Ganze Glaskörper Dissection für Vitreodynamic Analysis

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Murali, K., Kashani, A. H., Humayun, M. S. Whole Vitreous Humor Dissection for Vitreodynamic Analysis. J. Vis. Exp. (99), e52759, doi:10.3791/52759 (2015).

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Abstract

Introduction

Das Ziel dieser Methode ist es, detaillierter eine Technik, um eine ganze, intakte Glaskörper zu isolieren, mit dem glasartigen Kern und Cortex intakt von einem kadaver Auges, für die Zwecke der vitreodynamic Analyse. Da der Bereich der Glaskörper Physiologie hat, multidisziplinären Forscher, wie der Strömungsmechanik Forscher geworden, untersuchen die physikalischen und biomechanischen Eigenschaften des Glaskörpers 1. Zu diesem Zweck ist es wesentlich, detailliert eine Technik, die ganze, intakte Glaskörper zu isolieren, um multidisziplinäre Forscher unterstützen.

Sebag et al. 2 und 3 durchgeführt, andere elegant ganze Glaskörper Dissektionen auf menschliche kadaver Augen und zeigte Darstellungen der Ergebnisse. Jedoch wurde die Technik verwendet, nicht im Detail, und Nicht-Experten beschrieben nicht in der Lage ist, das Verfahren unabhängig replizieren. Andere Studien haben Glaskörper aus kadaver Augen mit einfacheren Methoden wie Aspiration oder Teilzerlegung geerntet,von denen beide nicht in eine ganze, intakte Glaskörper führen. Gisladottis et al. 4 und Xu et al. 5 zu untersuchen Lässigkeit in Glaskörper aus kadaver Augen geerntet. Da jedoch kein Verfahren aus glasartigem Extraktion wurde beschrieben, wurde angenommen, daß sie die Glaskörperflüssigkeit mit einer Spritze abgesaugt. Watts et al. 6 ging noch einen Schritt weiter, indem ein Verfahren zur Isolierung Kaninchen Glaskörper mit einem Operationstechnik beschreibt. Führt dieses Verfahren jedoch in einer Isolation von nur dem Glaskern und dem Glaskörper nicht. Skeie et al. 7 später organisierte den Glaskörper in 4 einzigartigen Regionen und ein Verfahren beschrieben, um jeden Teil zur Analyse sezieren elegant. Diese Technik jedoch nicht in einer intakten Glaskörper als Ganzes führen.

Die aktuelle Technik wurde entwickelt, um die biophysikalischen Experimenten, die derzeit nur in kadaver Augen durchgeführt werden, zu erleichtern. Früheren Verfahren, beschrieben alsBove, sind begrenzt, da 1) keine die gesamte Glaskörper vollständig zu isolieren, 2) geerntet glasigen Kern und Cortex homogenisiert, 3) glasartigen anatomischen Struktur nicht beibehalten wird, oder 4) Dissektion Techniken sind nicht ausreichend für die Replikation von Forschern in anderen Bereichen detailliert . Darüber hinaus aufgrund der Opazität des Sklera und Aderhaut, die Visualisierung des Glaskörpers in der intakten Augapfels beschränkt. Dies begrenzt die Genauigkeit und Realisierbarkeit von Messungen, die innerhalb des ganzen Auges gemacht werden können. Zusätzlich können die anatomischen Strukturen umgebenden Glaskörper das Studium der biochemischen und physikalischen Eigenschaften der glasartigen verwechseln.

In den letzten Jahren hat der Körper aus glasartigem Wissenschaft enorm gewachsen und es gibt Grund zu glauben, dass die gesamte Glaskörper hat andere Eigenschaften als ihre Einzelteile. Es gibt ein wachsendes Interesse bei der Untersuchung der physikalischen, biomechanische und chemischen Eigenschaften des Glaskörpers für vitreodynamics research, die Anwendungen in der klinischen Medizin, wie Arzneimittelabgabe, intravitreale Sauerstoffversorgung 8 und Vitrektomie hat. Pharmakologische vitreodynamics, das pharmakologische Mittel verwendet, um den Glaskörper zu manipulieren, können zur Vitrektomie Ergebnisse 9 zu verbessern. Biomechanischen Eigenschaften verwendet werden, um glasartige Fluidströmung, die verwendet werden können zur Verbesserung der intravitrealen Darreichungsformen 10-12 modellieren. Die physikalischen Eigenschaften der verschiedenen Segmente des Glaskörpers sind entscheidend für das Verständnis vitreoretinalen Sauerstofftransport 13. Die vorgeschlagene glasigen Dissektionstechnik verwendet, um verschiedene Eigenschaften des intakten Glaskörper zu untersuchen. Es ermöglicht Tischexperimente auf ganze, intakte Glaskörper mit besseren Visualisierung erfolgen.

Zusammenfassend aktuellen Methoden zur Untersuchung des Glaskörpers sind entweder nicht hinreichend beschrieben, oder führen zu einer unvollständigen Trennung der Glaskern und Kortex. Daher besteht ein Bedarf, e auszuführenXperiments in einem transparenten Augenmodell unter Beibehaltung der Anatomie des Glaskörpers, die im kadaver Auge vorliegt.

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Protocol

Alle Augen enukleiert wurden von einem Schlachthaus erhalten, und alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit institutionellen Biosicherheit Gesetze durchgeführt.

  1. Sichere entkernte Auge nach unten auf eine Oberfläche. Tun Sie dies, indem Gewebestifte durch das überschüssige Gewebe um das Auge herum und befestigen Sie sie nach unten in eine Styroporplatte.
  2. Sezieren und nehmen perilimbal Bindehaut aus dem Auge.
    1. Verwenden feinen Pinzette (0.3 Pinzette) und Mikroschere (Westcott Schere), die Bindehaut am Limbus einzuschneiden und stumpf sezieren von der Lederhaut. Schneiden Sie die Bindehaut entlang des Limbus, wie der stumpfe Präparation schreitet weiter Dissektion ermöglichen.
    2. Entfernen Binde ganzen Weg rund um das Auge (360 Grad), um so viel wie möglich Sklera freizulegen.
      HINWEIS: Es ist hilfreich, eine kleine Menge von Bindehaut zu verlassen, um zu erleichtern Fixierung des Auges mit den chirurgischen Stiften oder einer Pinzette während der Rest des Verfahrens.
  3. Erstellen Sie eine volle Dicke Skleralappen entlang einerSeite des Auges (Skalpellklinge 69).
    1. Einen ~ 5 mm Skleraeinschnitt parallel zum Limbus und 3 mm hinter dem Limbus durch leichtes Einschneiden der Sklera mit dem Skalpell (Skalpell 11) bis dunkel pigmentierten Chorioidea sichtbar. Achten Sie darauf, die Aderhaut selbst einzuschneiden.
    2. Sorgfältig seziert entlang der Ebene zwischen der Sklera und der Choroidea, entweder mit einer Schere (unter Verwendung stumpf) oder mit dem Skalpell, bis es möglich ist, das Potential Raum zwischen diesen Geweben zu vergrößern, indem der Choroidea sanft nach innen.
    3. Eine weitere Skleraeinschnitt senkrecht zur ersten Skleraeinschnitt mit scharfen Mikroscheren, wodurch eine T-förmige Einschnitt.
    4. Dann weiterhin unverblümt sezieren in Umfangs Mode, um die Skleragewebe von der darunter liegenden Aderhaut zu entfernen, und schieben Sie die Aderhaut weg von der Lederhaut, wie oben erwähnt.
    5. Vergrößern Sie die Lederhautlappen nach Bedarf.
      1. Sanft leckersten Blunt der Aderhaut weg von der Lederhaut zu sezierenwährend des gesamten Prozesses.
      2. Vergrößern der Klappe bis der Schnitt senkrecht zu dem Limbus vorgenommen erreicht den Sehnerv und der Einschnitt parallel zum Limbus ist zumindest ein Drittel des Auges Umfangs (45 °).
      3. Verwenden Sie die Lederhautlappen als Quelle der Hebelwirkung für die Manipulation des Auges während stumpf. Die Gegen Traktion auf der Klappe erleichtert es stumpf.
    6. Wiederholen Sie diesen Schritt auf der anderen Lederhautlappens.
  4. Schneiden Sie die Lederhautlappen um einen großen Bereich der Aderhaut freizulegen.
  5. Weiterhin den Einschnitt in Schritt 3, die um das Auge des Umfangs (360 Grad) aus.
  6. Entfernen Sie die verbleibenden Aderhaut-Retina-Gewebe.
    1. Innerhalb der freigelegten Bereich, mit einem Watte-Spitze vorsichtig abbürsten die verbleibende Aderhaut-Retina-Gewebe. Alternativ sanft greifen das Gewebe mit einer Pinzette und abziehen der darunter liegenden Glaskörper.
    2. Falls erforderlich einen Einschnitt in die Aderhaut starting vom Sehnerven. Dann abziehen der Aderhaut sanft, um die Netzhaut und Glaskörper freizulegen.
  7. Weiter stumpfes Sezieren der Aderhaut weg von der Lederhaut und dann abziehen der Aderhaut, die ganze, intakte Glaskörper zu erhalten.
  8. Verwenden Sie die Sklerarand an der Hornhaut angebracht, um die gesamte Glaskörper in gewünschten Stelle zu positionieren. An diesem Punkt wird der Glaskörper an der vorderen Sklera und Objektiv.
  9. Blunt den Glaskörper von der Innenseite der Sklera zu zergliedern, um die Linse, Entfernen aller Sklera.
  10. Verwenden Sie ein stumpfes Werkzeug, um die Linse von der Glaskörper schöpfen, wenn es sein muss. Verwenden Sie die Probe für verschiedene vitreodynamic Experimente.
    1. Man gibt die Probe in einem Becherglas mit bekannter Oberfläche der Luft ausgesetzt. Platzieren Sauerstoff empfindliche Sonde an der Kante der Probe. Verwenden Sie einen Mikromanipulator, um die Sonde zu einem bekannten Abstand (r) in die Probe zu bewegen.
    2. Verwenden Fickschen Gesetzen der Diffusion, die theoretische Diffusionsgleichung erhalten. Mit dem data in Schritt 10.1 gesammelt, erhalten den experimentellen Diffusionskoeffizient / Reaktionszeit usw.

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Representative Results

Anlehnung an das Protokoll zu einem erfolgreichen glasigen Dissektion mit dem Kern und Cortex (Abbildung 3) intakt zu führen. Dies ergibt sich aus den Reststücken Retina in den Glas cortex haftet. Intakte ganze Glaskörper kann auf verschiedene Weise für spezifische vitreodynamic Experimente eingesetzt werden. In unserem Fall ist die Diffusionsgeschwindigkeit von Sauerstoff in intakten Glaskörper und entsprechende Zeitkonstante wurde (Figur 2) untersucht. Glaskörper, die präpariert wurde (Kern und Kortex) in unserem Experiment wurde in einem Becherglas mit einem bekannten exponierten Oberfläche platziert. Dies war im Vergleich zu Glaskörper, die mit einem zuvor veröffentlichten Methode, die nur vereinzelt Glaskörperkern 6 geerntet. Alle anderen Faktoren waren konsistent über den Versuchs- und Kontrollgruppen gehalten. Der Glasoberfläche wurde mit Luft, die eine bekannte Sauerstoffspannung (~ 160 mm Hg) ausgesetzt. Die Sauerstoffspannung in der Glaskörper war niedrig (<10 mmHg). Basierend auf der Rate der vitreous Sauerstoffverbrauch durch Shui et al. 14 für Glaskörper im Gelzustand bestimmt, können wir die Gleichung für 1 dimensionale Sauerstofftransport (im stationären oder instationären Formen) zu verwenden. Durch die Messung der Sauerstoffspannung eine bekannte Strecke in der Glaskörperoberfläche, können wir experimentell zu validieren den Diffusionskoeffizienten. Der Sauerstoffdruck wurde mit einer Sauerstoffsonde wie Oxford aufgezeichnet, und die Fehlerrate war ± 10%. Eine Probe wurde alle 30 Sekunden gesammelt. Das Vorhandensein von Glaskörper beeinflußt die Diffusionsgeschwindigkeit von Sauerstoff in die Mitte des Glaskörpers. In Gegenwart von Glaskörper, die Diffusion von Sauerstoff tritt über einen längeren Zeitraum.

Die physikalischen Eigenschaften des Glaskern und Rinde haben Auswirkungen in Gesundheit und Krankheit. Zum Beispiel lokalisiert ergänzenden Intraokularlinse Oxygenierung wurde zur Behandlung von retinaler Ischämie 8 vorgeschlagen. Das Verständnis der verschiedenen Diffusionskoeffizienten für Sauerstoff durch GlaskörperKern ermöglichen es den Forschern, die tatsächliche Rate der Sauerstoffversorgung der Netzhaut vorherzusagen.

Abbildung 1
Abb. 1: Querschnitt durch das Auge die Anzeige relevanten anatomischen Strukturen (vom National Eye Institute, National Institutes of Health modifiziert) Die Hornhaut ist das transparente Gewebe, das die vordere meisten Augenabschnitt bildet und stellt einen wesentlichen Teil des Auges Licht Macht. Der Limbus ist der Knotenpunkt der Hornhaut, Bindehaut und Lederhaut. Die Sklera verläuft vom Limbus zum posterioren Aspekt des Auges, wo er den Sehnerv erfüllt. Die Bindehaut ist eine dünne Epithel, die Linien der sehr außerhalb des Auges und die Grenze zwischen der äußeren Umgebung und der Lederhaut bildet. Die internen Komponenten des Auges aus der Vorderkammer, Linse, Iris, Ziliarkörper, Hinterkammer, hinteren Hohlraum, Netz- und Aderhaut. Die vitreous Kern den zentralen Bereich des Glaskörpers, innerhalb der hinteren Hohlraum des Auges. Der Glaskörper ist um den Glaskörper angeordnet und mit der Netzhaut an mehreren Stellen einschließlich der Pars plana, Netzhautgefäße, Papille und Macula befestigt. Der Glaskörper ist eine dreidimensionale Zone, die sich von ~ 2 mm vor der Ora serrata bis 3 mm hinter der Ora serrata erstreckt. Die Aderhaut ist eine Gefäßgewebe-Schicht, die zwischen der Lederhaut und der Netzhaut befindet, und stellt die Blutversorgung der äußeren Netzhaut. Die Netzhaut ist der neurosensorischen Schicht des Auges, die das Licht sendet Kapazität des Auges ist dienlich. Die Lederhaut ist die weiße Deckschicht, die Masse der strukturelle Unterstützung für das Auge Wand bietet.

Figur 2
Abb. 2: Plot der Sauerstoffspannung der Glaskörper gegen die Zeit Plot der Sauerstoffspannung in glasartigen Kern (grüne Linie) im Vergleich zu intakten ganzen vitreous (blaue Linie). Eine Sauerstoffmesssonde wurde in die Mitte der Probe gelegt und die Probe wurde an der Luft, die einen Sauerstoffdruck von 160 mmHg ausgesetzt.

Figur 3
Abbildung 3: Beispiele für isolierte gesamte Glaskörper. Oberen Bild ist ein Beispiel für die gesamte intakte Glaskörper noch an der skleralen Randes befestigt. Mittelbild ist ein Beispiel für die ganze intakte Glaskörper ohne Lederhaut, aber mit einigen verbleibenden Netzhautgewebe. Unten ist ein Beispiel für ganze, intakte Glaskörper.

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Discussion

Es gibt zwei wichtige Schritte, die sorgfältig im Glaskörper Dissektion durchgeführt werden müssen. Schritt 3, der eine gesamte Dicke Lederhautlappen, ist von entscheidender Bedeutung für die gesamte Sektion. Achten Sie darauf, nicht in die Aderhaut schneiden bei der Erstellung der gesamten Dicke Lederhautlappen werden. Die andere wichtige Schritt ist Sezieren entfernt die Lederhaut von der Aderhaut. Dieser Schritt muss sorgfältig durchgeführt werden Erstellen mehrerer Löcher in der Aderhaut, aus der die Glaskörper kann austreten, um zu verhindern. Es gibt einen Weg, um das Protokoll zu ändern und noch sezieren intakte ganze Glaskörper. Schritt 6 kann verzögert werden, bis Schritt 8 Die Aderhaut am Ende entfernt werden, nachdem der Glasgewebes an der gewünschten Stelle positioniert ist.

Der Nachteil dieser Verfahren ist, dass bei der Präparation, gibt es nur visuelle Hinweise, um den Erfolg und die Genauigkeit des intakten glasigen Präparation vor. Da der glasartigen Kern und Kortex ebenso transparent ununterscheidbar mit dem bloßen Auge, diesekann eine Herausforderung sein. Dass man auf die Haftung der Netzhaut auf dem Glaskörper ist es möglich, festzustellen, wenn erfolgreiche Präparation der Glaskörper eingetreten ist. Andernfalls pharmakologischen Substanzen wie Kenalog kann verwendet werden, um die Visualisierung 15 des Glaskörpers zu verbessern, kann aber nicht ohne weiteres erlauben es, zwischen Glaskörper und Glaskern unterscheiden. Eine weitere Einschränkung dieses Verfahrens ist, dass es am effektivsten für die Zerlegung des Gels Glaskörper ist. Menschen glasigen Gel ist ein nicht-regenerative Gewebe, das mit dem Alter Verflüssigung unterzogen. Diese Verflüssigung verhindert, dass wir komplett zerlegt das ganze, intakte Glaskörper aus dem Auge. Somit erstreckt sich unsere Technik nur auf Glaskörper von Tieren, wie Kühen, Schweinen oder Kaninchen, oder in die Augen von jungen Menschen, die keine signifikanten Mengen an Verflüssigung. Der Glaskörper in diesen Tieren neigt, vollständig in einen Gel-Zustand ist.

Doch derzeit gibt es keine etablierte Methode, die schon desc hatribed im Detail, zum Präparieren ganze intakte Glaskörper aus kadaver Augen. Derzeit sind die einzigen glasigen Dissektion Techniken, die gut aufgeführten Maßnahmen umfassen die Präparation des einzigartig, aber voneinander getrennte Bereiche des Glaskörpers 7 bzw. mit der Dissektion der nur den Glaskern 6.

Die Anwendungen seziert intakte Glaskörper sind unter geschätzt und ausreichend genutzt. Chirurgische Erfahrung mit dem glasartigen sowie klinische, histologische und biochemische Untersuchungen darauf hin, dass die chemischen und strukturellen Eigenschaften des Glas signifikant 16,17 variieren. Daher ist es notwendig, die Struktur des gesamten Glaskörper zu erhalten, um die Funktion des Glaskörpers in der Augenphysiologie und Anatomie zu studieren. Intact Glaskörper können zu einer transparenten Kugel zur besseren Visualisierung während der Experimente explantiert werden. Sie können dann für eine Vielzahl von mechanischen / chemischen Tests verwendet werden, um die Messungen der physikalischen / biomechanische prop verbessernschaften des Glaskörpers. So schlagen wir vor, die seziert ganze intakte Glaskörper kann anstelle von Kochsalzlösung, viskose Ersatzstoffe oder glasartigen Kern in den genannten Rheologie Experimente 6,18 verwendet werden.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.3 forceps Storz Opthalmics E1793
Westcott Tenotomy Scissors Curved Right Storz Opthalmics E3320 R
Scalpel Handle No. 3 VWR 25607-947
Scalpel Blade, #11, for #3 Handle VWR 470174-844

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References

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