Phenomics de phages: approches physiologiques à caractériser de nouvelles protéines virales

Immunology and Infection
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Sanchez, S. E., Cuevas, D. A., Rostron, J. E., Liang, T. Y., Pivaroff, C. G., Haynes, M. R., Nulton, J., Felts, B., Bailey, B. A., Salamon, P., Edwards, R. A., Burgin, A. B., Segall, A. M., Rohwer, F. Phage Phenomics: Physiological Approaches to Characterize Novel Viral Proteins. J. Vis. Exp. (100), e52854, doi:10.3791/52854 (2015).

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Abstract

Les enquêtes actuelles sur les interactions hôte-phage sont tributaires de l'extrapolation de la connaissance (méta) génomes. Fait intéressant, 60 - 95% de toutes les séquences de phage part aucune homologie avec des protéines annotées actuelles. En conséquence, une grande partie des gènes de phage annotés comme hypothétique. Cette réalité affecte lourdement l'annotation des deux gènes métaboliques structurelles et auxiliaires. Ici, nous présentons les méthodes Phenomic conçus pour capturer la réponse (s) physiologique d'un hôte sélectionné pendant l'expression de l'un de ces gènes de phages inconnus. Multi-phénotype Assay Plates (MAP) sont utilisés pour surveiller l'utilisation de la diversité de substrat d'accueil et la formation subséquente de la biomasse, alors que la métabolomique fournit une analyse bi-produit en surveillant l'abondance et la diversité des métabolites. Ces deux outils sont utilisés simultanément pour fournir un profil phénotypique associée à l'expression d'un cadre de lecture ouvert de phage putative unique (ORF). Les résultats représentatifs pour les deux méthodes sont comparées, highlighting profil différences phénotypiques d'un hôte portant soit des gènes de structure ou métaboliques putatives phages. En outre, les techniques de visualisation et haut débit pipelines de calcul qui ont facilité l'analyse expérimentale sont présentés.

Introduction

Les virus qui infectent les bactéries (aka bactériophage ou phage) sont estimés à exister à plus de 10 31 pseudo particules virales (VLP) à l'échelle mondiale et plus nombreux que tous les autres organismes dans un environnement 1,2. La première étude métagénomique enquêter sur les communautés virales associées aux environnements marins concentre sur la quantification de la diversité au sein de la fraction vu virale 3. En outre, Breitbart et ses collègues ont constaté que plus de 65% des séquences virales communautaires partagé aucune homologie avec des séquences disponibles dans les bases de données publiques. Des études ultérieures ont trouvé des preuves de métagénomique similaire: métagénomes de sédiments marins à San Diego, en Californie contiennent 75% de séquences virales inconnues 4; métagénomes des lacs hypersalines de la Salton Sea contiennent 98% de séquences virales inconnues 5; et métagénomes coralliens associée contiennent 95 à 98% de séquences virales inconnues 6. Cette accumulation d'informations non annoté a donné lieu àphage matériel génétique étant «la matière noire de l'univers biologique" 7.

Caractérisation génomique du phage repose sur l'identification de la similarité de séquence par comparaison des bases de données existantes nucléiques de protéines et acides. Parce que l'information génétique codée phage est essentiellement inconnue, les méthodes reposant sur l'homologie sont inefficaces. Au sein de leur génome, phages codent généralement trois types principaux de gènes: les gènes de transcription et de réplication, les gènes métaboliques, et des gènes de structure. La transcription et la réplication des gènes (classe I / II gènes 8) comprennent polymérases, primases, endo / exo-nucléases, et kinases. Ces gènes sont hautement conservées en raison de leur importance dans l'infection par le phage, la transcription et la replication du matériel génétique du phage. polymérases de phages sont facilement identifiés en utilisant des méthodes d'homologie de séquence traditionnels en raison de leur conservation mondiale et 9 ont été montré pour servir de marqueurs phylogénétiques efficaces 10.En revanche, phage métabolique et gènes de structure (classe de gènes II / III 8) sont de plus en plus divergentes et souvent annoté gènes hypothétiques.

gènes métaboliques de phages affectent la capacité métabolique de l'hôte et ne sont pas nécessairement requises pour la réplication virale. Ces gènes, souvent appelés gènes métaboliques comme auxiliaires 11 (AMG), semblent moduler le métabolisme de l'hôte et de permettre la progression optimale de l'infection et le succès de la maturation des virions. AMG ont été associés à l'utilisation et l'absorption des nutriments limitant ou dans les voies de production d'énergie. Quelques exemples incluent les gènes de photosystèmes trouvés dans les génomes de différents cyanophage 12-16, gènes reliés à et réglementés par le métabolisme du phosphate 17,18, et l'utilisation de la voie des pentoses phosphates pour le phage dNTP biosynthèse 18,19. En comparaison, les gènes de structure sont parmi les milieu à la fin des gènes produites au cours de l'infection et varient selon les différents phage-hosystèmes st. La production de protéines structurelles sont tributaires de la disponibilité de dNTP virale, et les piscines de l'énergie pour leur transcription, la traduction et l'assemblage 8. Les protéines de la capside et la queue fibres structurelles sont considérées comme étant les plus divergents de l'ensemble des gènes codant pour des protéines virales et sont nécessaires pour le succès de la production de virion. Leur divergence est généralement attribué au rôle actif qu'ils jouent dans la coévolution virus-hôte 20. Protéines divergentes, indépendamment de la classe de gènes, sont facilement négligés lors de l'utilisation des techniques d'homologie de séquence et d'alignement traditionnelles. Un effort pour corriger les limites observés avec des comparaisons de séquences strictes a abouti à outils bioinformatiques capables d'utiliser les caractéristiques de séquence pour déterminer association, tels que les réseaux de neurones artificiels 21. Les réseaux de neurones artificiels (RNA) de permettre la prédiction de gènes structurels et métaboliques, cependant, nécessite une validation expérimentale aval à caractériser directementla fonction des gènes.

L'objectif de ce manuscrit est de fournir les protocoles de Phenomic capables de contrôler à la fois le métabolisme catabolique et anabolique d'une bactérie hôte lors de l'expression d'un gène de phage roman, prédit fonctionnellement par RNA. Le domaine de la phénomique, la biologie associée à des phénotypes cellulaires, est bien établi dans la biologie des systèmes pour aider à l'enquête de protéines de fonction inconnue ou pléiotropique. Phenomic outils sont utilisés pour relier l'information phénotypique à l'information génotypique. Nous émettons l'hypothèse de gènes de phages putatifs que leur fonction (s) peut être déterminé par observation accueil effets physiologiques au cours de l'expression du gène de phage. Pour vérifier cette hypothèse, deux méthodes quantitatives ont été choisis. Multi-phénotype Assay Plates (MAP) ont été utilisés pour surveiller l'utilisation de l'hôte substrat et la formation subséquente de la biomasse pendant la métabolomique mesurées diversité des métabolites de l'hôte et l'abondance relative pendant la croissance dans des environnements spécifiquesconditions mentales. Les protéines structurales et métaboliques putatifs ont été surexprimés dans Escherichia coli et des résultats représentatifs de deux expériences sont comparés. De nombreuses techniques visuelles et haut débit pipelines de traitement sont présentés pour faciliter la reproduction expérimentale. Enfin, la reproductibilité et la précision des méthodes présentées sont examinées dans le contexte des effets physiologiques prévus pour une protéine de capside et annoté phage protéine métabolique, la thiorédoxine, ainsi que deux AMG putatifs.

Protocol

1. Préparation de Multi-phénotype Assay Plate (MAP) substrats, des milieux de base, la croissance pré-Media, et le tampon

  1. Faire 50 ml de 1,0 à 1,25% d'actions de substrat.
    1. Dissoudre 1,0 à 1,25% (p / v) de substrat solide dans de l'eau stérile (la chaleur si nécessaire). Filtre à stériliser des solutions avec une unité de filtre de 0,22 um et les stocks du magasin à la température ambiante. Des exemples de substrats utilisés dans ces expériences sont présentés dans le tableau 2.
  2. Faites 250 ml de milieux de base 3x pour toutes les classes de substrat (carbone, azote, soufre et phosphore). Les MOPS (3-morpholinopropane-1-sulfonate) milieux de base 22 sur la base contient les éléments suivants: MOPS 1x (40 mM MOPS + 10 mM tricine), 0,4% de glycérol *, 9,5 mM NH 4 Cl *, mM NaSO 0,25 4 *, 1.0 * mM MgSO 4, 1,32 mM de K 2 HPO 4 *, 10 mM de KCl, 0,5 uM de CaCl2, 5 mM de NaCl, 6 uM de FeCl3, et de 0,1% (p / v) L-arabinose ** (tableaux 1 et 2) .
    Note: * Ces composés ne sont pas inclus, selon les médias basale. Par exemple, 0,4% de glycerol est pas utilisé dans les milieux basaux de carbone et de soufre dans le milieu de base de 1,0 mM de MgSO 4, est remplacé par 1,0 mM de MgCl2. ** L-arabinose est spécifique pour l'induction de vecteur promoteur pBAD, pEMB11, qui a été transformé en un ara - E. coli souche K-12 (BW 27784) 23.
    1. Ajouter chaque composant du milieu de base dans un flacon stérile et amener la solution au volume. Bien mélanger. Avec une unité de 0,22 um de filtre, filtre stériliser chaque support de base dans un flacon stérile.
  3. Faites 500 ml de milieu MOPS pré-croissance. MOPS médias sur la base de pré-croissance 22 contient les éléments suivants: MOPS 1x (40 mM de MOPS + Tricine 10 mM), 0,4% de glycerol, 9,5 mM de NH 4 Cl, 0,25 mM NaSO 4, 1,0 mM de MgSO 4, 1,32 mM de K 2 HPO 4, 10 mM de KCl, 0,5 uM de CaCl2, NaCl 5 mM, 6 pM et FeCl 3.
    1. Ajoutez chaquecomposant du support de pré-croissance dans un flacon stérile et amener à volume. Stériliser par filtration avec une unité de filtre de 0,22 um, puis ajouter de l'ampicilline à une concentration finale de 100 ug / ml. Conserver la solution à 4 ° C.
  4. Faites 500 ml de 0,5x Luria-Bertani (LB) Les plaques d'agar. Dans un flacon stérile, ajouter des composants LB pour obtenir une concentration de 0,5 (1,25 g extrait de levure, 2,5 g de NaCl, 2,5 g de tryptone, 7,5 g d'agar). Mélangez bien et l'autoclave pour stériliser.
    1. Agar Laisser refroidir, puis ajouter 100 pg / ml d'antibiotique ampicilline en mélangeant. Verser ~ 25 ml de gélose en boîtes de Pétri, permettra de mettre, et conserver à 4 ° C jusqu'à ce que nécessaire.
  5. Faites 250 ml de Tris 10 mM (pH 7,4), plus la solution 10 mM MgSO4 tampon. Filtre stériliser avec une unité de 0,22 um de filtre, et une solution de magasin à la température ambiante.

2. Préparation de la société Bacterial Cell-suspension

  1. Préparer colonies frais. D'un stock de glycérol congelés de 12,5%, nouvelle plaque E. coli clones sur gélose 0.5x LB contenant 100 ug / ml d'ampicilline. Incuber à 37 ° C pendant 24 heures.
  2. Préparer des cultures liquides:
    1. Pipette 3 ml de milieu de pré-croissance contenant 100 ug / ml d'ampicilline dans des tubes de culture. Pour chaque clone, utilisez triplicatas biologiques.
    2. Inoculer colonies indépendantes de l'article 2.1 dans des tubes de culture préparés. Incuber à 37 ° C avec agitation par secousses pendant 22 heures.
  3. Pellet et laver les cellules bactériennes:
    1. Transfert O / N cultures dans 1,7 ml microtubes. Pellet cellules par centrifugation à la vitesse maximale (16 900 x g) pendant 2 min dans une microcentrifugeuse. Décanter le surnageant et laver les cellules par remise en suspension dans 500 pi de Tris 10 mM / mM MgSO4 tampon 10. Répéter.
    2. Re-granulés cellules, décanter le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 1 ml de Tris 10 mM / tampon mM MgSO4 10.
  4. Mesurer la densité cellulaire et de se concentrer cellules (si nécessaire):
    1. Diluer les cellules de la section 2.3.3 10 fois dansTris 10 mM / 10 mM MgSO4 tampon et transférer cette dilution dans une cuvette. Mesurer la densité optique (DO 600 nm) de cette dilution et enregistrer.
    2. Concentrez-cellules pour obtenir une concentration finale de 0,07 (DO 600 nm) dans les cartes (les cellules seront diluées 15 fois quand ils sont ajoutés aux cartes, donc les cellules doivent être à une concentration initiale de la DO 600 nm = 1,05). Transfert suspension concentrée de cellules dans un réservoir et enregistrer (à température ambiante) jusqu'à l'étape 3.5 du MAP préparation.

3. Préparation de Multi-phénotype Assay Plaques (MAP)

  1. Étiqueter cartes. Étiquetage des plaques à 96 puits de microtitrage stériles avec un E. coli numéro d'identification du clone et la carte Type schématique.
  2. Aliquote de l'eau stérile en cartes. De façon aseptique, le transfert de l'eau stérile dans un réservoir de liquide. Pipette 60 ul dans chaque puits de la plaque micro-titre à l'aide d'une pipette multi-canal.
  3. Aliquote int milieux de baseo cartes. Transférer de façon aseptique 3x milieux de base dans un réservoir de liquide. Pipette 50 ul dans chaque puits de la plaque micro-titre à l'aide d'une pipette multi-canal. Répétez les étapes 3.2 et 3.3 pour chaque support de base utilisés dans la carte schématique.
  4. substrats aliquotes dans Maps. Transférer 30 pi de chaque substrat dans le puits approprié des cartes.
  5. Ajouter suspension bactérienne aux cartes. Transfert 10 pi de cellules bactériennes de la section 2.4.2 dans chaque puits de la carte en utilisant une pipette multi-canal. Changer conseils avant de ré-introduire pipette de nouveau dans la culture stock.
  6. MAP Couvrir avec un film adhésif. Couvrir chaque plaque avec un seul film de la plaque adhésive. Appuyez fermement sur le film au sommet des puits de la plaque et le long des bords pour créer un joint même et serré. Enlever l'excès de film à partir des bords de la plaque micro-titre avec une lame de rasoir stérile.
  7. Mesurer la densité optique de cartes:
    1. Placez cartes préparées dans le "Input" manche d'un spectro multi-plaquephotomètre lecteur de plaque. Logiciel de lecture ouverte de la plaque et créer un protocole qui mesure l'absorbance (DO 600 nm) toutes les 30 minutes, pour un total de 32 heures, avec 60 sec de serrer entre les lectures.
    2. Régler la température dans l'appareil à 37 ° C. Lancer protocole fois MAP ont équilibrée pour régler la température.
    3. Après 32 h, supprimer des cartes de la "sortie" manchon du lecteur de plaque. Étiqueter chaque fichier texte de données à inclure: l'E. numéro d'identification du clone coli, date à laquelle le PAM a couru, et le type de schéma MAP.

4. Multi-phénotype Assay Plaques (MAP) de traitement et de paramétrage

  1. Évaluer les courbes de croissance en utilisant un processus d'assurance qualité automatisée, par exemple, PMAnalyzer 24.
    1. Vérifiez que les courbes de croissance ont DO 600 nm <0,20 dans les 2 premières heures. Ne pas utiliser absorbance au point de temps initial (t 0) dans le filtre en raison d'artefacts de la condensation, qui résolvent généralement àt 1 (30 min).
    2. Retirer les courbes de croissance qui violent filtre QA. Enregistrer les informations de la courbe (nom de l'échantillon, ainsi nombre, et OD 600 valeurs nm) dans un fichier de sortie distinct pour référence future. Continuer avec l'analyse si la courbe de croissance passe filtre QA.
  2. Calculer courbes médianes de croissance. Utilisation de la réplication de données, par puits, calculer la courbe de croissance médian en prenant la densité optique médiane (DO 600 nm) valeur à chaque point de temps. Enregistrez résultant courbes de croissance médians dans un fichier de sortie distinct pour une utilisation future.
  3. Calculer le modèle logistique de meilleur ajustement pour chaque courbe de croissance en utilisant une adaptation de l'équation proposée par Zwietering 25. L'équation logistique comprend trois paramètres décrivant la croissance bactérienne: le temps de latence, λ (h), le taux de croissance maximum, μ max (DO 600 nm 100 -1), et le rendement de biomasse finale, α (DO 600 nm). Utiliser les données au temps = 30 minutes (y 1) en tant que valeur initiale en raison d'artefacts de condensation.
    Equation 1 [1]
    1. Calculer le taux de croissance maximale en utilisant une recherche directe. Enregistrez le plus grand taux de variation sur un intervalle de 90 minutes dans les données.
      Equation 2 [2]
    2. Estimer le rendement de biomasse finale par la recherche de la valeur asymptotique supérieure de la plus grande moyenne mobile sur une fenêtre de 90 min. Plus précisément, définir comme l'asymptote de la courbe de croissance.
      Équation 3 [3]
    3. Utilisation du μ max et A des valeurs de 4.3.1 et 4.3.2, trouver la valeur de λ en essayant toutes les valeurs λ:
      Equation 4 [4]
      1. Utilisez chaque valeur de λ pour calculer une somme de l'erreur quadratique (SSE). Utilisez le plus bas SSE est le SSE (Xs):
        /files/ftp_upload/52854/52854eq5.jpg "/> [5]

5. Phénotype analyse des cartes

  1. Calculer le niveau de croissance (GL) pour chaque courbe de croissance pour évaluer la croissance globale par clone par substrat. Définir GL que la moyenne harmonique des valeurs de logistique équipée décalées:
    Equation 6 [6]
  2. Attribuer un phénotype à chaque courbe de croissance fondée sur les valeurs GL. Ici, les quatre phénotypes utilisés sont: la croissance prévue, pas de croissance, gain de fonction, et la perte de fonction.
    1. Déterminer phénotypes en comparant la croissance dans tous les clones sur un substrat spécifique en termes d'écarts types de la moyenne. Utiliser cette statistique et un seuil minimum de croissance pour désigner le phénotype présenté par la courbe de croissance (Figure 1A, B). Figure 1C donne des exemples d'affectation de phénotype.
    2. Définir la croissance comme GL ≥ 0,4 (Figure 1A, B). Définir gain de fonction (figure 1C, vert) comme ayant une GL> deux écarts-types au-dessus de la moyenne et une moyenne> le seuil de croissance. Perte fonctionnelle (Figure 1C, rouge) est défini comme ayant un GL <Les deux écarts types en dessous de la moyenne et un moyen pour> le seuil de croissance.
  3. Créer des représentations visuelles de l'ensemble de données sur la base des phénotypes et des courbes de croissance.
    1. Voir la dynamique de croissance dépeignant OD 600 nm valeurs de la couleur de comparer rapidement les courbes de croissance entre plusieurs clones (Figure 2).
    2. Voir distributions phénotypiques parmi tous les clones en fonction des conditions de croissance (Figure 3).

6. Construire l'appareil de culture continue

  1. construction du port du réacteur (figure 4A, B). Percer trois 1/4 po. Trous, espacés de 3/4 po. À part, dans le chapeau du réacteur de culture continue.
    1. Foα portuaires r: visser un panneau de style fil de luer femelle montage à 1/16 dans barbe du fond de la capsule avec l'ardillon pointant vers le haut, sur le bouchon.. Ardillon sécurisé avec un panneau 1/4 po. De montage écrou.
    2. Pour le port β: visser un panneau de style fil de luer femelle montage à 1/16 dans barbe avec l'ardillon pointant vers le haut, sur le bouchon.. Ardillon sécurisé avec un panneau 1/4 po. De montage écrou.
    3. Pour le port γ: visser un panneau de style fil de luer femelle montage à 1/16 dans barbe du fond du capuchon de sorte que la barbe est orientée vers le haut, sur le bouchon.. Ardillon sécurisé avec 1/4 po. À montage sur panneau écrou. Visser un luer mâle avec bague de verrouillage intégrante de 1/8 po. À grand diamètre tuyau au raccord à l'intérieur de la capsule barbe.
    4. Pour le port de sortie: percer un 5/16 dans le trou à la marque de 75 ml de la réacteur de culture continue.. Couper 3/4 po. À l'extrémité de l'écrou de l'1/4 po. Barbelés raccord de cloison. Visser dans la 4.1. Raccord de cloison à barbillons (joint d'étanchéité est à l'extérieur de la bouteille et l'écrou est à l'intérieur, Figure 4B).
  2. Nourrir la construction du port de la bouteille (Figure 4C). Percez deux 1/4 po. Trous espacés 1. À part dans le bouchon de la bouteille d'alimentation.
    1. Pour la δ de port: visser un panneau de style fil de luer femelle de montage à 1/8 dans barbe avec l'ardillon pointant vers le haut, sur le bouchon.. Ardillon sécurisé avec un panneau 1/4 po. De montage écrou.
    2. Pour la ε de port: visser un panneau de style fil de luer femelle montage à 1/16 dans barbe avec l'ardillon pointant vers le haut, sur le bouchon.. Ardillon sécurisé avec un panneau 1/4 po. De montage écrou.
      1. Visser un luer mâle avec bague de verrouillage intégrante de 1/8 po. À grand diamètre tuyau au raccord cannelé, à l'intérieur de la capsule.
  3. Nourrir les tubes et les extensions de tube:
    1. Couper une à deux. Morceaux de tube (1/8 in. De diamètre externe (OD) x 1/16 in. De diamètre interne (ID)). Pièces adapter sur α et γ ports du réacteur de culture continue apportée à l'article 5.2.
    2. Couper une seule 1. Morceau de tUbing (1/4 po. OD x 1/8 po. ID). Pièce Fit sur le port Β du réacteur de culture continue.
    3. Couper une seule 3.5. Morceau de tuyau (1/8 po. OD x 1/16 po. ID). Monter cette pièce à l'intérieur de γ portuaires, sur le luer mâle avec bague de verrouillage intégrante de 1/8 po. De large tuyau de forage. Port γ est l'orifice d'échantillonnage du réacteur de culture continue.
    4. Couper une seule 1. Morceau de tuyau (1/4 po. OD x 1/8 po. ID). Le montage de cette pièce sur le port δ du biberon.
    5. Couper un seul 11. Morceau de tube (1/16 po. OD x 1/8 po. ID). Monter cette pièce à l'intérieur du port de ε de la bouteille d'alimentation, sur le luer mâle avec bague de verrouillage intégrante de 1/8 po. De large tuyau de forage.
    6. Couper deux 18. Morceaux de tube (1/8 po. OD x 1/16 po. ID). Monter une pièce au port ε de la bouteille d'alimentation. Sauver l'autre pièce pour l'article 7.

7. Courir cultures continues pour métabolomique

  1. Stériliser matériaux:
    1. Autoclave les matières sèches de 30 min. Assurez-vous d'envelopper bouchon de la bouteille d'alimentation faite à l'article 5 dans une feuille d'aluminium. Gardez joint tube droit.
      1. Enveloppez bouchon du réacteur de culture continue, faite à l'article 5, dans une feuille d'aluminium. Gardez joint tube droit. Enveloppez 18. Tube coupé à la section 6.3.5 et le plus petit adaptateur de tuyau de la pompe péristaltique dans une feuille d'aluminium. Gardez tube droit. Autoclave pendant 30 minutes.
    2. Faire 2 L de bouillon LB 0.5x. Dans le biberon, assurez 0.5x bouillon LB. Couvrir le biberon avec du papier. Autoclave pendant 1 heure.
    3. Faire 70 ml de bouillon LB 0.5x. Verser le bouillon dans le réacteur de culture continue. Placez une barre d'agitation dans le réacteur de culture continue. Couvrir de papier d'aluminium et de réacteur autoclave pendant 30 min.
  2. Culture continue mis en place:
    1. Bactérienne suspension cellulaire.
      1. D'un stock de glycérol congelés de 12,5%, nouvelle plaque E. coli clones sur gélose 0.5x LB contenant 100 ug / ml d'ampicilline. Incuberà 37 ° C pendant 24 heures.
      2. Inoculer une colonie unique dans 3 ml de bouillon LB contenant 0,5 x 100 ug / ml d'ampicilline. Pour chaque clone utiliser triplicatas biologiques. Incuber à 37 ° C avec agitation par secousses pendant 22 heures.
    2. Connecter les pièces ensemble.
      1. Placez tous les matériaux autoclave dans une armoire de sécurité biologique et allumer la lumière ultraviolette sur tout support soit refroidi. Une fois que les médias a refroidi, ajouter 0,1% de L-arabinose et 100 pg / ml d'ampicilline à tous bouillon LB 0.5x.
      2. Déballer bouchon continu de réacteur de culture et le visser sur le réacteur. Évitez de toucher le tube de prélèvement. Déroulez le bouchon de la bouteille d'alimentation et visser sur le biberon. Évitez de toucher le tube de prélèvement.
      3. Gardez le 18 à. Tube attaché au port ε stérile. Un-envelopper le 18. Tubes et péristaltique adaptateur de tuyau de pompe.
      4. Mettre en place une extrémité libre de la 18 à. La tubulure sur une extrémité de l'adaptateur de tube de pompe péristaltique. Monter l'autre extrémité de l'adaptateur de tuyau de la pompe péristaltiquele tube 18. attaché au port ε du capuchon du biberon.
      5. Visser 0,22 um unités de filtrage sur les ports β et δ du réacteur de culture continue. Visser une unité de 0,22 um de filtre sur l'adaptateur du port de α. Pour l'unité de filtre de 0,22 um, adapter à l'extrémité libre de la 18. Tubes.
    3. Lancer la culture continue.
      1. Dans la hotte de biosécurité, inoculer le réacteur de culture continue avec 100 ul de culture O / N formulées à la section 7.2.1.1.
      2. Fermer le système avant de déplacer la culture continue dans un incubateur à 37 ° C. Dans l'incubateur ont une plaque d'agitation magnétique et d'un mini pompe péristaltique mis en place.
      3. Monter l'adaptateur de tuyau de la pompe péristaltique dans la pompe péristaltique. Tubes de la bouteille d'alimentation commence à la "In" et le tube côté menant au réacteur commence sur le côté "Out".
      4. Réglez la pompe péristaltique à: "FAST". Démarrer la pompe péristaltique en passant à R20; AVANT ". Vérifiez que les médias commence à couler à travers le tube.
      5. Placez réacteur sur la plaque d'agitation magnétique et commencer à mélanger. Réacteur de culture continue doit équilibrer pendant 24 heures avant l'échantillonnage.
    4. Échantillonnage de la culture continue. Visser un 5 ml seringue luer lok sur γ portuaires et tirez en hausse de 4,5 ml de la culture.
      1. Utiliser 500 ul de la culture pour mesurer la densité (DO 600 nm). Diluer cellules pour faire 4 x 1 ml de cultures à OD 600 nm = 0,35.
      2. Aliquote diluée cultures dans 1,7 ml microtubes. Répétez à échantillonner chaque 12 heures pendant 4 jours.
    5. Préparer les échantillons pour GC-TOFMS:
      1. Pellet cellules par centrifugation à vitesse max (16 900 xg) pendant 2 min. Décanter le surnageant. Laver les cellules avec 500 ul de solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Répétez cette étape.
      2. Décanter surnageant une dernière fois, puis plonger les microtubes avec des cellules granulés dans l'azote liquide jusqu'à ce bouillonnement arrêts. Sdéchira échantillons dans le congélateur à -80 ° C.

8. Courir série Passage des cultures en lots pour métabolomique

  1. Préparation bactérienne suspension cellulaire. D'un stock de glycérol congelés de 12,5%, nouvelle plaque E. coli clones sur de la gélose LB contenant 0,5 x 100 pg / ml ampicilline. Incuber à 37 ° C pendant 24 heures.
    1. Ensemencer les colonies individuelles dans 3 ml de bouillon LB contenant 0,5 x 100 pg / ml ampicilline. Utilisez triplicatas biologiques pour chaque clone.
  2. Des cultures en lots de passage de série.
    1. Subculture O / N à partir de 8.1.1 via une dilution de 500 fois dans 3 ml de bouillon LB contenant 50 ug / ml d'ampicilline et 0,1% de L-arabinose. Subculture devrait avoir une DO 600 nm <0,005. Incuber à 37 ° C avec agitation par secousses.
    2. Vérifiez la densité optique (DO 600 nm) à 2 et 2,5 heures. Cultiver des cellules pour obtenir DO 600 nm = 0,35.
      1. Subculture via un 500 fois dilution dans 3 ml de bouillon LB contenant 50 ug / ml d'ampicilline et 0,1% de L-arabinose. Subculture devrait avoir une DO 600 nm <0,005.
    3. Vérifiez la densité optique (DO 600 nm) à 2 et 2,5 heures. Cultiver des cellules pour obtenir DO 600 nm = 0,35.
  3. Échantillonnage des cultures en lots de passage en série.
    1. En utilisant des pinces stériles, placer un filtre de 0,22 pm de membrane au-dessus d'un collecteur de filtre. Aliquote de 1 ml de tampon phosphate salin (PBS) sur le papier filtre et puis tourner sur la pompe à vide.
    2. Répéter l'addition de 1 ml de PBS. Transférer 1 ml de la sous-culture de la section 8.2.3 sur le papier filtre. De là, agir rapidement pour obtenir des échantillons dans de l'azote liquide immédiatement. Remplissez ce en 1 min.
    3. Aliquote de 1 ml de PBS sur un papier filtre pour laver l'échantillon. Rincer rapidement sans répandre l'échantillon sur les côtés de papier filtre. Répéter.
    4. En utilisant des pinces stériles lieu filtre dans un tube de centrifugeuse de 1,7 ml en le pliant soigneusement la fifiltre. Immerger tube de centrifugeuse dans l'azote liquide jusqu'à ce bouillonnement arrêts. conserver les échantillons dans les -80 ° C congélateur.

9. analyse de métabolites et de traitement

  1. Navire 3 échantillons par clone sur glace sèche à une installation de base de la métabolomique pour le traitement de l'échantillon, l'analyse et la normalisation des GC-TOFMS.
  2. Pour chaque échantillon, déterminer la moyenne, la médiane, l'écart type et le coefficient de variation entre les métabolites, en utilisant les données répliquées.
  3. Pour l'analyse statistique, coder manuellement un pipeline de QA en utilisant des instructions conditionnelles et des exécutions répétitives 26 pour éliminer les métabolites qui ne suivent pas des conditions définies.
    1. Pour Condition 1, retirez métabolites dans laquelle plus de 2 échantillons ont abondance zéro. Retirer les normes internes des profils métabolomique.
    2. Pour Condition 2, supprimer ces métabolites qui ne figurent pas dans les cellules d'intérêt. Ici, retirez les métabolites suivants: 3 acétate indole, dihydroabiet l'acide ique, l'acide nonadécanoïque, l'acide salicylique, le salicylaldéhyde, le cholestérol, le phénol, le 1-monostéarine, l'octadécanol, le 1-monopalmitine, le dodécane, le dodécanol, le 1-hexadécanol, le 5-méthoxy tryptamine, l'acide benzoïque, l'acide pentadécanoïque, l'acide phosphorique, l'acide pélargonique, l'acide palmitique acide, l'acide caprique, l'hydroxylamine, l'acide stéarique, l'acide myristique, le maléimide, le lévoglucosan, et l'acide 4-hydroxybutyrique.
    3. Pour Condition 3, supprimer ces métabolites dont le coefficient de variation est supérieur à 1.
  4. Capturez les effets globaux de la métabolomique en regardant les abondances relatives de métabolites.
    1. Créer une représentation visuelle de l'abondance de métabolite médian par clone pour chaque métabolite (figure 6).
  5. Identifier des valeurs aberrantes par l'observation de la paire de fréquences de clone-métabolite.
    1. Calculer le score Z pour chaque valeur médiane de chaque métabolite dans un clone. Calculer les scores z en utilisant l'équation suivante:
      /52854/52854eq7.jpg "/> [7]
      Remarque: Terme X MC représente le niveau de l'abondance d'un métabolite spécifique pour un clone spécifique. μ terme C représente la moyenne de tous les clones pour un métabolite spécifique. σ terme C est l'écart type associé.
    2. Créer une représentation visuelle des données dans laquelle sont mis en évidence les valeurs aberrantes (données non fournies).

Representative Results

Tous les échantillons utilisés pour déterminer les cadres de lecture ouverts (ORF) sélectionnés dans cette étude ont été recueillies à partir de l'île de Starbuck, site 7 (STAR7) et Caroline Atoll, Site 9 (CAR9) des îles de la Ligne du sud. On estime à 100 L d'eau de mer à partir de ces sites ont été recueillis ci-dessous les coraux couche limite à l'aide de pompes de cale, comme décrit précédemment 5. Sommaire des pompes étaient soumis à fragmentation par les grands filtres à pores pour éliminer les petites eucaryotes et ensuite concentrées en utilisant 100 kDa filtres de flux tangentiel ne laissant que les microbes et les virus comme des particules (VLP). Pour séparer les VLP, restant l'eau de mer a été adoptée de 0,45 um filtres résultant dans le virome. Le chloroforme a été introduit à cette fraction virale pour interrompre la croissance de toutes les cellules restantes et stocké à 4 ° C.

VLP ont été purifiées en utilisant le procédé au chlorure de césium, dans laquelle des gradients de densité séparés par centrifugation et permettent la récupération de vir~ ions à 1,35 g / ml à 1,5 g / ml 3. L'ADN viral a été extrait en utilisant un CTAB / phénol: protocole de chloroforme et amplifié par une amplification de déplacement multiples utilisant des réactifs phi29. Le séquençage de l'virome a été réalisée avec la technologie disponible dans le commerce pyroséquençage.

Bioinformatique utilisés dans le traitement et la sélection des ORF viraux pour cette étude sont les suivantes. Trois étapes de pré-traitement ont été utilisés sur les métagénomes virales CAR9 et STAR7. Tout d'abord, le logiciel du public a été utilisée pour éliminer les séquences d'étiquette résultant de l'amplification de l'ADN viral 27 avant le séquençage. Deuxièmement, les artefacts de séquençage communs tels que des doublons de séquence et faible nombre de copies ont été filtrées hors de l'ensemble de données par l'intermédiaire d'un programme de bioinformatique 28 supplémentaire. Enfin, l'élimination de la contamination de séquence étrangère 29 a été réalisée pour les séquences qui avaient ≥ 90% de couverture et ≥ 94% d'identité avec des séquences dans les bases de données suivantes: RefSeq vgénomes irus; Human - Référence GRCh37; Human - Celera Genomics; Human - Craig Venter (HuRef); Human - Seong-Jin Kim (Corée); Human - Chromosome 7 version 2 (GACT); et humain - James Watson, Yanhuang (YH; Asie), Yoruba (NA18507; africaine) séquences de référence 21. Suite à ces processus, des séquences à partir des échantillons CAR9 totalisé 591 600 et 939 311 séquences ont totalisé STAR7. Ces séquences ont été téléchargés sur MGRAST et assemblés par le logiciel assembleur en utilisant les paramètres par défaut. Contigs ont été traduites en 6 cadres de lecture et putatifs cadres de lecture ouverts (pORFs) ont été identifiés en utilisant des scripts, comme décrit précédemment 21.

Pour identifier ORF inconnus un certain nombre de recherches de similarité base ont été effectuées pour retirer ORF de fonction connue. En bref, les recherches suivantes ont été réalisées avec leurs critères de Recherche en 21 correspondants:

  1. Similarité significative de ≥ 95% d'identité sur ≥40 paires de base (pb) par MGRAST BLAT dans la base M5NR.
  2. Similarité significative (valeur e ≤ 0,001) par TBLASTN contre toutes métagénomes publics dans Mon ressources de base de données de Metagénome.
  3. Similarité significative (valeur e ≤ 0,001) par BLASTP et TBLASTN contre NR base de données.
  4. Similarité significative (valeur e ≤ 0,001) par RPS-BLAST contre la base de données Conserves de domaine.
  5. traduction de protéines à partir d'une fraction de sélection de chaque ensemble de données comparés à ceux de structures de protéines résolues dans la Protein Data Bank.
  6. Calcul des fréquences dinucléotidiques utilisant package Dinucleotide Signatures.

Les pORFs résultants ont été conçus pour l'expression dans E. coli en utilisant la disposition du public un logiciel de conception de gène. Retour-traduction des séquences amino-acide utilisé une utilisation Universal Table Codon conçu pour accueillir l'expression dans E. coli avec un seuil minimum d'utilisation de 2%. séquence de reconnaissance d'enzyme de restrictions pour BamHI et HindIII ont été exclus des séquences pour faciliter le clonage. Une entreprise de l'extérieur synthétisé le gène modifié séquences 30 et puis ORF ont été clonées dans un vecteur de promoteur numéro de pBAD moyen copie, pEMB11, via le clonage d'enzyme de restriction standard. Tous les clones ont été transformés en E. coli souche K-12 BW 27784 23.

Multi-phénotype Assay Plaques (MAP)

Un pipeline à haut débit et un logiciel robuste a été mobilisé pour l'analyse des cartes, l'PMAnalyzer 24. Le pipeline a été développé dans un environnement de serveur Linux et effectue diverses étapes, notamment: analyse de fichiers de densité optique, le formatage des données dans des fichiers textes, de pré-traitement des courbes de croissance pour l'assurance qualité (AQ), et de la scène de techniques de modélisation mathématique pour analyser les courbes de croissance . Les scripts de modélisation primaires ont été développés dans la version Python 2.7.5 de faire usage du module PyLab.

(figure 2A). Matières premières courbes de croissance ont été comparées à des courbes de croissance de logistique afin de déterminer si le programme PMAnalyzer croissance de clones avec précision paramétrée au cours de l'expérimentation et modélisées (données non présentées). Pour de plus amples informations sur l'exactitude et la validité des cartes et PMAnalyzer voir Cuevas et al. 24

Après la validation de la méthode, les données ont été analysées MAP en utilisant les plusieurs paramètres, tels que la vitesse maximale de croissance (μ max) et le niveau de croissance (GL), fourni par le pipeline de traitement. Visualisation comparative des courbes de croissance est souvent utilisé pour l'interprétation des données de la croissance; toutefois, le nombre de courbes qui peut être visualisée à la fois pour la comparaison a ses limites. Pour analyser de nombreuses courbes de croissance simultanément, carte de chaleur parcelles dérivées ont été imploré de comparer des dizaines de clones cultivés sur une seule substratee à l'encontre réponse moyen que les conditions de (figure 2B). L'influence placé par la surexpression d'un roman protéine de phage est observé à travers les changements dans les paramètres de la courbe, spécifiquement: phase de latence, la phase exponentielle et le rendement de la biomasse maximum (asymptote). A titre d'exemple, la montée raide de la phase de latence en phase exponentielle modélisé dans la courbe de croissance pour la protéine de capside (figure 2A) est reproduit par un changement rapide de l'intensité de la couleur du noir au blanc pour le même clone dans le complot dynamique de la figure 2B .

Pour obtenir une image globale de la distribution de clone travers substrats, classifications phénotypiques provenant de la GL ont été utilisés (Figure 3). Ici, les quatre phénotypes sont séparés en quatre tableaux où la hauteur de chaque barre représente le nombre de clones présentant ce phénotype pour un substrat spécifique. Les valeurs aberrantes dans les données sont reconnues comme des clones de tomber dans le «gain de function "ou" perte de la catégorie de fonction ". Les valeurs aberrantes peuvent ensuite être recherchées individuellement et étudiés de plus près expérimentalement. En outre, l'analyse globale reconnaît biais de substrat dans le dosage. Des substrats tels que la phenylalanine, l'acide malique, la glycine et ont donné lieu à une "absence de croissance" classification. Substrats qui tombent toujours dans le pas de classification de la croissance, dans tous les clones, ne sont pas fortement pondérés dans la caractérisation fonctionnelle en aval.

Métabolomique

Les produits cataboliques de clones exprimant des gènes de phages inconnus ont été identifiés en utilisant la métabolomique. En bref, les clones ont été cultivés sous une culture en continu, soit un passage en série ou en lot milieu de culture avant d'être envoyé à l'analyse GC-TOFMS à un centre de noyau de la métabolomique. Pour plus de détails sur le traitement des échantillons, l'analyse et la normalisation pour GC-TOFMS mises en œuvre par l'installation de base choisie voir Fiehn et al. 31 BrieFly, 1 ml de solvant d'extraction à froid est ajouté à chaque échantillon, après quoi les échantillons sont vortexés et soniquées dans un bain froid pendant 5 min. Les échantillons sont centrifugés et enfin la moitié de l'échantillon est décanté et séché vers le bas pour analyse. Extraits sont purifiés et dopés avec des marqueurs d'index de rétention interne avant d'être chargé sur le chromatographe en phase gazeuse et ensuite transférée vers le spectromètre de masse. Les données de chaque échantillon sont analysées de telle sorte que les intensités de signal de tous les signaux détectés dans le chromatogramme sont rapportés. Pour la normalisation, l'abondance des pics pour chaque échantillon est résumée et le total des abondances de pointe sont en moyenne entre tous les échantillons dans l'ensemble. Abondances métabolites par échantillon sont divisés par le pic de l'abondance de l'échantillon, puis multipliées par l'abondance de pointe moyenne de l'ensemble de l'échantillon. Les données résultantes sont utilisées pour l'analyse du métabolome de la recherche examinée.

Validation de la métabolomique reproductibilité a été nécessaire pourdéterminer la taille appropriée de l'échantillon pour chaque méthode de culture. Pour détecter la précision vu dans les échantillons et la variation vu à travers des tailles d'échantillon de l'erreur standard de la moyenne (S M) à la fois pour n = 3 et n = 6 ensembles de données ont été examinés (figure 5B). Quelle que soit la culture en continu (CC) la taille de l'échantillon, moins de 1% des données avait un M S ≤ 1,5. Median S M s étaient 221 et 300, et les valeurs variaient de 0 à 7,55 x 10 5 et 3,74 x 10 5, pour n = 3 et n = 6, respectivement. S M s ont également été calculées pour chaque ensemble de l'échantillon répétitions dans la méthode de la culture de série (SC). Encore une fois, moins de 1% des données a eu un S M ≤ 1,5, une médiane S M de 137, et une gamme de 0 à 3,51 x 10 5. Pour comparer les distributions S M entre chaque ensemble de l'échantillon (CC n = 3 vs . CC n = 6, CC n = 3 vs SC n = 3, et CC n = 6 vs SC n = 3) un test de permutation a été effectuée. La distribution soit culture continue S M valeurs données n'a pas été significativement différente de la distribution de la culture série S M valeurs (valeur p = 0,0). Cependant, la distribution des valeurs S M pour la culture en continu des données n = 3 était significativement différente de celle des valeurs S M pour la culture en continu des données n = 6 (p = 1,908804 x 10 -49). Enfin, le coefficient de variation par métabolite a été comparée avant et après la mise en œuvre d'une étape d'assurance qualité (QA) (Figure 5C). Au total, 210 métabolites ont été éliminés après application de la canalisation de QA (40% des données). Moins de 1% de l'effacement des données avait une abondance de métabolite de zéro, ~ 2% était données standard internes, ~ 5% a été données de métabolites jamais observée dans E. coli, et les métabolites restants (> 30%) avaient un coefficient de variation supérieur à 1.

Comme pour l'analyse des cartes, observatio mondialens fourni une compréhension initiale de la profondeur de la métabolomique d'information offres. Pour obtenir une image globale, les clones ont été regroupés hiérarchiquement en fonction de leurs abondances relatives de métabolites fournissant des informations sur les profils de clones-métabolite, clones potentiels avec des fonctions connexes, et les valeurs aberrantes de clones-métabolite (figure 6). Pour mettre en évidence les fonctions des protéines, métabolites sont séparées et regroupées en fonction des voies métaboliques communes. En utilisant cette analyse avec les résultats préliminaires, il était évident que la métabolomique est capable de séparer les gènes de différentes classes (figure 6, mis en évidence clones). En outre, l'identification des valeurs aberrantes avec les données de métabolomique a été déterminée par le calcul des scores standard (z scores) pour chaque paire de clone-métabolite. Pour assurer la signification statistique, les valeurs aberrantes ont été définis comme une paire de clone-métabolite avec une valeur de Z score de 2, ce qui représente seulement 5 pour cent des données (données non présentées).

ether.within-page = "always"> Figure 1
Figure 1. Définitions des classifications de phénotype. (A) Rapport entre le niveau de croissance (GL) et le taux de croissance maximal. Les points de données entourées en rouge représentent les courbes de croissance montrant peu ou pas de l'utilisation du substrat. (B) Représentation Boxplot définissant le seuil de croissance basée sur la distribution des courbes de croissance avec un taux de croissance minime (<0,15 OD / h). (C) La variance et l'écart type est calculé pour GL substrat D-galactose. Pointillés courts représentent deux écarts types de la moyenne. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 2. Cartes validation par la précision et la différenciation. (A) Les courbes de croissance pour les clones structurelles (capside) et métaboliques (annotés thiorédoxine), deux nouveaux clones métaboliques (EDT2440, EDT2441), et la réponse moyenne de clones cultivés sur le saccharose, D- galactose et D-mannose dans les cartes. Les lignes bleues indiquent l'erreur-type observée entre données répliquées (n = 3). (B) Les courbes de croissance pour les 47 clones différents sont représentés sur les localisations de chaleur pour le saccharose, le D-galactose et D-mannose. La structure (cercle vert) annoté et clones métaboliques (cercle orange), deux clones métaboliques nouvelles (cercles bleus sombres et claires), et la réponse moyenne (cercle rouge) sont mis en évidence. S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 3. Répartition de Clone pour chaque phénotype sur plusieurs substrats. Le phénotype-clone comptent pour 47 clones dans 72 des conditions de croissance spécifiques carbone. Tableau fournit les chiffres directs pour chaque phénotype. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4. Schéma décrivant la construction de l'appareil de culture continue. (A) Les étapes utilisées pour construire les ports α-γ du réacteur de culture continue, (B) les étapes utilisées pour construire l'orifice d'écoulement du réacteur de culture en continu, et (C ) les mesures pour construire des ports δ et ε de la bouteille culture de l'alimentation continue. = "Https://www.jove.com/files/ftp_upload/52854/52854fig4highres.jpg" target = "_ blank"> S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5
Figure 5. Comparaison des méthodes Phenomic présentés. (A) Flux de travail pour la préparation des multi-phénotype Assay Plaques (MAP), des cultures et des cultures continues de série. (B) Le pourcentage d'erreur standard de la moyenne (S M) compte à la fois pour n = 3 et n = 6 tailles d'échantillon pour la culture en continu (CC) et la culture de série (SC) les méthodes de préparation pour la métabolomique. L'axe des ordonnées est sur une échelle logarithmique. (C) Les distributions des coefficients de variation (CV) par un métabolite, avant et après la mise en œuvre de la canalisation d'assurance qualité pour le procédé de culture en continu (CC).g5highres.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 6
Figure 6. profils métabolomique de clones cultivés en culture continue. Les abondances métabolites médian pour un ensemble de métabolites sont tracées pour 84 clones cultivés dans des cultures continues. Profils métabolites pour les clones annotés structurelles (capside) et métaboliques (thiorédoxine), deux nouveaux clones métaboliques (EDT2440, EDT2441), et la réponse métabolique moyenne sont surlignés en rouge. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Composé Carbone Azote Soufre Phosphore
Glycérol - 0,40% 0,40% 0,40%
Le chlorure d'ammonium 9,5 mM - 9,5 mM 9,5 mM
Le sulfate de sodium 0,250 mM 0,250 mM - 0,250 mM
Le sulfate de magnésium 1,0 mM 1,0 mM - 1,0 mM
phosphate de potassium 1,32 mM 1,32 mM 1,32 mM -
Le chlorure de magnésium - - * -
Le chlorure de potassium 10 mM 10 mM 10 mM 10 mM
Le chlorure de calcium 0,5 pM 0,5 pM 0,5 pM
Le chlorure de sodium 5 mM 5 mM 5 mM 5 mM
Chlorure ferrique 6 pM 6 pM 6 pM 6 pM
L- arabinose 0,10% 0,10% 0,10% 0,10%
MOPS pH 7,4 1x 1x 1x 1x

Tableau 1. Les composés et les concentrations des différents milieux de base utilisés dans les cartes. * 1,0 mM de chlorure de magnésium est substitué. MOPS 1x = 40 mM de MOPS, 4 mM de Tricine.

L-lysine
des substrats de carbone substrats d'azote substrats de soufre Psubstrats hosphorus
2 désoxy-D-ribose 2-désoxy-D-ribose L'acide butane-1-sulfonique l'adénosine-5-monophoshate
Acide acétique hydroxy-4 phényl acétamide acétylcystéine bêta-glycérophosphate
acide acétique adénine D-cystéine creatinephosphate
l'adénosine-monophosphate 5- adénosine D-méthionine D-glucose-6-phosphate
adonitol allantoïne diéthyl-dithiophosphate diéthyl-dithiophosphate
alpha-D-glucose la bêta-phényléthylamine DL-éthionine DL-alpha-glycérophosphate
alpha-D-lactose biuret glutathion phosphate de potassium
alpha-D-melebiose cytidine l'acide iséthionique le pyrophosphate de sodium
acide citrique cytosine l'acide L-cystéique thiophosphate de sodium
D-alanine D-alanine L-cystéine
D-arabinose D-asparagine l'acide L-djenkolique
D-arabitol D-aspartate L-méthionine
D-asparagine D-cystéine du sulfate de magnésium
D-aspartate D-glucosamine l'acide méthane-sulfonique
D-cellobiose l'acide D-glutamique N-acétyl-DL-méthionine
D-cystéine Acide DL-alpha-amino-n-butyrique N-acétyl-L-cystéine
D-fructose D-méthionine potassium-tétra-thionate D-galactose D-sérine du thiosulfate de sodium
D-glucosamine D-valine l'acide sulfanic
D-glucose l'acide gamma-amino-N-butyrique taurine
D-glucose-6-phosphate glycine l'acide taurocholique
D-glutamate guanidine thiourée
D-mannose histamine
D-raffinose inosine
D-ribose L-alanine
D-salicine L-arginine
D-sérine L-asparagine
D-tréhalose L-citrulline
D-xylose L-cystéine
dulcitol l'acide L-glutamique
glycérol L-glutamine
glycine L-glutathion
i-érythritol L-histidine
inosine L-isoleucine
L-alanine L-leucine
L-arabinose L-lysine
L-arabitol L-méthionine
L-asparagine L-ornithine
L-aspartate L-phényl-alanine
l'acide L-cystéique L-proline
L-cystéine L'acide L-pyro-glutamique
L-fucose L-sérine; L-thréonine
Acide L-glutamique L-tryptophane
L-glutamine L-valine
L-isoleucine N-acétyl-D-glucosamine
L-leucine putrescine
thiourée
L-méthionine thymidine
L-phénylalanine thymine
L'acide L-pyro-glutamique tyramine
L-rhamnose tyrosine
L-sérine uridine
L-sorbose
L-thréonine
L-tryptophane
L-valine
L-xylose
lactate
lactulose
malate
myo-inositol
l'acide oxalique
sorbate de potassium
l'acide propionique
putrescine
l'acide quinique
pyruvate de sodium
le succinate de sodium
saccharose
thymidine
xylitol

Tableau 2. Liste des substrats utilisés dans les expériences du PAM.

Discussion

Ici, nous présentons les approches Phenomic pour la caractérisation fonctionnelle des gènes de phages putatifs. Les techniques comprennent développé un dosage capable de métabolisme anabolique de l'hôte de contrôle, les plaques multi-phénotype dosage (MAP), en plus de la méthode établie de la métabolomique, capable d'effets de métabolisme catabolique de mesure. Nous avons fourni des outils supplémentaires pour gérer les grands ensembles de données résultant de ces technologies, qui permet un traitement à haut débit et de l'analyse 24. Enfin, à travers la comparaison d'une protéine annotée de capside de phage, phage thiorédoxine, deux gènes de phages métaboliques putatives, et la réponse expérimentale moyenne, nous proposons diverses stratégies pour interpréter les deux ensembles de données et classes de gènes, en mettant l'accent sur l'identification des tendances phénotypiques et l'identification des valeurs aberrantes.

Comme mentionné, les deux approches mesurer quantitativement la moitié seulement du métabolisme de l'hôte. Pour interpréter la fonction relative de l'un desnouvelles protéines visées par l'enquête, les données des deux méthodes est nécessaire de fournir des preuves de la fonction. Bien que ce soit pas un objet de notre manuscrit actuel, sorties de données de chaque méthode Phenomic est mis à travers des analyses combinatoires qui se concentrent sur des techniques de clustering comme la forêt aléatoire et analyse en composantes principales. En outre, les hypothèses résultant de l'analyse combinée doivent ensuite être validés par des méthodes génétiques traditionnelles.

Enfin, les méthodes présentées sont fortement influencées par la physiologie bactérienne et donc suivre les mêmes normes. Lors de la réalisation ou l'autre méthode, des considérations doivent être prises pour assurer, des groupes de clones indépendants sont expérimenté; contamination est évitée; une seule variable est testé; et les contrôles appropriés sont tournent simultanément. Le défaut de tenir compte de ces points se traduira par des résultats peu claires, semblables à tout dosage physiologique.

Multi-phénotype Assay Plaques(MAP)

Le développement des cartes fournit un haut débit et le dosage adaptable par rapport aux technologies actuellement disponibles (figure 5A et tables 1,2). Le test utilise des consommables, l'équipement et les techniques fondamentales disponibles dans tous les laboratoires de microbiologie. L'incorporation d'un pipeline de calcul, PMAnalyzer 24, pour le traitement et l'analyse subséquente des données assure l'interprétation rapide des données. En outre, les deux aspects expérimentaux et analytiques de l'approche peuvent être facilement réglés ou réglés à des fins personnalisés. Par exemple, si une grande partie des données ne parvient pas à passer le filtrage dans la section 4, on peut tamiser manuellement à travers les courbes de croissance pour identifier les problèmes. Si le problème se pose en raison de paramètres de filtrage strictes, des ajustements au script peuvent être faites. Alternativement, si les problèmes sont associés à la démarche expérimentale (c.-à condensation prolongée; le transfert abusif des cel bactériennels, etc.), puis répétitions supplémentaires peuvent être facilement répétés.

Comme décrit dans Cuevas et al. 24, l'PMAnalyzer est un programme bash single écrit comme un script qui exécute les scripts d'analyse et d'analyse comme une cohésion, d'un pipeline automatisé. Tous les scripts sont librement accessibles à partir d'un dépôt Git à 25 en prenant la valeur médiane pour chaque point de temps à travers les données de trois exemplaires, et paramétrise ensuite la courbe logistique pour obtenir le temps de latence, taux de croissance maximum, asymptote, et un terme roman, Niveau croissance. La valeur médiane a été choisie sur la moyenne dans notre étude pour réduire l'effet de grandes valeurs aberrantes, cependant, le script peut être facilement adapté pour calculer la moyenne des données répliquées. En raison de la variation réduite (SE) vu à travers les données répliquées (figure 2A) nous avons maintenu l'utilisation de la médiane dans la PMAnalyzer pour ajuster une courbe logistique. En outre, le coupé de la croissance dans cette étude (GL ≥ 0,4) était determined en comparant comment les données séparées pour Niveau de croissance et le taux de croissance maximal (figure 1A, B). Selon le modèle instruments et système utilisé ce terme peut varier, ce qui nécessite une redéfinition de ce coupé valeur.

Un avantage majeur de notre analyse est la capacité de comparer les phénotypes en utilisant un seul paramètre caractérisant la croissance microbienne dans l'ensemble, que nous définissons comme niveau de croissance (GL). GL est une moyenne harmonique, et par conséquent atténue les effets de grandes valeurs aberrantes dans les données. L'utilisation d'une moyenne harmonique avec des valeurs de logistique équipée décalés de fournir un résumé de la croissance en est arrivé à par essai et erreur. D'autres procédés ont tenté de différencier croissance contient: temps nécessaire pour accéder à des paramètres spécifiques de la courbe (de moitié μ max, μ max, et la capacité de transport), le coefficient de détermination (R 2), et des combinaisons de R 2, multiplié par des paramètres spécifiques de la courbe. L'utilisation d'une moyenne harmonique avec décalévaleurs logistique-fit pour le GL à condition que la plus grande gamme dans l'évaluation de la croissance, donc il est devenu la méthode de choix. Une considération à noter est que les modèles dynamiques de la courbe de croissance ont le potentiel d'être perdu lors de l'utilisation d'un seul paramètre ou d'un modèle ajusté. Par exemple, les paramètres de la courbe individuels de la courbe logistique et GL sont incapables d'en croissance biphasique. Dans un environnement de carbone unique, cet effet sur la croissance implique la médiation de la protéine virale de chaque conversion du substrat ou de décalage de l'utilisation du substrat. D'autres effets potentiellement perdus lors ne pas considérer les paramètres de croissance multiples comprennent: temps de latence prolongée, proposant une charge accrue de machines ou produits virale; accélération rapide phase exponentielle, suggérant protéines virales couplés à accueillir les filières de production d'énergie; ou des niveaux plus élevés de formation de la biomasse, ce qui implique support viral dans l'absorption des nutriments de l'hôte et l'anabolisme (données non présentées). Ainsi, le traçage des courbes de croissance naissantes (

Lorsque l'on considère les différentes réponses apportées par les gènes structurels et métaboliques dans les cartes, il est observé que les différentes classes de substrat en question fournissent la plus grande preuve de la fonction des protéines. Par exemple, les protéines métaboliques sont souvent associés à l'acquisition de nutriments limitants, qui sont non spécifiques à l'hôte métabolisme central 16,32. Expériences de carte préliminaire révèle que les clones hébergeant des gènes de phages métaboliques putatifs ont une phase de latence accrue lorsqu'il est cultivé sur des sources métabolisme de carbone centraux (figure 2A). Inversement, des clones portant des gènes putatifs structurelles, qui nécessitent de grandes proportions de l'énergie de l'hôte et dNTP piscines, entraînent une réponse faux positif sur la croissance pour centmétabolisme des substrats natu- carbone et d'acides aminés. Cela est probablement dû à l'accumulation de protéines insolubles dans filamentation résultant d'accueil et / ou des corps d'inclusion, comme observé par microscopie (figure 2A et données non présentées). Alors une analyse plus approfondie est nécessaire pour valider ces résultats préliminaires, les cartes sont capables de récupérer réponses phénotypiques qui se rapportent à l'hypothèse fonctions de classes spécifiques de gènes de phage.

En plus de l'élucidation de protéines virales inconnues, les cartes sont un roman ressources pour enquêter sur la diversité fonctionnelle et métabolique d'une bactérie individu ou une communauté de bactéries. les composantes du PAM sont conçus pour la modification facile de soutenir la croissance d'une gamme de bactéries; y compris maritime, auxotrophe, et les microbes anaérobies. Pour faciliter ces efforts, la base et pré-croissance milieux définis exigent espèces chimiques supplémentaires ou réglés devant un genre bactérien différent peut être pris en charge dans les cartes.Une note dans cette utilisation des cartes est de maintenir des milieux définis, interdisant l'utilisation d'ingrédients tels que la tryptone, extrait de levure et de peptone.

Métabolomique

Le domaine de la métabolomique dépend de bases de données, qui comprennent des metabolites métabolites isolés identifiés par spectrométrie de masse. L'installation de base choisie ici a une des plus grandes bases de données de la métabolomique. Fait intéressant, plus de la moitié des métabolites résultant de nos expérimentations étaient non identifiables (~ 65%), tandis que d'autres avaient jamais été enregistrée dans notre hôte, Escherichia coli (des exemples comprennent: indole 3 acide acétique 33, l'acide salicylique 34, et de l'acide dihydroabiétique 35). Ce fait peut être attribué soit à une forte polarisation de la base de données vers métabolites végétaux, ou les protéines spécifiques visés par l'enquête. Peu importe, le résultat est un nombre limité de métabolites connus disponibles pour la représentation et l'analyse des données. Dans le future, de multiples méthodes de métabolomique utilisant diverses bases de données permettrait une plus grande couverture de métabolite.

Actuellement, à la fois connus et inconnus métabolites sont utilisés lorsque l'on compare et contraste nos nouvelles protéines virales. En utilisant cette approche, nous faisons l'hypothèse que les clones hébergeant protéines fonctionnellement similaires se partageront une similitude augmenté dans leur profil métabolomique complète. Analyse de la métabolomique préliminaire a révélé que, bien que des gènes de structure et ne se séparent pas métaboliques clairement les uns des autres, les gènes présentant des effets similaires sur l'hôte lorsque surexprimé ne corréler (Figure 6). Par exemple, les groupes de gènes de capside annotés en étroite collaboration avec les gènes métaboliques putatives mis en évidence dans cette étude, EDT2440 et EDT2441. Investigations en utilisant un programme de prédiction transmembranaire de la topologie et la disposition du public peptide signal ont montré des preuves que les deux gènes putatifs métaboliques abritent un seul domaine transmembranaire. Il est intéressant de 5 èmee 9 clones dans le premier groupe de cluster (plus partie du dendrogramme de gauche) ont prédit domaines transmembranaires utilisant le même programme de topologie. D'autres études sont nécessaires, toutefois, il est probable que les métabolites présents au cours de la surexpression de ces clones sont associés à la réponse au stress cellulaire résultant de membrane ou les charges structurelles. Ces données confirment que, bien que les données de métabolomique possède une quantité accrue de bruit, la méthode est capable de mettre en évidence des signaux qui différencient effets généraux de gènes, tant au sein d'une classe de gènes. Pour déterminer si le procédé est capable d'extraire des informations spécifiques de la fonction des gènes, les métabolites ont été regroupés dans des voies métaboliques spécifiques. L'hypothèse étant, si un clone affecte métabolites spécifiques à une seule voie, alors le gène surexprimé est actif dans cette voie. Avant la création de notre pipeline d'assurance de la qualité de la métabolomique, les données préliminaires ont révélé que sur uned métabolites étaient généralement sous-représentés "inconnu", fournissant peu d'information sur les voies auxquelles ils sont associés (données non présentées). Données de métabolomique prétraités, cependant, révèle que la majorité des profils de métabolites sont similaires et seul un nombre restreint d'abondances de métabolites connus et inconnus varient selon les clones, par exemple putrescine et l'uracile (figure 6). Pour assurer une plus grande résolution de protéines efforts de fonction sont en cours pour comparer expérimentalement les nouveaux gènes de phages contre les gènes de phages connus, qui peuvent être utilisés pour combler les «trous» de métabolite base caractérisation fonctionnelle. En utilisant cette technique, la fonction assignée de gènes viraux connus fournit une référence pour la fonction de gènes inconnus. Néanmoins, le facteur limitant de l'analyse métabolomique est la taille et la pertinence de la base de données. Pour pallier à ces limites, les bases de données métabolomique relatable à cette recherche doivent être élaborés; telcomme une base de données de métabolites et de leurs abondances spécifiques à la collecte de ASKA E. coli clones dans lesquels un seul ORF 36 est surexprimé. Preuve de la nécessité de ces bases de données a été fournie en 2013, lorsque des chercheurs de l'Lawerence Berkeley National Laboratory compilées la première base de données complète des métabolites spécifiques pour bibliothèques entières mutantes de bactéries modèles 37. Cette recherche a fourni un nouvel aperçu gènes nécessaires à l'utilisation des métabolites spécifiques, révélant le lien évident entre génotype et phénotype.

Lorsque l'on considère la métabolomique comme un outil, il est important de définir le régime de traitement suivi à l'installation de base. Un artefact de la plupart des procédures expérimentales est la variance au jour le jour, associée à des instruments d'utilisation. A ce jour toutes les analyses GC-MS implémente l'utilisation de normes internes qui sont inclus dans chaque série d'analyses; Cependant, plus d'échantillons internes spécifiques du projet </ Em> a couru chaque jour de l'expérimentation supprime variance additionnelle. Ces considérations doivent être abordées tôt pour éviter les problèmes de normalisation et les préjugés. Une autre solution consiste à traiter tous les échantillons dans une installation de base sur la même machine et en un seul lot, une option disponible à toute installation de base.

Les différents outils à la fois introduites et ré-exploré dans ce manuscrit fournir de nouveaux moyens pour dépister et caractériser les gènes de phages fonctionnellement inconnus. La simplicité et l'adaptabilité des techniques expérimentales avec l'utilisation de rationaliser des pipelines de calcul assure ces méthodes sont applicables à un large éventail d'activités et des champs de recherche. Notre objectif est que les approches Phenomic présentés ici aideront d'autres enquêtes de nouvelles protéines de phage en plus des systèmes qui sont tout aussi fonctionnellement définie.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 µm Sterivex Filter Fisher Scientific SVGP01050 Millipore
0.22 µm Millex Filters Fisher Scientific SLGV033RS Millipore
0.22 µm SteriCap Filter Fisher Scientific SCGPS02RE Millipore
0.22 µm Omnipore membrane filters Millipore JHWP02500 Millipore
96-well micro-titer plates VWR 82050-764 Standard F-Bottom 96 well Microplates
2 ml 96-well plate Fisher Scientific
Adhesive seal plate film Sigma-Aldrich Z369667
2 L Nalgene square bottles Cole Parmer T-06040-70
125 ml Nalgene square bottles Cole Parmer T-06040-50
1/4 in. Panel mount lock nut, black nylon Cole Parmer EW-45509-04
Female Luer thread style panel mount to 200 Series Barb, 1/16 in. Cole Parmer EW-45500-30
Female Luer thread style panel mount to 200 series barb, 1/8 in. Cole Parmer EW-45500-34
Male Luer integral lock ring to 500 series barb, 1/16 in. ID tubing Cole Parmer EW-45505-31
Male Luer with lock ring x female Luer coupler Cole Parmer T-45508-80
Barbed bulkhead fittings, 1/4 in. OD Fisher Scientific 6149-0002
Sanipure tubing, 1/16 in. ID x 1/8 in. OD SaniPure AR400002
Sanipure tubing, 1/4 in. OD x 1/8 in. ID SaniPure AR400007
Variable flow mini pump (peristaltic pump) Fisher Scientific 13-876-1
Magnetic stirrer Velp Scientifica F203A0160
Forceps Fisher Scientific 14-512-141 Millipore* Filter Forceps
Multi-plate spectrophotometer plate reader Molecular Devices Analyst GT
Filter manifold Fisher Scientific XX10 025 02
Software:
Python version 2.7.5 http://www.python.org/
PyLab module http://wiki.scipy.org/PyLab
R version 3.0.1 http://www.r-project.org/
reshape2 library http://had.co.nz/reshape
ggplot2 library http://ggplot2.org/
Gene Composer PSI Tech Portal http://www.genecomposer.net
Services:
West Coast Metabolomics Center UC Davis http://metabolomics.ucdavis.edu
DNA 2.0 https://www.dna20.com

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