파지 Phenomics : 생리 학적 접근 방법은 소설 바이러스 성 단백질의 특성을

Immunology and Infection
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Sanchez, S. E., Cuevas, D. A., Rostron, J. E., Liang, T. Y., Pivaroff, C. G., Haynes, M. R., Nulton, J., Felts, B., Bailey, B. A., Salamon, P., Edwards, R. A., Burgin, A. B., Segall, A. M., Rohwer, F. Phage Phenomics: Physiological Approaches to Characterize Novel Viral Proteins. J. Vis. Exp. (100), e52854, doi:10.3791/52854 (2015).

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Abstract

파지 - 호스트 상호 작용에 현재 조사 (메타) 게놈에서 지식을 외삽에 따라 달라집니다. 흥미롭게도, 60 - 모든 파지 시퀀스의 95 %는 현재 주석 단백질에는 동성을 공유하지 않습니다. 결과적으로, 파아지 유전자의 많은 부분은 가정으로 주석된다. 이 현실은 크게 두 구조 및 보조 대사 유전자의 주석에 영향을 미친다. 여기에서 우리는 이러한 알 수없는 파지 유전자 중 하나의 표현 동안 선택된 호스트의 생리적 반응 (들)을 캡처하도록 설계 노믹 방법을 제시한다. 대사 체학은 대사 풍부한 다양성을 모니터링함으로써 양방향 생성물 분석을 제공하면서 멀티 표현형 분석 플레이트 (맵), 숙주 기질 활용 및 후속 매스 형성의 다양성을 모니터링하는 데 사용된다. 두 도구 단일 파아지 추정되는 오픈 리딩 프레임 (ORF)의 발현과 연관된 표현형 프로파일을 제공하기 위해 동시에 사용된다. 두 가지 방법에 대한 대표적인 결과는 highl 비교추정 구조 또는 대사 파아지 유전자를 운반하는 호스트의 표현형 프로파일 차이 ighting입니다. 또한, 실험 분석을 용이하게 시각화 기술과 높은 처리량 계산 파이프 라인이되게됩니다.

Introduction

(박테리오파지 또는 파지 일명) 박테리아를 감염시키는 바이러스는 환경 1,2 세계적 입자와 같은 10 개 이상의 31 바이러스 (VLP를)에 존재하는 다른 모든 생물을 능가 할 것으로 추정된다. 해양 환경과 관련된 바이러스 성 지역 사회를 조사하는 첫 번째 metagenomic 연구는 바이러스 성 분수 3에서 볼 수있는 다양성을 정량화에 초점을 맞추었다. 또한, Breitbart 연구진은 바이러스 성 사회 서열의 65 % 이상이 공공 데이터베이스에서 사용할 수있는 시퀀스에 더 동성을 공유 없다는 것을 발견했다. 이후 metagenomic 연구는 유사한 증거를 발견 : 샌디에고 해양 퇴적물에서 metagenomes, 캘리포니아 75 % 알 수없는 바이러스 성 시퀀스 (4)를 포함; Salton의 바다의 hypersaline 호수에서 metagenomes 98 % 알 수없는 바이러스 성 시퀀스 (5)를 포함; 98 % 알 수없는 바이러스 성 시퀀스 6 - 산호 관련 metagenomes 95이 포함되어 있습니다. 주석이 달려 있지 않은 정보의이 축적 가져왔다7 "생물학적 우주의 암흑 물질"인 파지의 유전 물질.

파지의 게놈 특성은 기존의 핵산 및 단백질 데이터베이스에 대해 비교를 통해 서열의 유사성을 식별에 의존하고있다. 파지 인코딩 된 유전 정보는 주로 알 수 없기 때문에, 상 동성 기반의 방법은 효과가 있습니다. 전사 및 복제 유전자, 대사 유전자 및 구조 유전자 그들의 게놈 내에서, 일반적으로는 파지를 세 가지 종류의 유전자를 인코딩한다. 전사 및 복제 유전자 (클래스 I / II 유전자 8) 중합 효소, primases, 엔도 / 엑소 뉴 클레아 제, 및 키나아제를 포함한다. 이 유전자는 매우 전사와 파지의 유전 물질을 복제, 파지 감염의 중요성으로 인해 보존된다. 파아지 중합 효소 용이 인해 전역 보존 9에 서열 상 동성 전통적인 방법을 이용하여 식별되고 효과적인 계통 마커 (10)를 제공하는 것으로 나타났다.반면, 파지 대사 및 구조 유전자 (클래스 II / III 유전자를 8) 점점 발산 종종 가상의 유전자로 주석이 있습니다.

파지 대사 유전자는 숙주의 대사 능력에 영향을 미칠 필요는 바이러스 복제를 위해 요구되지 않는다. 종종 보조 대사 유전자 11 (AMGs) 함이 유전자는, 호스트 신진 대사를 조절하고 감염과 비리 성숙의 성공의 최적의 진행을 할 수 있도록 나타납니다. AMGs은 제한 영양소 나 에너지 생산 경로의 활용 및 흡수와 관련이있다. 몇 가지 예는 광계의 다양한 cyanophage 12-16의 게놈에있는 유전자, 유전자에 연결 인산 대사 17, 18, ​​및 파지의 dNTP 생합성 (18, 19)에 대한 탄당 인산 경로의 활용에 의해 규제를 포함한다. 비교, 구조 유전자는 감염 동안 생산 늦게 유전자 중반 사이에있는 다른 파지 호에 걸쳐 다양세인트 시스템. 구조 단백질의 생산은 전사, 번역, 조립 8 바이러스의 dNTP의 가용성 및 에너지 저장고에 의존한다. 캡시드 테일 섬유 구조 단백질은 모든 바이러스 성 단백질을 코딩하는 유전자의 대부분의 발산으로 간주되며 성공적인 비리 온 생산을 위해 필요하다. 이들의 차이는 일반적으로 그들은 바이러스 호스트 공진화 (20)을 형성에서 재생 적극적인 역할에 기인한다. 전통적인 상동 서열 정렬 기술을 이용하여 단백질을 발산 할 때, 상관없이 유전자 클래스의 용이 간과된다. 엄격한 서열 비교하여 볼 한계를 보정하기위한 노력은 인공 신경망 (21) 등의 관계를 결정하기 위해 시퀀스의 특성을 이용할 수있는 바이오 인포 매틱스 도구를 가져왔다. 인공 신경망 (앤스) 구조적 및 대사 유전자의 예측이 가능하지만, 직접 특성화 하류 실험 검증을 필요유전자 기능.

이 원고의 목적은 신규 한 파아지 유전자의 발현시에 숙주 세균의 양 이화 및 동화 대사를 모니터링 할 노믹 프로토콜을 제공하는 기능적 앤스 통해 예측. phenomics의 필드, 세포 표현형과 관련된 생물학은 잘 알 수 없거나다면 발현 성 기능을 가진 단백질의 조사에 도움을 시스템 생물학에 설립된다. 노믹 도구는 유전자형 정보 표현형 정보를 연결하는 데 사용됩니다. 우리는 자신의 기능 (들)가 파아지 유전자 발현시 관찰 호스트 생리적 효과를 통해 결정될 수있다 추정 파아지 유전자 가설. 이 가설을 조사하기 위해, 두 정량적 방법이 선택되었다. 대사 체학은 특정 싸다 성장하는 동안 호스트 대사 산물의 다양성과 상대적 풍요를 측정하는 동안 멀티 표현형 분석 플레이트 (지도) 호스트 기판 활용 및 후속 바이오 매스 형성을 모니터링하는 데 사용되었다정신 상태. 추정 구조 및 신진 대사에 영향을 미치는 단백질을 대장균에서 과발현 된 두 실험에서 대표적인 결과를 비교. 수많은 영상 기술과 높은 처리량 처리 파이프 라인은 실험 복제를 용이하게하기 위해 제공됩니다. 마지막으로, 제시된 방법의 재현성 및 정확성 주석 캡시드 단백질 및 파지 단백질 대사, 티 오레 독신, 플러스 두 추정 AMGs 예상 생리 효과의 맥락에서 논의되었다.

Protocol

멀티 표현형 분석 플레이트 1. 준비 (MAP) 기판, 기저 미디어, 사전 성장 미디어 및 버퍼

  1. 1.25 % 기판 주식 - 1.0의 50 mL로.
    1. 멸균 고체 기판 (/ V W) (열 필요한 경우) 1.25 % - 1.0을 녹인다. RT에서 0.22 μm의 필터 장치 및 저장 축적량 용액을 멸균 필터. 이 실험에서 사용되는 기판의 예는 표 2에 제공된다.
  2. 모든 기판 클래스 (탄소, 질소, 황, 인)에 대해 3 배 기저 미디어의 250 mL로한다. (40 밀리미터 MOPS + 된 10 mM 트리 신), 0.4 % 글리세롤 *, 9.5 mM의 NH 4 CL * 0.25 mM의 NaSO4로 4 * 1.0 1X MOPS : MOPS (3- 모르 폴리 노 프로판 -1- 술폰산) 기반의 기저 미디어 (22)는 다음을 포함 * mM의 황산, 1.32 mM의 K 2 HPO 4 *, 10 mM의 KCl을 0.5 μM CaCl2를, 5 mM의 염화나트륨, 6 μM FeCl3를, 0.1 % (w / v)의 L-아라비 ** (표 1 및 2) .
    참고 : *이 화합물은 기저 매체에 따라 포함되어 있지 않습니다. 예를 들어, 0.4 % 글리세롤은 탄소 기저 매체 및 기저 미디어 1.0 mM의 MgSO4로 1.0 mM의의 MgCl 2로 치환 황에서 사용되지 않는다. ** 아라비 노스 L은 아라로 변환 된 pBAD 프로모터 벡터, pEMB11의 유도를위한 특정 - E. 대장균 K-12 균주 (BW 27784) 23.
    1. 멸균 플라스크에 기초 미디어의 각 구성 요소를 추가하고 볼륨에 솔루션을 가지고. 잘 섞는다. 0.22 μm의 필터 유닛이, 필터 멸균 병에 각각 기초 미디어 살균.
  3. MOPS 사전 성장 배지 500 mL로한다. MOPS 따라 미리 성장 배지 (22)는 다음이 포함 1X MOPS를 (40 밀리미터 MOPS + 된 10 mM 트리 신)을, 0.4 % 글리세롤, 9.5 mM의 NH 4 CL, 0.25 mM의 NaSO4로 (4), 1.0 mM의 MgSO4로, 1.32 mM의 K 2 HPO 4 된 10 mM의 KCl, 0.5 μM CaCl2를, 5 mM의 염화나트륨, 및 6 μM의 FeCl3.
    1. 각 추가무균 플라스크에 미리 성장 배지의 성분 및 양을 가져온다. 필터는 100 μg의 / ㎖의 최종 농도 암피실린을 추가, 0.22 μm의 필터 유닛으로 살균. 4 ℃에서 보관 솔루션입니다.
  4. 0.5 배 루리아 - 베르 타니 (LB) 한천 플레이트 500 mL로한다. 멸균 플라스크에 0.5 배 농도 (1.25 g의 효모 추출물, 2.5 g의 NaCl, 2.5 g의 트립 톤, 7.5 g의 한천)을 만들기 위해 LB 구성 요소를 추가 할 수 있습니다. 잘 혼합 및 살균 오토 클레이브.
    1. 쿨 한천 후 혼합으로 항생제 암피실린 100 ㎍ / ㎖의를 추가합니다. 필요할 때까지 4 ° C에서, 배양 접시에 한천 ~ 25 ㎖를 붓고 설정할 수 및 저장.
  5. 10 mM 트리스 (PH 7.4) 플러스 10 mM의 황산 완충 용액 250 mL로한다. RT에서 0.22 μm의 필터 유닛, 및 저장 용액으로 살균 필터를 포함한다.

박테리아 세포 현탁액의 2. 준비

  1. 신선한 식민지를 준비합니다. 12.5 % 글리세롤 냉동 재고, 신선한 E. 플레이트 대장균 클론100 ㎍ / ml 암피실린 0.5X LB 한천 상 ES. 24 시간 동안 37 ° C에서 품어.
  2. 액체 문화를 준비합니다
    1. 피펫 배양 튜브에 100 μg의 / ml의 암피실린을 함유하는 프리 성장 배지 3 ㎖. 각 클론의 경우, 생물학적 삼중를 사용합니다.
    2. 준비 문화 튜브에 2.1 독립 식민지를 접종한다. 22 시간 동안 진탕 37 ° C에서 품어.
  3. 펠렛 및 박테리아 세포를 씻어 :
    1. 전송 O / 1.7 mL의 미세 원심 분리 튜브에 N 개의 문화. 마이크로 원심에서 2 분 동안 최대 속도 (16,900 XG)에서 원심 분리를 통해 펠렛 세포. 뜨는을 가만히 따르다 10 mM 트리스 / 10 mM의 황산 버퍼 500 μL에 다시 현탁 세포를 씻으십시오. 반복합니다.
    2. 다시 펠렛 세포 상등액 캔트 10 mM 트리스 / 10 mM의 황산 완충액 1 ml의 세포를 다시 일시.
  4. 세포 밀도를 측정 (필요한 경우) 세포를 농축 :
    1. 섹션 2.3.3에서 세포 희석에 10 배10 mM 트리스는 / 10 mM의 4 버퍼를 황산과 큐벳에이 희석을 전송합니다. 광학 밀도이 희석 및 기록 (OD 600 nm의)를 측정한다.
    2. 맵에서 0.07 (OD 600 ㎚)의 최종 농도를 (그들이 MAP에 추가 될 때 세포 따라서 셀 OD 600 nm 인 = 1.05의 초기 농도로 할 필요가 15 배 희석한다) 달성하는 세포를 농축시켰다. 저수지에 집중 세포 현탁액을 전송,지도의 준비 단계 3.5까지 (실온에서) 저장합니다.

멀티 표현형 분석 플레이트 3. 준비 (MAP에)

  1. MAP에 레이블. E. 레이블 멸균 96 웰 마이크로 타이 터 플레이트 대장균 클론 식별 번호 및 개략적 인 유형을 매핑.
  2. MAP에로 나누어지는 멸균. 액체 용기에 무균 전송 멸균. 피펫 멀티 채널 피펫을 사용하여 마이크로 타이 터 플레이트의 각 웰에 60 μL.
  3. 나누어지는 기저 미디어 INTO 매핑합니다. 액체 저장소에 기초 미디어 배 무균 전송. 피펫 멀티 채널 피펫을 사용하여 마이크로 타이 터 플레이트의 각 웰에 50 μL. 반복지도 회로도에 사용 된 각 기초 미디어 3.2과 3.3 단계를 반복합니다.
  4. MAP에로 나누어지는 기판. 맵의 적절한 우물에 각 기판의 30 μl를 전송합니다.
  5. MAP에에 세균 현탁액을 추가합니다. 전송 멀티 채널 피펫을 이용하여 MAP의 각 웰에 2.4.2 절에서 균체 10 μL. 다시 문화 재고로 재 도입하기 전에 피펫 팁을 변경합니다.
  6. 접착 필름과 커버에 매핑합니다. 하나의 접착 판 필름과 각 플레이트를 커버. 단단히 더 꽉 도장을 만들기 위해 판 우물 꼭대기와 가장자리를 따라 필름을 누릅니다. 멸균 면도날과 마이크로 타이 터 플레이트의 가장자리에서 초과 필름을 제거합니다.
  7. MAP에의 광학 밀도를 측정한다 :
    1. 멀티 플레이트 분광의 "입력"소매 준비 MAP에 배치광도계 플레이트 리더. 열기 플레이트 리더 소프트웨어 및 읽기 사이에 떨고의 60 초와 32 시간의 총 흡광도 (OD 600 nm의) 매 30 분, 측정 프로토콜을 만듭니다.
    2. 37 ° C의 장치에서 설정 온도. 지도 온도를 설정할 수 평형 일단 프로토콜을 시작합니다.
    3. 32 시간 후, 플레이트 리더의 "출력"소매에서지도를 제거합니다. 포함 할 각 데이터 텍스트 파일 레이블 : E.을 콜라이 클론 식별 번호, MAP 도망 날짜 및 MAP 개략적 형.

4. 멀티 표현형 분석 플레이트 (MAP에) 처리 및 매개 변수화

  1. 자동화 QA 프로세스, 예를 들어, 24을 사용 PMAnalyzer 성장 곡선을 평가.
    1. 있는지 확인 성장 곡선은 OD 600 nm의 <최초의 2 시간에서 0.20 있습니다. 때문에 일반적으로 해결 응축의 유물로 필터의 초기 시점 (T 0)에서의 흡광도를 사용하지 마십시오T 1 (30 분).
    2. 품질 보증 필터를 위반 성장 곡선을 제거합니다. 곡선 정보를 저장 (샘플 이름을 잘 수, OD 600 nm의 값) 나중에 참조 할 수 있도록 별도의 출력 파일. 성장 곡선은 품질 보증 필터를 통과하면 분석을 계속합니다.
  2. 평균 성장 곡선을 계산합니다. 웰 당, 데이터를 복제하여, 각각의 시점에서 평균 광학 밀도 (OD 600 ㎚)의 값을 취함으로써 중앙값 성장 곡선을 계산한다. 향후 사용을 위해 별도의 출력 파일의 평균 성장 곡선을 결과 기록.
  3. Zwietering (25)에 의해 제안 된 방정식의 적응을 사용하여 각 성장 곡선위한 최적 물류 모델을 계산한다. 지연 시간, λ (HR), 성장의 최대 속도, μ 최대 (OD 600 nm의 100 -1), 최종 바이오 매스 수율, α (OD 600 nm의) : 물류 방정식은 세균의 성장을 설명하는 세 개의 매개 변수를 포함합니다. 같은 시간 = 30 분 (Y 1)의 데이터를 사용하여 때문에 응축의 유물에 초기 값.
    식 (1) [1]
    1. 직접 검색을 사용하여 최대 성장 속도를 계산한다. 데이터 내에서 90 분 간격에 변화의 최대 속도를 기록한다.
      식 (2) [2]
    2. 90 분 창을 통해 최대의 이동 평균의 상단 점근 값을 검색하여 최종 바이오 매스 생산량을 추정하고있다. 구체적으로는, 성장 곡선의 점근선과 같이 정의한다.
      식 (3) [3]
    3. μ 최대 및 4.3.1과 4.3.2에서 값을 사용하면, 모든 값 λ를 시도하여 λ 값을 찾을 수 있습니다 :
      식 (4) [4]
      1. 제곱 오차 (SSE)의 합을 계산하도록 각각의 λ 값을 사용한다. 가장 낮은 SSE는 SSE (λS)이다 사용
        /files/ftp_upload/52854/52854eq5.jpg "/> [5]

MAP에 5. 표현형 분석

  1. 기판 당 클론 당 전체의 성장을 평가하기 위해 각 성장 곡선의 성장 레벨 (GL)을 계산합니다. 이동 물류-장착 값의 조화 평균으로 GL을 정의
    식 (6) [6]
  2. GL 값에 기초하여 각각의 성장 곡선에 표현형을 할당한다. 여기에 사용 된 네 개의 표현형은 다음과 같습니다 예상 성장, 더 성장, 기능의 이득 및 기능의 손실.
    1. 거리 평균으로부터 표준 편차의 관점에서 특정 기판상의 모든 클론 걸쳐 성장 표현형을 비교하여 결정한다. 성장 곡선 (그림 1A, B). 그림 1C는 표현형 할당의 예를 제공 제시 표현형을 지정하기 위해이 통계 및 최소 성장 임계 값을 사용합니다.
    2. GL ≥ 0.4 (Figur로 성장을 정의전자 1A, B). GL을 갖는 것으로 함수의 게인 (녹색도 1C를) 정의> 평균 및 평균> 성장 임계치 이상의 두 표준 편차. 함수 (적색도 1C)의 손실 GL <개의 표준 편차와 평균 이하 평균> 성장 임계 값을 갖는 것으로 정의된다.
  3. 표현형과 성장 곡선에 기초하여 데이터 세트의 시각적 인 표현을 생성.
    1. 컬러로 OD 600 nm의 값을 묘사보기 성장 역학 빠르게 여러 클론 (그림 2) 사이의 성장 곡선을 비교.
    2. 성장 조건 (그림 3)을 기반으로하는 모든 클론 중 표현형 분포를 볼 수 있습니다.

6. 연속 배양 장치 구축

  1. 원자로 포트 건설 (그림 4A, B). 세 1/4. 구멍을 드릴에 3/4 간격. 떨어져, 연속 배양 반응기의 모자.
    1. FOR 포트 (α)는 : 여성 루어 스레드 스타일 패널에 1/16에 장착 나사 미늘을 미늘 캡에서 최대 가리키는 캡의 바닥에서.. 1/4 인치 패널로 고정 미늘 잠금 너트를 탑재합니다.
    2. 포트 β의 경우 : 여성 루어 스레드 스타일 패널에 1/16에 장착 나사 미늘을 미늘 캡에서 최대 가리키는.. 1/4 인치 패널로 고정 미늘 잠금 너트를 탑재합니다.
    3. 포트 γ를 들면 다음과 같습니다. 미늘 캡에서, 가리키는되도록 여성 루어 스레드 스타일 패널은 캡의 바닥에서 미늘의 1/16에 장착 나사. 안전 미늘의 1/4. 패널 잠금 너트를 탑재합니다. 1/8에 필수적인 잠금 링 남성 루어 나사. 넓은 구멍 호스를 캡의 안쪽에 피팅 바브에.
    4. 유출 포트 :에 5/16을 드릴 연속 배양 반응기의 75 ml의 시점에서 구멍을.. 3/4을 잘라.의 1/4의 너트 끝을 끕니다. 가시 벌크 헤드 피팅. 1/4의 스크류. 철 격벽 피팅 (개스킷 병의 외측에 있으며 너트 내부 F에igure 4B).
  2. 젖병 포트 건설 (그림 4C). 드릴에 두 개의 1/4. 구멍 1 간격. 떨어져 먹이 병의 모자.
    1. 포트 δ의 경우 : 여성 루어 스레드 스타일 패널의 1/8에 장착 나사 미늘을 미늘 캡에서 최대 가리키는.. 1/4 인치 패널로 고정 미늘 잠금 너트를 탑재합니다.
    2. 포트 ε의 경우 : 여성 루어 스레드 스타일 패널에 1/16에 장착 나사 미늘을 미늘 캡에서 최대 가리키는.. 1/4 인치 패널로 고정 미늘 잠금 너트를 탑재합니다.
      1. 1/8에 필수적인 잠금 링 남성 루어 나사. 넓은 구멍 호스를 바브 피팅에, 캡의 안쪽에.
  3. 튜브와 튜브 확장을 먹이 :
    1. 튜브의 두 1인치 조각 잘라 (1/8. 외경 (OD)의 1/16을 X. 내경 (ID)를). 포트에 맞게 조각 α와 연속 배양 반응기의 γ는 5.2 절에했다.
    2. 단일 한 컷. T의 조각을(에 1/4.. 자료 (외경) x 1/8) ubing. 연속 배양 반응기의 포트 Β에 맞게 조각.
    3. 인치 튜브의 조각 단일 3.5 잘라 내기 (1/8.에 (외경) x 1/16. ID)를. 1/8에 필수적인 잠금 링 남성 루어에, 포트 γ의 내부에이 부분을 맞 춥니 다. 넓은 구멍 호스. 포트 γ는 연속 배양 반응기의 샘플링 포트이다.
    4. 인치 튜브의 조각 (1/4입니다.에 (외경) x 1/8. ID)를 하나의 1을 잘라. 젖병의 δ 포트에이 조각을 맞 춥니 다.
    5. (1/16.의 (외경) x 1/8. ID)를 인치 튜브의 조각 하나 (11)을 잘라. 1/8에 필수적인 잠금 링 남성 루어에 공급 병의 포트 ε의 내부에이 부분을 맞 춥니 다. 넓은 구멍 호스.
    6. (1/8.에 (외경) x 1/16. ID)를 튜브의 두 18인치 조각을 잘라. 젖병의 ε 포트에 하나의 조각을 맞 춥니 다. 제 7의 다른 부분을 저장합니다.

7. 대사 체학에 대한 지속적인 문화 실행

  1. 자료를 소독 :
    1. Autocla30 분 동안 건조 물질을했습니다. 알루미늄 호일의 섹션 5에서 만든 젖병의 뚜껑을 포장해야합니다. 부착 된 튜브를 똑바로 유지합니다.
      1. 알루미늄 호일의 섹션 5에서 만든 연속 배양 반응기의 캡을, 랩. 부착 된 튜브를 똑바로 유지합니다. 18 랩. 섹션 6.3.5에서 튜브 절단 및 알루미늄 호일에서 가장 작은 연동 펌프 호스 어댑터를. 튜브를 똑바로 유지합니다. 30 분 동안 오토 클레이브.
    2. 0.5 배의 LB 배지의 2 패를 확인합니다. 젖병에서 0.5 배의 LB 국물을 만든다. 호일로 병을 먹이 커버. 1 시간 동안 오토 클레이브.
    3. 0.5 배의 LB 배지 70 mL로한다. 연속 배양 반응기에 국물을 붓고. 연속 배양 반응기에서 교반 막대를 놓습니다. 30 분 동안 박 및 오토 클레이브와 원자로를 커버.
  2. 연속 문화는 설정 :
    1. 박테리아 세포 현탁액.
      1. 12.5 % 글리세롤 냉동 재고, 신선한 E. 플레이트 100 ㎍ / ml 암피실린 0.5X LB 한천 상 대장균 클론. 품다24 시간 동안 37 ° C에서.
      2. 100 ㎍ / ml 암피실린 0.5X LB 액체 배지 3 ㎖에 단일 콜로니를 접종한다. 각 클론은 생물학적 삼중를 사용합니다. 22 시간 동안 진탕 37 ° C에서 품어.
    2. 함께 부품을 연결합니다.
      1. 생물 안전 캐비닛에 모든 멸균 재료를 놓고 미디어가 냉각 상태에 자외선을 켭니다. 미디어가 냉각되면, 모든 0.5 배 LB 배지에 0.1 % L - 아라비 노스 및 100 μg의 / ㎖ 암피실린을 추가합니다.
      2. 연속 배양 반응기 캡 포장을 푸는 반응기에 나사. 샘플링 튜브를 만지지 마십시오. 공급 병 뚜껑 포장을 푸는 및 공급 병에 나사. 샘플링 튜브를 만지지 마십시오.
      3. 에 (18)를 유지합니다. 포트 ε 멸균에 연결된 튜브를. 18인치 튜브와 연동 펌프 튜브 어댑터의 선택을 취소 포장.
      4. 의 18의 끝을 맞 춥니 다. 연동 펌프 튜브 어댑터의 한쪽 끝에 튜브. 연동 펌프 튜브 어댑터의 다른 쪽 끝을 장착18인치 튜브 공급 병 뚜껑의 ε 포트에 연결합니다.
      5. 포트 β 상 0.22 μm의 필터 유닛 스크류 및 연속 배양 반응기 δ. 포트 (α)의 어댑터에 0.22 μm의 필터 장치를 나사. 0.22 μm의 필터 유닛. 튜빙 (18)의 자유 단부를 장착한다.
    3. 연속 배양을 시작합니다.
      1. 바이오 안전성 후드, 섹션 7.2.1.1에서 만든 O / N 문화 100 ㎕와 연속 배양 반응기 접종.
      2. 37 ° C 배양기에 연속 문화를 이동하기 전에 닫기 시스템. 인큐베이터에서 자기 교반 플레이트와 미니 연동 펌프가 설정되어 있습니다.
      3. 연동 펌프에 연동 펌프 튜브 어댑터를 장착한다. 공급 병에서 튜브는 시작 측과 반응기에 선도적 인 튜브는 "아웃"측면에서 시작 "에서".
      4. "빠른"에 연동 펌프를 설정합니다. R로 전환하여 연동 펌프를 시작합니다20; 앞으로 ". 미디어가 튜브를 통해 흐르기 시작 있는지 확인합니다.
      5. 자기 볶음 접시에 원자로를 놓고 혼합 시작합니다. 연속 배양 반응기는 샘플링하기 전에 24 시간 동안 평형을해야합니다.
    4. 연속 문화의 샘플링. 포트 γ 상을 5 ml 루어 LOK 주사기 나사와 4.5 ml의 문화를 당깁니다.
      1. 밀도 (OD 600 nm의)를 측정하기 위해 문화의 500 μl를 사용합니다. OD 600 nm에서 4 × 1 ml의 문화 = 0.35을 만드는 세포를 희석.
      2. 나누어지는 1.7 mL의 미세 원심 분리 튜브에 문화를 희석. 4 일 동안 매일 12 시간 샘플링을 반복합니다.
    5. GC-TOFMS에 대한 샘플을 준비합니다
      1. 2 분 동안 최대 속도 (16,900 XG)에서 원심 분리를 통해 펠렛 세포. 가만히 따르다 뜨는. 인산염 완충 생리 식염수 500 μL (PBS)와 세포를 씻으십시오. 이 단계를 반복합니다.
      2. 최종 시간을 뜨는 가만히 따르다 한 다음 중지를 버블 링 할 때까지 액체 질소에 펠렛 세포의 microfuge 튜브 잠수함. 에스C 냉동고 °에서 -80 샘플을 찢었다.

8. 대사 체학 시리얼 통로 일괄 문화를 실행

  1. 박테리아 세포 현탁액을 준비. 12.5 % 글리세롤 냉동 재고, 신선한 E. 플레이트 콜라이 100 μg의 / ㎖를 함유하는 LB 한천 0.5X 상 클론 암피실린. 24 시간 동안 37 ° C에서 품어.
    1. 에 개별 식민지를 접종 3 100 μg의 / ㎖를 포함하는 0.5 배의 LB 배지 m​​l의 암피실린. 각 복제에 대한 생물학적 삼중를 사용합니다.
  2. 직렬 통로 배치 문화.
    1. 50 μg의 / ㎖ 암피실린 및 0.1 % L - 아라비 노스를 포함하는 LB 배지 3 ㎖에 500 배 희석을 통해 8.1.1에서 하위 문화의 O / N. 하위 문화는 OD 600 nm의 <0.005이 있어야합니다. 진탕 37 ° C에서 품어.
    2. 2 2.5 시간에서 광학 밀도 (OD 600 nm의)를 확인합니다. 600 nm의 OD = 0.35을 달성하기 위해 세포 성장.
      1. 500 배 디를 통해 하위 문화50 μg의 / ㎖ 암피실린 및 0.1 % L - 아라비 노스를 포함하는 LB 배지 3 ㎖에 lution. 하위 문화는 OD 600 nm의 <0.005이 있어야합니다.
    3. 2 2.5 시간에서 광학 밀도 (OD 600 nm의)를 확인합니다. 600 nm의 OD = 0.35을 달성하기 위해 세포 성장.
  3. 시리얼 통로 배치 문화를 샘플링.
    1. 멸균 된 핀셋 사용 필터 매니 폴드의 상부에 0.22 ㎛의 멤브레인 필터를 배치했다. 분취 한 여과지 상에 인산 완충 식염수 (PBS)의 용액 후 진공 펌프를 켜.
    2. PBS 1 ml의 첨가를 반복한다. 필터 용지에 섹션 8.2.3에서 배양 1 ㎖를 전송합니다. 여기에서 즉시 액체 질소에 샘플을 얻기 위해 빠르게 이동합니다. 1 분에이 작업을 완료합니다.
    3. 필터 용지에 PBS의 나누어지는 1 ml의 샘플을 씻어. 필터 종이의 양면에 걸쳐 샘플을 흘리고없이 빠르게 세척. 반복합니다.
    4. 주의 깊게 파이를 접어 1.7 mL의 미세 원심 분리 튜브에 멸균 집게에게 장소 필터를 사용하여LTER. 정지 버블 링 할 때까지 액체 질소에서의 microfuge 튜브를 담근다. -80 ° C의 냉동고에 보관 샘플.

9. 대사 분석 및 가공

  1. 선박 샘플 처리, 분석 및 GC-TOFMS의 정상화를위한 대사 체학 핵심 시설에 드라이 아이스에 클론 당 3 샘플.
  2. 각 샘플에 대한 데이터를 이용하여 복제, 대사 걸쳐 편차의 평균, 중앙값의 표준 편차와 계수를 결정한다.
  3. 통계 분석을 위해 수동으로 정의 된 조건을 따르지 않는 대사 산물을 제거하는 조건문과 반복 실행 (26)를 사용하여 품질 보증 파이프 라인을 코드입니다.
    1. 조건 1의 경우, 2 개 이상의 샘플이 제로 풍요 로움이있는 대사 물질을 제거합니다. 대사 체 프로파일에서 내부 표준 물질을 제거합니다.
    2. 조건 2의 경우, 관심의 세포에서 발견되지 않은 그 대사 산물을 제거합니다. 여기에, 다음과 같은 대사 산물을 제거 : 인돌 3 아세테이트, dihydroabiet을 IC 산, 노나 데칸 산, 살리실산, 살리 실 알데히드, 콜레스테롤, 페놀, 1- monostearin, 옥타 데칸 올, 1- monopalmitin, 도데 칸, 도데 칸올, 1- 헥사 데칸 올, 5- methoxytryptamine, 벤조산, 펜타, 인산, 펠라 르 곤산 산, 팔 미트 프르 산, 히드 록실 아민, 스테아르 산, 미리스트 산, 말레이 미드, levoglucosan, 및 4- 하이드 록시 부티르산.
    3. 조건 3의 경우, 변동 계수가 1보다 크면 그 대사 산물을 제거합니다.
  4. 대사 상대적인 존재비를보고 글로벌 대사 체학 효과를 캡처합니다.
    1. 각 대사 산물 (그림 6)에 대한 복제 당 중간 대사 산물 풍부한 시각적 표현을 만듭니다.
  5. 클론 - 대사 쌍의 주파수를 관찰하여 이상 값을 확인합니다.
    1. 클론의 모든 대사 산물의 각 중간 값의 Z 점수를 계산합니다. 다음 식을 이용하여 Z 스코어를 계산 :
      /52854/52854eq7.jpg "/> [7]
      참고 : 기간 X MC는 특정 복제에 대한 특정 대사 산물의 풍부한 수준을 나타냅니다. 용어 μ C는 특정 대사 산물에 대한 모든 클론의 평균을 나타냅니다. 용어 σ의 C는 연관된 표준 편차이다.
    2. 아웃 라이어가 강조되는 데이터의 시각적 표현을 만듭니다 (데이터가 제공되지 않음).

Representative Results

본 연구에서 선택한 오픈 리딩 프레임 (ORF를)를 결정하는 데 사용되는 모든 샘플은 스타벅 섬, 사이트 7 (STAR​​7)와 캐롤라인 아톨, 남부 라인 제도의 사이트 9 (CAR9)에서 수집 하였다. 이전 5 설명한대로이 사이트에서 해수의 약 100 L은, 산호 경계층 사용 빌지 펌프 아래에 수집 하였다. 펌프의 내용은 작은 진핵 생물을 제거하는 큰 기공 필터를 통해 분별 화의 대상이되었고 이후에만 미생물 입자 (VLP를) 같은 바이러스를 떠나 100 kDa의 접선 흐름 필터를 사용하여 집중. VLP를 분리하기 위해, 나머지 해수는 virome 결과 0.45 μm의 필터를 통과시켰다. 클로로포름은 남아있는 세포의 성장을 체포하기 위해이 바이러스 성 부분을 소개하고 4 ℃에서 보관 하였다.

VLP를 밀도 구배 원심 분리를 통해 분리 VIR의 복구 할 수있는 염화 세슘 법을 이용하여 정제 된에 이온 ~ 1.35 g / ㎖에서 1.5 g / ㎖ 3. 바이러스 DNA는 CTAB / 페놀을 사용하여 추출 하였다 클로로포름 프로토콜 및 Phi29 시약을 사용하여 여러 변위 증폭 통해 증폭. virome의 연속 시판 pyrosequencing 기술로 이루어졌다.

본 연구에 대한 처리 및 바이러스의 ORF의 선택에 사용되는 생물 정보학입니다. 세 개의 사전 처리 단계 및 CAR9 STAR7 바이러스 metagenomes에 사용 하였다. 우선, 공개 소프트웨어 서열 27에 앞서 바이러스 DNA의 증폭에 기인 태그 서열을 제거하기 위해 사용되었다. 둘째, 서열 중복과 낮은 카피 수와 같은 일반적인 순서 아티팩트가 추가 생물 정보학 프로그램 (28)를 통해 데이터 세트의 필터링되었다. 마지막으로, 외국의 순서 오염 (29)의 제거는 ≥ 90 % 범위 다음과 같은 데이터베이스의 시퀀스 ≥ 94 %의 정체성을 가지고 그 순서에 대해 수행 하였다 나온 RefSeq의 VIRUS 게놈; 인간 - 참고 GRCh37; 인간 - 셀레라 지노믹스; 인간 - 크레이그 벤터 (HuRef); 인간 - 성 진 김 (한국어) 인간 - 염색체 7 버전 2 (TCAG); 인간 - 제임스 왓슨, YanHuang (YH, 아시아), 요루바어 (NA18507, 아프리카) 참조 시퀀스 (21). 이러한 프로세스에 따라, CAR9 샘플에서 서열은 591,600 억원과 STAR7 시퀀스는 939,311에 달했다. 이 시퀀스는 MGRAST에 업로드 및 기본 설정을 사용하여 어셈블러 소프트웨어를 통해 조립되었다. 이전 21 설명 된대로 콘티는 6 독서 프레임과 추정 오픈 리딩 프레임 (pORFs) 스크립트를 사용하여 확인 된로 번역되었다.

유사성 기반 검색의 숫자는 알려진 기능의 ORF를 제거하기 위해 수행 한 알의 ORF를 식별합니다. 요약하면, 다음의 검색은 해당 검색 조건 (21)을 사용하여 수행했다 :

  1. ≥ 이상 ≥ 95 %의 정체성에 상당한 유사성40 염기쌍 M5NR 데이터베이스에 MGRAST BLAT로 (BP).
  2. 내 Metagenome 데이터베이스 리소스의 모든 공용 metagenomes에 대한 TBLASTN에 의해​​ 상당한 유사성 (0.001 ≤ 전자 값).
  3. NR 데이터베이스에 대해 상당한 BLASTP으로 유사성 (0.001 ≤ 전자 값)과 TBLASTN.
  4. 상당한 유사성 보존 도메인 데이터베이스에 대해 RPS-BLAST에 의해 (0.001 ≤ 전자 값).
  5. 단백질 데이터 뱅크에서 해결 단백질 구조 비교 각 데이터 세트의 선택 부분에서 단백질 번역.
  6. 뉴클레오티드 서명 패키지를 사용 뉴클레오티드 주파수의 계산.

그 결과 pORFs는 E.의 표현을 위해 설계되었다 대장균은 공개적으로 사용 가능한 유전자 설계 소프트웨어를 사용하여. E. 발현을 수용하도록 설계된 범용 코돈 사용 표 채용 아미노산 서열의 맨 번역문 2 %의 최소 사용량 임계치와 대장균. 제한 효소 인식 서열BamHI 및 HindIII로 용의 클로닝을 용이하게하는 서열로부터 제외 하였다. 표준 제한 효소 복제를 통해, 외부 회사는 설계 유전자가 30 시퀀스를 합성 한 후 개의 ORF는 중간 사본 번호 pBAD 프로모터 벡터, pEMB11에 클로닝 하였다. 모든 클론의 E.으로 변화되었다 대장균 K-12 균주 BW 27784 (23).

멀티 표현형 분석 플레이트 (MAP에)

높은 처리량과 강력한 소프트웨어 파이프 라인은지도, PMAnalyzer (24)의 분석에 활용되었다. 판독 가능한 텍스트 파일, 품질 보증 성장 곡선 (QA)의 전처리 및 성장 곡선을 분석하는 수학적 모델링 기술을 수행으로 데이터를 포맷, 광학 밀도 파일을 파싱하는 파이프 라인을 포함하는 다양한 단계를 리눅스 서버 환경에서 개발되고 수행 된 . 차 모델링 스크립트 PyLab 모듈을 사용하도록 파이썬 버전 2.7.5에서 개발되었다.

(그림 2A)의 표준 오차 (SE)를 사용하여 평가 하였다. 원시 성장 곡선은 실험 중에 프로그램 PMAnalyzer 정확하게 파라미터와 모델링 된 클론이 성장했다 (데이터는 제시하지 않음)의 여부를 결정하기 위해 로지스틱 성장 곡선을 비교 하​​였다. 지도와 PMAnalyzer의 정확성과 유효성에 대한 자세한 내용은 등. 24 쿠에바스 참조

검증 방법에 따라,지도 데이터는 프로세싱 파이프 라인에 의해 제공된 이러한 최대 성장 속도 (μ 최대) 및 성장 레벨 (GL) 등의 여러 매개 변수를 사용하여 분석 하였다. 성장 곡선의 비교는 종종 가시화 성장 데이터 해석을 위해 사용된다; 그러나, 비교를 위해 한 번에 시각화 될 수있는 곡선의 개수는 한계가있다. 동시에 다수의 성장 곡선을 분석하기 위해, 열 맵 도출 플롯 단일 substrat상에서 성장한 클론의 수만을 비교 하​​였다 간청그 조건 '평균 응답 (그림 2B)에 대한 전자. 새로운 파지 단백질의 과발현에 의해 배치 영향은 특히, 곡선 매개 변수의 변화를 통해 관찰된다 : 단계, 지수 상 최대 바이오 매스 수율 (점근선)를 지연. 예로서, 캡시드 단백질 (도 2A)에 대한 성장 곡선으로 모델링 지수 위상으로 유도기에서 가파른 상승은도 2b의 동적 플롯에서 동일한 클론에 대해 검정에서 흰색으로 색 강도의 빠른 변화에 의해 재생 .

기판에 걸쳐 복제 분포의 글로벌 사진을 얻으려면, GL에서 파생 된 표현형 분류는 (그림 3)를 사용 하였다. 여기서, 네 개의 표현형은 각 바의 높이가 그 특정 기판에 대한 표현형을 디스플레이 클론의 수를 나타낸다 네 차트로 분리된다. 데이터에서 특이점은 쿵푸의 "이득에 떨어지는 클론으로 인식하고 있습니다nction "또는"기능 "카테고리의 손실. 아웃 라이어는 개별적으로 돌렸지하고 실험적으로 더 자세히 조사 할 수 있습니다. 또한, 글로벌 분석은 분석에서 기판 바이어스를 인식한다. 페닐알라닌, 말산, 글리신 등의 기판은 "아니오 성장"분류 결과. 지속적으로 모든 복제를 통해, 더 성장 분류에 해당 기판은 주로 다운 스트림 기능 특성에 가중되지 않습니다.

대사 체학

알 파아지 유전자를 발현하는 클론 이화 대사 체학의 제품을 사용하여 확인 하였다. 간단히, 클론 전에 대사 체학 핵심 시설에서 GC-TOFMS 분석을 위해 발송되기 배치 문화 환경에서 연속 배양 또는 직렬 통로 중 하나에서 성장했다. 선택된 핵심 시설에 의해 구현 GC-TOFMS 샘플 처리, 분석 및 표준화에 대한 자세한 내용은 Fiehn 등. (31) 브리 참조efly 감기 추출 용매 1 ㎖ 샘플을 볼 텍싱하고 5 분간 냉각 조에서 초음파 처리 된 후, 각각의 샘플에 첨가한다. 마지막으로 샘플을 원심 분리 샘플의 절반은 경사 분리 및 분석을 위해 아래로 건조된다. 추출물과 정제 된 가스 크로마토 그래피 상에 로딩하고 다음으로 질량 분석 장치로 이송되기 전에 내부 고정 인덱스 마커 아군이다. 각 샘플의 데이터는 크로마토 그램의 모든 검출 된 신호에 대한 신호 강도가보고되도록 분석된다. 표준화의 경우, 각 샘플에 대한 피크의 풍부한 합산되어 총 피크 존재비는 세트의 모든 샘플 사이의 평균 있습니다. 샘플 당 대사 존재비는 샘플의 피크 풍요로 나눈 후, 샘플 세트의 평균 피크 풍부 곱합니다. 결과 데이터는 논의 연구 대사 체학의 분석을 위해 사용된다.

대사 체학의 재현성 검증을해야했습니다각각의 배양 방법에 대한 적절한 표본 크기를 결정합니다. 샘플 내에서 볼 정밀도와 샘플에 걸쳐 본의 변화를 감지하는 것은 모두 N = 3, N = 6 데이터 세트를 검토 하였다 (그림 5B)의 평균 (S, M)의 표준 오차 크기. 상관없이 연속 배양 (CC)의 샘플 크기, 상기 데이터의 1 % 미만이 1.5 ≤ S의 M 있었다. 중간 S M의 221과 300이었고, 값은 0 5 10 × 7.55 및 3.74 × 10 5 N = 3, N = 6 각각에서였다. S M S도 시료의 각 세트에 대해 계산 된 직렬 문화 (SC) 방법에 복제합니다. 또 다시, 데이터의 1 % 미만이 1.5 ≤ S의 M, 137의 중앙값 S M 및 0 X 3.51 105의 범위였다. S M 각 샘플 세트 사이의 분포 (CC N = 3 대를 비교하기 SC 대. CC N = 6, N = CC 3 대에 SC N = 3, CC N = 6, N = 3) 순열 시험을 수행 하였다. DISTRIB중 연속 배양 S, M은 데이터 세트 값의의 ution 직렬 문화 S M 값 (p- 값 = 0.0)의 분포에서 유의 한 차이가 있었다. 그러나, 연속 배양 N = 3 데이터에 대한 S M 값의 분포는 (1.908804 × 10 -49 = P 값) S M의 연속 문화에 대한 값 N = 6 데이터와는 크게 달랐다. 마지막으로, 당 대사의 변이 계수 및 품질 보증 (QA) 단계의 개시 후 (도 5C) 전에 비교 하였다. 총 210 대사는 품질 보증 파이프 라인 (데이터의 40 %)의 구현 후 제거 하였다. 제거 된 데이터의 1 % 미만은 2 %가 ~ 5 %가 대사의 데이터 이전 E. 관찰되지 않았다, 내부 표준 데이터이었다 ~, 0의 대사 풍부했다 콜라이, 나머지 대사 (> 30 %)는 1보다 큰 변동 계수를 가졌다.

MAP에 분석, 글로벌 observatio로NS는 정보의 대사 체학 제공의 깊이의 초기 이해를 제공했다. 글로벌 사진을 얻으려면, 클론 계층 복제-대사 프로필, 관련 기능을 가진 잠재적 인 클론 및 복제-대사 이상 값 (그림 6)에 대한 정보를 제공 상대적 대사 산물 존재비를 기반으로 클러스터했다. 단백질의 기능을 강조하기 위해, 대사 물질 분리 및 일반 대사 경로를 기반으로 그룹화됩니다. 예비 결과이 분석을 이용하여, 그것 (클론을 강조도 6) 대사 체학은 다른 클래스에서 유전자를 분리 할 수있는 것을 알 수 있었다. 또한, 대사 체학 데이터 아웃 라이어의 식별은 각 클론 - 대사 쌍의 표준 점수 (Z 스코어)를 계산함으로써 결정 하였다. 통계적 유의성을 보장하기 위해, 특이점이 데이터의 단지 5 %를 차지한다 (2)의 Z 스코어 값 클론 - 대사 쌍으로 정의 하였다 (데이터는 보이지 않음).

ether.within 페이지 = "항상"> 그림 1
그림 표현형 분류 1. 정의. 성장 레벨 (GL) 및 최대 성장률 사이의 () 관계. 빨간색 원으로 데이터 포인트없이 기판 활용에 작은을 보여주는 성장 곡선을 나타냅니다. (B) 상자 그림 표현은 최소한의 성장률 (<0.15 OD / HR)와 성장 곡선의 분포에 기초하여 성장 임계치를 정의. (C)는 GL의 편차 및 표준 편차는 기판 D 갈락토오스에 대해 계산된다. 짧은 점선이 두 표준 편차 떨어져 평균에서 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

highres.jpg "/>
정밀도와 차별화를 통해 그림 2. MAP에 확인. () 주석 구조 (캡시드)과 대사 클론의 성장 곡선 (티 오레 독신),이 소설 대사 클론 (EDT2440, EDT2441)과 클론의 평균 응답은 자당, D- 성장 갈락토스와 D 만노오스지도에서. 블루 라인 복제 데이터 사이 본 표준 오차를 나타낸다 (n = 3)를 나타낸다. (B) 47 다른 클론의 성장 곡선은 자당, D- 갈락토스와 D 만노오스에 대한 열지도로 표시됩니다. 주석 구조 (녹색 원) 및 신진 대사에 영향을 미치는 클론 (주황색 원), 두 소설 대사 클론 (어둡고 밝은 파란색 원), 평균 응답 (빨간색 원)으로 강조 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

PLOAD / 52854 / 52854fig3highres.jpg "폭 ="700 "/>
여러 기판에서 각 표현형 그림 3. 복제 분포는. 표현형 - 클론 (72) 탄소 특정 성장 조건에서 47 클론 계산합니다. 표는 각각의 표현형 직접 수를 제공합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
연속 배양 장치의 구성을 상세하게도 4의 다이어그램. (A) α-γ 연속 배양 반응기의 포트를 구축하는 데 사용하는 단계, (B) 단계는 (C를 밖으로 유동 연속 배양 반응기 포트 및 구축에 사용 ) 포트 δ 및 연속 배양 공급 병의 ε을 구축하는 단계를. = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/52854/52854fig4highres.jpg"대상 = "_ 빈">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5
제시된 노믹 방법 그림 5. 비교. 멀티 표현형 분석 플레이트 (MAP에), 연속 문화와 시리얼 문화의 제조 (A) 워크 플로우. (B)는 평균의 표준 오차 (S, M)의 비율은 계산 모두 N = 3, N = 대사 체학의 연속 문화 (CC) 및 직렬 문화 (SC) 제조 방법에 대한 6 샘플 크기. y 축은 로그 스케일이다. (C) 대사 당 변화 (CV)의 계수의 분포, 이전과 연속 배양 (CC) 방법에 대한 품질 보증 파이프 라인의 구현 후.g5highres.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6
연속 배양에서 재배 클론의 그림 6. 대사 체 프로파일. 대사 세트의 중간 대사 산물 존재비 연속 문화에서 자란 84 클론 플롯됩니다. 주석 (캡시드) 구조 및 대사 클론 (티 오레 독신),이 소설 대사 클론 (EDT2440, EDT2441), 평균 대사 응답 대사 프로파일이 빨간색으로 강조 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

화합물 탄소 질소
글리세린 - 0.40 % 0.40 % 0.40 %
염화 암모늄 9.5 mM의 - 9.5 mM의 9.5 mM의
황산나트륨 0.250 mM의 0.250 mM의 - 0.250 mM의
황산 마그네슘 1.0 mM의 1.0 mM의 - 1.0 mM의
인산 칼륨 1.32 mM의 1.32 mM의 1.32 mM의 -
마그네슘 클로라이드 - - * -
염화칼륨 10 mM의 10 mM의 10 mM의 10 mM의
염화칼슘 0.5 μm의 0.5 μm의 0.5 μm의
염화나트륨 5 mM의 5 mM의 5 mM의 5 mM의
염화 제이철 6 μm의 6 μm의 6 μm의 6 μm의
L- 아라비 노스 0.10 % 0.10 % 0.10 % 0.10 %
MOPS의 pH가 7.4 1X 1X 1X 1X

표 1 화합물 및 MAP에 사용되는 다양한 기저 미디어 농도. * 염화 마그네슘 1.0 mM의은 치환된다. 1X MOPS = 40 mM의 MOPS, 4 mM의 트리 신.

L- 라이신
탄소 기판 질소 기판 황 기판 hosphorus 기판
2- 데 옥시 -D- 리보오스 2- 데 옥시 -D- 리보오스 1- 부탄 술폰산 아데노신 -5- monophoshate
4- 히드 록시 - 페닐 아세트산 아세트 아미드 아세틸 시스테인 베타 - 글리세
아세트산 아데닌 D-시스테인 creatinephosphate
아데노신 -5- 모노 아데노신 D-메티오닌 D 글루코스 -6- 포스페이트
아 도니 알란토인 디 에틸 디티 오 포스페이트 디 에틸 디티 오 포스페이트
알파 - 디 - 글루코즈 베타 - 페닐 에틸 아민 DL-티오 닌 DL - 알파 - 글리세
알파 - D-락토스 뷰렛 글루타티온 인산 칼륨
알파 - D-melebiose 시티 딘 이세 티 온산 산 피로 인산 나트륨
구연산 시토신 L-cysteic 산 나트륨 티오
D-알라닌 D-알라닌 L 시스테인
D-아라비 노스 D-아스파라긴 L-djenkolic 산
D-아라비 톨 D-아스파 테이트 L 메티오닌
D-아스파라긴 D-시스테인 황산 마그네슘
D-아스파 테이트 D-글루코사민 메탄 설 폰산
D-cellubiose D 글루탐산 N 아세틸 DL 메티오닌
D-시스테인 DL - 알파 - 아미노 - N - 부티르산 N- 아세틸 -L- 시스테인
D 과당 D-메티오닌 칼륨 테트라 thionate D - 갈락토오스 D 세린 티오 황산나트륨
D-글루코사민 D-발린 sulfanic 산
D 글루코오스 감마 아미노 부티르산 N 타우린
D 글루코스 -6- 포스페이트 글리신 타우로 콜린 산
D-글루타메이트 구아니딘 티오
D 만노오스 히스타민
D-피노 오스 이노신
D-리보스 L 알라닌
D-살리신 L 아르기닌
D 세린 L-아스파라긴
D-트레 할로 오스 L - 시트룰린
D-자일 로스 L 시스테인
dulcitol L 글루타민산
글리세린 L- 글루타민
글리신 L - 글루타티온
I-에리트 리톨 L 히스티딘
이노신 L 이소류신
L 알라닌 L - 류신
L - 아라비 노스 L- 라이신
L - 아라비 톨 L 메티오닌
L-아스파라긴 L - 오르니 틴
L - 아스 파르 테이트 L 페닐 알라닌
L-cysteic 산 L 프롤린
L 시스테인 L-파이로 글루타민산
L - 퓨 코스 L 세린; L- 쓰 레오 닌
L 글루타민산 L- 트립토판
L- 글루타민 L 발린
L 이소류신 N- 아세틸 -D- 글루코사민
L - 류신 퓨 트레 신 (putrescine)
티오
L 메티오닌 티미 딘
L- 페닐알라닌 티민
L-파이로 글루타민산 타이 라민
L-람 노스 티로신
L 세린
L-소르 보스
L- 쓰 레오 닌
L- 트립토판
L 발린
L-자일 로스
젖산
락툴 로스
말 산염
이노시톨
옥살산
소르빈산 칼륨
프로피온산
퓨 트레 신 (putrescine)
닉산
피루브산 나트륨
나트륨 숙시 네이트
자당
티미 딘
크 실리 톨

지도 실험에 사용 된 기판의 표 2. 목록.

Discussion

여기서는 추정 파아지 유전자의 기능적 특성화 노믹 방법을 제시한다. 기술 모니터링 호스트 동화 대사 능력 개발 분석을 포함 멀티 표현형 분석 플레이트 (매핑)하여, 이화 대사에 대한 효과를 측정 할 수있는 대사 체학의 확립 된 방법에 추가하여. 우리는 높은 처리량 처리 및 분석 24 있도록 이러한 기술에 의한 대용량 데이터 세트를 관리하기위한 추가 툴을 제공 하였다. 마지막으로, 주석 파지 캡시드 단백질, 파지 티 오레 독신,이 추정 대사 파지 유전자, 평균 실험 응답의 비교를 통해 우리는 표현형 동향 및 아웃 라이어의 식별의 확인에 중점을두고, 데이터 세트 및 유전자 클래스 모두를 해석하는 다양한 전략을 제안한다.

언급 한 바와 같이, 두 접근 정량적 호스트 대사의 절반만을 측정한다. 임의의 상대 기능을 해석 할조사에서 새로운 단백질, 두 방법 모두에서 데이터 기능의 증거를 제공해야합니다. 이것이 우리의 현재 원고의 초점은 아니지만, 각 노믹 방법의 데이터 출력은 랜덤 숲과 주성분 분석과 같은 클러스터링 기술에 초점을 조합 적 분석을 통해 배치됩니다. 또한, 결합 분석에 의한 가설은 이후 기존의 유전 적 방법에 의해 검증되어야합니다.

마지막으로, 방법은 주로 박테리아의 생리학에 영향을 따라서 동일한 표준을 따르고 제시된다. 어느 방법을 착수 할 때, 고려되는 실험 독립 클론 집단을 보장하기 위해 필요; 오염이 방지된다; 하나의 변수는 테스트되고; 적절한 컨트롤을 동시에 실행되고있다. 이러한 점을 고려하지 않으면 어떤 생리 학적 분석과 유사 불분명 결과가 발생합니다.

멀티 표현형 분석 플레이트(MAP에)

맵의 개발은 높은 처리량과 현재 이용 가능한 기술 (도 5a표 1,2)와 비교 분석 적응을 제공한다. 분석은 모든 미생물 실험실에서 사용할 수 공급, 장비, 기본 기술을 사용합니다. 이후의 데이터 처리 및 분석을위한 연산 파이프 라인의 혼입, PMAnalyzer 24 빠른 데이터 해석을 보장한다. 또한, 접근법 모두 실험 및 분석 양태 용이 조정될 수 또는 사용자 정의 목적 동조. 데이터의 많은 부분은 제 4 절에서 설명 된 필터를 통과하지 못하는 경우, 예를 들어, 하나의 수동으로 문제를 식별하기 위해 성장 곡선을 통해 가려 낼 수있다. 문제가 엄격한 필터 파라미터들로 인해 발생하는 경우, 스크립트에 대한 조정이 이루어질 수있다. 또한, 문제가 실험 과정과 관련된 경우 (즉, 연장 응축, 부적절한 세균 CEL의 전송LS는 등) 추가적인 복제 쉽게 반복 될 수있다.

쿠에바스 등. 24에서 설명한 바와 같이, PMAnalyzer 응집력, 자동화 된 파이프 라인과 구문 분석 및 분석 스크립트를 실행하는 래퍼 스크립트로 작성된 하나의 bash는 프로그램입니다. 모든 스크립트 중으로 데이터 사이를 각 시점에 대해 중간 값을 취함으로써 25 자식 저장소로부터 자유롭게 액세스 할 수 있으며 계속해서 지연 시간을 획득하기 위해 로지스틱 곡선, 최대 성장 속도, 점근선과 신규 용어 성장 수준을 매개 변수화. 중앙값은 큰 이상치의 효과를 감소시키는 연구에서는 평균 걸쳐 선택되었다 그러나, 스크립트는 용이하게 복제 된 데이터의 평균을 계산하도록 구성 될 수있다. 감소 변화 복제 데이터 (그림 2A)에 걸쳐 본 (SE)으로 인해 우리는 물류 곡선 피팅에 대한 PMAnalyzer의 중간의 사용을 유지했다. 또한, 본 연구에서 성장을 차단 (GL ≥ 0.4) DETE했다데이터 성장 레벨과 최대 증가율에 걸쳐 분리 방법과 비교하여 rmined (도 1A, B). 이의 재정을 필요로하는이 용어가 다를 수 있습니다 사용되는 장비 및 모델 시스템에 따라 값을 잘라.

우리의 분석의 가장 큰 장점은 우리가 성장 레벨 (GL)로 정의하는 전체 미생물의 성장을 특징 짓는 하나의 매개 변수를 사용하여 표현형을 비교하는 기능입니다. GL은 조화 평균, 따라서 데이터에 큰 이상 값의 영향을 완화시킨다. 이동 물류-장착 값을 조화 평균의 사용은 성장의 요약은 시행 착오를 통해에 도착했다 제공합니다. 다른 방법은 성장이 포함 차별화를 시도 : 그것은 걸린 시간은 특정 곡선 파라미터 (반 μ 최대, μ 최대 및 운반 능력), 결정 (R 2)의 계수, 특정 곡선의 매개 변수를 곱한 R 2의 조합에 도달 할 수 있습니다. 시프트와 조화 평균을 이용하여GL에 대한 물류 맞는 값은 따라서 선택의 방법이되었다, 성장을 평가하는 가장 큰 범위를 제공했다. 주목해야 할 한가지 고려 사항은 동적 성장 곡선 패턴이 단일 파라미터 또는 피팅 모델을 사용할 때 손실 될 가능성이 있다는 것이다. 예를 들어, 로지스틱 곡선 GL의 개별 곡선 파라미터 이상성 성장을 나타내는 능력이있다. 하나의 탄소 환경에서 성장이 효과는 기판 사용으로 기판 또는 변화 중 하나 변환에 바이러스 성 단백질의 중재를 의미한다. 여러 성장 매개 변수를 고려하지 않을 경우 잠재적 손실 추가 효과는 다음과 같습니다 연장 지연 시간, 바이러스 성 기계 또는 제품의 증가 부담을 제안을; 빠르게 에너지 생산 경로를 호스트하기 위해 결합 된 바이러스 성 단백질을 제안, 지수 상을 가속; 호스트 영양소 흡수 및 동화에 바이러스 지원 암시 매스 형성하거나 더 높은 수준 (데이터는 미도시). 따라서, (초기 성장 곡선을 그리는

지도의 구조적 및 대사 유전자 기부 상이한 반응을 고려할 때, 해당 다른 기판 클래스 단백질 기능에 대한 증거를 제공 큰 것으로 관찰된다. 예를 들어, 대사 단백질은 종종 중앙 대사 16, 32를 호스팅하는 불특정 있습니다 제한 영양소의 획득과 연결되어 있습니다. 예비 실험은 MAP 중앙 대사 탄소원 (도 2a) 상에 성장 될 때, 추정 대사 파아지 유전자 형질 클론 증가 유도기이 있는지 알 수있다. 반대로, 호스트 에너지와의 dNTP 풀의 큰 비율을 필요로 추정 구조 유전자를 운반하는 클론, %의 성장에 거짓 긍정적 인 반응을 초래할RAL 아미노산 대사 탄소 기질. (미도도 2A 및 데이터) 현미경을 통해 관찰이 때문에 호스트 filamentation 및 / 또는 봉입체 결과 불용성 단백질의 축적 가능성이 높다. 추가 분석은 이러한 예비 결과를 검증 할 필요가 있지만, 맵은 특정 파아지 유전자 클래스의 함수를 가정하는 상관 표현형 반응을 입수 할 수있다.

미지의 바이러스 단백질의 해명 외에지도 개별 세균의 대사 작용과 다양성 또는 박테리아의 커뮤니티를 조사하는 신규 한 자원이다. MAP 성분은 세균의 범위의 성장을 지원하기 위해 설계 쉽게 변경되며 해양, 영양 요, 혐기성 미생물을 포함. 다른 속 세균은 맵에서 지원 될 수 있기 전에 사전 정의 된 기저 성장 매체가 추가 또는 조정 된 화학 종을 필요 이러한 노력을 용이.MAP에 이러한 사용 중 하나는 주 트립 톤, 효모 추출물 및 펩톤 등 성분의 사용을 금지하고, 정의 된 미디어를 유지하는 것이다.

대사 체학

대사 체학 분야는 질량 분석에 의해 확인 된 고립 된 대사 산물을 포함 대사 데이터베이스에 따라 달라집니다. 여기에 선택 핵심 시설은 가장 큰 대사 체학 데이터베이스 중 하나가 있습니다. 다른 사람이 전에 우리의 호스트에 기록 된 적이 없었다 동안 흥미롭게도, 우리의 실험과에서 발생하는 대사의 절반 이상이 (~ 65 %)을 식별 할 수없는했다, 대장균은 (예는 다음과 같습니다 인돌 3 아세트산 (33), 살리실산 (34), 및 디 히드로 산 35). 이 사실은 식물 대사 산물, 또는 조사 대상인 특정 단백질 데이터베이스를 향해 강한 바이어스 중 하나에 기인 할 수있다. 그럼에도 불구하고, 그 결과 데이터 표시 및 분석을 위해 사용 가능한 공지 대사 산물의 한정된 수이다. 푸에진짜야는 다양한 데이터베이스를 사용하여 여러 대사 체학 방법은 더 큰 대사 범위를 허용한다.

현재, 모두 알려진 비교하고 우리의 새로운 바이러스 성 단백질을 대조 할 때 알 수없는 대사가 사용된다. 이 방법을 사용하여, 우리는 기능적으로 유사한 단백질을 형질 클론들이 완전한 대사 체 프로파일 증가 유사성을 공유한다는 가설. 예비 대사 체학 분석은 구조 및 신진 대사에 영향을 미치는 유전자를 명확하게 서로 분리되지 않는 동안 (그림 6)의 상관 관계 않는 과발현 때, 그 유전자가 호스트에 비슷한 효과를 보이는 것으로 나타났다. 예를 들어, 밀접하게 추정 대사 유전자 주석 캡시드 유전자 클러스터는이 연구, EDT2440 및 EDT2441 강조. 공개 트랜스 토폴로지 및 신호 펩티드 예측 프로그램을 이용하여 조사 모두 추정 대사 유전자가 단일 막 횡단 도메인 항구 증거를 보였다. 흥미롭게도 5 일 중(대부분 Dendrogram이 부분을 좌) 첫 번째 클러스터 그룹 E 9 클론 같은 토폴로지 프로그램을 사용하여 경막 도메인을 예측 하였다. 또한, 조사가 필요하다, 그러나, 이들 클론의 과발현시 본 대사 물질 또는 막 구조의 부담으로 인한 세포 스트레스 반응과 관련된 것으로 보인다. 이러한 증거는 대사 체학 데이터 잡음 증가량을 보유하면서,이 방법은 유전자 내 및 클래스 걸쳐 두 유전자의 일반적인 효과를 구별 신호를 강조 할 수있는 것을 지원한다. 이 방법은 유전자 기능의 특정 정보를 추출 할 수 있는지 여부를 확인하려면, 대사 산물 특정 대사 경로로 분류되었다. 클론은 단일 통로 특정 대사에 영향을 미치는 경우 가설 존재는, 그 후에 과잉 발현 유전자는 그 경로에서 활성화된다. 우리 대사 체학 품질 보증 파이프 라인의 설립 이전에, 예비 데이터는 위에 밝혀소수 D 대사 산물들은와 연관된 경로에 적은 정보를 제공하는, 일반적으로 "알"이었다 (데이터는 보이지 않음). 대사 체학 전처리 된 데이터는, 그러나, 대사 산물 프로파일의 대부분이 유사하고 단지 알려지지 공지 대사 존재비의 선택 수가 인스턴스 퓨 트레 및 우라실 (도 6)의 경우, 클론 걸쳐 달라질 것으로 나타났다. 단백질 기능 노력의 높은 해상도를 제공하기 위해 실험적으로 기능적 특성을 기초 대사의 "구멍"을 작성하는 데 사용될 수 공지 파지 유전자에 대해 신규 파아지 유전자를 비교하도록 이루어지고있다. 이 기술을 사용하여, 공지의 바이러스 유전자의 할당 기능 미지 유전자의 기능에 대한 기준을 제공한다. 그럼에도 불구하고, 대사 체의 분석 제한 요인은 데이터베이스의 크기와 관련이있다. 이 연구에 논리적 인 사람이어야 메타 볼로 데이터베이스가 개발 될 필요가 이러한 제한, 수정하기 위해; 이러한E.의 아스카의 컬렉션에 특정 대사 산물의 데이터베이스와 자신의 존재비 등 콜라이 클론 된 단일 ORF 36 과발현된다. Lawerence 버클리 국립 연구소의 연구원이 모델 박테리아 (37)의 전체 돌연변이 라이브러리에 특정 대사 산물의 최초의 종합 데이터베이스를 컴파일 할 때 이러한 데이터베이스의 필요성에 대한 증거는 2013 년에 제공되었다. 이 연구는 표현형과 유전자형 사이의 명확한 연결을 공개, 특정 대사 산물의 이용에 필요한 유전자에 새로운 통찰력을 제공했다.

공구로 대사 체학을 고려하면, 처리 정권 코어 시설에서 뒤에 정의하는 것이 중요하다. 대부분의 실험 절차의 유물은 사용의 악기와 관련된 일상의 변화이다. 지금까지 모든 GC-MS 분석은 각각의 실행을 분석에 포함되는 내부 표준을 사용하는 구현; 그러나, 프로젝트 별 내부 샘플 또한 </ EM은> 실험 매일 추가 분산을 제거 달렸다. 이러한 고려 사항은 정상화 문제와 편견을 피하기 위해 조기 해결해야합니다. 또 다른 해결책은 동일한 시스템의 핵심 시설에서 단일 배치, 어떤 핵심 시설에서 사용할 수있는 옵션으로 모든 샘플을 처리하는 것입니다.

다양한 도구를 모두 도입 소설은 화면과 기능적으로 미지의 파지 유전자의 특성을 의미한다 제공이 원고에 다시는-탐구. 연산 파이프 라인의 유선형 사용하여 실험 기술의 단순성과 적응성이 방법은 연구 노력과 필드의 넓은 범위에 적용 할 수있는 보장합니다. 우리의 목표는 여기에 제시된 노믹 방법이 동일하게 기능적으로 정의하는 시스템뿐만 아니라 새로운 파지 단백질의 추가 조사를 도울 것입니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 µm Sterivex Filter Fisher Scientific SVGP01050 Millipore
0.22 µm Millex Filters Fisher Scientific SLGV033RS Millipore
0.22 µm SteriCap Filter Fisher Scientific SCGPS02RE Millipore
0.22 µm Omnipore membrane filters Millipore JHWP02500 Millipore
96-well micro-titer plates VWR 82050-764 Standard F-Bottom 96 well Microplates
2 ml 96-well plate Fisher Scientific
Adhesive seal plate film Sigma-Aldrich Z369667
2 L Nalgene square bottles Cole Parmer T-06040-70
125 ml Nalgene square bottles Cole Parmer T-06040-50
1/4 in. Panel mount lock nut, black nylon Cole Parmer EW-45509-04
Female Luer thread style panel mount to 200 Series Barb, 1/16 in. Cole Parmer EW-45500-30
Female Luer thread style panel mount to 200 series barb, 1/8 in. Cole Parmer EW-45500-34
Male Luer integral lock ring to 500 series barb, 1/16 in. ID tubing Cole Parmer EW-45505-31
Male Luer with lock ring x female Luer coupler Cole Parmer T-45508-80
Barbed bulkhead fittings, 1/4 in. OD Fisher Scientific 6149-0002
Sanipure tubing, 1/16 in. ID x 1/8 in. OD SaniPure AR400002
Sanipure tubing, 1/4 in. OD x 1/8 in. ID SaniPure AR400007
Variable flow mini pump (peristaltic pump) Fisher Scientific 13-876-1
Magnetic stirrer Velp Scientifica F203A0160
Forceps Fisher Scientific 14-512-141 Millipore* Filter Forceps
Multi-plate spectrophotometer plate reader Molecular Devices Analyst GT
Filter manifold Fisher Scientific XX10 025 02
Software:
Python version 2.7.5 http://www.python.org/
PyLab module http://wiki.scipy.org/PyLab
R version 3.0.1 http://www.r-project.org/
reshape2 library http://had.co.nz/reshape
ggplot2 library http://ggplot2.org/
Gene Composer PSI Tech Portal http://www.genecomposer.net
Services:
West Coast Metabolomics Center UC Davis http://metabolomics.ucdavis.edu
DNA 2.0 https://www.dna20.com

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