Whole Vitré Dissection d'analyse Vitreodynamic

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Murali, K., Kashani, A. H., Humayun, M. S. Whole Vitreous Humor Dissection for Vitreodynamic Analysis. J. Vis. Exp. (99), e52759, doi:10.3791/52759 (2015).

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Abstract

Introduction

Le but de cette méthode est de définir une technique pour isoler un ensemble de corps vitré, intact, avec le noyau et le cortex intact vitreux, à partir d'un œil de cadavre, aux fins de l'analyse vitreodynamic. Comme le domaine de la physiologie vitreux a augmenté, de chercheurs multidisciplinaires, telles que la mécanique des fluides chercheurs, enquêtent sur ​​les propriétés physiques et biomécaniques du corps vitré 1. À cette fin, il est essentiel de détail une technique pour isoler l'ensemble, corps vitré intacte pour aider les chercheurs multidisciplinaires.

Sebag et al. 2 et 3 autres dissections réalisées élégantes vitreux entiers sur des yeux de cadavres humains et ont montré des illustrations des résultats. Cependant, la technique utilisée n'a pas été décrite en détail et non-experts ne serait pas capable de se répliquer indépendamment de la méthode. D'autres études ont récolté vitré de yeux de cadavres à l'aide de méthodes plus simples telles que l'aspiration ou la dissection partielle,deux qui ne donnent pas, en tout un corps vitreux, intacte. Gisladottis et al. 4 et Xu et al. 5 enquêter perméabilité dans l'humeur vitrée récoltées à partir de cadavres yeux. Cependant, étant donné qu'aucune méthode d'extraction vitreux a été décrit, on a supposé qu'ils le corps vitré aspiré avec une seringue. Watts et al. 6 est allé plus loin en décrivant un procédé d'isolement de lapin humeur vitrée avec une technique chirurgicale. Cependant, cette méthode conduit à un isolement de seulement le noyau vitreux et non le cortex vitréen. Skeie et al. 7 organisé plus tard le corps vitré en 4 régions uniques et élégamment décrit une méthode pour disséquer chaque partie pour analyse. Cette technique toutefois, ne donne pas lieu à un vitreux intact dans son ensemble.

La technique actuelle a été développé pour faciliter les expériences biophysiques qui ne sont actuellement effectuées dans les yeux de cadavres. Les méthodes antérieures, comme décrit uneBove, sont limitées parce que 1) aucune isoler complètement l'ensemble du corps vitré, noyau vitreux 2) récoltés et le cortex sont homogénéisés, 3) structure anatomique vitré est pas maintenue, ou 4) techniques de dissection ne sont pas suffisamment détaillées pour la réplication par les chercheurs dans d'autres domaines . En outre, en raison de l'opacité de la sclérotique et la choroïde, la visualisation du corps vitré est limitée dans le globe oculaire intact. Ceci limite la précision et la faisabilité de mesures qui peuvent être faites à l'intérieur de l'œil entier. En outre, les structures anatomiques environnantes du vitré peuvent confondre l'étude des propriétés physiques et biochimiques du corps vitré.

Au cours des dernières années, le corps de la science vitreux a considérablement augmenté et il ya des raisons de croire que l'ensemble du corps vitré a des propriétés différentes de celles de ses parties individuelles. Il ya un intérêt croissant dans les enquêtes sur les propriétés physiques, biomécaniques et chimiques du corps vitré pour vitreodynamics research, ce qui a des applications en médecine clinique, tels que l'administration de médicaments, oxygénation intravitréenne 8 et vitrectomie. Vitreodynamics pharmacologiques, qui utilise des agents pharmacologiques pour manipuler le corps vitré, peuvent être utilisés pour améliorer les résultats de vitrectomie 9. Propriétés biomécaniques sont utilisés pour modéliser l'écoulement de fluide vitré, qui peut être utilisé pour améliorer les technologies d'administration de médicaments par voie intravitréenne 10-12. Les propriétés physiques des différents segments du corps vitré sont cruciales pour comprendre vitréo-rétinienne transport de l'oxygène 13. La technique proposée de dissection vitreux peut être utilisée pour étudier les différentes propriétés de l'humeur vitrée intacte. Il permet de paillasse expériences à faire sur les corps vitreux, entières intactes avec une meilleure visualisation.

En résumé, les méthodes actuelles pour l'étude du corps vitré soit ne sont pas décrits de manière adéquate, ou aboutissent à un isolement incomplète du noyau vitreux et le cortex. Par conséquent, il est nécessaire d'effectuer eXperiments dans un modèle oculaire transparent tout en conservant l'anatomie du corps vitré qui existe dans l'œil de cadavre.

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Protocol

Tous les yeux énucléés ont été obtenus à partir d'un abattoir et toutes les expériences ont été réalisées en conformité avec les lois institutionnelles en matière de biosécurité.

  1. Fixez œil énucléé sur une surface. Pour ce faire, en plaçant les repères de tissus à travers le tissu en excès autour de l'œil et la sécurisation vers le bas dans un conseil de styromousse.
  2. Disséquer et détachez la conjonctive de l'œil périlimbique.
    1. Utilisez une pince fine (0,3 forceps) et microciseaux (ciseaux Westcott) à inciser la conjonctive au limbe et carrément disséquer au large de la sclérotique. Couper la conjonctive long du limbe que la dissection procède à la poursuite de la dissection.
    2. Retirer conjonctive tout autour de l'oeil (360 degrés) afin d'exposer autant que possible sclérotique.
      NOTE: Il est utile de laisser une petite quantité de la conjonctive de faciliter l'œil fixateur avec les broches chirurgicales ou une pince pendant le reste de la procédure.
  3. Créez un volet scléral pleine épaisseur le long d'uncôté de l'oeil (lame de scalpel 69).
    1. Faire un ~ 5 mm incision scléral parallèlement au limbe et 3 mm derrière le limbe en coupant doucement dans la sclérotique avec un scalpel (lame de scalpel 11) jusqu'à ce que la choroïde pigmentation foncée est visible. Veillez à ne pas inciser la choroïde lui-même.
    2. Disséquer soigneusement le long du plan entre la sclérotique et la choroïde, soit avec l'aide de ciseaux (dissection) ou avec le scalpel, jusqu'à ce qu'il soit possible d'agrandir l'espace potentiel entre ces tissus en poussant doucement vers l'intérieur de la choroïde.
    3. Faire une autre incision sclérale perpendiculaire à la première incision sclérale avec microciseaux pointus, ce qui crée une incision en forme de T.
    4. Ensuite, continuer à disséquer sans ménagement dans un mode périphérique pour enlever le tissu scléral de la choroïde sous-jacente et pousser doucement la choroïde loin de la sclérotique, comme mentionné ci-dessus.
    5. Agrandir le volet scléral au besoin.
      1. Doucement Blunt disséquer la choroïde loin de la sclérotiquetout au long du processus.
      2. Agrandir le rabat jusqu'à ce que l'incision pratiquée perpendiculairement au limbe atteint le nerf optique et l'incision faite parallèle au limbe est au moins un tiers de la circonférence de l'oeil (45 °).
      3. Utiliser le volet scléral en tant que source d'effet de levier pour manipuler l'oeil lors de la dissection émoussé. Le contre-traction sur le rabat rend plus facile pour dissection.
    6. Répétez l'étape précédente de l'autre volet scléral.
  4. Coupez les volets scléral pour exposer une grande surface de la choroïde.
  5. Continuer l'incision pratiquée dans l'étape 3 autour de la circonférence de l'oeil (360 degrés).
  6. Retirer le tissu choroïde-rétine restant.
    1. Dans la région exposée, utilisez un coton-tige pour brosser délicatement le tissu choroïde-rétine restant. Sinon, prenez doucement le tissu avec une pince et le retirer le corps vitré sous-jacent.
    2. Si nécessaire faire une incision dans la choroïde stArting du nerf optique. Puis décoller délicatement la choroïde pour exposer la rétine et le cortex vitré.
  7. Continuer émoussée disséquer la choroïde loin de la sclérotique, puis décoller la choroïde d'obtenir l'ensemble, vitreux intacte.
  8. Utilisez le rebord scléral attaché à la cornée afin de positionner l'ensemble vitré à l'endroit désiré. À ce stade, le corps vitré est fixée à la sclérotique antérieure et le cristallin.
  9. Blunt disséquer le corps vitré de l'intérieur de la sclère, autour de la lentille, en supprimant tous sclérotique.
  10. Utilisez un outil contondant pour ramasser la lentille loin de le vitré si besoin est. Utilisez l'échantillon pour diverses expériences vitreodynamic.
    1. Placer l'échantillon dans un récipient en verre avec une surface connue exposée à l'air. Placez l'oxygène sonde sensible au bord de l'échantillon. Utilisation d'un micro-manipulateur pour déplacer la sonde à une distance connue (r) dans l'échantillon.
    2. Utiliser les lois de diffusion de Fick pour obtenir l'équation de diffusion théorique. Avec le data recueilli à l'étape 10.1, obtenir le terme coefficient de diffusion expérimentale / réaction, etc.

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Representative Results

En suivant le protocole conduira à une dissection vitreux réussie avec le noyau et le cortex (Figure 3) intact. Ceci est évident à partir des morceaux résiduels de rétine adhéré au cortex vitréen. Vitré toute Intact peut être utilisé de plusieurs façons pour les expériences vitreodynamic spécifiques. Dans notre cas, le taux de diffusion de l'oxygène dans le corps vitré intacte et il est la constante de temps correspondant a été étudiée (Figure 2). Vitreux qui a été disséqué (noyau et le cortex) en utilisant notre méthode a été placé dans un bêcher en verre avec une surface exposée connu. Ce fut par rapport à vitreux qui a été récoltée en utilisant une méthode publiée précédemment qui isole uniquement noyau vitreux 6. Tous les autres facteurs ont été maintenus cohérente entre les groupes expérimentaux et de contrôle. La surface vitrée a été exposé à l'air, qui a une tension d'oxygène connue (~ 160 mmHg). La tension d'oxygène à l'intérieur du corps vitré était faible (<10 mm Hg). Basé sur le taux de vitrla consommation d'oxygène UVE déterminé par Shui et al. 14 pour vitreux à l'état de gel, nous pouvons utiliser l'équation pour 1 dimensions transport de l'oxygène (en formes étatiques stables ou instables). En mesurant la pression d'oxygène à une distance connue à l'intérieur de la surface vitrée, on peut valider expérimentalement le coefficient de diffusion. La tension d'oxygène a été enregistré avec une sonde à oxygène comme Oxford, et le taux d'erreur est de ± 10%. Un échantillon a été prélevé toutes les 30 secondes. La présence de cortex vitréen affecte le taux de diffusion de l'oxygène dans le corps vitré milieu. En présence du cortex vitréen, la diffusion de l'oxygène se produit pendant un intervalle de temps plus long.

Les propriétés physiques du noyau vitreux et le cortex ont un impact sur la santé et la maladie. Par exemple, localisé, oxygénation intraoculaire d'appoint a été proposé comme traitement pour l'ischémie rétinienne 8. Comprendre les différents coefficients de diffusion pour l'oxygène à travers cortex vitréenbase permettra aux chercheurs de prédire le taux réel de l'apport d'oxygène à la rétine.

Figure 1
Figure 1:. Vue en coupe transversale de l'œil afficher structures anatomiques pertinentes (modifié à partir du National Eye Institute, National Institutes of Health) La cornée est le tissu transparent qui forme la partie antérieure plus partie de l'oeil et fournit une part importante de l'œil de optique pouvoir. Le limbe est la jonction de la cornée, de la conjonctive et de la sclérotique. La sclérotique étend à partir du limbe à l'aspect le plus postérieur de l'oeil où elle rencontre le nerf optique. La conjonctive est une mince épithélium qui tapisse la très à l'extérieur de l'oeil et forme la limite entre le milieu extérieur et la sclérotique. Les composants internes de l'œil sont composés de la chambre antérieure, cristallin, l'iris, le corps ciliaire, la chambre postérieure, la cavité postérieure, de la rétine et de la choroïde. Le vitreous noyau comprend la région centrale du corps vitré, à l'intérieur de la cavité postérieure de l'oeil. Le cortex vitréen se trouve autour du corps vitreux et est attachée à la rétine en plusieurs points, y compris la pars plana, les vaisseaux de la rétine, le disque optique et la macula. La base du vitré est une zone tridimensionnelle qui se prolonge à partir de ~ 2 mm en avant de l'ora serrata à 3 mm en arrière de l'ora serrata. La choroïde est une couche de tissu vasculaire qui est située entre la rétine et la sclérotique et fournit l'alimentation en sang de la rétine externe. La rétine est la couche neurosensorielle de l'œil qui subserves la capacité de l'œil à la lumière d'envoi. La sclérotique est la couche opaque blanc qui fournit la plus grande partie de support structurel à la paroi oculaire.

Figure 2
Figure 2:. Parcelle de tension en oxygène du corps vitré contre le temps Parcelle de tension d'oxygène dans le noyau vitreux (ligne verte) par rapport à l'ensemble intacte vitreous (ligne bleue). Une sonde de détection de l'oxygène a été placée au milieu de l'échantillon et l'échantillon a été exposé à l'air qui a une pression d'oxygène de 160 mmHg.

Figure 3
Figure 3: Exemples de corps vitré ensemble isolé. Haut image est un exemple de l'ensemble du corps vitré intact encore attaché à la jante sclérale. Moyen image est un exemple de l'ensemble du corps vitré intact sans sclère mais avec une certaine tissu rétinien restant. Bottom est un exemple d'ensemble du corps vitré, intact.

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Discussion

Il ya deux étapes essentielles qui doivent être soigneusement exécutées lors de la dissection vitreux. Étape 3, la création d'un volet scléral pleine épaisseur, est cruciale pour l'ensemble de la dissection. Il faut prendre soin de ne pas couper dans la choroïde lors de la création de la pleine épaisseur volet scléral. L'autre étape essentielle est loin disséquait la sclérotique de la choroïde. Cette étape doit être effectuée avec soin pour éviter de créer de multiples trous dans la choroïde à partir de laquelle le corps vitré peut déborder. Il ya une façon de modifier le protocole et encore disséquer humeur vitrée toute intact. Étape 6 peut être retardée jusqu'à ce que l'étape 8. La choroïde peut être retiré à la fin après que le tissu vitré est positionné à l'endroit désiré.

La limitation de cette procédure est que lors de la dissection, il n'y a que des repères visuels pour suggérer la réussite et la précision de la dissection vitreux intacte. Étant donné que le noyau et le cortex vitreux sont à la fois transparente et indiscernables à l'oeil nu, cepeut être difficile. En remarquant l'adhérence de la rétine sur le corps vitré, il est possible de déterminer si dissection réussie du cortex vitréen est produite. Dans le cas contraire, les substances pharmacologiques, comme Kenalog, peuvent être utilisés pour améliorer la visualisation de 15 l'humeur vitrée, mais ne peuvent aisément permettre de distinguer entre cortex vitréen et noyau vitreux. Une autre limite de cette technique est qu'elle est le plus efficace pour la dissection de gel vitreux. Gel vitréen humain est un tissu non régénératif qui subit la liquéfaction avec l'âge. Cette liquéfaction nous empêche de disséquer complètement l'ensemble, vitré de l'oeil intact. Ainsi, notre technique ne porte que sur des animaux vitreux, tels que des vaches, des porcs ou des lapins, ou des yeux de l'homme de jeunes qui ne disposent pas des quantités significatives de liquéfaction. Le corps vitré de ces animaux a tendance à être complètement dans un état de gel.

Cependant, actuellement, il n'y a pas de méthode établie, qui a été described en détail, pour disséquer toute vitreux intacte aux yeux des cadavres. Actuellement, les seules techniques de dissection vitreuses qui ont été bien détaillés impliquent la dissection des régions uniques, mais séparés de corps vitré 7 ou la dissection de tout le noyau vitreux 6.

Les applications de l'humeur vitrée intacte disséqué sont sous-estimés et sous-utilisées. Expérience chirurgicale avec le corps vitré ainsi que des études cliniques, histopathologiques et biochimiques suggèrent que les propriétés chimiques et structurelles de la vitré peuvent varier considérablement 16,17. Par conséquent, il est nécessaire de préserver la structure de tout le corps vitré pour étudier la fonction du corps vitré dans la physiologie et l'anatomie oculaire. Vitreux Intact peut être explantées à un globe transparent pour une meilleure visualisation lors des expériences. Ils peuvent alors être utilisés pour une variété de tests / mécaniques chimiques pour améliorer les mesures de prop physique / biomécaniqueproprié- de l'humeur vitrée. Par exemple, nous suggérons que l'ensemble vitré intacte disséqué peut être utilisé en lieu et place d'une solution saline, des substituts visqueux, ou noyau vitreux dans les expériences de rhéologie cités 6,18.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.3 forceps Storz Opthalmics E1793
Westcott Tenotomy Scissors Curved Right Storz Opthalmics E3320 R
Scalpel Handle No. 3 VWR 25607-947
Scalpel Blade, #11, for #3 Handle VWR 470174-844

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References

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