Phenomics הפאג: גישות פיזיולוגיות לאפיין חלבונים חדשים ויראלי

Immunology and Infection
JoVE Journal
Immunology and Infection
AccessviaTrial
 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Sanchez, S. E., Cuevas, D. A., Rostron, J. E., Liang, T. Y., Pivaroff, C. G., Haynes, M. R., Nulton, J., Felts, B., Bailey, B. A., Salamon, P., Edwards, R. A., Burgin, A. B., Segall, A. M., Rohwer, F. Phage Phenomics: Physiological Approaches to Characterize Novel Viral Proteins. J. Vis. Exp. (100), e52854, doi:10.3791/52854 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

חקירות נוכחי לאינטראקציות הפאג-מארח תלויות באקסטרפולציה ידע מהגנום (meta). מעניין לציין, 60-95% מכל רצפי הפאג לשתף אין הומולוגיה לחלבונים מבואר הנוכחיים. כתוצאה מכך, חלק גדול מהגנים הפאג הוא מבואר כהיפותטי. מציאות זו משפיעה במידה רבה את הביאור של שני גני חילוף חומרים מבניים ועזר. כאן אנו מציגים שיטות phenomic נועדו ללכוד את התגובה הפיזיולוגית (ים) של מארח נבחר במהלך הביטוי של אחד הגנים הפאג ידועים אלה. צלחות Assay רב-פנוטיפ (מפות) משמשות כדי לפקח על המגוון של ניצול מצע מארח והיווצרות ביומסה לאחר מכן, בזמן שmetabolomics מספק ניתוח דו-מוצר על ידי ניטור שפע המטבוליט וגיוון. שני כלים המשמשים בו זמנית כדי לספק פרופיל פנוטיפי הקשורים לביטוי של מסגרת אחת הפאג משוער קריאה פתוחה (ORF). תוצאות עבור נציג שני השיטות הן בהשוואה, highlighting הבדלי פרופיל פנוטיפי של מארח ביצוע או גני הפאג מבניים או חילוף חומרים משוערים. בנוסף, הטכניקות להדמיה וצינורות חישובית תפוקה גבוהה שאפשרו ניתוח ניסיוני מוצגות.

Introduction

וירוסים שמדביקים חיידקים (aka bacteriophage או הפאג) מוערכים להתקיים על יותר מ 10 31 וירוס כמו חלקיקים (VLPs) בעולם והמספר בכל אורגניזמים אחרים בסביבה 1,2. מחקר metagenomic הראשון חוקר את קהילות ויראלי כרוכות בסביבות ימיות התמקד בכימות המגוון ראה בתוך שבריר הנגיפי 3. בנוסף, ברייטברט ועמיתיו מצאו כי מעל 65% מרצפי הקהילה הנגיפיים משותפים לא הומולוגיה לכל רצפים זמינים במאגרי מידע ציבוריים. מחקרי metagenomic לאחר מצאו עדויות דומות: metagenomes ממשקעים ימיים בסן דייגו, קליפורניה מכילה רצפי ויראלי ידועים 75% 4; metagenomes מימות המלוחות של ים סלטון מכיל רצפי ויראלי ידועים 98% 5; וmetagenomes הקשורים אלמוגים מכילים 95 - רצפי ויראלי ידועים 98% 6. הצטברות זו של מידע unannotated הביאהחומר גנטי הפאג להיות "החומר האפל של היקום הביולוגי" 7.

אפיון גנטי של הפאג מסתמך על זיהוי דמיון רצף באמצעות השוואה מול מסדי נתונים חומצת גרעין וחלבונים קיימים. מכיוון שהמידע גנטי מקודד הפאג הוא בעיקר ידוע, שיטות המבוססת על הומולוגיה אינן יעילות. בתוך הגנום שלהם, בדרך כלל פאגים לקודד שלושה סוגים עיקריים גן: גני שעתוק ושכפול, גני חילוף חומרים, והגנים מבניים. גני השעתוק ושכפול (בכיתה I / II גנים 8) כוללים polymerases, primases, אנדו / Exo-nucleases, וקינאז. גנים אלה השמורים ביותר בשל חשיבותם בזיהום הפאג, תמלול ומשכפלים את החומר גנטי הפאג. polymerases הפאג קלות מזוהה באמצעות שיטות הומולוגיה רצף מסורתיות בשל השימור העולמי שלהם 9 והוכח לשמש כסמני פילוגנטי יעילים כמו 10.לעומת זאת, חילוף חומרים הפאג וגנים מבניים (כיתה השנייה / שלישי גנים 8) הם מסתעף יותר ויותר, ולעתים קרובות מבואר כגנים היפותטי.

גני טבולי הפאג להשפיע על יכולת חילוף חומרים של המארח ולא נדרשים בהכרח לשכפול נגיפי. גנים אלו, המכונים לעתים קרובות גני עזר כמו חילוף חומרים 11 (AMGs), מופיעים לווסת את חילוף החומרים של מארח ולאפשר התקדמות אופטימלית של זיהום והצלחה של התבגרות virion. AMGs נקשר עם הניצול והספיגה של חומרים מזינים הגבלה או במסלולי הפקת אנרגיה. כמה דוגמאות כוללות photosystem גנים שנמצאו בגנום של cyanophage השונים 12-16, גנים הקשורים לחילוף חומרים ומוסדרים על ידי פוספט 17,18, וניצול של מסלול פנטוז פוספט לביוסינתזה dNTP הפאג 18,19. לשם השוואה, גנים מבניים הם בין אמצע לסוף גנים הופקו במהלך הזיהום ולהשתנות על פני הפאג-הו שוניםמערכות st. הייצור של חלבונים מבניים תלוי בזמינות של dNTP הנגיפית, ובריכות אנרגיה לשעתוק, התרגום, והרכבתם 8. חלבוני קפסיד וזנב סיבים מבניים נחשבים כסוטים ביותר של כל הגנים מקודדי החלבונים הנגיפיים ונדרשים לייצור virion מוצלח. הסטייה שלהם מיוחסת בדרך כלל לתפקיד הפעיל שהם משחקים בעיצוב אבולוציה משותף-מארח וירוס 20. חלבונים מסתעפים, ללא קשר למעמד הגן, הם בקלות להתעלם בעת השימוש בטכניקות הומולוגיה ויישור רצף מסורתיות. מאמץ לתקן את המגבלות ראו בהשוואות רצף קפדניות הביא כלים ביואינפורמטיקה מסוגלים באמצעות מאפייני רצף כדי לקבוע עמותה, כגון רשתות עצביות מלאכותיות 21. רשתות עצביות מלאכותיות (Anns) לאפשר החיזוי של גנים מבניים וחילוף חומרים, לעומת זאת, דורש אימות ניסיוני במורד הזרם לאפיין ישירותתפקוד גן.

המטרה של כתב היד הזה היא לספק פרוטוקולי phenomic מסוגלים ניטור שני חילוף החומרים קטבולי ואנבוליים של חיידק מארח בביטוי של גן הפאג רומן, חזה תפקודי באמצעות Anns. תחום Phenomics, הביולוגיה קשורה עם פנוטיפים סלולריים, מבוסס היטב בביולוגיה מערכות כדי לסייע בחקירה של חלבונים עם פונקציה לא ידועה או pleiotropic. כלים Phenomic משמשים לקשר מידע פנוטיפי למידע genotypic. אנו משערים לגנים הפאג משוערים שתפקידם (ים) ניתן לקבוע דרך השפעות פיסיולוגיות מארח התבוננות בביטוי גני הפאג. כדי לחקור את ההשערה הזאת, שתי שיטות כמותיות נבחרו. צלחות Assay רב-פנוטיפ (מפות) שמשו כדי לפקח על ניצול מצע מארח והיווצרות ביומסה הבאה תוך metabolomics נמדד גיוון המטבוליט מארח ושפע יחסי בצמיחה בסביבה וספציפיתתנאים נפשיים. חלבונים מבניים וחילוף חומרים משוערים היו ביטוי יתר בEscherichia coli ותוצאות נציג משני הניסויים בהשוואה. טכניקות חזותיות רבות וצינורות עיבוד תפוקה גבוהה מוצגות כדי להקל על שכפול ניסיוני. לבסוף, שחזור והדיוק של השיטות שהוצגו הם דנו בהקשר של השפעות פיסיולוגיות צפויות לחלבון מבואר קפסיד וחלבון מטבולי הפאג, thioredoxin, בתוספת שתי AMGs משוער.

Protocol

1. הכנת פלייט Assay Multi-פנוטיפ מצעים (MAP), בסל מדיה, מדיה טרום צמיחה, והצפה

  1. לעשות 50 מיליליטר של 1.0 - מניות מצע של 1.25%.
    1. לפזר 1.0-1.25% (w / v) של מצע מוצק במים סטריליים (חום במידת צורך). סנן לעקר פתרונות עם יחידת 0.22 מיקרומטר סינון ומניות חנות ב RT. דוגמאות של מצעים המשמשים בניסויים אלה ניתנים בטבלה 2.
  2. הפוך 250 מיליליטר של תקשורת הבסיסית 3x עבור כל מעמדות המצע (פחמן, חנקן, גופרית וזרחן). מגבים (3-morpholinopropane-1-sulfonate) התקשורת הבסיסית מבוסס 22 מכילים את הדברים הבאים: מגבים 1x (40 מגבים מ"מ + 10 מ"מ tricine), 0.4% * גליצרול, 9.5 מ"מ NH 4 Cl *, 0.25 מ"מ נשא * 4, 1.0 מ"מ MgSO 4 *, 1.32 מ"מ K 2 HPO * 4, 10 מ"מ KCl, 0.5 מיקרומטר CaCl 2, 5 מ"מ NaCl, 6 מיקרומטר FeCl 3, ו -0.1% (w / v) L-arabinose ** (לוחות 1 ו -2) .
    הערה: * תרכובות אלה אינן כלולות בהתאם לתקשורת הבסיסית. לדוגמא, גליצרול 0.4% אינו משמש בתקשורת הבסיסית פחמן והגופרית בתקשורת בסיסית 1.0 מ"מ MgSO 4 הוא הוחלף על ידי 1.0 מ"מ MgCl 2. ** L-arabinose הוא ספציפי לאינדוקציה של וקטור pBAD אמרגן, pEMB11, שהפך לער - E. coli K-12 זן (BW 27,784) 23.
    1. להוסיף כל רכיב של מדיה הבסיסית לבקבוק סטרילי ולהביא פתרון לנפח. מערבבים היטב. עם יחידת 0.22 מיקרומטר מסנן, מסנן לעקר כל תקשורת בסיסית לבקבוק סטרילי.
  3. הפוך 500 מיליליטר של תקשורת מגבים מראש צמיחה. מגבים תקשורת מראש צמיחה מבוססת 22 מכילה את הדברים הבאים: מגבים 1x (40 מגבים מ"מ + 10 מ"מ tricine), גליצרול 0.4%, 9.5 מ"מ NH 4 Cl, 0.25 מ"מ 4 נשא, 1.0 מ"מ MgSO 4, 1.32 מ"מ K 2 4 HPO, 10 מ"מ KCl, 0.5 מיקרומטר CaCl 2, 5 מ"מ NaCl, ו -6 מיקרומטר FeCl 3.
    1. להוסיף כלרכיב של מדיה מראש הצמיחה לבקבוק סטרילי ולהביא לנפח. סנן לעקר עם יחידת מסנן 0.22 מיקרומטר, ולאחר מכן להוסיף אמפיצילין בריכוז סופי של 100 מיקרוגרם / מיליליטר. פתרון חנות ב 4 מעלות צלזיוס.
  4. הפוך 500 מיליליטר של 0.5x לוריא-Bertani (LB) צלחות אגר. לבקבוק סטרילי, להוסיף רכיבי LB לעשות ריכוז 0.5x (תמצית שמרים 1.25 גר ', 2.5 גר' NaCl, 2.5 tryptone גרם, 7.5 אגר ז). מערבבים היטב וחיטוי לעקר.
    1. אגר מגניב, ולאחר מכן להוסיף 100 מיקרוגרם / מיליליטר של אמפיצילין אנטיביוטיקה עם ערבוב. יוצקים ~ 25 מיליליטר של אגר לצלחות פטרי, תאפשר להגדיר, ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס עד צורך.
  5. הפוך 250 מיליליטר של 10 מ"מ טריס (pH 7.4) בתוספת 10 פתרון חיץ MgSO 4 מ"מ. סנן לעקר עם יחידה 0.22 מיקרומטר מסנן, ופתרון חנות ב RT.

2. הכנת תא-השעיה חיידקים

  1. הכן מושבות טריות. מ12.5% ​​מניות קפוא גליצרול, צלחת ה טרי coli clones על אגר 0.5x LB המכיל 100 מיקרוגרם / מיליליטר אמפיצילין. לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות.
  2. הכן תרבויות נוזלי:
    1. פיפטה 3 מיליליטר של תקשורת מראש צמיחה המכיל 100 מיקרוגרם / מיליליטר אמפיצילין לתוך צינורות תרבות. לכל שיבוט, להשתמש triplicates ביולוגי.
    2. לחסן מושבות עצמאיות מסעיף 2.1 לצינורות תרבות מוכנים. לדגור על 37 מעלות צלזיוס עם רעד במשך 22 שעות.
  3. גלולה ולשטוף תאי חיידקים:
    1. ההעברה O / תרבויות N ל1.7 מיליליטר צינורות microfuge. תאים גלולה באמצעות צנטריפוגה במהירות המרבית (16,900 XG) במשך 2 דקות בmicrocentrifuge. למזוג supernatant ולשטוף תאים על ידי מחדש השעיית ב500 μl של 10 מ"מ טריס / 10 חיץ מ"מ MgSO 4. חזור.
    2. להשעות מחדש מחדש גלולה תאים, supernatant למזוג ותאים ב 1 מיליליטר של 10 מ"מ טריס / 10 חיץ מ"מ MgSO 4.
  4. למדוד צפיפות תאים ולהתרכז תאים (במידת צורך):
    1. לדלל תאים מסעיף 2.3.3 פי 10 ב10 מ"מ טריס / 10 מ"מ MgSO 4 חיץ ולהעביר את זה לדילול קובט. למדוד צפיפות אופטית (OD ננומטר 600) של דילול זה ולהקליט.
    2. להתרכז תאים כדי להשיג ריכוז סופי של 0.07 (OD 600 ננומטר) במפות (התאים יהיו מדוללים פי 15 כאשר הם מתווספים למפות, ולכן תאים צריכים להיות בריכוז ראשוני של OD 600 ננומטר = 1.05). העבר את ההשעיה תא מרוכזת לתוך מאגר ולהציל (ב RT) עד שלב 3.5 של הכנת מפות.

3. הכנת צלחות Assay Multi-פנוטיפ (מפות)

  1. תווית מפות. צלחות לייבל סטרילי 96-גם מיקרו-כייל עם E. מספר זיהוי קולי שיבוט ומפה סכמטית סוג.
  2. מים סטריליים Aliquot לתוך מפות. העברת סביבה נקיה מחיידקי מים סטריליים למאגר נוזלים. פיפטה 60 μl לבאר כל צלחת מיקרו-כייל בעזרת פיפטה רבת-ערוצית.
  3. int תקשורת הבסיסית Aliquotמפות o. העברת הסביבה נקיה מחיידקי 3x תקשורת בסיסית למאגר נוזלים. פיפטה 50 μl לבאר כל צלחת מיקרו-כייל בעזרת פיפטה רבת-ערוצית. חזור על שלבים 3.2 ו -3.3 לכל אמצעי תקשורת בסיסית בשימוש בסכמטי MAP.
  4. מצעי Aliquot לתוך מפות. העבר את 30 μl של כל מצע לתוך הבאר המתאימה של המפות.
  5. להוסיף השעיה חיידקים למפות. העברה 10 μl של תאים חיידקיים מסעיף 2.4.2 לכל טוב של המפה בעזרת פיפטה רבת-ערוצית. לשנות טיפים לפני פיפטה החדרת מחדש בחזרה למניית התרבות.
  6. כיסוי מפות עם סרט דבק. כיסוי כל צלחת עם סרט דבק צלחת אחת. לחץ בחוזקה על גבי סרט הבארות של הצלחת ובשולים ליצור חותם אפילו והדוק. הסר סרט עודף מהקצוות של צלחת מיקרו-כייל בסכין גילוח סטרילי.
  7. למדוד צפיפות אופטית של מפות:
    1. הנח מפות שהוכנו בשרוול "הקלט" של Spectro רב-צלחתצלחת קורא פוטומטר. תוכנת צלחת פתוחה קורא וליצור פרוטוקול שמודד ספיגה (ננומטר OD 600) כל 30 דקות, עבור הסכום כולל של 32 שעות, עם 60 שניות של טלטול בין קורא.
    2. טמפרטורה שנקבעה במנגנון ל -37 מעלות צלזיוס. התחל פרוטוקול פעם מפות יש equilibrated להגדיר טמפרטורה.
    3. אחרי 32 שעות, להסיר את המפות מהשרוול "הפלט" של קורא הצלחת. לייבל כל קובץ טקסט נתונים לכלול: א מספר זיהוי שיבוט coli, מועד המפה רצה, והסוג סכמטי MAP.

4. צלחות Assay Multi-פנוטיפ עיבוד (מפות) וparameterization

  1. להעריך עקומות גדילה באמצעות תהליך בקרת איכות אוטומטית, למשל, 24 PMAnalyzer.
    1. יש לוודא שעקומות הגדילה ננומטר 600 OD <0.20 בשעה 2 הראשונה. אל תשתמשו בספיגה בנקודת הזמן הראשונית (t0) במסנן בשל ממצאים של עיבוי, אשר בדרך כלל לפתור ב1 t (30 דקות).
    2. הסר עקומות גדילה המפרות מסנן QA. שמור את מידע עקומה (שם מדגם, גם מספר, וOD 600 ערכי ננומטר) בקובץ פלט נפרד לשימוש עתידי. המשך עם ניתוח אם עקומת צמיחה עוברת סינון QA.
  2. חישוב עקומות גדילת חציון. באמצעות לשחזר נתונים, בכל טוב, לחשב את עקומת הצמיחה החציוני על ידי לקיחת צפיפות החציון האופטית (ננומטר 600 OD) ערך בכל נקודת זמן. שיא וכתוצאה מעקומות גדילה החציוני בקובץ פלט נפרד לשימוש עתידי.
  3. לחשב את המודל לוגיסטי ביותר המתאים לכל עקומת צמיחה באמצעות התאמה של המשוואה שהוצעה על ידי Zwietering 25. המשוואה לוגיסטית כוללת שלושה פרמטרים המתארים את צמיחת חיידקים: זמן ההשהיה, λ (HR), השיעור המרבי של צמיחה, μ מקסימום (OD 600 100 ננומטר -1), והתשואה ביומסה הסופית, α (OD 600 ננומטר). להשתמש בנתונים בזמן = 30 דקות (y 1) כ ערך ראשוני עקב ממצאים של עיבוי.
    משוואת 1 [1]
    1. לחשב את שיעור הצמיחה המרבי באמצעות חיפוש ישיר. רשום את השיעור הגדול ביותר של שינוי לאורך מרווח 90 דקות בתוך הנתונים.
      משוואה 2 [2]
    2. לאמוד את התשואה ביומסה הסופית על ידי חיפוש הערך האסימפטוטי העליון של הממוצע נע הגדול מעל חלון 90 דקות. באופן ספציפי, מגדיר כאסימפטוטה של ​​עקומת הצמיחה.
      משוואה 3 [3]
    3. שימוש במקסימום μ וערכים מ4.3.1 ו4.3.2, למצוא את ערך λ ידי מנסה כל λ הערכים:
      משוואה 4 [4]
      1. להשתמש בכל ערך λ לחשב סכום של שגיאה בריבוע (SSE). השתמש בSSE הנמוך ביותר הוא SSE (λS):
        /files/ftp_upload/52854/52854eq5.jpg "/> [5]

5. ניתוח הפנוטיפ של מפות

  1. לחשב את רמת הצמיחה (GL) עבור כל עקומת צמיחה להעריך את הצמיחה הכוללת לשיבוט למצע. הגדר GL כממוצע ההרמוני של הערכים מצויד לוגיסטיים השתנו:
    משוואה 6 [6]
  2. הקצאת פנוטיפ לכל עקומת צמיחה המבוססת על ערכי GL. כאן, פנוטיפים ארבעה משמשים הם: צמיחה צפויה, אין צמיחה, רווח של פונקציה, ואובדן התפקוד.
    1. לקבוע פנוטיפים ידי השוואת צמיחה בכל השיבוטים על מצע ספציפי במונחים של סטיות תקן מהממוצע. השתמש נתון זה וסף צמיחה מינימאלי לייעד את הפנוטיפ שהוצג על ידי עקומת הצמיחה (איור 1 א ', ב'). תרשים 1C מספק דוגמאות למשימת פנוטיפ.
    2. הגדר צמיחה כGL ≥ 0.4 (Figur1A דואר, ב '). להגדיר רווח של פונקציה (איור 1 ג, ירוק) כבעל GL> שתי סטיות תקן מעל הממוצע וממוצע> סף הצמיחה. אובדן התפקוד (איור 1 ג, אדום) מוגדר כבעל GL <שתי סטיות תקן מתחת לממוצע וממוצע> סף הצמיחה.
  3. צור ייצוגים חזותיים של ערכת הנתונים מבוססת על פנוטיפים ועקומות גדילה.
    1. דינמיקת צפה צמיחה מתארת ​​OD 600 ננומטר ערכים כמו צבע כדי להשוות במהירות בין עקומות גדילת שיבוטים המרובים (איור 2).
    2. צפה הפצות פנוטיפי בין כל הכפילים המבוססים על תנאי גידול (איור 3).

6. בנה את מתקן התרבות הרציף

  1. בניית נמל כור (איור 4 א, ​​ב). לקדוח שלוש 1/4 ב. חורים, במרווחי 3/4 ב. בנפרד, בכובע של כור התרבות הרציף.
    1. FOα נמל r: לדפוק פנל בסגנון חוט luer נקבת הר ל1/16 בעקיצה מהחלק התחתון של הכובע עם העקיצה כלפי מעלה, מתוך הכובע.. עקיצה מאובטחת עם 1/4 ב. הרכבה בלוח אגוז מנעול.
    2. לβ נמל: לדפוק פנל בסגנון חוט luer נקבת הר ל1/16 בעקיצה עם העקיצה כלפי מעלה, מתוך הכובע.. עקיצה מאובטחת עם 1/4 ב. הרכבה בלוח אגוז מנעול.
    3. לγ נמל: לדפוק פנל בסגנון חוט luer נקבת הר ל1/16 בעקיצה מהחלק התחתון של הכובע כל כך העקיצה מצביעה למעלה, מתוך הכובע.. עקיצה מאובטחת עם 1/4 ב. הרכבה בלוח אגוז מנעול. בורג luer גברי עם טבעת נעילה נפרד ל1/8 ב. צינור נשא רחב לעקיצה הולמת בחלק הפנימי של הכובע.
    4. לנמל יצוא: לקדוח חור ב5/16 בסימן 75 מיליליטר של כור התרבות הרציף.. חותך 3/4 ב. את סוף האגוז של 1/4 ב. ראוי מחיצת תיל. בורג ב1/4 ב. ראוי מחיצת תיל (אטם הוא בצד החיצוני של הבקבוק והאגוז הוא בצד הפנימי, Figure 4B).
  2. בניית האכלת נמל בקבוק (איור 4C). שני 1/4 ב. לקדוח חורים במרווחי 1 ב. מלבד בכובע של בקבוק ההאכלה.
    1. לδ הנמל: לדפוק פנל בסגנון חוט luer נקבת הר ל1/8 בעקיצה עם העקיצה כלפי מעלה, מתוך הכובע.. עקיצה מאובטחת עם 1/4 ב. הרכבה בלוח אגוז מנעול.
    2. לε הנמל: לדפוק פנל בסגנון חוט luer נקבת הר ל1/16 בעקיצה עם העקיצה כלפי מעלה, מתוך הכובע.. עקיצה מאובטחת עם 1/4 ב. הרכבה בלוח אגוז מנעול.
      1. בורג luer גברי עם טבעת נעילה נפרד ל1/8 ב. צינור נשא רחב לעקיצה הראויה, בחלק הפנימי של הכובע.
  3. האכלת צינורות והרחבות צינור:
    1. חותך שתי 1 ב. חתיכות של צינורות (1/8 ב. קוטר חיצוני (OD) x 1/16 ב. קוטר הפנימי (ID)). חתיכות תתאמנה ליציאות α γ ושל כור התרבות הרציף שנעשה בסעיף 5.2.
    2. חותך 1 יחיד ב. חתיכת tubing (1/4 ב. OD x 1/8 ב. ID). חתיכה תתאים לΒ נמל כור התרבות הרציף.
    3. חותך 3.5 יחידים ב. חתיכת הצינור (1/8 ב. OD x 1/16 ב. ID). להתאים חתיכה לחלק הפנימי של γ יציאה זו, על luer הגברי עם טבעת נעילה נפרד ל1/8 ב. צינור נשא רחב. γ הנמל הוא נמל הדגימה של כור התרבות הרציף.
    4. חותך 1 יחיד ב. חתיכת הצינור (1/4 ב. OD x 1/8 ב. ID). להתאים חתיכה ביציאת δ של בקבוק ההאכלה זה.
    5. חותך 11 בודדים ב. חתיכת הצינור (1/16 ב. OD x 1/8 ב. ID). להתאים חתיכה לחלק הפנימי של ε נמל בקבוק ההאכלה זה, על luer הגברי עם טבעת נעילה נפרד ל1/8 ב. צינור נשא רחב.
    6. חותך שתי 18 ב. חתיכות של צינורות (1/8 ב. OD x 1/16 ב. ID). להתאים חתיכה אחת לנמל ε של בקבוק ההאכלה. שמור את החתיכה לסעיף 7 האחרות.

7. הפעלת תרבויות רציפות לMetabolomics

  1. לעקר חומרים:
    1. Autoclaיש חומרים יבשים למשך 30 דקות. הקפד לעטוף כובע של בקבוק ההאכלה שנעשה בסעיף 5 ברדיד אלומיניום. שמור ישר צינורות מחוברים.
      1. לעטוף כובע של כור התרבות הרציף, שנעשה בסעיף 5, בנייר אלומיניום. שמור ישר צינורות מחוברים. לעטוף 18 ב. חתך צינורות בסעיף 6.3.5 ומתאם צינור משאבת peristaltic הקטן ביותר ברדיד אלומיניום. שמור ישר צינורות. החיטוי במשך 30 דקות.
    2. הפוך 2 ליטר של מרק 0.5x LB. בבקבוק ההאכלה, להפוך את מרק LB 0.5x. לכסות האכלת בקבוק בנייר כסף. החיטוי במשך שעה 1.
    3. הפוך 70 מיליליטר של מרק LB 0.5x. יוצקים מרק לתוך כור התרבות הרציף. הנח בר סערה בכור התרבות הרציף. לכסות בנייר כסף וכור החיטוי למשך 30 דקות.
  2. הגדרת תרבות רציפה:
    1. תא-השעיה חיידקים.
      1. מ12.5% ​​מניות קפוא גליצרול, צלחת ה טרי שיבוטים coli על אגר 0.5x LB המכיל 100 מיקרוגרם / מיליליטר אמפיצילין. דגירהב 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות.
      2. לחסן מושבה אחת ל 3 מיליליטר של מרק 0.5x LB המכיל 100 מיקרוגרם / מיליליטר אמפיצילין. לכל שיבוט להשתמש triplicates ביולוגי. לדגור על 37 מעלות צלזיוס עם רעד במשך 22 שעות.
    2. לחבר את החלקים יחד.
      1. מניחים את כל חומרי autoclaved לארון בטיחות ביולוגי ולהפוך את אור אולטרה סגול בזמן שתקשורת מתקררת. ברגע שהתקשורת התקררה, להוסיף 0.1% L-arabinose ו -100 מיקרוגרם / מיליליטר אמפיצילין לכל מרק 0.5x LB.
      2. לגולל כובע כור התרבות רציף ולדפוק על הכור. הימנע מלגעת בצינור הדגימה. לגולל את הפקק של בקבוק האכלה ולדפוק על בקבוק ההאכלה. הימנע מלגעת בצינור הדגימה.
      3. שמור 18 ב. צינורות מחוברים ליציאת ε סטרילי. Un-לעטוף 18 ב. צינורות ומתאם צינור משאבת peristaltic.
      4. להתאים קצה חופשי של 18 ב. צינורות על קצה אחד של מתאם צינור משאבת peristaltic. התאם את הקצה השני של מתאם צינור משאבת peristaltic ל18 ב. צינורות מחוברים ליציאת ε של הפקק של בקבוק האכלה.
      5. בורג 0.22 מיקרומטר יחידות סינון על יציאות β וδ של כור התרבות הרציף. בורג יחידה 0.22 מיקרומטר לסנן על המתאם של α נמל. ליחידת המסנן 0.22 מיקרומטר, להתאים את הקצה החופשי של 18 ב. צינורות.
    3. התחל התרבות רציפה.
      1. בשכונה הבטיחות הביולוגית, לחסן כור התרבות הרציף עם של O / תרבות N 100 μl עשה בסעיף 7.2.1.1.
      2. מערכה לפני שעבר התרבות רציפה לתוך 37 ° C חממה. בחממה יש צלחת ומערבבים מגנטית ומשאבת peristaltic מיני להגדיר.
      3. התאם את מתאם צינור משאבת peristaltic למשאבה peristaltic. צינורות מבקבוק ההאכלה מתחיל ב" בצד "וצינורות מובילים לכור מתחיל בצד" מתוך ".
      4. הגדר את משאבת peristaltic ל: "מהיר". התחל משאבת peristaltic על ידי מעבר לR20; קדימה ". בדוק שתקשורת מתחילה לזרום דרך צינורות.
      5. מניחים על צלחת ומערבבים כור מגנטית ולהתחיל ערבוב. כור התרבות רציף חייב לאזן במשך 24 שעות לפני הדגימה.
    4. דגימה של התרבות רציפה. בורג מזרק לוק 5 מיליליטר luer על γ נמל ולמשוך את 4.5 מיליליטר של התרבות.
      1. השתמש 500 μl של התרבות למדוד את הצפיפות (ננומטר 600 OD). לדלל תאים להפוך 4 x 1 מיליליטר תרבויות בננומטר 600 OD = 0.35.
      2. Aliquot מדולל תרבויות לתוך 1.7 מיליליטר צינורות microfuge. חזור על דגימת כל 12 שעות במשך 4 ימים.
    5. הכן דגימות לGC-TOFMS:
      1. תאים גלולה באמצעות צנטריפוגה במהירות מקסימלית (16,900 XG) במשך 2 דקות. supernatant למזוג. לשטוף את התאים עם 500 μl של נאגר מלוח פוספט (PBS). חזור על שלב זה.
      2. למזוג supernatant בפעם אחרונה, ולאחר מכן לצלול צינורות microfuge עם תאי טבליות בחנקן נוזלי עד מבעבע עצירות. Sקרע דגימות במקפיא -80 מעלות צלזיוס.

8. הפעלת תרבויות אצווה מעבר סידוריים לMetabolomics

  1. הכנת תא השעיה חיידקים. מ12.5% ​​מניות קפוא גליצרול, צלחת ה טרי coli שיבוטים על אגר 0.5x LB המכילים 100 מיקרוגרם / מיליליטר אמפיצילין. לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות.
    1. לחסן מושבות בודדות לתוך 3 מיליליטר של מרק 0.5x LB המכיל 100 מיקרוגרם / מיליליטר אמפיצילין. השתמש triplicates ביולוגי לכל שיבוט.
  2. תרבויות אצווה מעבר סידורי.
    1. O תת / N מ8.1.1 באמצעות דילול 500 פי 3 למ"ל של מרק LB המכיל 50 מיקרוגרם / מיליליטר אמפיצילין ו -0.1% L-arabinose. תת-תרבות צריכה ננומטר OD 600 <0.005. לדגור על 37 מעלות צלזיוס עם רעד.
    2. בדוק צפיפות אופטית (OD ננומטר 600) ב 2 ו 2.5 שעות. לגדל תאים להשיג OD 600 ננומטר = 0.35.
      1. תת-תרבות באמצעות di 500-פיlution ל 3 מיליליטר של מרק LB המכיל 50 מיקרוגרם / מיליליטר אמפיצילין ו -0.1% L-arabinose. תת-תרבות צריכה ננומטר OD 600 <0.005.
    3. בדוק צפיפות אופטית (OD ננומטר 600) ב 2 ו 2.5 שעות. לגדל תאים להשיג OD 600 ננומטר = 0.35.
  3. דגימת תרבויות אצווה מעבר סדרתי.
    1. בעזרת מלקחיים סטריליות, למקם מסנן 0.22 מיקרומטר קרום על גבי סעפת מסנן. Aliquot 1 מיליליטר של בופר פוספט (PBS) על גבי נייר הסינון ולאחר מכן להפעיל את משאבת ואקום.
    2. חזור על תוספת של 1 מיליליטר של PBS. העבר 1 מיליליטר של תת-תרבות מסעיף 8.2.3 על גבי נייר הסינון. מכאן, לנוע במהירות כדי לקבל דגימות לתוך חנקן נוזלי באופן מיידי. השלם זה בדקות 1.
    3. 1 מיליליטר aliquot של PBS על נייר מסנן לשטוף מדגם. לשטוף במהירות מבלי לשפוך מדגם על צדדים של נייר סינון. חזור.
    4. בעזרת מלקחיים סטרילית מסנן מקום לתוך צינור microfuge 1.7 מיליליטר על ידי הקיפול אלחוטי בזהירותניטור ארוך טווח. לצלול צינור microfuge בחנקן נוזלי עד מבעבע עצירות. מדגם חנות במקפיא C -80 °.

9. המטבוליט ניתוח & עיבוד

  1. ספינה 3 דגימות לשיבוט על קרח יבש למתקן גרעין metabolomics לעיבוד מדגם, ניתוח ונורמליזציה של GC-TOFMS.
  2. עבור כל דגימה לקבוע את הממוצע, חציון, הסטייה ומקדם סטנדרטיים של וריאציה על פני מטבוליטים, תוך שימוש בנתונים לשכפל.
  3. לניתוח סטטיסטי, קוד באופן ידני צינור QA באמצעות הצהרות מותנות והוצאות להורג חוזרים 26 כדי להסיר מטבוליטים שלא פעלו בתנאים מוגדרים.
    1. ל1 מצב, להסיר מטבוליטים שביש יותר מ -2 דגימות אפס שפע. הסר סטנדרטים פנימיים מפרופילי metabolomic.
    2. למצב 2, להסיר אותם מטבוליטים שאינם נמצאים בתאים של עניין. כאן, להסיר את מטבוליטים הבאים: 3 אצטט אינדול, dihydroabiet חומצת IC, חומצת nonadecanoic, חומצה סליצילית, salicylaldehyde, כולסטרול, פנול, 1-monostearin, octadecanol, 1-monopalmitin, dodecane, dodecanol, 1-hexadecanol, 5-methoxytryptamine, חומצת benzoic, חומצת pentadecanoic, חומצה זרחתית, חומצת pelargonic, palmitic חומצה, חומצת capric, hydroxylamine, חומצה סטארית, חומצת myristic, maleimide, levoglucosan, וחומצת 4-hydroxybutyric.
    3. למצב 3, להסיר אותם מטבוליטים המקדם שהווריאציה שלהן הוא מעל 1.
  4. ללכוד השפעות metabolomics העולמיים ע"י הסתכלות בשכיחותם היחסית המטבוליט.
    1. צור ייצוג חזותי של שפע המטבוליט החציונית לשיבוט לכל המטבוליט (איור 6).
  5. לזהות חריגים על ידי התבוננות תדרי זוג שיבוט-המטבוליט.
    1. לחשב את ציון Z עבור כל ערך החציוני של כל המטבוליט בשיבוט. חישוב ציוני Z באמצעות המשוואה הבאה:
      /52854/52854eq7.jpg "/> [7]
      הערה: טווח X MC מייצג את רמת השפע של המטבוליט ספציפי לשיבוט ספציפי. μ הטווח C מייצג את הממוצע של כל השיבוטים להמטבוליט ספציפי. C σ הטווח הוא סטיית התקן קשורה.
    2. צור ייצוג חזותי של נתונים שבחריגים מודגשים (נתונים לא מסופקים).

Representative Results

כל הדגימות ששמשו לקביעת המסגרות פתוחות הקריאה (ORFs) נבחרו במחקר זה נאספו מסטארבק איילנד, אתר 7 (STAR7) וקרוליין אטול, אתר 9 (CAR9) של איי הקו הדרומיים. של מי ים מהאתרים האלה 100 L מוערך נאסף מתחת למשאבות ספנו באמצעות שכבת גבול האלמוגים, כפי שתואר לעיל 5. תוכן של המשאבות היו כפוף לפיצול דרך מסננים התעמקו גדולים כדי להסיר אאוקריוטים קטנים ולאחר מכן מרוכז באמצעות 100 זרימה משיקה מסנני kDa משאיר רק חיידקים ונגיפיים כמו חלקיקים (VLPs). כדי להפריד את VLPs, מי ים שנותר הועבר דרך 0.45 מיקרומטר מסננים וכתוצאה מכך virome. כלורופורם הוצג לשבריר נגיפי זה לעצור את הצמיחה של כל תאים הנותרים ומאוחסן על 4 מעלות צלזיוס.

VLPs היו מטוהר בשיטת צזיום כלוריד, שבו הדרגתיים בצפיפות להפריד באמצעות צנטריפוגה ולאפשר להתאוששות של virיונים ב~ 1.35 גר '/ מיליליטר 1.5 גר' / מיליליטר 3. ה- DNA הנגיפי הופק באמצעות CTAB / פנול: פרוטוקול כלורופורם ומוגבר באמצעות הגברה עקירה מרובה באמצעות ריאגנטים Phi29. רצף של virome הושג עם טכנולוגית pyrosequencing זמינה מסחרי.

ביואינפורמטיקה משמשת בעיבוד והבחירה של ORFs הנגיפי למחקר זה היא כדלקמן. שלושה שלבי עיבוד מראש שמשו בmetagenomes הנגיפי CAR9 וSTAR7. ראשית, תוכנה ציבורית משמשת להסרת רצפי תג שנבעו מהגברה של ה- DNA הנגיפי לפני רצף 27. שני, חפצי רצף נפוצים כגון כפילויות רצף ועותק נמוך מספר סוננו מתוך בסיס הנתונים באמצעות תכנית ביואינפורמטיקה נוספת 28. לבסוף, הסרת זיהום רצף זר 29 בוצעה עבור אלה רצפים ש≥ כיסוי 90% ו≥ זהות 94% עם רצפים במאגרי המידע הבאים: RefSeq נ 'הגנום אירוס; אדם - התייחסות GRCh37; אדם - סלרה; אדם - קרייג ונטר (HuRef); אדם - סאונג-ג'ין קים (קוריאנית); אדם - כרומוזום 7 גרסה 2 (TCAG); ואדם - ג'יימס ווטסון, Yanhuang (י"ח; אסיה), יורובה (NA18507; אפריקה) רצפי התייחסות 21. בעקבות תהליכים אלה, רצפים מדגימות CAR9 הסתכמו 591600 ורצפי STAR7 הסתכמו 939311. רצפים אלה הועלו על MGRAST והורכבו באמצעות תוכנת מאסף באמצעות הגדרות ברירת מחדל. Contigs תורגם ל6 מסגרות קריאה ומסגרות קריאה פתוחות המשוערות (pORFs) זוהו באמצעות סקריפטים, כפי שתואר בעבר 21.

לזהות ORFs לא ידוע מספר חיפושי דמיון מבוסס בוצע כדי להסיר ORFs של פונקציה ידועה. בקצרה, החיפושים הבאים בוצעו עם קריטריוני החיפוש המקביל שלהם 21:

  1. דמיון משמעותי של ≥ זהות 95% מעל ≥זוג 40 בסיס (נ"ב) על ידי MGRAST בלאט באתר M5NR.
  2. דמיון משמעותי (e-ערך ≤ 0.001) על ידי TBLASTN נגד כל metagenomes הציבור במשאב מסד Metagenome שלי.
  3. דמיון משמעותי (e-ערך ≤ 0.001) על ידי BLASTP וTBLASTN נגד בסיס הנתונים ע"נ.
  4. דמיון משמעותי (e-ערך ≤ 0.001) על ידי RPS-תפציץ נגד המאגר נשמרים דומיין.
  5. תרגומי חלבון מחלק נבחרים של כל בסיס נתוני השוואה נגד מבנים חלבוניים פתרו בחלבון נתוני הבנק.
  6. חישוב תדרי dinucleotide באמצעות חבילת dinucleotide חתימות.

PORFs כתוצאה נועדו לביטוי בE. coli באמצעות תוכנת עיצוב גן זמינה בפומבי. חזור-תרגום של רצפי חומצות אמינו מועסק טבלת שימוש האוניברסלי קודון תוכננה כדי להכיל ביטוי בE. coli עם סף שימוש מינימאלי של 2%. רצף הכרת אנזים הגבלה ים לBamHI וHindIII הוצאו מהרצפים כדי להקל על שיבוט. חברה מחוץ מסונתזת הגן המהונדס רצפי 30 ולאחר מכן ORFs היה משובט לתוך וקטור אמרגן pBAD המספר בינוני עותק, pEMB11, באמצעות שיבוט אנזים הגבלה סטנדרטי. כל השיבוטים הפכו לE. coli K-12 זן BW 27,784 23.

צלחות Assay רב-פנוטיפ (מפות)

צינור תפוקה גבוהה ותוכנה חזקה היה ממונף לניתוח של המפות, 24 PMAnalyzer. הצינור פותח בסביבת שרת לינוקס ומבצע צעדים שונים, כולל: ניתוח של קבצי צפיפות אופטיים, עיצוב נתונים לתוך קבצי טקסט קריאים, עיבוד מראש של עקומות גדילה לאבטחת איכות (QA), וביצוע טכניקות מודלים מתמטיות לניתוח עקומות גדילה . תסריטי הדוגמנות העיקריים פותחו בגרסת 2.7.5 פייתון לעשות שימוש במודול PyLab.

ss = "jove_content"> מפות שחזור הוערך באמצעות השגיאה סטנדרטית (SE) עבור נתונים לשכפל (איור 2 א). עקומות גדילת גלם הושוו לעקומות גדילה לוגיסטית כדי לקבוע אם גידול שיבוט מדויק פרמטרים ומודל התכנית PMAnalyzer במהלך ניסויים (מידע לא מוצג). למידע נוסף על הדיוק ותוקפו של המפות וPMAnalyzer לראות Cuevas et al. 24

בעקבות אימות של השיטה, נתוני מפות נותחו באמצעות מספר רב של פרמטרים, כגון שיעור מרבי צמיחה (מקסימום μ) ורמת צמיחה (GL), המסופקים על ידי צינור העיבוד. הדמיה השוואתית של עקומות גדילה משמשת לעתים קרובות לפרשנות נתוני צמיחה; עם זאת, יש מספר העיקולים שניתן דמיין בזמן להשוואת מגבלות. כדי לנתח עקומות גדילה רבות בו זמנית, מגרשים נגזרו מפת החום היו הפצירו להשוות עשרות שיבוטים גדלו על substrat אחתדואר נגד התגובה הממוצעת ש'התנאים (איור 2). ההשפעה שהונחה על ידי ביטוי יתר של חלבון הפאג רומן נצפתה באמצעות שינויים בפרמטרים עקום, במיוחד: לפגר שלב, שלב מעריכי והתשואה המקסימלי ביומסה (אסימפטוטה). כדוגמא, הטיפוס התלול משלב פיגור לשלב מעריכי מודל בעקומת הצמיחה לחלבון capsid (איור 2 א) הוא מיוצר בשינוי מהיר בעוצמת צבע משחור ללבן לאותו שבט בעלילה הדינמית של איור 2 .

כדי לקבל תמונה גלובלית של הפצת שיבוט פני מצעים, סיווגים פנוטיפי הנגזרים מGL שמשו (איור 3). הנה, ארבעה פנוטיפים נפרדים לארבעה תרשימים שבו הגובה של כל בר מייצג את מספר השיבוטים מוצגות פנוטיפ שלמצע מסוים. חריגים בנתונים מוכרים כשיבוטים נופלים לתוך "הרווח של פוnction "או" אובדן הקטגוריה פונקציה ". אז יכול להיות ביקש חריגים החוצה בנפרד ונחקר באופן הדוק יותר בניסוי. בנוסף, ניתוח הגלובלי מכיר הטיות מצע בassay. מצעים כגון פנילאלנין, חומצת מאלית, וגליצין הביאו סיווג "אין צמיחה". מצעים שנופלים באופן עקבי ללא סיווג צמיחה, בכל השיבוטים, אינם משוקללים בכבדות באפיון פונקציונלי במורד הזרם.

Metabolomics

מוצרי קטבולי משיבוטים לבטא גני הפאג ידועים זוהו באמצעות metabolomics. בקצרה, שיבוטים גדלו תחת או תרבות רציפה או מעבר סידורי בסביבת התרבות אצווה לפני שנשלח לניתוח GC-TOFMS במתקן גרעין metabolomics. לפרטים על עיבוד מדגם, ניתוח, ונורמליזציה לGC-TOFMS מיושם על ידי מתקן הגרעין בחר לראות Fiehn et al. 31 Briefly, 1 מיליליטר של מיצוי ממס קר מתווסף לכל דגימה, לאחר שדגימות vortexed וsonicated באמבט קר למשך 5 דקות. דוגמאות סוף סוף centrifuged והמחצית מהמדגם יצק ומיובש מטה לניתוח. תמציות הן מטוהרים וזנק עם סמני אינדקס השימור פנימי לפני שהועמס על גז כרומטוגרף ולאחר מכן הועברתי לאחר מכן לספקטרומטר המסה. נתונים מכל מדגם מנותח כך שעוצמות אות לכל האותות שזוהו בchromatogram מדווחים. לנורמליזציה, השפע של פסגות עבור כל מדגם סיכם וכוללת שכיחות שיאם בממוצע בין כל הדגימות בסט. שכיחות המטבוליט לדגימה מחולקת על ידי שפע השיא של המדגם ולאחר מכן מוכפלת בשפע השיא הממוצע של קבוצת המדגם. את הנתונים המתקבלים משמש לניתוח metabolomics במחקר דן.

אימות של שחזור metabolomics נדרשהלקבוע את גודל המדגם המתאים לכל שיטת culturing. כדי לזהות את הדיוק ראה בדוגמאות והווריאציה ראתה פני מדגם גדלי שגיאת התקן של הממוצע (S M) לשני n = 3 וn = 6 מערכי נתונים נסקרו (איור 5). ללא קשר לגודל מדגם התרבות רציפה (CC), פחות מ -1% מהנתונים שM S ≤ 1.5. חציון S M של היו 221 ו -300, והערכים נעו בין 0 x ל7.55 10 5 ו3.74 x 10 5, עבור n = 3 וn = 6 בהתאמה. S M של גם חושבו עבור כל קבוצה של מדגם משכפל בשיטת התרבות הסידורי (SC). שוב, פחות מ -1% מהנתונים שM S ≤ 1.5, S M החציוני של 137, ומגוון 0-3.51 x 10 5. כדי להשוות את הפצות S M בין כל סט מדגם (CC n = 3 לעומת . CC n = 6, CC n = SC 3 לעומת n = 3, וCC n = 6 לעומת SC n = 3) מבחן תמורה בוצע. Distribution של שתי התרבות רציפה S M ערכי בסיס הנתונים לא היה שונה באופן משמעותי מהפצת ערכי התרבות סידורי S M (p-value = 0.0). עם זאת, חלוקת ערכי S M לתרבות רציפה n = 3 הנתונים הייתה שונה באופן משמעותי מזה של ערכי S M לתרבות הרציף n = 6 נתונים (p-value = 1.908804 x 10 -49). לבסוף, מקדם שונה להמטבוליט הושווה לפני ואחרי יישום צעד אבטחת איכות (QA) (איור 5 ג). בסך הכל, 210 מטבוליטים הוסרו לאחר יישום צינור QA (40% מהנתונים). פחות מ -1% מהנתונים הוסרו היו שפע מטבוליט של אפס, ~ 2% היו נתונים סטנדרטיים פנימיים, ~ 5% היו נתונים ממטבוליטים מעולם לא נצפו בעבר בE. coli, ומטבוליטים שנותרו (> 30%) היו מקדם שונה גדול מ -1.

כמו בניתוח המפות, observatio העולמי NS סיפק הבנה ראשונית של העומק של הצעות metabolomics המידע. כדי לקבל תמונה גלובלית, שיבוטים היו היררכי אשכולות המבוססים על שכיחותם היחסית שלהם המטבוליט מתן מידע על פרופילי שיבוט-המטבוליט, שיבוטים פוטנציאליים עם פונקציות נלוות, וחריגי שיבוט-המטבוליט (איור 6). כדי להדגיש פונקציות חלבון, מטבוליטים מופרדים ומקובצים המבוססים על מסלולי מטבוליים נפוצים. באמצעות ניתוח זה עם תוצאות ראשוניות, היה ברור שmetabolomics מסוגל להפריד גנים מסוגים שונים (איור 6, הדגיש שיבוטים). בנוסף, זיהוי חריג בנתונים metabolomics נקבע על ידי חישוב ציוני תקן (ציוני z) לכל זוג שיבוט-המטבוליט. כדי להבטיח מובהקות סטטיסטיות, חריגים הוגדרו כזוג שיבוט-המטבוליט עם ערך ציון Z של 2, והיוו רק 5 אחוזים מהנתונים (מידע לא מוצג).

ether.within עמודים = "תמיד"> איור 1
איור 1. הגדרות של סיווגי פנוטיפ. מערכת יחסים () בין רמת הצמיחה (GL) ושיעור צמיחה מרבי. נקודות נתונים בעיגול אדום מייצגות עקומות גדילה מראה לא מעט על מנת ניצול מצע. ייצוג Boxplot (ב) הגדרת סף צמיחה מבוסס על ההפצה של עקומות גדילה עם שיעור צמיחה מינימאלי (<0.15 OD / שעה). (ג) השונות וסטיית התקן של GL מחושב עבור D-גלקטוז מצע. קווים מקווקווים קצרים מייצגים שתי סטיות תקן מהממוצע. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

highres.jpg "/>
אימות איור 2. מפות באמצעות דיוק והבחנה. (א) עקומות גדילה לשיבוטים מבניים (capsid על) וחילוף חומרים מבואר (thioredoxin), שני שיבוטים חילוף חומרים רומן (EDT2440, EDT2441), והתגובה הממוצעת של שיבוטים גדלו על סוכרוז, D- גלקטוז וD-מנוז במפות. קווים כחולים מציינים את סטיית ההתקן ראה בין נתונים לשכפל (n = 3). (ב) עקומות הגדילה במשך 47 שיבוטים שונים מיוצגות כמפות חום לסוכרוז, D-גלקטוז וD-מנוז. (העיגול הירוק) המבואר המבני ושיבוטי חילוף חומרים (עיגול כתום), שני שיבוטים רומן חילוף חומרים (עיגולים כחולים כהים ובהירים), והתגובה הממוצעת (העיגול אדום) מודגשים. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

טען / 52,854 / "width =" 700 52854fig3highres.jpg "/>
הפצת Clone איור 3. לכל פנוטיפ פני מצעים מרובים פנוטיפ-השיבוט. לסמוך על 47 שיבוטים פני 72 תנאי גידול פחמן ספציפי. שולחן מספק ספירה ישירה לכל פנוטיפ. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
תרשים איור 4. המפרט את הבנייה של מנגנון התרבות הרציף. () צעדים המשמשים לבניית נמלי α-γ של כור התרבות הרציף, צעדים (ב) המשמשים לבניית נמל הזרימה החוצה של כור התרבות הרציף, ו- (ג ) הצעדים לבנות δ יציאות וε של בקבוק האכלת התרבות הרציף. = יעד "https://www.jove.com/files/ftp_upload/52854/52854fig4highres.jpg" = "_ blank"> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
השוואת איור 5. מהשיטות phenomic הציגו. זרימת עבודה (א) להכנת צלחות רב-פנוטיפ Assay (מפות), התרבויות רציפות ותרבויות סידוריים. (ב) אחוז שגיאת תקן של ממוצע (S M) נחשב לשני n = 3 וn = 6 מדגם גדלים לתרבות הרציף (CC) ושיטות הכנת התרבות סידורי (SC) לmetabolomics. ציר y הוא בקנה מידת יומן. (ג) ההפצות של מקדמים שונים (CV) למטבוליט, לפני ואחרי היישום של צינור QA לתרבות רציפה השיטה (CC)."Target =" _ g5highres.jpg blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 6
6. פרופילי metabolomic איור של שיבוטים גדלו בתרבות רציפה. שכיחות המטבוליט החציוני עבור קבוצה של מטבוליטים הם זממו לשיבוטים 84 גדלו בתרבויות רציפות. פרופילי המטבוליט לשיבוטים מבואר מבניים (capsid על) וחילוף חומרים (thioredoxin), שני שיבוטים חילוף חומרים רומן (EDT2440, EDT2441), ואת התגובה המטבולית הממוצעת מודגשים באדום. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

מתחם פחמן חנקן גופרית זרחן
גליצרול - 0.40% 0.40% 0.40%
אמוניום כלוריד 9.5 מ"מ - 9.5 מ"מ 9.5 מ"מ
נתרן גופרתי 0.250 מ"מ 0.250 מ"מ - 0.250 מ"מ
מגנזיום סולפט 1.0 מ"מ 1.0 מ"מ - 1.0 מ"מ
פוספט אשלגן 1.32 מ"מ 1.32 מ"מ 1.32 מ"מ -
מגנזיום כלוריד - - * -
אשלגן כלורי 10 מ"מ 10 מ"מ 10 מ"מ 10 מ"מ
סידן כלוריד 0.5 מיקרומטר 0.5 מיקרומטר 0.5 מיקרומטר
נתרן כלורי 5 מ"מ 5 מ"מ 5 מ"מ 5 מ"מ
כלוריד Ferric 6 מיקרומטר 6 מיקרומטר 6 מיקרומטר 6 מיקרומטר
arabinose L- 0.10% 0.10% 0.10% 0.10%
pH 7.4 מגבים 1x 1x 1x 1x

טבלת 1. התרכובות והריכוזים של התקשורת הבסיסית השונות המשמשת במפות. * 1.0 מ"מ של מגנזיום כלוריד מוחלף. מגבים 1x = 40 מגבים מ"מ, 4 מ"מ tricine.

L ליזין
מצעי פחמן מצעי חנקן מצעי גופרית Pמצעי hosphorus
2 deoxy-D-ribose 2-D-ribose deoxy חומצת 1-בוטאן-sulfonic אדנוזין-5-monophoshate
חומצה אצטית 4 הידרוקסי-פניל acetamide ציסטאין אצטיל בטא glycerophosphate
חומצת אצטית אדנין D-ציסטאין creatinephosphate
אדנוזין-5-monophosphate אדנוזין D-מתיונין D-גלוקוז-6-פוספט
adonitol אלנטואין diethyl-dithiophosphate diethyl-dithiophosphate
אלפא-D-גלוקוז בטא phenylethylamine DL-ethionine DL-אלפא-glycerophosphate
אלפא-D-לקטוז biuret גלוטתיון פוספט אשלגן
אלפא-D-melebiose cytidine חומצת isethionic pyrophosphate נתרן
מֶלַח לִימוֹן ציטוזין חומצת L-cysteic thiophosphate נתרן
D-אלאנין D-אלאנין L-ציסטאין
D-arabinose D-asparagine חומצת L-djenkolic
D-arabitol D-aspartate L-מתיונין
D-asparagine D-ציסטאין מגנזיום סולפט
D-aspartate D-גלוקוזאמין חומצת sulfonic המתאן
D-cellubiose חומצה גלוטמית D- N-אצטיל-DL-מתיונין
D-ציסטאין חומצת DL-אלפא-אמינו-N-butyric N-Acetyl-L-ציסטאין
D-פרוקטוז D-מתיונין אשלגן-טטרה-thionate D-גלקטוז D-סרין Thiosulfate נתרן
D-גלוקוזאמין D-ולין חומצת sulfanic
D-גלוקוז חומצת גמא-אמינו-N-butyric טאורין
D-גלוקוז-6-פוספט גליצין חומצת taurocholic
D-גלוטמט guanidine thiourea
D-מנוז היסטמין
D-raffinose inosine
D-ribose L-אלאנין
D-salicin L- ארגינין
D-סרין L-asparagine
D-trehalose L-Citrulline
D-קסילוז L-ציסטאין
dulcitol חומצת L-גלוטמית
גליצרול L-גלוטמין
גליצין L-גלוטתיון
i-Erythritol L-היסטידין
inosine L-isoleucine
L-אלאנין L-לאוצין
L-arabinose L ליזין
L-arabitol L-מתיונין
L-asparagine L-ornithine
L-aspartate L-פניל אלנין-
חומצת L-cysteic L-פרולין
L-ציסטאין חומצת L-Pyro-גלוטמית
L-fucose L-סרין; L-תראונין
L-גלוטמית חומצה L- טריפטופן
L-גלוטמין L-ולין
L-isoleucine N-אצטיל-D-גלוקוזאמין
L-לאוצין פוטרסין
thiourea
L-מתיונין תימידין
L-פנילאלנין תימין
חומצת L-Pyro-גלוטמית טירמין
L-rhamnose טירוזין
L-סרין uridine
L-sorbose
L-תראונין
L- טריפטופן
L-ולין
L-קסילוז
חומצת החלב
lactulose
malate
מיו-אינוזיטול
חומצה אוקסלית
סורבט אשלגן
חומצה פרופיונית
פוטרסין
חומצת quinic
פירובט נתרן
succinate נתרן
סוכרוז
תימידין
קסיליטול

רשימת 2. טבלה של מצעים המשמשים בניסויי MAP.

Discussion

כאן, אנו מציגים גישות phenomic לאפיון הפונקציונלי של גני הפאג משוערים. טכניקות כוללות assay פיתח מסוגל חילוף חומרים אנאבוליים מארח ניטור, צלחות Assay Multi-פנוטיפ (מפות), בנוסף לשיטה המבוססת של metabolomics, מסוגל למדוד השפעות לחילוף חומרי קטבולי. אנחנו סיפקנו כלים נוספים כדי לנהל את ערכות נתונים הגדולות הנובעות מטכנולוגיות אלה, המאפשרים לעיבוד תפוקה גבוה וניתוח 24. לבסוף, באמצעות ההשוואה של חלבון מבואר קפסיד הפאג, thioredoxin הפאג, שני גני הפאג חילוף חומרים משוערים, והתגובה הניסיונית הממוצעת אנו מציעים אסטרטגיות שונות לפרש את שני מערכי נתונים וכיתות גן, בדגש על זיהוי מגמות וזיהוי חריגים פנוטיפי.

כאמור, שתי גישות כמותית למדוד רק מחצית מחילוף חומרי מארח. לפרש את התפקוד היחסי של כל אחד מחלבוני רומן תחת חקירה, הנתונים משני השיטות נדרש לספק ראיות של פונקציה. אמנם זה לא פוקוס של כתב היד הנוכחית שלנו, יציאות נתונים מכל שיטת phenomic היא לשים בניתוחים combinatory המתמקדים בטכניקות אשכולות כגון יער אקראי וניתוח מרכיבים ראשי. יתר על כן, השערות כתוצאה מהניתוח המשולב חייבים להיות מאומתות לאחר מכן על ידי שיטות גנטיות מסורתיות.

לבסוף, השיטות שהוצגו מושפעים במידה רבה על ידי פיזיולוגיה של חיידקים ולכן בצעו את אותם הסטנדרטים. כאשר התחייבות או שיטה, שיקולים צריכים להיעשות כדי להבטיח קבוצות עצמאיות, משובטים הם התנסו ב; זיהום נמנע; משתנה אחד נבדק; והבקרות מתאימות שרצו בו זמנית. אי חשבון לנקודות אלה יגרמו לתוצאות לא ברורות, דומות לכל assay פיסיולוגי.

צלחות Assay רב-פנוטיפ(מפות)

הפיתוח של מפות מספק תפוקה גבוהה וassay להתאמה בהשוואה לטכנולוגיות זמינות כרגע (איור 5 א ושולחנות 1,2). Assay משתמש אספקה, ציוד, וטכניקות בסיסיות זמינה בכל מעבדות מיקרוביולוגיה. השילוב של צינור חישובית, 24 PMAnalyzer, לעיבוד וניתוח נתונים שלאחר מכן מבטיח פרשנות נתונים מהירה. בנוסף, שני ההיבטים ניסיוניים ואנליטיות של הגישה יכולים להיות מותאמים בקלות או מכוון למטרות מותאמות אישית. לדוגמא, אם חלק גדול מהנתונים לא מצליח לעבור סינון המפורטים בסעיף 4, אפשר לנפות ידני באמצעות עקומות הגדילה לזהות בעיות. אם מתעוררת הבעיה בשל פרמטרים מסנן מחמירים, התאמות לתסריט יכולה להתבצע. לחלופין, (כלומר עיבוי אם בעיות קשורות בתהליך הניסוי, ממושך; לא תקין של העברת חיידקי celLS, וכו ') ולאחר מכן משכפל נוסף ניתן לחזור בקלות.

כפי שתואר בCuevas et al. 24, PMAnalyzer היא תכנית יחידה bash נכתבה כתסריט מעטפת שמבצע את הניתוח וניתוח התסריטים כצינור מלוכד, אוטומטי. כל התסריטים נגישים באופן חופשי ממאגר Git ב 25 על ידי לקיחת הערך החציוני עבור כל נקודה על פני נתוני שלושה עותקים זמן, ולאחר מכן parameterizes העקומה לוגיסטית להשיג זמן ההשהיה, שיעור צמיחה מרבי, אסימפטוטה, וטווח רומן, צמיחת רמה. ערך החציון נבחר על הממוצע במחקר שלנו כדי להפחית את ההשפעה של חריגים גדולים, לעומת זאת, התסריט ניתן להתאים בקלות לחשב את הממוצע של הנתונים לשכפל. בשל וריאציה מופחתת (SE) ראה על פני נתונים לשכפל (איור 2 א) שמרנו את השימוש בחציון בPMAnalyzer להתקנת עקומה לוגיסטית. בנוסף, נותק לצמיחה במחקר זה (GL ≥ 0.4) היה Determined ידי השוואת נתונים כיצד הופרדו על פני רמת צמיחה ושיעור צמיחה המרבית (איור 1 א ', ב'). בהתאם למערכת המכשירים והמודל השתמשה במונח זה עשוי להשתנות, דורשת הגדרה מחדש של זה מנותק ערך.

יתרון עיקרי של assay שלנו הוא היכולת להשוות פנוטיפים באמצעות פרמטר יחיד המאפיין את התפתחותם של חיידקים כללי, שבו אנו מגדירים כצמיחה רמה (GL). GL הוא ממוצע הרמוני, ולכן מפחית את ההשפעות של חריגים גדולים בנתונים. השימוש בממוצע הרמוני עם ערכים מצויד לוגיסטיים עברו לספק סיכום של הצמיחה הגיע בדרך של ניסוי וטעייה. שיטות אחרות ניסו לבדל את הצמיחה כללה: זמן שלקח להגיע פרמטרים ספציפיים עקומה (מחצית μ מקסימום, μ מקסימום, ויכולת נשיאה), המקדם של נחישות (R 2), ושילובים של R 2 מוכפל בפרמטרים עקומה ספציפיים. שימוש בממוצע הרמוני עם עברערכים לוגיסטי-כשירים לGL סיפקו את מגוון הגדול ביותר בהערכת צמיחה, וכך היא הפכה לשיטה של ​​בחירה. שיקול אחד שיש לשים לב כי יש דפוסי עקומת צמיחה דינמיים הפוטנציאל של איבוד בעת שימוש בפרמטר אחד או מודל מצויד. לדוגמא, הפרמטרים העקומה הבודדים של העקומה לוגיסטית וGL אינם מסוגלים גידול biphasic. בסביבת פחמן בודדת, השפעה זו על צמיחה מרמזת תיווכו של החלבון הנגיפי משני ההמרה של המצע או שינוי בניצול מצע. השפעות נוספות שעלולים להיות לאיבוד כאשר לא שוקלים פרמטרים צמיחה מרובים כוללות: זמן השהיה ממושך, מציע נטל מוגבר של מכונות או של מוצרים נגיפיים; במהירות מואצת שלב מעריכי, המצביע על חלבונים נגיפיים בשילוב לארח מסלולי הפקת אנרגיה; רמות גבוהות יותר של היווצרות או ביומסה, רומזים תמיכה נגיפית בספיגת חומרים מזינים מארח ואנאבוליזם (מידע לא מוצג). לפיכך, זומם עקומות גדילה המתהווה (

כאשר בוחנים את התגובות השונות שנתרמו על ידי גנים מבניים וחילוף חומרים במפות, הוא ציין כי שיעורי המצע השונים בשאלה לספק הראיות הגדולות ביותר לתפקוד חלבון. לדוגמא, חלבוני חילוף חומרים הקשורים לעתים קרובות עם רכישה של חומרים מזינים הגבלה, שהם נוקבים לארח 16,32 חילוף חומרים מרכזיים. ניסויים ראשוניים עולים כי MAP יש שיבוטים מחסה גני הפאג חילוף חומרים משוערים שלב פיגור מוגבר כאשר גדלו על מקורות מרכזיים פחמן חילוף חומרים (איור 2 א). לעומת זאת, שיבוטים נושאים גנים מבניים משוערים, הדורשים פרופורציות גדולות של בריכות אנרגיית המארח וdNTP, לגרום לתגובה חיובית כוזבת על צמיחה לסנאטמצעי פחמן חילוף חומרים RAL וחומצות אמינו. זה כנראה עקב ההצטברות של חלבונים מסיסים וכתוצאה מכך filamentation מארח ו / או גופי הכללה, כפי שנצפה באמצעות מיקרוסקופ (איור 2 א ומידע לא מוצג). בעוד נדרש ניתוח נוסף כדי לאמת את התוצאות הראשוניות אלה, המפות מסוגלות אחזור תגובות פנוטיפי המתואמים להשערת פונקציות של כיתות גן הפאג ספציפיות.

בנוסף להבהרה של חלבונים נגיפיים בלתי ידועים, המפות הן משאב רומן לחקור את המגוון הפונקציונלי וחילוף חומרים של חיידק בודד או קהילה של חיידקים. רכיבי MAP מיועדים לשינוי קל כדי לתמוך בצמיחה של מגוון רחב של חיידקים; כולל ימי, auxotrophic, וחיידקים אנאירוביים. כדי להקל על מאמצים אלה התקשורת הבסיסית ומראש צמיחה המוגדרת דורשות מינים כימיים נוספים או הותאמו לפני סוג חיידקים שונה יכול להיות נתמכת במפות.הערה אחת בשימוש זה של המפות היא לשמור על תקשורת מוגדרת, האוסר על השימוש במרכיבים כגון tryptone, תמצית שמרים וpeptone.

Metabolomics

תחום metabolomics תלוי במאגרי מידע המטבוליט, הכוללים מטבוליטים מבודדים המזוהים על ידי ספקטרומטריית מסה. יש מתקן הליבה נבחר כאן אחד ממאגרי המידע הגדולים ביותר metabolomics. מעניין, יותר ממחצית מטבוליטים וכתוצאה מexperimentations היתה בלתי מזוהות (~ 65%), בעוד שאחרים מעולם לא לפני שנרשמו במארח שלנו, Escherichia coli (דוגמאות כוללות: אינדול 3 חומצה אצטית 33, חומצה סליצילית 34, וחומצת dihydroabietic 35). עובדה זו ניתן לייחס לשתי הטיה חזקה של בסיס הנתונים למטבוליטים צמח, או החלבונים הספציפיים תחת חקירה. ללא קשר, התוצאה הוא מספר מצומצם של מטבוליטים ידועים זמינים לייצוג נתונים וניתוח. בפוture, שיטות metabolomics מרובות באמצעות מאגרי מידע שונים יאפשר לכיסוי המטבוליט יותר.

נכון להיום, ידוע והן מטבוליטים ידועים המשמשים בעת השוואה והנגדה החלבונים הנגיפיים הרומן שלנו. שימוש בגישה זו, אנו משערים כי שיבוטים מחסה חלבונים פונקציונלי דומים יחלקו דמיון מוגבר בפרופיל metabolomic המלא שלהם. ניתוח metabolomics ראשוני עולה כי בעוד גנים מבניים וחילוף חומרים לא להפריד אחד מהשני בצורה ברורה, גנים אלה מציגים השפעות דומות על המארח כאשר ביטוי יתר אין לתאם (איור 6). לדוגמא, אשכולות גני capsid על מבואר עם הדוק גני הטבולים המשוערים מודגשים במחקר זה, EDT2440 וEDT2441. חקירות באמצעות תכנית מנבא טופולוגיה הטרנסממברני ופפטיד האות זמינה לציבור הראו ראיות לכך ששניהם גני הטבולים המשוערים נמל תחום הטרנסממברני יחיד. מעניין 5 מתוך ה9 שיבוטים דואר בקבוצה הראשונה האשכול (משמאל החלק מdendrogram ביותר) היו לחזות תחומים הטרנסממברני באמצעות אותה תכנית טופולוגיה. יש צורך בבדיקות נוספות, עם זאת, סביר להניח כי מטבוליטים בביטוי היתר של שיבוטים אלה הקשורים לתגובת לחץ סלולרית כתוצאה מקרום או נטל מבני. עדות זו תומכת שבזמן שנתוני metabolomics בעל כמות מוגברת של רעש, השיטה היא מסוגלת הדגשת אותות שמבדילים השפעות כלליות של הגנים, הן בתוך ועל פני כיתת גן. כדי לקבוע אם השיטה היא מסוגלת להוציא את מידע ספציפי של תפקוד גן, מטבוליטים קובצו למסלולים מטבוליים ספציפיים. בן ההשערה, אם שיבוט משפיע מטבוליטים ספציפיים למסלול אחד, ולאחר מכן גן ביטוי יתר הוא פעיל באותו מסלול. לפני הקמת צינור אבטחת איכות metabolomics, נתונים ראשוניים עולים כי מעלמטבוליטים underrepresented ד היו בדרך כלל "לא ידועים", המספקים מידע מועט על המסלולים הם קשורים עם (מידע לא מוצג). נתונים metabolomics מעובד, לעומת זאת, מגלים כי הרוב המכריע של פרופילי המטבוליט דומים ורק מספר מצומצם של שכיחות המטבוליט ידועה וידועה להשתנות על פני שיבוטים, לדוגמא פוטרסין ואורציל (איור 6). כדי לספק רזולוציה גדולה יותר של מאמצי תפקוד חלבון נעשים כדי להשוות ניסוי גני הפאג הרומן נגד גני הפאג ידועים, אשר ניתן להשתמש בי למלא "החורים" של המטבוליט אפיון פונקציונלי מבוססים. שימוש בטכניקה זו, הפונקציה שהוקצתה של גנים נגיפיים ידועים מספקת התייחסות לפונקציה של גנים לא ידועים. עם זאת, הגורם של ניתוח metabolomic הגבלה הוא בגודל ואת הרלוונטיות של מסד הנתונים. כדי לתקן את המגבלות האלה, מסדי נתונים metabolomic אפשר להתייחס אליה למחקר זה צריכים להיות מפותחים; כזהכבסיס נתונים של מטבוליטים ושכיחותם ספציפיים לאוסף ASKA של א ' השיבוטים coli בי ORF אחת מבוטא ביתר 36. ראיות לצורך של מסדי נתונים מסוג זה הניתנות בשנת 2013, כאשר חוקרים במעבדה הלאומית ברקלי Lawerence מלוקט מסד נתונים המקיף הראשונים של מטבוליטים ספציפיים לספריות מוטציה שלמות של חיידקי מודל 37. מחקר זה סיפק תובנה חדשה לגנים הנדרשים לניצול של מטבוליטים מסוימים, חושף את הקשר ברור בין הפנוטיפ וגנוטיפ.

כאשר שוקלים metabolomics ככלי, חשוב להגדיר את משטר העיבוד ואחרי במתקן הגרעין. חפץ של רוב הליכי ניסוי הוא שונות היום-יום הקשורים למכשירים של שימוש. עד כה כל ניתוח GC-MS מיישם את השימוש בסטנדרטים פנימיים שכלולים בכל ריצה אנליטיים; עם זאת, תוספת של דגימות פנימיות ספציפיות פרויקט </ Em> רץ בכל יום של ניסויים מסיר שונות נוסף. שיקולים אלה יש לטפל מוקדם כדי להימנע מבעיות נורמליזציה והטיות. פתרון נוסף הוא לעבד את כל הדגימות במתקן גרעין באותו מחשב וכיצווה אחת, אפשרות זמינה בכל מתקן גרעין.

הכלים השונים הציג שני ובחנו מחדש בכתב היד הזה מספק רומן פירוש מסך ולאפיין גני הפאג תפקודי לא ידועים. הפשטות וההתאמה של השיטות הניסיוניות עם השימוש לייעל צינורות חישובית מבטיחים שיטות אלו חלות על מגוון רחב של מאמצי מחקר ושדות. המטרה שלנו היא שגישות phenomic מוצגות כאן תסייע חקירות נוספות של חלבוני הפאג רומן בנוסף למערכות שנמצאות באותה מידה תפקודית מוגדרים.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 µm Sterivex Filter Fisher Scientific SVGP01050 Millipore
0.22 µm Millex Filters Fisher Scientific SLGV033RS Millipore
0.22 µm SteriCap Filter Fisher Scientific SCGPS02RE Millipore
0.22 µm Omnipore membrane filters Millipore JHWP02500 Millipore
96-well micro-titer plates VWR 82050-764 Standard F-Bottom 96 well Microplates
2 ml 96-well plate Fisher Scientific
Adhesive seal plate film Sigma-Aldrich Z369667
2 L Nalgene square bottles Cole Parmer T-06040-70
125 ml Nalgene square bottles Cole Parmer T-06040-50
1/4 in. Panel mount lock nut, black nylon Cole Parmer EW-45509-04
Female Luer thread style panel mount to 200 Series Barb, 1/16 in. Cole Parmer EW-45500-30
Female Luer thread style panel mount to 200 series barb, 1/8 in. Cole Parmer EW-45500-34
Male Luer integral lock ring to 500 series barb, 1/16 in. ID tubing Cole Parmer EW-45505-31
Male Luer with lock ring x female Luer coupler Cole Parmer T-45508-80
Barbed bulkhead fittings, 1/4 in. OD Fisher Scientific 6149-0002
Sanipure tubing, 1/16 in. ID x 1/8 in. OD SaniPure AR400002
Sanipure tubing, 1/4 in. OD x 1/8 in. ID SaniPure AR400007
Variable flow mini pump (peristaltic pump) Fisher Scientific 13-876-1
Magnetic stirrer Velp Scientifica F203A0160
Forceps Fisher Scientific 14-512-141 Millipore* Filter Forceps
Multi-plate spectrophotometer plate reader Molecular Devices Analyst GT
Filter manifold Fisher Scientific XX10 025 02
Software:
Python version 2.7.5 http://www.python.org/
PyLab module http://wiki.scipy.org/PyLab
R version 3.0.1 http://www.r-project.org/
reshape2 library http://had.co.nz/reshape
ggplot2 library http://ggplot2.org/
Gene Composer PSI Tech Portal http://www.genecomposer.net
Services:
West Coast Metabolomics Center UC Davis http://metabolomics.ucdavis.edu
DNA 2.0 https://www.dna20.com

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wommack, K. E., Colwell, R. R. Virioplankton: Viruses in Aquatic Ecosystems. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 64, (1), 69-114 (2000).
  2. Hendrix, R. W. Recoding in Bacteriophages. Recoding: Expansion of decoding rules enriches gene expression. 24, 249-258 (2010).
  3. Breitbart, M., et al. Genomic analysis of uncultured marine viral communities. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99, (22), 14250-14255 (2002).
  4. Breitbart, M., et al. Diversity and population structure of a near-shore marine-sediment viral community. Proceedings. Biological sciences / The Royal Society. 271, (1539), 565-574 (2004).
  5. Dinsdale, E. A., et al. Functional metagenomic profiling of nine biomes. Nature. 452, (7187), 629-632 (2008).
  6. Vega Thurber, R. L., et al. Metagenomic analysis indicates that stressors induce production of herpes-like viruses in the coral Porites compressa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, (47), 18413-18418 (2008).
  7. Pedulla, M. L., et al. Origins of highly mosaic mycobacteriophage genomes. Cell. 113, (2), 171-182 (2003).
  8. Calendar, R., Abedon, S. T. The bacteriophages. Oxford Univeresity Press. (2006).
  9. Breitbart, M., Miyake, J. H., Rohwer, F. Global distribution of nearly identical phage-encoded DNA sequences. FEMS microbiology letters. 236, (2), 249-256 (2004).
  10. Klenk, H. -P., Palm, P., Zillig, W. DNA-Dependent RNA Polymerases as Phylogenetic Marker Molecules. Systematic and Applied Microbiology. 16, (4), 638-647 (1993).
  11. Breitbart, M., Thompson, L., Suttle, C., Sullivan, M. Exploring the Vast Diversity of Marine Viruses. Oceanography. 20, (2), 135-139 (2007).
  12. Mann, N. H., Cook, A., Millard, A., Bailey, S., Clokie, M. Marine ecosystems: bacterial photosynthesis genes in a virus. Nature. 424, (6950), 741 (2003).
  13. Mann, N. H., et al. The genome of S-PM2, a “photosynthetic” T4-type bacteriophage that infects marine Synechococcus strains. Journal of bacteriology. 187, (9), 3188-3200 (2005).
  14. Lindell, D., et al. Transfer of photosynthesis genes to and from Prochlorococcus viruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, (30), 11013-11018 (2004).
  15. Millard, A., Clokie, M. R. J., Shub, D. A., Mann, N. H. Genetic organization of the psbAD region in phages infecting marine Synechococcus strains. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, (30), 11007-11012 (2004).
  16. Sullivan, M. B., Coleman, M. L., Weigele, P., Rohwer, F., Chisholm, S. W. Three Prochlorococcus cyanophage genomes: signature features and ecological interpretations. PLoS biology. 3, (5), e144 (2005).
  17. Rohwer, F., et al. The complete genomic sequence of the marine phage Roseophage SIOI shares homology with nonmarine phages. Limnology and Oceanography. 45, (2), 408-418 (2000).
  18. Miller, E. S., et al. Complete genome sequence of the broad-host-range vibriophage KVP40: comparative genomics of a T4-related bacteriophage. Journal of bacteriology. 185, (17), 5220-5233 (2003).
  19. Thompson, L. R., et al. Phage auxiliary metabolic genes and the redirection of cyanobacterial host carbon metabolism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, (39), E757-E764 (2011).
  20. Paterson, S., et al. Antagonistic coevolution accelerates molecular evolution. Nature. 464, (7286), 275-278 (2010).
  21. Seguritan, V., et al. Artificial neural networks trained to detect viral and phage structural proteins. PLoS computational biology. 8, (8), e1002657 (2012).
  22. Neidhardt, F. C., Bloch, P. L., Smith, D. F. Culture Medium for Enterobacteria. Journal of Bacteriology. 119, (3), 736-747 (1974).
  23. Khlebnikov, A., Datsenko, K. A., Skaug, T., Wanner, B. L., Keasling, J. D. Homogeneous expression of the P(BAD) promoter in Escherichia coli by constitutive expression of the low-affinity high-capacity AraE transporter. Microbiology (Reading, England). 147, (Pt 2), 3241-3247 (2001).
  24. Cuevas, D. A., et al. Elucidating genomic gaps using phenotypic profiles. F1000Research. (2014).
  25. Zwietering, M. H., Jongenburger, I., Rombouts, F. M., van’t Riet, K. Modeling of the bacterial growth curve. Applied and environmental microbiology. 56, (6), 1875-1881 (1990).
  26. Venables, W. N., Smith, D. M. An introduction to R. Available from: http://cran.r-project.org/doc/manuals/R-intro.pdf (2014).
  27. Schmieder, R., Lim, Y. W., Rohwer, F., Edwards, R. TagCleaner: Identification and removal of tag sequences from genomic and metagenomic datasets. BMC bioinformatics. 11, 341 (2010).
  28. Schmieder, R., Edwards, R. Quality control and preprocessing of metagenomic datasets. Bioinformatics (Oxford, England). 27, (6), 863-864 (2011).
  29. Schmieder, R., Edwards, R. Fast identification and removal of sequence contamination from genomic and metagenomic datasets. PloS One. 6, (3), e17288 (2011).
  30. Welch, M., et al. Design parameters to control synthetic gene expression in Escherichia coli. PloS One. 4, (9), e7002 (2009).
  31. Fiehn, O., et al. Quality control for plant metabolomics: reporting MSI-compliant studies. The Plant journal: for cell and molecular biology. 53, (4), 691-704 (2008).
  32. Zeng, Q., Chisholm, S. W. Marine viruses exploit their host’s two-component regulatory system in response to resource limitation. Current biology: CB. 22, (2), 124-128 (2012).
  33. Shindy, W. W., Smith, O. E. Identification of plant hormones from cotton ovules. Plant physiology. 55, (3), 550-554 (1975).
  34. Lee, H. I., Leon, J., Raskin, I. Biosynthesis and metabolism of salicylic acid. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, (10), 4076-4079 (1995).
  35. Chappell, J. The Biochemistry and Molecular Biology of Isoprenoid Metabolism. Plant Physiology. 107, (1), 1-6 (1995).
  36. Kitagawa, M., et al. Complete set of ORF clones of Escherichia coli ASKA library (a complete set of E. coli K-12 ORF archive): unique resources for biological research. DNA research: an international journal for rapid publication of reports on genes and genomes. 12, (5), 291-299 (2005).
  37. Baran, R., et al. Metabolic footprinting of mutant libraries to map metabolite utilization to genotype. ACS chemical biology. 8, (1), 189-199 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.

    Usage Statistics