ファージフェノミクス:小説のウイルスタンパク質を特徴づけるために、生理的アプローチ

Immunology and Infection
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Sanchez, S. E., Cuevas, D. A., Rostron, J. E., Liang, T. Y., Pivaroff, C. G., Haynes, M. R., Nulton, J., Felts, B., Bailey, B. A., Salamon, P., Edwards, R. A., Burgin, A. B., Segall, A. M., Rohwer, F. Phage Phenomics: Physiological Approaches to Characterize Novel Viral Proteins. J. Vis. Exp. (100), e52854, doi:10.3791/52854 (2015).

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Abstract

ファージ - 宿主相互作用への電流の研究は、(メタ)ゲノムから知識を外挿することに依存しています。興味深いことに、60 - すべてのファージ配列の95%が現在の注釈付きタンパク質に相同性を共有しません。その結果、ファージ遺伝子の大部分は、仮定としてアノテートされています。この現実は頻繁に両方の構造および補助代謝遺伝子の注釈に影響を与えます。ここでは、これらの未知のファージ遺伝子のいずれの発現時に選択された宿主の生理学的応答(複数可)を捕捉するように設計phenomic方法を提示します。メタボロミクスは、代謝物質の存在量および多様性を監視することにより、副生成物の分析を提供しながら、複数の表現型アッセイプレート(マップ)が、ホスト基質利用およびその後のバイオマス形成の多様性を監視するために使用されます。両方のツールは、単一の推定上のファージのオープンリーディングフレーム(ORF)の発現に関連する表現型のプロファイルを提供するために同時に使用されます。両方の方法のための代表的な結果を、highl比較します推定上の構造的または代謝ファージ遺伝子のいずれかを有する宿主の表現型プロファイルの違いをighting。また、実験的な分析を容易に可視化技術と高スループットの計算パイプラインが提示されています。

Introduction

(バクテリオファージまたはファージ別名)細菌に感染するウイルスは、世界的に粒子(VLP)のように10以上31ウイルスに存在すると推定し、環境1,2内の他のすべての生物を上回っています。海洋環境に関連したウイルスのコミュニティを調査する最初のメタゲノム研究では、ウイルス画分3内に見られる多様性を定量化することに焦点を当てました。さらに、Breitbartらは、ウイルスコミュニティ配列の65%以上が公共のデータベースで利用可能な任意の配列と相同性を共有していないことがわかりました。その後のメタゲノム研究では、同様の証拠を発見した:サンディエゴの海洋堆積物からmetagenomes、カリフォルニア州は、4、75%の未知のウイルス配列が含まれています。ソルトン湖の過塩性の湖からmetagenomesは98%で、未知のウイルス配列5が含まれています。 98%の未知のウイルス配列6 -やサンゴ関連metagenomesは、95が含まれています。注釈のないこのような情報の蓄積がもたらしました7「生物学的宇宙の暗黒物質」であるファージの遺伝物質。

ファージのゲノムの特徴付けは、既存の核酸とタンパク質データベースとの比較を通して配列類似性を特定することに依存しています。ファージにコードされた遺伝情報は、主に不明であるため、相同性に基づく方法は効果がありません。転写及び複製遺伝子、代謝遺伝子、構造遺伝子:そのゲノム内に、ファージは、典型的には3つの主要な遺伝子型をコードします。転写および複製遺伝子(クラスI / II遺伝子8)ポリメラーゼ、プライマーゼ、エンド/エキソヌクレアーゼ、およびキナーゼを含みます。これらの遺伝子は、高度に転写し、ファージの遺伝物質を複製、ファージ感染におけるその重要性のために保存されています。ファージポリメラーゼは、容易に、それらの地球環境保全9に、従来の配列相同性の方法を用いて同定され、系統学的マーカーとして有効で10を提供するために示されています。これとは対照的に、ファージ代謝および構造遺伝子(クラスII / III遺伝子8)は 、ますます発散、しばしば架空の遺伝子として注釈されています。

ファージ代謝遺伝子は、宿主の代謝能力に影響を与え、必ずしもウイルスの複製に必要とされていません。これらの遺伝子は、多くの場合、補助代謝遺伝子11(AMGs)と呼ばれる、ホストの代謝を調節し、成熟ビリオンの感染及び成功の最適な進行を可能にするように思われます。 AMGsは栄養素を制限する利用及び取り込みまたはエネルギー産生経路に関連しています。いくつかの例は、種々の12-16シアノファージのゲノム中に見出さ光化学遺伝子、遺伝子に連結され、リン酸代謝17,18、およびファージのdNTP生合成18,19用のペントースリン酸経路の利用により調節が挙げられます。比較では、構造遺伝子は、感染中に生成後期遺伝子中旬の間であり、異なるファージ浩にわたって変化しますSTシステム。構造タンパク質の生産は、それらの転写、翻訳、およびアセンブリ8のためのウイルスのdNTP、およびエネルギー·プールの可用性に依存しています。カプシドと尾部繊維構造タンパク質は、すべてのウイルスタンパク質をコードする遺伝子の最も発散とみなされ、成功したビリオン産生のために必要とされます。その発散は、通常、彼らは、ウイルス-宿主共進化20の形成に果たして積極的な役割に起因します。伝統的な相同性および配列アラインメント技術を使用した場合発散タンパク質は関係なく、遺伝子クラスの、容易に見過ごされています。厳密な配列比較で見られる制限を補正するための努力は、人工ニューラルネット21との関連付けを決定するために、配列の特徴を使用することが可能なバイオインフォマティクスツールをもたらしました。人工ニューラルネット(のANN)の構造および代謝遺伝子の予測を可能にする、しかし、直接特徴づけるために、下流の実験的検証が必要遺伝子機能。

本稿の目的は、新規なファージ遺伝子の発現の間に宿主細菌の両方の異化と同化代謝を監視することができるphenomicプロトコルを提供することで、機能のANNを通じて予測しました。フェノミクスの分野では、細胞表現型に関連する生物学は、十分に不明または多面的な機能を有するタンパク質の研究を支援するためにシステム生物学で確立されています。 Phenomicツールは、遺伝子型情報に表現型情報をリンクするために使用されています。我々は、その機能(複数可)は、ファージ遺伝子発現時に宿主の生理学的効果を観察することによって決定することができる推定上のファージ遺伝子を仮定しました。この仮説を調べるために、2つの定量的な方法を選択しました。メタボロミクスは、特定の環境で成長中のホスト代謝産物の多様性と相対的な存在量を測定しながら、複数の表現型アッセイプレート(マップ)がホスト基質利用およびその後のバイオマス形成をモニターするために使用しました。精神状態。推定上の構造および代謝タンパク質が大腸菌内で過剰発現し、両実験からの代表的な結果が比較されます。多数の視覚技術および高スループット処理パイプラインは、実験の複製を容易にするために提示されています。最後に、提示される方法の再現性と精度は、注釈付きのキャプシドタンパク質およびファージ代謝タンパク質、チオレドキシン、プラス2つの推定AMGsの予想生理学的効果との関連で議論されています。

Protocol

マルチ表現型アッセイプレートの調製(MAP)基板、基本培地、プレ成長メディア、およびバッファ

  1. 1.25%の基質ストック - 1.0の50ミリリットルを加えます。
    1. 滅菌水中の固体基板の(w / v)の(熱必要な場合)1.25% - 1.0に溶解します。室温で0.22μmのフィルターユニット、店舗の在庫を持つソリューションを殺菌フィルター。これらの実験で使用される基材の例は、 表2示します
  2. すべての基板クラス(炭素、窒素、硫黄、リン)のために3回基礎培地の250ミリリットルを行います。 1×MOPS(40mMのMOPS + 10mMのトリシン)、0.4%グリセロール*、9.5 mMのNH 4 Clで*、0.25ミリモルのNaSO 4 *、1.0:MOPS(3-モルフォリノプロパン-1-スルホネート)ベースの基礎培地22は、以下が含まれていますミリモルのMgSO 4 *、1.32 mMのK 2 HPO 4 *、10mMの塩化カリウム、0.5μMのCaCl 2、5mMの塩化ナトリウム、6μMのFeCl 3、および0.1%(w / v)のL-アラビノース**( 表1および2)
    注:*これらの化合物は、基本培地に応じて含まれていません。例えば、0.4%グリセロールを炭素基礎培地および基本培地1.0mMのMgSO 41.0ミリモルのMgCl 2により置換され、硫黄では使用されません。 E. - ** L-アラビノースをARAに変換したのpBADプロモーターベクター、pEMB11の誘導に特異的です大腸菌 K-12株(BW 27784)23。
    1. 無菌フラスコに基礎培地の各コンポーネントを追加し、ボリュームに解決策をもたらします。よく混ぜます。 0.22μmのフィルターユニットを使用すると、フィルタは、滅菌ボトルに各基礎培地を滅菌します。
  3. MOPS前増殖培地の500ミリリットルを行います。 1×MOPS(40mMのMOPS + 10mMのトリシン)、0.4%グリセロール、9.5 mMのNH 4 Clで、0.25 mMののNaSO 4、1.0mMのMgSO 4を、1.32 mMのK 2 HPO 4、:MOPSベースのプレ成長培地22は、以下が含まれています10のKCl、0.5μMのCaCl 2、5 mMの塩化ナトリウム、および6μMのFeCl 3。
    1. それぞれの追加無菌フラスコにプレ増殖培地の成分とボリュームにもたらします。フィルター0.22μmのフィルターユニットで滅菌し、100μg/ mlの最終濃度でアンピシリンを加えます。 4℃で保存液。
  4. 0.5Xルリア - ベルターニ(LB)寒天プレートの500ミリリットルを加えます。無菌フラスコに、0.5倍の濃度(1.25グラムの酵母エキス、2.5グラムのNaCl、2.5グラムのトリプトン、7.5グラムの寒天)を作るためにLBのコンポーネントを追加します。よく混合し、滅菌するオートクレーブ。
    1. クールな寒天は、その後、混合しながら抗生物質アンピシリン100μg/ mlを追加します。ペトリ皿に寒天の〜25ミリリットルを入れ、必要になるまでセットし、4℃で保存することができます。
  5. メイク10mMトリス(pH7.4)に加えた10mMの250mlを4緩衝液を硫酸マグネシウム。室温で0.22μmのフィルターユニット、およびストア溶液で滅菌濾過します。

細菌の細胞懸濁液の調製

  1. 新鮮なコロニーを準備します。 12.5%グリセロール凍結ストックから、新鮮なE.をめっき大腸菌 CLON100μg/ mlのアンピシリンを含む0.5×LB寒天上にES。 24時間37℃でインキュベートします。
  2. 液体培養物を準備します。
    1. ピペット培養チューブに100μg/ mlのアンピシリンを含有するプレ増殖培地3mlの。各クローンについて、生物学的な三連を使用します。
    2. 調製した培養管に2.1節から独立したコロニーを接種します。 22時間、37℃で振盪しながらインキュベートします。
  3. ペレット化し、細菌細胞を洗浄します:
    1. 転送O / N 1.7ミリリットルマイクロチューブに培養。微量で2分間、最大速度(16,900 XG)で遠心分離を介して細胞をペレット化。上清を除去し、10 mMトリス/ 10mMのMgSO 4を緩衝液500μl中に再懸濁することにより細胞を洗浄します。繰り返します。
    2. 再ペレット細胞、上清をデカントし、10mMのトリス/ 10mMのMgSO 4を緩衝液1mlで細胞を再懸濁します。
  4. 細胞密度を測定し、必要に応じて細胞を濃縮します。
    1. セクション2.3.3からの細胞を希釈で10倍10 mMトリス/ 10 mMのは4バッファを硫酸マグネシウムおよびキュベットにこの希釈液を移します。この希釈及びレコードの光学密度(OD 600 nm)を測定します。
    2. (それらがマップに追加されたときの細胞は、細胞がOD 600 nmの = 1.05の初期濃度であることが必要ので、15倍に希釈される)マップの0.07の最終濃度(OD 600 nm)を達成するために、細胞を濃縮。リザーバに濃縮された細胞懸濁液を移し、MAPの準備の段階3.5まで(室温で)保存します。

マルチ表現型アッセイプレートの調製(MAP)の

  1. MAPのラベルを付けます。 E.とラベル滅菌96ウェルマイクロタイタープレート大腸菌クローン識別番号とMAP模式タイプ。
  2. のMAPに小分けし、滅菌水。無菌的液体リザーバーに滅菌水を移します。ピペットマルチチャンネルピペットを用いてマイクロタイタープレートの各ウェルに60μlの。
  3. 小分け基礎培地はintOマッピングします。無菌的液体リザーバーに3回基礎培地を転送します。ピペットマルチチャンネルピペットを用いてマイクロタイタープレートの各ウェルに50μlの。繰り返しは、MAPの概略図で使用される各基本培地のため3.2と3.3を繰り返します。
  4. のMAPに小分け基板。 MAPの適切なウェルに各基板の30μLを転送します。
  5. マップに細菌懸濁液を追加します。マルチチャンネルピペットを使用してマップの各ウェルに移すセクション2.4.2からの細菌細胞を10μl。バック培養ストックへの再導入ピペット前にヒントを変更します。
  6. 接着フィルム付きカバーのMAP。単一の接着プレートフィルムで各プレートをカバーしています。しっかりと偶数と緊密なシールを作成するために、プレートのウェル上に及び縁に沿ってフィルムを押してください。滅菌カミソリの刃を有するマイクロタイタープレートの縁から過剰なフィルムを取り外します。
  7. MAPの光学濃度を測定します。
    1. 多板分光の「入力」のスリーブで製造したのMAPを配置光度計プレートリーダー。オープンプレートリーダー·ソフトウェアと読み込みの間振とうの60秒で、32時間の合計吸光度(OD 600 nm)で 30分毎に、測定プロトコルを作成します。
    2. 37°Cまでの装置内の温度設定。 MAPは、温度を設定するために平衡化した後でプロトコルを起動します。
    3. 32時間後、プレートリーダーの「出力」袖からマップを削除。含まれるように、各データのテキストファイルにラベルを付ける:E.大腸菌クローン識別番号、MAPが実行された日付、およびMAP模式タイプ。

4.マルチ表現型アッセイプレート(MAP)の処理とパラメータ化

  1. 自動化されたQAプロセス、 例えば、PMAnalyzer 24を使用して成長曲線を評価します。
    1. その成長曲線は、OD 600nmの <最初の2時間で0.20を持っていることを確認します。典型的に解決する、結露のアーティファクトにフィルタで最初の時点(T 0)での吸光度を使用しないでくださいT 1(30分)。
    2. QAフィルタに違反する成長曲線を削除します。今後の参考のために個別の出力ファイルにカーブ情報(サンプル名、十分番号、OD 600nmの値)を保存します。成長曲線は、QAフィルタを通過した場合の分析に進みます。
  2. 中央値は成長曲線を計算します。データを複製使用して、ウェル当たり、各時点で中央値の光学密度(OD 600 nm)の値をとることによって、中央値成長曲線を算出します。将来の使用のために別々の出力ファイル内の中央値の成長曲線を生じたレコード。
  3. Zwietering 25によって提案された式の適応を使用して、各成長曲線のためのベストフィットロジスティックモデルを計算します。ラグタイム、λ(時間)、成長の最大速度、μMAX(OD 600 nmで 100 -1)、および最終的なバイオマス収量、α(OD 600 nm)の :ロジスティック方程式は、細菌の増殖を記述する3つのパラメータを含んでいます。など、時間= 30分(Y 1)でデータを使用結露のアーチファクトに起因する初期値。
    式(1) [1]
    1. ダイレクトサーチを使用して、最大の成長率を計算します。データ内の90分間隔での変化の最大率を記録します。
      式(2) [2]
    2. 90分ウィンドウを超える最大の移動平均の上漸近値を検索することによって、最終的なバイオマス収量を推定します。具体的には、成長曲線の漸近線として定義します。
      式3 [3]
    3. μmaxと4.3.1および4.3.2からの値を使用すると、すべての値λを試みることにより、λの値を検索します。
      式4 [4]
      1. 二乗誤差(SSE)の合計を計算するために、各λ値を使用してください。最低SSEは、SSE(λS)で使用します。
        /files/ftp_upload/52854/52854eq5.jpg "/> [5]

MAPの5表現型解析

  1. 基板1枚あたりのクローンあたりの全体的な成長性を評価するために、各成長曲線の成長レベル(GL)を計算します。シフトロジスティックフィット値の調和平均としてGLを定義します。
    式6 [6]
  2. GL値に基づいて、各成長曲線に表現型を割り当てます。ここでは、使用される4つの表現型は、次のとおりです。期待成長、成長なし、関数のゲイン、および機能喪失。
    1. 離れて、平均からの標準偏差の点で特定の基板上のすべてのクロー​​ンの両端の成長を比較することにより、表現型を決定します。成長曲線( 図1A、B)によって提示された表現型を指定するには、この統計値と最小成長のしきい値を使用してください。 図1Cは、表現型の割り当ての例を示します。
    2. GL≥0.4(FIGURとして成長を定義します。電子装置1A、B)。平均値と平均以上のGL> 2標準偏差>成長閾値を有するように関数のゲイン( 図1C、緑色)を定義します。機能( 図1C、赤)の損失は、成長閾値<2つの標準偏差平均値と平均より> GLを有するものとして定義されます。
  3. 表現型と成長曲線に基づいて、データセットの視覚的表現を作成します。
    1. すぐに複数のクローン( 図2)との間の成長曲線を比較する色としてOD 600nmの値を描いた表示成長動態。
    2. 成長条件( 図3)に基づいて、すべてのクローンの中で表現型の分布を表示します。

6.連続培養装置の構築

  1. リアクターポート構造( 図4A、B)。中3の1/4。穴を開け、中に3/4を離間さ。離れて、連続培養リアクターのキャップに。
    1. フォーRポートα:雌ルアースレッドスタイルパネルはバーブは、キャップのうち、上向きにキャップの底からバーブで1/16にマウントネジ。 1/4インチのパネルを使用したセキュアなバーブは、ロックナットをマウントします。
    2. ポートβの場合:雌ルアースレッドスタイルパネルはバーブは、キャップのうち、上向きにバーブに1/16にマウントネジ。 1/4インチのパネルを使用したセキュアなバーブは、ロックナットをマウントします。
    3. ポートγの場合:バーブは、キャップのうち、上を向いているように、雌ルアースレッドスタイルパネルがキャップの下からバーブで1/16にマウントネジ。 。パネルの1/4との安全なバーブは、ロックナットをマウントします。キャップの内側に、バーブ継手に。広い口径ホースで1/8に不可欠なロックリングと雄ルアーをねじ込み。
    4. 流出口の場合:連続培養リアクター75mlのマークの穴に5/16をドリル。で3/4をカットします。1/4のナット末尾から。有刺バルクヘッドフィッティングで。 (ガスケットは、ボトルの外側にあり、ナットは、内側にFである。とげのバルクヘッドフィッティングで1/4にネジigure 4B)。
  2. 瓶の港湾建設( 図4C)。インチ穴ドリル2 1/4に1を離間さ。離れて哺乳瓶のキャップに。
    1. ポートδの場合:雌ルアースレッドスタイルパネルはバーブは、キャップのうち、上向きにバーブに1/8にマウントネジ。 1/4インチのパネルを使用したセキュアなバーブは、ロックナットをマウントします。
    2. ポートεの場合:雌ルアースレッドスタイルパネルはバーブは、キャップのうち、上向きにバーブに1/16にマウントネジ。 1/4インチのパネルを使用したセキュアなバーブは、ロックナットをマウントします。
      1. キャップの内側に、バーブ継手に。広い口径ホースで1/8に不可欠なロックリングと雄ルアーをねじ込み。
  3. 給管と管の拡張機能:
    1. 2 1はでカットします。チューブの部分(外径(OD)1/8インチ内径(ID)で1/16をX)。 αおよび5.2節で行った連続培養器のγポート上にフィット枚。
    2. Tの。一枚で単一の1をカット(1/4インチ。IDでOD X 1/8)ubing。連続培養リアクターのポートΒ上にフィット作品。
    3. チューブの。個(ID中のx 1/16。OD 1/8)で単一の3.5をカット。 。大口径ホースで1/8に不可欠ロックリングと雄ルアーに、ポートγの内側にこの作品を取り付けます。ポートγは、連続培養反応器のサンプリングポートです。
    4. チューブの。一片(1/4インチ外径のx 1/8インチIDで)で単一の1をカット。哺乳瓶のδポート上でこの作品を取り付けます。
    5. チューブの。個(ID中のx 1/8インチ。ODで1/16)で、単一の11をカット。 。大口径ホースで1/8に不可欠ロックリングと雄ルアーに、哺乳瓶のεポートの内側にこの作品を取り付けます。
    6. (1/8インチを。でOD X 1/16。ID)をチューブの2 18インチの部分をカットします。哺乳瓶の口εに一枚を取り付けます。セクション7のための他の作品を保存します。

7.メタボロミクスのための連続培養を実行します

  1. 材料を殺菌:
    1. Autocla30分間の乾燥材料VEの。アルミホイルでセクション5で作られた哺乳瓶のキャップをラップすることを確認します。添付のチューブをまっすぐにしてください。
      1. アルミホイルで、セクション5で作られた連続培養リアクターのキャップを包みます。添付のチューブをまっすぐにしてください。セクション6.3.5で。チューブカットとアルミ箔で最小の蠕動ポンプチューブアダプタ18をラップします。チューブをまっすぐにしてください。 30分間オートクレーブ。
    2. 0.5×LBブロスの2 Lを作ります。哺乳瓶では、0.5×LBブロスを作ります。ホイルで瓶を供給するカバーしています。 1時間オートクレーブ。
    3. 0.5×LBブロス70mlのを行います。連続培養反応器にスープを注ぎます。連続培養反応器内の攪拌棒を配置します。 30分間箔とオートクレーブ反応器をカバーしています。
  2. 連続培養のセットアップ:
    1. 細菌細胞懸濁液。
      1. 12.5%グリセロール凍結ストックから、新鮮なE.をめっき100μg/ mlのアンピシリンを含む0.5×LB寒天上に大腸菌クローン 。インキュベート24時間37℃で。
      2. 100μg/ mlのアンピシリンを含む0.5×LBブロス3mlの中に単一コロニーを接種します。各クローンについて、生物学的三連を使用します。 22時間、37℃で振盪しながらインキュベートします。
    2. 部品を互いに接続します。
      1. 生物学的安全キャビネットの中にすべてのオートクレーブ処理材料を配置し、メディアが冷却しながら、上の紫外光を向けます。メディアが冷却されると、すべての0.5倍のLBブロスに0.1%のL-アラビノースおよび100μg/ mlのアンピシリンを追加します。
      2. 連続培養リアクターキャップをアンラップし、反応器の上にネジ止めします。サンプリングチューブに触れないようにしてください。哺乳瓶のキャップをアンラップし、哺乳瓶の上にネジ止めします。サンプリングチューブに触れないようにしてください。
      3. で18をしてください。チューブポートに接続されているε滅菌。 18インチチューブと蠕動ポンプチューブアダプタをアンラップします。
      4. 蠕動ポンプチューブアダプタの一方の端に。チューブ18の自由端を取り付けます。に蠕動ポンプチューブアダプタのもう一方の端を取り付け18インチチューブは哺乳瓶キャップのεポートに接続されています。
      5. ポートはβ、連続培養リアクターのδ上に0.22μmのフィルターユニットをねじ込みます。ポートαのアダプタに0.22μmフィルターユニットをねじ込みます。 0.22μmフィルターユニットに、。チューブ18の自由端にフィット。
    3. 連続培養を開始します。
      1. バイオセーフティーフード内で、セクション7.2.1.1で行われたO / N培養液100μlで連続培養リアクターに接種します。
      2. 37℃のインキュベーターに連続培養を移動する前に、システムカバーを閉じます。インキュベーター中で磁気攪拌プレート、ミニ蠕動ポンプがセットアップされています。
      3. 蠕動ポンプ内に蠕動ポンプチューブアダプタを取り付けます。哺乳瓶からのチューブはで開始側、反応器につながるチューブは「アウト」側で始まり "で"。
      4. 「FAST」:に蠕動ポンプを設定します。 Rに切り替えることにより、蠕動ポンプを起動します。20; FORWARD」。メディアは、チューブを通って流れ始めることを確認してください。
      5. 磁気撹拌プレート上の反応器を置き、混合を開始します。連続培養リアクターは、サンプリングの前に24時間平衡化しなければなりません。
    4. 連続培養のサンプリング。ポートγに5ミリリットルルアーLOK注射器をねじ込み、文化の4.5ミリリットルを引き上げます。
      1. 密度(OD 600 nm)を測定するために、培養液500μlを使用してください。 OD 600 nmで4×1ミリリットルの文化= 0.35を作るために細胞を希釈します。
      2. アリコート1.7ミリリットルマイクロチューブに培養液を希釈しました。 4日間ごとに12時間のサンプリングを繰り返します。
    5. GC-TOFMSのためのサンプルを準備します。
      1. 2分間、最大速度(16,900 XG)で遠心分離を介して細胞をペレット化。上清を除去。リン酸緩衝生理食塩水(PBS)の500μlの細胞を洗浄します。この手順を繰り返します。
      2. 最終的な時間を上清デカントし、次に停止をバブリングするまで液体窒素中でペレット化した細胞を用いたマイクロチューブを沈めます。 S℃の冷凍庫-80でサンプルを引き裂きました。

8.メタボロミクスのための連続継代のバッチ培養を実行します

  1. 細菌の細胞懸濁液を調製します。 12.5%グリセロール凍結ストックから、新鮮なE.をめっき大腸菌を100μg/ mlを含む0.5×LB寒天上にクローン アンピシリン。 24時間37℃でインキュベートします。
    1. を100μg/ mlを含む0.5×LBブロス3mlの中に個々のコロニーを接種します アンピシリン。各クローンについて、生物学的三連を使用してください。
  2. 連続継代のバッチ培養。
    1. 50μg/ mlのアンピシリンおよび0.1%L-アラビノースを含有するLB培地3ml中に500倍希釈を介して8.1.1から継代培養のO / N。サブカルチャーは、OD 600 nmの <0.005を有するべきです。振盪しながら37℃でインキュベートします。
    2. 2と2.5時間での光学密度(OD 600 nm)を確認してください。 OD 600 nmの = 0.35を達成するために、細胞を増殖させます。
      1. 500倍ジを介してサブカルチャー50μg/ mlのアンピシリンおよび0.1%L-アラビノースを含有するLB培地3ml中にリューション。サブカルチャーは、OD 600 nmの <0.005を有するべきです。
    3. 2と2.5時間での光学密度(OD 600 nm)を確認してください。 OD 600 nmの = 0.35を達成するために、細胞を増殖させます。
  3. 連続継代のバッチ培養をサンプリングします。
    1. 滅菌ピンセットを使用して、フィルターマニホールドの上に0.22μmのメンブレンフィルターを置きます。小分けろ紙上にリン酸緩衝生理食塩水(PBS)の1ミリリットル、次いで、真空ポンプの電源を入れます。
    2. 1mlのPBSを添加することを繰り返します。ろ紙上にセクション8.2.3からのサブカルチャーの1ミリリットルを転送します。ここから、直ちに液体窒素中にサンプルを取得するために迅速に移動します。 1分でこれを完了します。
    3. サンプルを洗浄するアリコートろ紙上に1mlのPBS中。ろ紙の側面の上にサンプルをこぼすことなく、急速にフラッシュします。繰り返します。
    4. 慎重Fiを提供して折り曲げて1.7ミリリットルのマイクロチューブに滅菌鉗子場所フィルタを使用してLTER。停止をバブリングするまで液体窒素中にマイクロチューブを沈めます。 -80℃の冷凍庫に保管したサンプル。

9.代謝物の分析·加工

  1. 船サンプル処理、分析及びGC-TOFMSの正規化のためのメタボロミクスの中核施設にドライアイス上のクローン当たり3つのサンプル。
  2. 各サンプルについての複製データを用いて、代謝物全体の変化の平均値、中央値、標準偏差と係数を決定します。
  3. 統計分析のために、手動で定義された条件に従わない代謝物を除去するために、条件文、繰り返し実行26を使用して、QAパイプラインをコーディングします。
    1. 条件1の場合は、2つ以上のサンプルがゼロ豊かさを持っている代謝産物を除去します。メタボロームプロファイルからの内部基準を削除します。
    2. 条件2の場合は、目的の細胞には見られないものの代謝物を削除します。ここでは、次代謝物を除去:インドール3酢酸、dihydroabietを IC酸、ノナデカン酸、サリチル酸、サリチルアルデヒド、コレステロール、フェノール、1-モノステアリン、オクタデカノール、1-モノパルミチン、ドデカン、ドデカノール、1-ヘキサデカノール、5-メトキシトリプタミン、安息香酸、ペンタデカン酸、リン酸、ペラルゴン酸、パルミチン酸、カプリン酸、ヒドロキシルアミン、ステアリン酸、ミリスチン酸、マレイミド、レボグルコサン、4-ヒドロキシ酪酸。
    3. 条件3については、変動係数が1よりも大きいものの代謝物を除去します。
  4. 代謝産物の相対的存在量を調べることで、グローバルメタボロミクス効果をキャプチャします。
    1. 各代謝産物のためのクローン当たりの中央値の代謝産物の存在量( 図6)の視覚的表現を作成します。
  5. クローン代謝物ペアの周波数を観察することによって、外れ値を識別します。
    1. クローン内のすべての代謝物の各中央値のためのZスコアを計算します。以下の式を用いて、Zスコアを計算します。
      /52854/52854eq7.jpg "/> [7]
      注:用語X MCは 、特定のクローンに特異的な代謝物質の存在量レベルを表します。用語μCは、特定の代謝産物のためのすべてのクローンの平均を表します。用語σCは、関連する標準偏差です。
    2. 異常値が強調表示されたデータの視覚的表現を作成します(データは提供されていません)。

Representative Results

この研究において選択されたオープンリーディングフレーム(ORF)を決定するために使用されるすべてのサンプルはスターバック島、サイト7(STAR7)とキャロライン環礁、南ライン諸島のサイト9(CAR9)から収集しました。以前5記載のように、これらのサイトからの海水の推定100 Lは、ビルジポンプを使用して、サンゴ境界層の下に回収しました。ポンプの内容は、小さな真核生物を除去するために、大きな孔のフィルターを通して分別の対象とし、その後粒子(VLP)のような唯一の微生物やウイルスを残し100kDaのタンジェンシャルフローフィルターを用いて濃縮しました。のVLPを分離するために、残りの海水はviromeその結果、0.45μmのフィルターを通過させました。クロロホルムは、残りの細胞の増殖を阻止するために、このウイルス画分に導入し、4℃で保存しました。

VLPは、密度勾配遠心分離を介して分離し、VIRの回復を可能にする塩化セシウム法を用いて精製しました。〜1.35グラム/ミリリットルグラム/ mlの3〜1.5でイオン。ウイルスDNAは、CTAB /フェノールを用いて抽出した。クロロホルムプロトコルとファージphi29試薬を用いて、複数の変位増幅を介して増幅しました。 viromeの配列決定は、市販のパイロシーケンシング技術を用いて達成されました。

以下のように、この研究のために処理し、ウイルスのORFの選択に使用されるバイオインフォマティクスです。三前処理ステップはCAR9とSTAR7ウイルスmetagenomesで使用されました。まず、公共のソフトウェアを配列27の前に、ウイルスDNAの増幅から生じたタグ配列を除去しました。第二に、このような配列の重複と低コピー数などの一般的なシーケンシングアーチファクトが追加のバイオインフォマティクスプログラム28を介して、データセットのうち、濾過しました。最後に、外来配列の汚染29を除去する≥90%の範囲と以下のデータベースにおける配列と≥94%の同一性を有していたこれらの配列のために実施した:のRefSeq Virusゲノム;ヒト - リファレンスGRCh37。ヒト - セレラ·ジェノミクス。ヒト - クレイグ·ベンター(HuRef)。ヒト - ソン·ジン·キム(韓国)。ヒト - 染色体7バージョン2(TCAG);と人間-ジェームズ·ワトソン、YanHuang(YH、アジア)、ヨルバ語(NA18507、アフリカ)参照配列21。これらのプロセスに続いて、CAR9サンプルからの配列は、591600を合計しSTAR7配列は939311円となりました。これらの配列はMGRASTにアップロードして、デフォルト設定を使用して、アセンブラソフトウェアを介して組み立てました。コンティグは6リーディングフレームと推定されるオープンリーディングフレーム(pORFs)に翻訳されました以前に21を説明するように、スクリプトを使用して同定しました。

未知のORFを同定するために、類似ベースの検索数は、既知の機能ののORFを除去するために行われました。簡単に説明すると、次の検索は、それに対応する検索条件21を用いて行きました。

  1. ≥超える≥95%の同一性の有意な類似性M5NRデータベース内MGRAST BLATで40塩基対(bp)。
  2. マイメタゲノムデータベースリソース内のすべてのパブリックmetagenomesに対するTBLASTNによる有意な類似性(0.001≤e値)。
  3. NRデータベースに対するBLASTPおよびTBLASTNによる有意な類似性(0.001≤e値)。
  4. 保存ドメインデータベースに対してRPS-BLASTによる有意な類似性(0.001≤e値)。
  5. タンパク質データバンクでは解決のタンパク質構造と比較し、各データセットの選択画分からのタンパク質の翻訳。
  6. ジヌクレオチド署名パッケージを使用してジヌクレオチド頻度の計算。

得られたpORFsは大腸菌における発現のために設計されました公に利用可能な遺伝子設計ソフトウェアを使用して大腸菌 。アミノ酸配列の逆翻訳E.における発現に適応するように設計されたユニバーサル·コドン使用表を用います2%の最低使用率のしきい値を持つ大腸菌 。制限酵素認識配列をBamHIおよびHindIIIのための、クローニングを容易にするために、配列から除外しました。社外30工学遺伝子配列を合成し、その後のORFは、標準的な制限酵素クローニングを介して、中程度のコピー数のpBADプロモーターベクター、pEMB11にクローニングしました。すべてのクローンは、 大腸菌に形質転換しました大腸菌 K-12株BW 27784 23。

マルチ表現型アッセイプレート(MAP)の

高いスループットと堅牢なソフトウェアパイプラインは地図、PMAnalyzer 24の分析のために活用されました。パイプラインは、Linuxサーバ環境で開発を含む様々なステップを実行した:光学密度ファイルの解析品質保証(QA)が読み取り可能なテキストフ​​ァイル、成長曲線の前処理へのデータをフォーマットし、成長曲線を分析するために、数学的モデリング技術を実行します。主要モデリングスクリプトはPyLabモジュールを利用するPythonのバージョン2.7.5に開発されました。

図2A)のための標準誤差(SE)を用いて評価しました。生の成長曲線は、実験中にプログラムPMAnalyzer正確にパラメータ化し、モデル化され、クローン増殖(データは示していない)かどうかを決定するためにロジスティック増殖曲線と比較しました。 MAPの正確性および有効性の詳細については、とPMAnalyzerクエバスらを参照してください。24

方法の検証に続いて、地図データは、処理パイプラインによって提供されるような最大増殖速度(μmax)が、成長レベル(GL)などの複数のパラメータを用いて分析しました。増殖曲線の比較視覚化は、多くの場合、成長データの解釈のために使用されます。しかしながら、比較のために一度に視覚化することができる曲線の数には限界があります。同時に多数の成長曲線を分析するために、ヒートマップ派生プロットは、単一substrat上に成長させたクローンの数十を比較するために懇願しました。その条件「平均応答( 図2B)に対してE。新規ファージタンパク質の過剰発現によって配置影響は、特に、曲線パラメータの変化によって観察される:誘導期、対数期最大バイオマス収量(漸近線)。一例として、カプシドタンパク質( 図2A)の成長曲線でモデル化された指数期に遅滞期から急な登りが、 図2Bの動的なプロットに同じクローンについて黒から白への色強度の迅速な変化によって再現されます。

基板全体のクローン分布の全体像を得るためには、GLから誘導される表現型の分類は( 図3)を用いました。ここでは、4つの表現型は、各バーの高さは、特定の基材のためにその表現型を示すクローンの数を表す4のグラフに分離されています。データ内の異常値は、府の「ゲインに落ちるクローンとして認識されていますnction」または「機能」カテゴリの損失。異常値は、その後、個別に求めることが実験的に、より密接に調査することができます。また、世界的な分析は、アッセイに基板バイアスを認識します。フェニルアラニン、リンゴ酸、およびグリシンなどの基質は、「非増殖」分類をもたらしました。一貫して成長なし分類に分類された基板は、全てのクロー​​ンを横切って、重く下流機能的特徴に加重されていません。

メタボロミクス

未知のファージ遺伝子を発現するクローンからの異化産物は、メタボロミクスを用いて同定しました。簡単に説明すると、クローンは前メタボロミクスコア施設でGC-TOFMS分析のために送信されるまで、バッチ培養環境中で連続培養または連続継代のいずれかの下で成長させました。選択された中核施設によって実装GC-TOFMS用のサンプル処理、分析、および正規化の詳細についてはFiehn 31ブリを参照してくださいefly、冷抽出溶媒1mlのサンプルはボルテックスし、5分間冷浴中で超音波処理された後、各サンプルに添加されます。試料は、最終的に遠心分離し、試料の半分をデカントし、分析のためにダウン乾燥します。抽出物を精製し、ガスクロマトグラフ上にロードし、その後質量分析計に転送される前に、内部保持指標マーカーでスパイクされています。各サンプルからのデータは、クロマトグラムのすべての検出された信号の信号強度を報告するように分析されます。正規化のために、各サンプルのピークの存在量が合計され、総ピーク存在量は、セット内のすべてのサンプル間で平均化されます。サンプルあたりの代謝産物の存在量は、サンプルのピーク豊富で割って、サンプルセットの平均ピーク豊富で乗算されています。得られたデータを考察研究のメタボロミクスの分析のために使用されます。

メタボロミクス再現性の検証をする必要がありました各培養方法のための適切なサンプルサイズを決定します。サンプル内に見られる精度とサンプル全体に見られる変化を検出するには、両方のn = 3およびn = 6のデータセットを検討した( 図5B)の平均(S M)の標準誤差のサイズ。かかわらず、連続培養(CC)サンプルサイズの、データの1%未満、1.5≤S Mを有していました。中央値S M sが221と300であり、そして値は、0〜5×10 7.55へと3.74×10 5用のn = 3およびn = 6、それぞれの範囲でした。 S、M sは、サンプルの各セットについて計算した、シリアル文化(SC)メソッドで複製します。ここでも、データの1%未満ではS、M≤1.5、137の中央値S M、0〜3.51×10 5の範囲であった。各サンプルセット(CC n = 3のの間のS、Mの分布を比較しますSC 対。CC、N = 6、n = 3のCC 対の SC n = 3であり、CCはn = 6は、n = 3)並べ替え検定を行いました。 DISTRIBいずれかの連続培養S、Mは 、データセットの値のutionはシリアル文化S M値 (p値= 0.0)の分布と有意差はなかったです。しかし、連続培養のためのS M分布はn = 3のデータは著しく連続培養のためのM S とは異なった、N = 6のデータ(p値= 1.908804×10 -49)でした。最後に、代謝産物あたり変動係数は、品質保証(QA)ステップ( 図5C)の実施の前と後を比較しました。合計では、210の代謝産物は、QAパイプライン(データの40%)の実施後に削除されました。削除されたデータの1%未満では、ゼロの代謝物の豊かさを持っていた〜2%、内部標準データだった、〜5%が代謝物からのデータは、前のEに観察されませんでした大腸菌 、残りの代謝物(> 30%)が1より大きく変動係数を有していました。

MAPの分析と同様に、グローバルobservatioNSは、情報メタボロミクスの提供の深さの初期の理解を提供しました。全体像を得るために、クローンは、階層的にクローン代謝産物プロファイル、関連する機能の潜在的なクローン、およびクローンの代謝産物の異常値( 図6)についての情報を提供し、それらの相対的な代謝産物の存在量に基づいてクラスター化しました。タンパク質の機能を強調するために、代謝産物を分離し、共通の代謝経路に基づいてグループ化されています。予備的な結果で、この分析を使用して、メタボロミクスは、異なるクラスからの遺伝子を分離することができることは明らかであった( 図6、クローンを強調しました)。さらに、メタボロミクスのデータと外れ値の識別は、各クローンの代謝産物対のための標準的なスコア(Zスコア)を計算することによって決定しました。統計的有意性を確保するために、外れ値は、データのわずか5%を占める、2のZスコア値を有するクローン代謝産物ペアとして定義された(データは示さず)。

ether.withinページ= "常に"> 図1
図の表現型分類の1.定義。成長レベル(GL)と最大成長率との間に(A)の関係。赤い丸で囲んだデータ点はない基質利用に少しを示す成長曲線を表します。 (B)箱ひげ図表現最小の伸び率(<0.15 OD /時間)での成長曲線の分布に基づいて、成長閾値を定義します。 (C)分散及びGLの標準偏差は、基質D-ガラクトースについて計算されます。短い破線は、2つの標準偏差平均から離れ表す。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

highres.jpg "/>
精度と差別化を介して、図2のMAP検証。(A)、注釈付き構造(カプシド)および代謝のクローンの成長曲線(チオレドキシン)、2つの新規な代謝のクローン(EDT2440、EDT2441)、およびクローンの平均応答は、スクロース、D-上に成長させましたマップのガラクトースとD-マンノース。青い線は、レプリケート·データとの間に見られる標準誤差を示す(n = 3)でした。 (B)47の異なるクローンの成長曲線は、白糖、D-ガラクトースとD-マンノースのヒートマップとして表されます。注釈付き構造(緑色の丸)および代謝のクローン(オレンジ色の円)、2つの新規な代謝クローン(濃い水色の円)、平均応答(赤い円)がハイライトされている。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

PLOAD / 52854 / 52854fig3highres.jpg "幅=" 700 "/>
複数の基板を挟んで表現型については、図3のクローン分布。72カーボン特有の成長条件を横切る47個のクローンのための表現型クローン数。表は、各表現型についての直接のカウントを提供しています。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

図4
連続培養装置の構成を詳述する図4図(A)α-γ連続培養リアクターのポートを構築するために使用される手順は、(B)ステップは、(Cアウトフロー連続培養リアクターのポートと、を構築するために使用します)δと連続培養哺乳瓶のεポートを構築するための手順を。 = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/52854/52854fig4highres.jpg「ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

図5
提示phenomic方法の図5の比較。マルチ表現型アッセイプレートを調製するための(A)ワークフロー(MAP)の、連続的な文化やシリアル文化。 (B)は、平均の標準誤差(S M)の割合はカウントのための両方のn = 3およびn =メタボロミクスのための連続培養(CC)とシリアル文化(SC)の調製方法のための6サンプルサイズ。 y軸は対数スケールです。連続培養(CC)メソッドのQAパイプラインの実装前後の代謝産物あたり(C)変動係数の分布(CV)、。g5highres.jpg「ターゲット= "_空白">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

図6
連続培養で増殖させたクローンの図6.メタボロームプロファイル。代謝物のセットの中央代謝産物の存在量を連続培養で増殖さ84クローンについてプロットされています。注釈付き(カプシド)の構造および代謝のクローン(チオレドキシン)、2つの新規な代謝のクローン(EDT2440、EDT2441)、平均代謝反応のための代謝産物プロファイルは赤色で強調表示されている。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

化合物 カーボン 窒素 硫黄 リン
グリセロール - 0.40パーセント 0.40パーセント 0.40パーセント
塩化アンモニウム 9.5 mMの - 9.5 mMの 9.5 mMの
硫酸ナトリウム 0.250 mMの 0.250 mMの - 0.250 mMの
硫酸マグネシウム 1.0 mMの 1.0 mMの - 1.0 mMの
リン酸カリウム 1.32 mMの 1.32 mMの 1.32 mMの -
塩化マグネシウム - - * -
塩化カリウム 10 mMの 10 mMの 10 mMの 10 mMの
塩化カルシウム 0.5μM 0.5μM 0.5μM
塩化ナトリウム 5 mMの 5 mMの 5 mMの 5 mMの
塩化第二鉄 6μM 6μM 6μM 6μM
L-アラビノース 0.10% 0.10% 0.10% 0.10%
MOPSのpHは7.4 1X 1X 1X 1X

表1の化合物とのMAPで使用される異なる基礎培地の濃度。 *塩化マグネシウム、1.0 mMのは、置換されています。 1×MOPS = 40mMのMOPS、4 mMのトリシン。

L-リジン
炭素基質 窒素基質 硫黄基質 Phosphorus基質
2デオキシ-D-リボース 2-デオキシ-D-リボース 1-ブタンスルホン酸アデノシン-5- monophoshate
4ヒドロキシフェニル酢酸アセトアミドアセチルシステインベータ - グリセロリン
酢酸アデニン D-システイン creatinephosphate
アデノシン-5-一リン酸アデノシン D-メチオニン D-グルコース-6-リン酸
アドニトールアラントインジエチルジチオホスフェートジエチルジチオホスフェート
α-D-グルコースベータ - フェニルエチルアミン DL-エチオニン DL-α-グリセロリン
α-D-ラクトースビウレットグルタチオンリン酸カリウム
α-D-melebiose シチジンイセチオン酸ピロリン酸ナトリウム
クエン酸シトシン L-システイン酸ナトリウムチオリン
D-アラニン D-アラニン L-システイン
D-アラビノース D-アスパラギン L-ジエンコル酸
D-アラビトール -D-アスパラギン酸 L-メチオニン
D-アスパラギン D-システイン硫酸マグネシウム
-D-アスパラギン酸 D-グルコサミンメタンスルホン酸
D-セルビオース D-グルタミン酸 N-アセチル-DL-メチオニン
D-システイン DL-α-アミノ-N-酪酸 N-アセチル-L-システイン
D-フルクトース D-メチオニンカリウムテトラチオン D-ガラクトース D-セリンチオ硫酸ナトリウム
D-グルコサミン D-バリン sulfanic酸
D-グルコースガンマアミノ-N-酪酸タウリン
D-グルコース-6-リン酸グリシンタウロコール酸
D-グルタミン酸グアニジンチオ尿素
D-マンノースヒスタミン
D-ラフィノースイノシン
Dリボース L-アラニン
D-サリシン Lアルギニン
D-セリン L-アスパラギン
D-トレハロース L-シトルリン
D-キシロース L-システイン
ズルシトール L-グルタミン酸
グリセロール L-グルタミン酸
グリシン Lグルタチオン
I-エリスリトール L-ヒスチジン
イノシン L-イソロイシン
L-アラニン L-ロイシン
L-アラビノース L-リジン
L-アラビトール L-メチオニン
L-アスパラギン L-オルニチン
L-アスパラギン酸 L - フェニル - アラニン
L-システイン酸 L-プロリン
L-システイン L-ピログルタミン酸
L-フコース L-セリン; L-スレオニン
L-グルタミン酸 L-トリプトファン
L-グルタミン酸 L-バリン
L-イソロイシン N-アセチル-D-グルコサミン
L-ロイシンプトレッシン
チオ尿素
L-メチオニンチミジン
L-フェニルアラニンチミン
L-ピログルタミン酸チラミン
L-ラムノースチロシン
L-セリンウリジン
L-ソルボース
L-スレオニン
L-トリプトファン
L-バリン
Lキシロース
乳酸塩
ラクツロース
リンゴ酸塩
ミオイノシトール
シュウ酸
ソルビン酸カリウム
プロピオン酸
プトレッシン
キナ酸
ピルビン酸ナトリウム
コハク酸ナトリウム
スクロース
チミジン
キシリトール

MAP実験に使用される基板の表2にリスト。

Discussion

ここでは、推定上のファージ遺伝子の機能解析のためのphenomicアプローチを提示します。技術は、監視ホスト同化代謝可能な開発されたアッセイを含む、マルチ表現型アッセイプレート(マップ)、異化代謝に効果を測定することができるメタボロミクスの確立された方法に加えて。我々は、高スループット処理および分析24を可能にする、これらの技術に起因する大規模なデータセットを管理するための追加のツールを提供しました。最後に、注釈付きファージキャプシドタンパク質、ファージチオレドキシン、2つの推定代謝ファージ遺伝子、平均実験的応答を比較して、我々は、表現型の傾向や異常値の識別の識別に重点を置いて、データセットと遺伝子クラスの両方を解釈する様々な戦略を提案します。

述べたように、両方のアプローチを定量宿主代謝の半分のみを測定します。のいずれかの相対的な機能を解釈するために、調査中の新規タンパク質は、両方の方法からのデータは、機能の証拠を提供する必要があります。これが私たちの現在の原稿の焦点では​​ありませんが、各phenomicメソッドからのデータ出力は、ランダム森林や主成分分析などのクラスタリング手法に焦点を当てコンビナトリアル分析を通して置かれます。また、複合解析から得られた仮説は、その後、伝統的な遺伝的方法によって検証されなければなりません。

最後に、提示される方法は、頻繁に細菌生理学の影響を受けているため、同じ基準に従います。どちらの方法を実施する場合、考慮事項がで実験している独立した、クローングループを確保するためになされる必要があります。汚染が防止されます。単一の変数をテストしています。および適切な制御を同時に実行されています。これらの点を考慮しないと、任意の生理学的アッセイと同様の不明瞭な結果をもたらすであろう。

マルチ表現型アッセイプレート(MAP)の

MAPの開発は、( 図5Aおよび表1,2)は、現在利用可能な技術と比較して高いスループットと適応性アッセイを提供します。アッセイは、消耗品、機器、およびすべての微生物学研究室で利用可能な基本的な技術を使用しています。その後のデータ処理および分析のための計算パイプライン、PMAnalyzer 24の組み込みは、迅速なデータ解釈を確保します。また、アプローチの実験と解析の両方の側面が容易に調整することができるか、またはカスタマイズされた目的のために調整。データの大部分は、セクション4で概説フィルタリングを通過しなかった場合、例えば、一方が手動で問題を識別するために成長曲線を取捨選択することができます。問題は厳しいフィルタパラメータに起因して生じる場合は、スクリプトの調整を行うことができます。あるいは、問題が実験的プロセスに関連付けられている場合( すなわち、長期の縮合;不適切な細菌性セルの転送LSは、等)、追加の複製を容易に繰り返すことができます。

クエバス 24に記載されているように、PMAnalyzerは凝集性、自動化されたパイプラインとして構文解析し、解析スクリプトを実行するラッパー·スクリプトとして記述された単一のbashのプログラムです。すべてのスクリプトは、3回のデータ全体の各時点で中央値をとることにより、25℃でのGitリポジトリから自由にアクセス可能であり、その後、遅れ時間を得るためにロジスティック曲線、最大増殖速度、漸近線、および新規の用語、成長レベルをパラメータ化。中央値を大きく外れ値の影響を低減するために我々の研究において、平均の上に選択された、しかし、スクリプトが容易に複製データの平均値を計算するように適合させることができます。原因レプリケート·データ全体に見られる減少変化(SE)( 図2A)に、私たちはロジスティック曲線をフィッティングするためのPMAnalyzerにおける中央値の使用を維持しました。さらに、本研究では成長のためのカットオフ(GL≥0.4)はDETEましたデータは、成長レベルと最大増殖速度( 図1A、B)を横切って分離する方法と比較することによってrmined。楽器とモデル·システムに応じて、この再定義がカットオフ値を必要とする、この用語は変更になる場合があります使用しました。

私たちの分析の主な利点は、我々は成長レベル(GL)として定義し、全体的な微生物の増殖を特徴付ける単一のパラメータを使用して表現型を比較す​​る機能です。 GLは調和平均であるため、データの大きな外れ値の影響を軽減します。成長の概要を提供するために、シフトロジスティック当てはめ値との調和平均を使用することは試行錯誤に到着しました。他の方法は、成長が含ま区別しようとした:それがかかった時間は、特定の曲線パラメータ(半μmaxを、μMAX、及び運搬能力)、決意(R 2)の係数、および特定の曲線パラメータを乗じたR 2の組み合わせに到達します。シフトと調和平均を使用してGLのためのロジスティックフィット値は、このように、それが選択の方法となり、成長を評価する際に最大の範囲を提供しました。注意すべき検討事項は、動的な成長曲線パターンは、単一のパラメータまたはフィットモデルを使用する場合に失われる可能性を有することです。例えば、ロジスティック曲線とGLの個々の曲線のパラメータは、二相の成長を表現することができません。単一の炭素の環境では、成長のこの効果は、基質利用中の基板やシフトのいずれかの変換にウイルスタンパク質の仲介を意味します。複数の成長パラメータを考慮していないときに、潜在的に失われた追加の効果は、次のとおりです。長期の遅れ時間を、ウイルスの機械や製品の負担増を提案。急速に、対数期の加速エネルギー産生経路をホストするように結合されたウイルスタンパク質を示唆しています。バイオマス形成のまたはより高いレベル、ホスト栄養摂取及び同化(データは示していない)におけるウイルスのサポートを意味します。したがって、(新生増殖曲線をプロット

マップの構造および代謝遺伝子に寄与異なる応答を考慮するとき、それは、問題の異なる基板クラスがタンパク質機能の最大の証拠を提供することが観察されます。例えば、代謝性タンパク質は、多くの場合、中央代謝16,32をホストするために非特異的であり限定的な栄養素の買収に関連しています。 MAP予備実験は、中央代謝炭素源( 図2A)上に成長した時、推定代謝ファージ遺伝子を保有するクローンが増加誘導期を有することを明らかにする。逆に、ホストのエネルギーとのdNTPプールの大きな割合を必要と推定される構造遺伝子を担持するクローンは、セントの成長に偽陽性応答をもたらしますRALおよびアミノ酸代謝の炭素基質。顕微鏡で観察されたように、これは( 図2Aおよびデータは示さず)によるホストフィラメンテーションおよび/ ​​または封入体を生じる不溶性タンパク質の蓄積に起因する可能性が高いです。さらなる分析は、これらの予備的な結果を確認するために必要とされているが、MAPは、特異的ファージ遺伝子クラスの機能を仮定する相関表現型の応答を取得することが可能です。

未知のウイルスタンパク質の解明に加えて、MAPは、個々の細菌または細菌のコミュニティの機能および代謝の多様性を調査するための新規な資源です。 MAP成分が細菌の範囲の成長をサポートするために容易に改変するために設計されています。海洋、栄養要求性、及び嫌気性微生物を含みます。異なる細菌属は、マップでサポートすることができる前に、これらの取り組みを促進するために定義された基礎および前増殖培地は、追加または調整された化学種を必要とします。MAPのこの使用中のノートには、トリプトン、酵母エキス、ペプトンなどの成分の使用を禁止する、定義されたメディアを維持することです。

メタボロミクス

メタボロミクスの分野は、質量分析により同定し単離した代謝産物を含む代謝物データベースに依存します。ここで選択した中核施設では最大のメタボロミクスのいずれかのデータベースを持っています。他の人が前に私たちのホストに記録されていなかったしながら興味深いことに、我々の実験法から得られた代謝物の半分以上は、(〜65%)識別不能であった、 大腸菌は、(例としては、インドール3酢酸33、サリチル酸34、及びジヒドロ酸を35)。この事実は、植物代謝物、または調査中の特定のタンパク質に向けたデータベースの強いバイアスのいずれかに起因する可能性があります。それにもかかわらず、結果は、データ表現および分析のために利用可能な既知の代謝物の、限られた数です。府でトゥーレ、各種データベースを使用して複数のメタボロミクス法が大きく代謝産物のカバレッジを可能にするであろう。

本発明の新規なウイルスタンパク質を比較し、対比するとき現在、既知および未知の両方の代謝産物が使用されます。このアプローチを使用して、我々は機能的に類似のタンパク質を保有するクローンは、完全なメタボロームプロファイルで増加した類似性を共有すると仮定しました。予備メタボロミクス分析は、構造と代謝遺伝子は明らかに互いから分離しないしながら( 図6)を関連付けるか過剰発現された場合、それらの遺伝子は、ホスト上の同様の効果を発揮することが明らかになりました。例えば、本研究では、EDT2440とEDT2441で強調表示、推定代謝遺伝子と密接にキャプシド遺伝子クラスターを注釈付き。公的に利用可能な膜貫通トポロジーおよびシグナルペプチド予測プログラムを用いて調査の両方の推定上の代謝遺伝子は、単一の膜貫通ドメインを保有証拠を示しました。興味深いことに5番目のうち最初のクラスター·グループ(系統樹の最も左側の部分)で電子9クローンは、同じトポロジのプログラムを使用して、膜貫通ドメインを予測しています。さらなる調査が必要である、しかし、それは、これらのクローンの過剰発現の間に存在する代謝物が膜または構造負荷に起因する細胞ストレス応答と関連している可能性があります。この証拠は、メタボロミクスのデータは、ノイズの増加量を有しているが、この方法は、遺伝子のクラス内および間の両方、遺伝子の一般的な効果を区別する信号を強調することが可能であることを支持しています。この方法は、遺伝子機能の具体的な情報を抽出することができるかどうかを判断するには、代謝産物は、特定の代謝経路に分類しました。クローンは、単一の経路に特異的な代謝物に影響を与える場合である仮説は、その後、過剰発現した遺伝子は、その経路において活性です。私たちのメタボロミクスの品質保証·パイプラインの確立に先立って、予備データは、上にいることを明らかにしました過小評価D代謝産物は、それらが関連付けられている経路にほとんど情報を提供し、典型的には、「不明」であった(データは示さず)。前処理されたメタボロミクスデータは、しかし、代謝産物プロファイルの大部分が類似しており、唯一の未知および既知の代謝産物の存在量の選択された数は、インスタンスプトレシンおよびウラシル( 図6)のために、クローン間で異なることが明らかになりました。タンパク質機能の努力のより高い解像度を提供するために、実験的に機能的な特徴付けをベース代謝産物の「穴」を埋めるために使用することができる公知のファージ遺伝子、ファージに対する新規遺伝子を比較するために行われています。この技術を使用して、既知のウイルス遺伝子の割り当てられた機能は、未知の遺伝子の機能のためのリファレンスを提供します。それにもかかわらず、メタボローム解析の制限要因は、データベースのサイズと関連性があります。これらの制限を補正するために、本研究に関係づけメタボロミクスのデータベースを開発する必要があります。そのようなEのASKAコレクションに特定の代謝物のデータベースとその存在量として大腸菌クローンは、1つのORFは、36を過剰発現されます。 Lawerenceバークレー国立研究所の研究者がモデル細菌37の全体の変異体のライブラリーに特有の代謝物の最初の包括的なデータベースをコンパイルした場合、データベースの必要性の証拠は、2013年に提供されました。本研究では、表現型と遺伝子型との間に明確な接続を明らかに、特定の代謝産物の利用のために必要な遺伝子に新たな洞察を提供しました。

ツールとしてメタボロミクスを考えると、それは、処理体制は中核施設で追跡定義することが重要です。ほとんどの実験手順のアーティファクトは、使用の機器に関連する日々の分散です。現在までに、すべてのGC-MS分析は、各分析の実行に含まれる内部標準の使用を実装しています。しかし、プロジェクト固有の内部のサンプルの追加</ em>の実験のそれぞれの日には、追加の分散を削除しました。これらの考慮事項は、正規化の問題とバイアスを回避するために、早期に対処する必要があります。別の解決策は、同じマシン上の中核施設で、かつ単一のバッチ、任意の中核施設で利用可能なオプションとして、すべてのサンプルを処理することです。

この原稿に導入され、再調査し、両方のさまざまなツールは、新規の提供、機能未知のファージ遺伝子をスクリーニングし、特徴づけることを意味します。計算パイプラインの流線用いた実験手法の単純さと適応性は、これらの方法は、研究努力と幅広い分野に適用可能である保証します。私たちの目標は、ここに提示phenomicアプローチも同様に機能的に定義されていませんシステムに加えて、新規のファージタンパク質のさらなる研究を支援することです。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 µm Sterivex Filter Fisher Scientific SVGP01050 Millipore
0.22 µm Millex Filters Fisher Scientific SLGV033RS Millipore
0.22 µm SteriCap Filter Fisher Scientific SCGPS02RE Millipore
0.22 µm Omnipore membrane filters Millipore JHWP02500 Millipore
96-well micro-titer plates VWR 82050-764 Standard F-Bottom 96 well Microplates
2 ml 96-well plate Fisher Scientific
Adhesive seal plate film Sigma-Aldrich Z369667
2 L Nalgene square bottles Cole Parmer T-06040-70
125 ml Nalgene square bottles Cole Parmer T-06040-50
1/4 in. Panel mount lock nut, black nylon Cole Parmer EW-45509-04
Female Luer thread style panel mount to 200 Series Barb, 1/16 in. Cole Parmer EW-45500-30
Female Luer thread style panel mount to 200 series barb, 1/8 in. Cole Parmer EW-45500-34
Male Luer integral lock ring to 500 series barb, 1/16 in. ID tubing Cole Parmer EW-45505-31
Male Luer with lock ring x female Luer coupler Cole Parmer T-45508-80
Barbed bulkhead fittings, 1/4 in. OD Fisher Scientific 6149-0002
Sanipure tubing, 1/16 in. ID x 1/8 in. OD SaniPure AR400002
Sanipure tubing, 1/4 in. OD x 1/8 in. ID SaniPure AR400007
Variable flow mini pump (peristaltic pump) Fisher Scientific 13-876-1
Magnetic stirrer Velp Scientifica F203A0160
Forceps Fisher Scientific 14-512-141 Millipore* Filter Forceps
Multi-plate spectrophotometer plate reader Molecular Devices Analyst GT
Filter manifold Fisher Scientific XX10 025 02
Software:
Python version 2.7.5 http://www.python.org/
PyLab module http://wiki.scipy.org/PyLab
R version 3.0.1 http://www.r-project.org/
reshape2 library http://had.co.nz/reshape
ggplot2 library http://ggplot2.org/
Gene Composer PSI Tech Portal http://www.genecomposer.net
Services:
West Coast Metabolomics Center UC Davis http://metabolomics.ucdavis.edu
DNA 2.0 https://www.dna20.com

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