de 60 mg / kg de kétamine et de 5 mg / kg de xylazine est utilisé). Cela affecte l'ERG moins que l'anesthésie gazeux tels isoflurane et halothane, et a prouvé relativement non toxique, avec des taux de récupération élevés 17,21,22. Cette approche tient immobile animal pour ~ 40 min; une demi-dose peut être utilisé pour étendre les conditions d'enregistrement pour une période similaire. L'étude menée par Chang directement comparé l'ERG avec et sans anesthésie et a montré que la kétamine-xylazine ne perturbe de façon mesurable l'amplitude et la latence de A- et B-ondes 17. La plupart des chercheurs de normaliser les conditions d'anesthésie, puis tester les paramètres expérimentaux; un effet des anesthésiques ne peut être totalement écartée.

Environnement oculaire

La physiologie de l'œil nécessite un entretien, d'optimiser et de normaliser l'enregistrement ERG. Les élèves devraient être une taille standard; ceci est obtenu avec un mydriatique, appliqué sous la forme de gouttes oculaires, de réaliser la dilatation maximale. Chez les rongeurs, l'atropine ou la phényléphrine est utilisé 23. L'hydratation de la cornée est maintenue par l'application d'un polymère carbomère avant l'enregistrement; cette stabilise également la conductance électrique entre l'électrode positive et de la cornée. Si la cornée se déshydrate, les cicatrices et la formation de cataractes cornée peut se produire 24. la formation de la cataracte est plus fréquente chez la souris 25, et diverses méthodes de maintien de l'hydratation de la cornée ont été employées dans la souris enregistrements ERG, y compris un débit constant de liquide aqueux ouContact Style électrodes sur-mesure ce piège d'hydratation à la surface de la cornée 12.

Adaptive état de la rétine

Ceci est une variable importante. Le protocole indiqué ci-dessus est conçu pour faire en sorte que la rétine est adapté à l'obscurité, à son état le plus sensible. Idéalement, les rats pigmentés requis 3 h de logements sombre pour être totalement adaptée à l'obscurité tandis que les animaux non-pigmentées, comme les rats Sprague-Dawley, exigent un minimum de 5 h 26. Il est de pratique courante pour les enregistrements ERG scotopiques d'adapter les animaux la nuit pendant 12 heures. Adaptation partielle ou complète à la lumière peut être facilement et rapidement obtenu en tournant sur une intensité lumineuse de fond standard dans le stimulateur Ganzfeld. Après adaptation à la lumière, cependant, adaptation à l'obscurité complète prend des heures à réaliser; d'où la suggestion d'une extrême prudence pour veiller à ce que les yeux ne sont pas exposés accidentellement à la lumière avant l'enregistrement.

La technique d'enregistrement ERG est limitée par laci-dessus des facteurs déterminants (c.-à-ERG et relance set-up) et la compétence du chercheur au test GRE. Chercheurs inexpérimentés sont susceptibles d'avoir des enregistrements ERG variables. La variance peut être réduite par la création de grandes tailles d'échantillon suffisamment de comparer les résultats, tels que les réductions ou les gains dans la fonction visuelle. Alternativement, enregistrements ERG peuvent être normalisées entre les enregistrements de base et les enregistrements de post-traitement. Les données normalisées peuvent ensuite être regroupées et analysées. Lors de la présentation des données ERG, il est pratique courante pour afficher les données de groupe et représentatifs des formes d'onde.

Lorsque la totalité de ce qui précède sont soigneusement contrôlés, l'amplitude de l'ERG est une mesure de l'état fonctionnel de la rétine. L'ERG est systématiquement réduite en amplitude par l'appauvrissement de la couche des photorécepteurs causée par des dommages légers ou la dégénérescence génétiquement induite 27,28. A l'inverse, l'effet protecteur d'une intervention tels que RIP peut être détecté dans l'AMPLitude de l'ERG 29. L'ERG a également été utilisé pour démontrer les effets protecteurs de préconditionnement ischémique, préconditionnement hypoxique, l'exercice, et le safran alimentaire sur la rétine 8-10,30.

Une meilleure connaissance de la dynamique de la cascade de phototransduction de la rhodopsine, et des connexions synaptiques de la rétine, a encouragé le développement de modèles de génération ERG, et sophistiqué ERG analyse de forme d'onde est cependant possible modélisation cinétique basé sur des événements physiologiques connus de phototransduction dans photorécepteurs , et notre compréhension des circuits de la rétine interne 31. Par exemple, les a-onde modèles cinétiques sont basées sur les étapes biochimiques qui se produisent lors de phototransduction et l'ajustement du modèle permet de comparer des paramètres du modèle tels que les réponses de pointe, les retards de synchronisation et une sensibilité 14.

L'inconvénient de la modélisation est qu'elle repose sur des hypothèses concernant circuitr rétinienney, et ne peut être aussi informatif que les hypothèses permettent. À la lumière de cet inconvénient, le modèle cinétique d'une onde a été récemment critiqué pour simplifier à outrance une onde dynamique 32. Dans les études de la dégénérescence des photorécepteurs, ERG analyse de forme d'onde est généralement pas exécutée pour une raison différente. dégénérescence des photorécepteurs est souvent grave, entraînant des pertes dramatiques dans la fonction visuelle et, par conséquent, une analyse plus approfondie d'une onde et les paramètres b-ondes est pas justifiée 8,9,27,30. Peu importe, ERG modélisation de l'onde a et b-ondes a été adopté comme pratique courante dans de nombreuses études sur les rongeurs et des informations détaillées sur la modélisation ERG, pour une onde, b-ondes et les PO peuvent être trouvés dans les études par Hood, et l'examen articles de Weymouth et Vingrys, Frishman et Wachtmeister 11,32-34.

En résumé, la méthode ERG adaptés à l'obscurité présenté peut enregistrer des différences mesurables entre la dégénérescence rétinienne avec et sans interventions neuroprotecteurs sette comme préconditionnement ischémique distance. Les éléments essentiels à enregistrements ERG fiables ont été décrits. Les mesures ERG de photorécepteur et la fonction de la rétine intérieure sont utiles pour les chercheurs qui étudient les dégénérescences de la rétine, et les effets de diverses interventions génétiques, biopharmaceutiques et pharmacologiques sur la fonction visuelle.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Jonathan Stone est le directeur du CSCM Pty Ltd

Acknowledgements

Les auteurs sont reconnaissants de l'aide de Mme Sharon Spana dans la surveillance des rongeurs, la manipulation et l'expérimentation. soutien financier de doctorat a été fournie par l'Université de Sydney et du Centre australien de recherche pour l'excellence dans la Vision.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PC computer
Powerlab, 4 channel acquistion hardware AD Instruments PL 35044 Acquistion of ERG
Animal Bio Amp AD Instruments FE 136 Amplifier for ERG
Lab chart AD Instruments Signal collection software
Ganzfield Photometric solutions FS-250A Light stimulus
Ganzfield operating system Photometric solutions
Research Radiometer International light technologies ILT-1700 calibrate light series
Lux meter LX-1010B check red light illumanation
Excel Microsoft
Lead wires AD Instruments Connect postive, negative ground electrodes to amplifier
Lead wires - alligator AD Instruments ground ganzfield and acquistion hardware to computer
Platinum wire 95% A&E metals postive electrode
Mouth electrode Ag/AgCl Pellet SDR E205 negative electode
26 G needle BD ground electode
Water pump
Water bath
Tubing
Homeothermic blanket system with flexible probe Harvard Appartus 507222F
Atropine 1% w/v Bausch & Lomb topical mydriasis
Proxmethycaine 0.5% w/v Bausch & Lomb topical anaesthetic
Visco tears eye drops Novartis carbomer polymer
Thread retract eye lid
Tweezers
Reusable adhesive Blu tac Dim red headlamp. Affix electrodes
Absorbent bedding
Ketamil - ketamine 100 mg/ml - 50 ml Troy Laboratories Pty Ltd dissociative
Xylium - Xylazine 100 mg/ml - 50 ml Troy Laboratories Pty Ltd muscle relaxant
Scale

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Arden, G. B., Heckenlively, J. Principles and practice of clinical electrophysiology of vision. MIT Press. 139-183 (2006).
  2. Bui, B. V., Fortune, B. Ganglion cell contributions to the rat full-field electroretinogram. Journal of Physiology-London. 555, (1), 153-173 (2004).
  3. Fortune, B., et al. Selective ganglion cell functional loss in rats with experimental glaucoma. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45, (6), 1854-1862 (2004).
  4. Alarcon-Martinez, L., et al. Short and long term axotomy-induced ERG changes in albino and pigmented rats. Molecular Vision. 15, (254-255), 2373-2383 (2009).
  5. Lyubarsky, A. L., et al. Functionally rodless mice: transgenic models for the investigation of cone function in retinal disease and therapy. Vision Research. 42, (4), 401-415 (2002).
  6. Bush, R. A., Sieving, P. A. A PROXIMAL RETINAL COMPONENT IN THE PRIMATE PHOTOPIC ERG A-WAVE. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 35, (2), 635-645 (1994).
  7. Liu, K., et al. Development of the electroretinographic oscillatory potentials in normal and ROP rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47, (12), 5447-5452 (2006).
  8. Casson, R. J., Wood, J. P. M., Melena, J., Chidlow, G., Osborne, N. N. The effect of ischemic preconditioning on light-induced photoreceptor injury. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44, (3), 1348-1354 (2003).
  9. Lawson, E. C., et al. Aerobic Exercise Protects Retinal Function and Structure from Light-Induced Retinal Degeneration. Journal of Neuroscience. 34, (7), 2406-2412 (2014).
  10. Grimm, C., et al. HIF-1-induced erythropoietin in the hypoxic retina protects against light-induced retinal degeneration. Nature Medicine. 8, (7), 718-724 (2002).
  11. Weymouth, A. E., Vingrys, A. J. Rodent electroretinography: Methods for extraction and interpretation of rod and cone responses. Progress in Retinal and Eye Research. 27, (1), 1-44 (2008).
  12. Bayer, A. U., Cook, P., Brodie, S. E., Maag, K. P., Mittag, T. Evaluation of different recording parameters to establish a standard for flash electroretinography in rodents. Vision Research. 41, (17), 2173-2185 (2001).
  13. Pugh, E. N., Lamb, T. D. AMPLIFICATION AND KINETICS OF THE ACTIVATION STEPS IN PHOTOTRANSDUCTION. Biochimica Et Biophysica Acta. 1141, (2-3), 111-149 (1993).
  14. Breton, M. E., Schueller, A. W., Lamb, T. D., Pugh, E. N. ANALYSIS OF ERG A-WAVE AMPLIFICATION AND KINETICS IN TERMS OF THE G-PROTEIN CASCADE OF PHOTOTRANSDUCTION. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 35, (1), 295-309 (1994).
  15. Mizota, A., Adachi-Usami, E. Effect of body temperature on electroretinogram of mice. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 43, (12), 3754-3757 (2002).
  16. Szabo-Salfay, O., et al. The electroretinogram and visual evoked potential of freely moving rats. Brain Research Bulletin. 56, (1), 7-14 (2001).
  17. Charng, J., et al. Conscious Wireless Electroretinogram and Visual Evoked Potentials in Rats. Plos One. 8, (9), (2013).
  18. Galambos, R., Juhasz, G., Kekesi, A. K., Nyitrai, G., Szilagyi, N. NATURAL SLEEP MODIFIES THE RAT ELECTRORETINOGRAM. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, (11), 5153-5157 (1994).
  19. Galambos, R., Szabo-Salfay, O., Szatmar, E., Szilagyi, N., Juhasz, G. Sleep modifies retinal ganglion cell responses in the normal rat. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, (4), 2083-2088 (2001).
  20. Guarino, I., Loizzo, S., Lopez, L., Fadda, A., Loizzo, A. A chronic implant to record electroretinogram, visual evoked potentials and oscillatory potentials in awake, freely moving rats for pharmacological studies. Neural Plasticity. 11, (3-4), 241-250 (2004).
  21. Huang, J. C., Salt, T. E., Voaden, M. J., Marshall, J. NON-COMPETITIVE NMDA-RECEPTOR ANTAGONISTS AND ANOXIC DEGENERATION OF THE ERG B-WAVE IN-VITRO. Eye (London). 5, (4), 476-480 (1991).
  22. Sasovetz, D. KETAMINE HYDROCHLORIDE - EFFECTIVE GENERAL ANESTHETIC FOR USE IN ELECTRORETINOGRAPHY. Annals of Ophthalmology. 10, (11), 1510-1514 (1978).
  23. Mojumder, D. K., Wensel, T. G. Topical Mydriatics Affect Light-Evoked Retinal Responses in Anesthetized Mice). Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51, (1), 567-576 (2010).
  24. Fraunfel, F. t, Burns, R. P. ACUTE REVERSIBLE LENS OPACITY - CAUSED BY DRUGS, COLD, ANOXIA, ASPHYXIA, STRESS, DEATH AND DEHYDRATION. Experimental Eye Research. 10, (1), 19 (1970).
  25. Calderone, L., Grimes, P., Shalev, M. ACUTE REVERSIBLE CATARACT INDUCED BY XYLAZINE AND BY KETAMINE-XYLAZINE ANESTHESIA IN RATS AND MICE. Experimental Eye Research. 42, (4), 331-337 (1986).
  26. Behn, D., et al. Dark adaptation is faster in pigmented than albino rats. Documenta Ophthalmologica. 106, (2), 153-159 (2003).
  27. Sugawara, T., Sieving, P. A., Bush, R. A. Quantitative relationship of the scotopic and photopic ERG to photoreceptor cell loss in light damaged rats. Experimental Eye Research. 70, (5), 693-705 (2000).
  28. Machida, S., et al. P23H rhodopsin transgenic rat: Correlation of retinal function with histopathology. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41, (10), 3200-3209 (2000).
  29. Brandli, A., Stone, J. Remote Ischemia Influences the Responsiveness of the Retina. Observations in the Rat. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55, (4), 2088-2096 (2014).
  30. Maccarone, R., Di Marco, S., Bisti, S. Saffron supplement maintains morphology and function after exposure to damaging light in mammalian retina. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49, (3), 1254-1261 (2008).
  31. Hood, D. C., Birch, D. G. Assessing abnormal rod photoreceptor activity with the a-wave of the electroretinogram: Applications and methods. Documenta Ophthalmologica. 92, (4), 253-267 (1996).
  32. Robson, J. G., Frishman, L. J. The rod-driven a-wave of the dark-adapted mammalian electroretinogram. Progress in Retinal and Eye Research. 39, 1-22 (2014).
  33. Hood, D. C., Birch, D. G. A COMPUTATIONAL MODEL OF THE AMPLITUDE AND IMPLICIT TIME OF THE B-WAVE OF THE HUMAN ERG. Visual Neuroscience. 8, (2), 107-126 (1992).
  34. Wachtmeister, L. Oscillatory potentials in the retina: what do they reveal. Progress in Retinal and Eye Research. 17, (4), 485-521 (1998).

Comments

3 Comments

  1. The article is very helpful to setup ERG to discriminate cone and rod electrical contributions. Could you please, let me know how can I access TABLE1 that it is mentioned in the article.

    Reply
    Posted by: Marcelo N.
    April 14, 2016 - 2:00 PM
  2. Hi Marcelo,

    Below is a link to table 1 as a pdf file. Not the voltages used were based on our calibration, and you may need to adjust your voltage settings to reach equivalent light intensities.
    http://tiny.cc/he5vay

    Reply
    Posted by: Alice B.
    April 17, 2016 - 10:18 PM
  3. Thank you very much.

    Reply
    Posted by: Marcelo N.
    April 18, 2016 - 10:19 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics