数字核酸定量实验分析的简单堆积读数

Biology

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Morinishi, L. S., Blainey, P. Simple Bulk Readout of Digital Nucleic Acid Quantification Assays. J. Vis. Exp. (103), e52925, doi:10.3791/52925 (2015).

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Abstract

数字测定是强大的方法,使检测稀有细胞和单个核酸分子的计数。但是,数字实验仍然没有常规应用,由于成本,并与商购的方法相关联的特定设备。在这里,我们提出了一个简单的方法,使用传统的实时PCR仪测量液滴为基础的数字检测散装荧光数字墨滴检测读数。

我们表征使用合成的液滴的混合物和液滴数字多重置换扩增(MDA)的测定中的散装读数测定法的性能。定量MDA特别是从数字的反应形式的好处,但我们的新方法适用于任何数字检测。为建立数字测定协议,如数字PCR,该方法用于加快和简化测定读数。

我们的批量读取方法带来partitione的优势ð测定,而不需要专门的读取仪​​表。墨滴计数平台以及需要的标准样品相比,大部分的读出方法的主要限制是减少的动态范围,虽然对于这个标准的要求比以往的实时实验要求不高。定量全基因组扩增(WGA)被用来测​​试在WGA反应污染物是最敏感的方法来检测具有未知序列的DNA片段的存在,从而在不同的应用领域,包括药物质量控制和天体生物学方法巨大潜力。

Introduction

数字测定核酸定量(数字PCR),1-4和基本顺序(顺序)的强烈影响生命科学和医学。数字分析提供分子计数定量在绝对规模(而不是相对于对照),提供高灵敏度,在整个实验中实现浅显的比较,重要的是,使含可比数据5(1)大型数据库的建设。

在过去的15年中,全基因组扩增(WGA)出现旁边的PCR作为用于核酸扩增的通用工具。像的PCR,WGA为通过放大分钟样品的元素最多可以很容易地检测或用于随后的分析像碱基测序的水平分析和制备应用中有用。不像PCR,WGA不是特定于特定的DNA位点,而允许在样品中的所有序列,包括未知序列的扩增。PCR和WGA之间的这种根本差异使得互补彼此的方法和引起在他们的应用程序不同的挑战。

高产的WGA反应6的使基因组DNA的单分子7,单个细胞8和其它低生物质的样品9,用于量化或进一步分析例程扩增。与WGA化学相关的主要挑战是它的极端敏感性污染物和整个个体模板分子6不均匀放大。但是,WGA逐渐流行为单细胞测序已成为“杀手级应用”WGA技术10,和模板的定量通过WGA是在应用程序7中许多领域的重要。

仪器的数字核酸量化已在各种阀联结且无气门的微流体形式上的先前已经描述TS 11-14包括液滴基试验15,16( 表2)。然而,商用的微流体系统用于数字分析需要专门的设备以进行反应的设置和产物检测17。自阀微流体是灵活的,但需要精密微细加工和气动控制系统18。虽然这是相对简单的,使单分散的微滴乳化为基础的数字测定19,20,数字读出在技术上是麻烦的,需要无论大型宽视场成像(类似于流行下一代测序技术)21,22或高速的基于流滴检测23-25。理想情况下,数字检测将是从设置简单到读出,减少了需要复杂的仪器,并允许大量样品被迅速地读出。在这里,我们描述了用于数字液滴测定读出一个简化的方法,该方法使用常规的实时PCR我nstrument测量液滴为基础的数字检测散装荧光。

虽然新的方法可以应用到数字PCR测定法,它是用于该模拟的实时扩增分析(即提供优良的效果进行PCR)是有问题的数字的WGA实验特别有利的。 WGA通常应用于样本与模板分子的异质在序列,长度和基本内容。这些不同的模板分子扩增以不同速率6,迫使使用基准(“标准”)具有匹配特性的样品。通常情况下,没有这样的标准是可用的,或传入样本的特性是未知的。输入质量,分子的输入数,两个,或既不的组合- WGA化学的输入材料和长度依赖性属性的异质26还通过创建歧义什么被定量复杂化的结果的解释。 Finally,序列 - 非特异性呈现定量多重置换扩增(MDA)的更多的污染比定量PCR敏感,因为任何序列的污染物分子有一个潜在的干扰。微流体数字分析解决污染通过分离模板分子和减少的反应体积,使得更少的污染物被采样。

在这里,我们使用了流行的等温WGA的方法,MDA 27。值得注意的是,其他几个WGA化学品,包括PicoPlex和MALBAC 28关键取决于最初的等温链置换步骤。等温步骤加剧施加模拟实时测定法进行定量的WGA的挑战。 WGA既不能在安装过程中被完全防止,从而导致不希望的可变预放大,也不离散(“循环”)的方式,其中异构分子的复制可以被驱动到完成并停止之前,下一个周期的PCR像11 图1)。对于WGA数字测定形式可容纳典型的反应中的设置过程,由于每个分子为枚举在测定端点的偏析(因此扩增前不影响结果)原始读出装置的精度将是基本上独立变化的扩增效率。

该试验依赖于产生油具有均匀体积的液滴,作为每滴的信号电平在测定端点将取决于液滴体积上,我们不希望结果的一致性取决于跨越液滴尺寸的分布平均化。制造单分散的液滴是现在的标准程序(约3500的单分散液滴论文已自2013出版),但要求的微流体的仪器25。事实上,六年多的公司已经开发出依赖于生产这样的液滴独立的商业产品,和液滴制作微流控芯片市售23,29。在这项研究中,我们使用了内部(见协议)生产的定制微流体装置。注射泵来驱动流过器件也可商购的,但可替换地,可以用一个一次性注射器的真空驱动的流动被取代,以降低成本30。

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Protocol

注意:制造微流体装置是没有必要的该测定中,作为该协议的液滴可以与现有的商业液滴决策者23,29来形成。

1.使液滴形成微流体装置

  1. 制备母模的通道与SU-8万事达制作协议先前31所概述的,但有一个液滴发生器掩模图案 32。
  2. 编造使用软光刻32,33的技术,PDMS设备。

2.准备反应预混散装滴读数


注意:该协议可以用于量化使用多种类型的扩增反应的核酸。作为一个例子,所需的数是Lambda DNA浓度为MDA试剂给出。试剂细节中列出的具体试剂的表中。模板的液滴内的分布取决于sufficien吨混合样品。

  1. 获得或净化Phi29 DNA聚合酶。
    1. 净化Phi29如前所述7,或购买来自供应商。用于示出实验的Phi29进行纯化。
  2. 制备出10 ml的变性缓冲液的由65毫米的KOH,1.65毫摩尔EDTA,14毫DTT。
  3. 制备出10 ml的中和缓冲液的由65毫米的HCl,0.21摩尔Tris-CL pH为7.0,和9毫三Cl pH8.0中。
  4. 准备两个标准,一种无模板对照(NTC)如无核酸酶水,和一种高模板浓度(约4微克/微升是Lambda DNA)。变性3.3微升每个标准与定量PCR管3.3微升变性缓冲液。在室温下孵育3分钟。淬火每个和缓冲液3.3微升。
  5. 变性3.3微升与定量PCR管3.3微升变性缓冲液感兴趣的模板。在室温下孵育3分钟。淬火与3.3微升的中和缓冲。
  6. 准备每个样品11微升主混合物在冰上。的2倍的MDA反应主混合物由2个双链DNA的(双链DNA)结合染料,2倍的qPCR参照染料,50μM随机寡聚,2毫克/毫升牛血清白蛋白,2×Phi29 DNA聚合酶反应缓冲液,4.8毫的dNTPs,无核酸酶水和40微克/毫升Phi29 DNA聚合酶。添加Phi29 DNA聚合酶最后,以确保聚合酶不会遇到的pH水平要比7.5.Mix更高或更低的井。
  7. 可选:对于减少误判,暴露主结构用UV光形成液滴34之前。
    1. 准备10微升每个样品预混合物在冰上0.5 ml或1.5毫升透明管。预混由55微米的随机寡,2.2毫克/毫升BSA,1.1倍Phi29 DNA聚合酶反应缓冲液,5.3毫dNTPs和无核酸酶水。
    2. 将管中的水在冰上如所述34和暴露于UV光(254 nm)到一个ACCU5.7Ĵmulated剂量/厘米2。
    3. 双链DNA结合染料至1x,参考染料为1x,并且Phi29添加到40微克/毫升的预混合物。拌匀。
  8. 结合10微升变性的模板或标准和10μl主混合物。拌匀。

3.液滴形成

注意:液滴可以是静电和剪切应力非常敏感。脱去衣服,可能会产生静电,并形成液滴之前自己接地。处理乳液的管子从管的顶部,从乳液尽可能远。吸管乳剂非常慢,优选具有宽孔移液管尖端。当从移液管尖端的分配,观看在顶端侧的乳液,以确定移液速度。

  1. 形成液滴。对于所示的实验中,微流体装置具有进油口和两个水入口用流聚焦结用于产生液滴。用两个syriNGE泵通过微流体芯片来控制的55微升油与表面活性剂和20微升反应混合物的流速,以产生20000 1 NL液滴。
  2. 注意:可以生产具有许多类型的油与表面活性剂的液滴,但该组合物会大大在高温和随着时间的推移影响液滴的稳定性。一种可能的组合是氟化油HFE 7500与阴离子表面活性剂19,35。
  3. 产生液滴任何尺寸的任何方法在13,36,但是在液滴种群规模可变性将影响散装荧光,因此,测定的精确度。对于所示的实验中,微滴是单分散的1 NL的体积。
  4. 收集所有的微滴和油的进PCR管。对于每个样品,等份加入30μl的油进入新鲜PCR管具有光学帽,并转移20微升的液滴上的油的顶部。一贯卷保证试验是作为交流策展越好。
  5. 关闭管帽太紧,松盖将使中石油蒸发。

4.恒温扩增

  1. 使用PCR热循环仪,定量PCR热循环仪,或热板,孵育样品在30℃下7小时,和灭活1分钟在75℃。液滴的管可以留在用铝箔纸覆盖在这点上几个小时,一台冰箱。

5.数据采集与分析

  1. 紧接着反应失活,测量染料的荧光水平使用qPCR的热循环的所有样本。最佳的过滤器设置将取决于染料的激发和发射光谱。对于这个例子,使用492纳米516纳米滤光器对所述双链DNA结合染料设置,而585纳米-610nm的过滤器的参考染料设定。其它荧光测量技术可用于量化荧光。
  2. 对于每个样品,通过划分双链DNA结合染料的荧光强度参考染料的荧光强度。减去背景荧光,或无模板对照的标准化荧光,从所有样品。
  3. 创建使用从标准的校正的荧光测量值的线性标准曲线。 NTC的标准表示荧光为0%荧光滴的样品(“全部阴性”),而高浓度的模板荧光测量是用100%的荧光微滴的样品的预期荧光(“所有阳性”)。使用相应的标准曲线,预测基于它们散装荧光阳性和阴性的液滴的中间比率。

6.产液滴的证明性原理测量

  1. 使荧光灯(正)的液滴:准备一个PCR反应混合物由0.1纳克是Lambda DNA,1×双链DNA结合染料,1x引用染料,1.5单位Taq DNA聚合酶,10毫摩尔Tris-盐酸,50mM的氯化钾,1.5米的中号的MgCl 2,0.2 10mM的dNTP,和0.5μM引物。热循环该混合物的30倍(95℃,20秒,55℃,20秒,72℃1分钟),然后形成液滴,如上所述。
  2. 使非荧光(负)的液滴:准备一个PCR反应混合物由1×双链DNA结合染料的,1x引用染料,1.5单位Taq DNA聚合酶,10毫摩尔Tris-盐酸,50mM的氯化钾,1.5mM的MgCl 2的,为0.2mM的dNTP,和0.5μM的引物。热循环该混合物的30倍(95℃,20秒,55℃,20秒,72℃1分钟),然后形成液滴。
  3. 形成预混合液滴的比率
    1. 分发20微升氟化油的成定量PCR管,覆盖有光学帽以防止蒸发。
    2. 轻轻移取10微升充分混合液滴的期望正:负比对石油的顶部。在示出的结果,正面:负液滴比为1(所有阳性),0.8,0.5,0.2,0.1,0.01,0.001 0.0001,和0(所有阴性ative)。
  4. 测量染料的荧光水平使用qPCR的热循环的所有样本。此协议中,使用492毫微米-516 nm的滤波器的双链DNA结合染料设置,而585纳米-610nm的过滤器的参考染料设定。
    1. 规范化双链DNA结合使用参比染料荧光染料的荧光。由“一切积极”样品的荧光进一步规范。
  5. 创建使用从“一切积极”和“消极全部”样本归一化荧光测量线性标准曲线。使用相应的标准曲线,预测基于它们散装荧光阳性和阴性的液滴的中间比率。
  6. 重复实验的每个比(n = 3)与独立液滴形成并混合每个重复。

7.验证性原则MDA实验

  1. 测量的是Lambda DNA原液中的浓度与一个规范trophotometer。
    1. 计算需要每滴平均10模板分子的模板浓度。对于这个协议,假设液滴体积为1 NL和1纳克LAMBDA DNA中含有约1.9×10 7份。因此,每滴10模板将每NL 10份,或每微升526 FG LAMBDA DNA。该模板将被摊薄〜6倍的液滴时形成,因此初始模板最高浓度为3.2微克/微升。
  2. 串行稀释LAMBDA DNA以3.2微克/μL变性缓冲液和等量和缓冲液。为0.1的稀释因子,结合10微升样品与45微升变性缓冲液,并在室温下孵育3分钟。加入45为1L和缓冲液的淬火。
  3. 如步骤7.2中所述,使样品的其余部分的实验进一步稀释样品。在反应的初始模板浓度示分别为3.2皮克,320 FG,160 FG,32 FG,16 FG,3.2 FG,和每微升1.6 FG。
    注意:mastermix增设后的最终模板浓度分别为526 FG,52.6 FG,26.3 FG,5.26 FG,2.63 FG,526 Ag,以及263每微升股份公司。 10,1,0.5%,0.1,0.05,0.01,和0.005预期LAMBDA每液滴份,分别。
  4. 生成并如步骤2.5-5.3中所述分析来自每个样品液滴。
  5. 获得使用数码相机中所示的荧光图像2,3),其安装到一个落射荧光显微镜用在RT 10x物镜。收购查看每个样品12场。正确的荧光图像通过用荧光滑动而得到的背景图像。
  6. 使用含有室成像37的乳化油将蒸发快。
  7. 分析使用ImageJ的宏(补充代码文件)单个液滴的强度。
    1. 选择最分离非荧光滴在N阈值荧光强度TC图像从高浓度的模板图像的荧光液滴。对于每个未知样品,计算的液滴的馏分高于阈值的荧光强度。

8. PCR和MDA散装反应

  1. 制备PCR反应。
    1. 串联稀释的模板DNA为0.1的稀释因子。每个稀释,结合10微升模板与45微升变性缓冲液,并在室温下孵育3分钟。合并稀释45微升和缓冲液的。
    2. 准备20微升每个样品PCR反应体系的。的1.1倍的PCR反应主混合物由60单位/微升Taq DNA聚合酶,11毫摩尔Tris盐酸,55MM氯化钾,1.65毫氯化镁 ,0.22 10mM的dNTP,1.1倍的双链DNA结合染料,1.1倍参照染料,和550纳米每个底漆。
    3. 结合2微升稀释的模板和20微升反应体系的。
      注意:最终模板浓度吨他表示PCR反应是50 PG,PG 5,500 FG,50 FG,5 FG,500 Ag和0克LAMBDA每微升的DNA,并一式三份进行。
    4. 在定量PCR机热循环PCR反应与以下程序。运行的95℃的40个循环,30秒,57℃,20秒,72℃30秒2分钟,然后在72℃进行2分钟,并保持在4℃。
    5. 规范化双链DNA结合染料的荧光用参比染料荧光之前,进一步的分析。
  2. 准备MDA反应。
    1. 如步骤8.1.1中所述稀释样品。
    2. 准备每个样品11微升主混合物在冰上。的2倍的MDA反应主混合物由2个双链DNA结合染料,2倍参照染料,50μM随机寡聚,2毫克/毫升牛血清白蛋白,2×phi29 DNA聚合酶反应缓冲液,4.8毫的dNTPs,无核酸酶水,和40微克/毫升Phi29 DNA聚合酶。
    3. 所述Phi29 DNA聚合酶添加至40微克/ ml的持续确保聚合酶ðOES不会遇到的pH水平远高于7.5或更低。拌匀。
    4. 变性稀释模板3.3μL与定量PCR管3.3微升变性缓冲液。在室温下孵育3分钟。加入3.3微升和缓冲液的。
    5. 结合10μL的变性模板和10μl主混合物。拌匀。
    6. 运行定量PCR机MDA反应与以下程序。
    7. 持在30℃4小时,测量荧光每7.5分钟。
    8. 灭活在75℃下1分钟。
    9. 规范化双链DNA结合使用参比染料荧光染料的荧光。由最大荧光每个样品进一步正常化。

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Representative Results

而常规的本体/实时读数可用于既定量PCR和定量的WGA实验图1),数字定量分析提供的优点见表1)。中描述的方法,我们读出的微量流体格式数字分析用一个简单的批量终点测量( 图2)。虽然这种方法可广泛应用,我们专注于定量WGA(MDA),因为这种方法提出了传统的实时检测特殊的挑战。

要检查我们的实时PCR仪是否能检测出不同的分散在油中的荧光微滴的分数,我们测量荧光和非荧光液滴( 图2)的合成混合物中的大部分荧光。散装荧光和正滴数(用荧光显微镜独立评估)如预期荧光液滴的输入部分线性比例(图3A)。该实验进行三次,以独立液滴形成和混合为各组。

为了评估为“未知”样品的理论量化表现,我们建立线性标准曲线,使用完全积极的,完全阴性对照样品。利用这种液滴很多特异性标准曲线,计算了基于各样品的散装荧光合成正和负的液滴的混合物的比例。结果表明在整个动态范围两个日志中液滴比量化良好的性能(R 2 = 0.984; 图3B)。输入分析物浓度很容易地从正的或负的液滴38的分数计算。

要在真正的定量WGA检测测试我们的方法,我们测量跨越无线荧光水平和LAMBDA DNA数字液滴MDA检测阳性液滴的部分德的浓度范围图4)。 图4B中,示出的液滴的代 ​​表性荧光图像。散装荧光和阳性液滴馏分从数字MDA的样品比例按预期每个液滴的平均模板,表明大部分读出能够忠实捕捉数字测定法(R 2 = 0.927)的结果。我们反复实验对于每个浓度,独立形成液滴并进行WGA的每个重复。

表1
表1.实时和数字检 ​​测摘要。 请点击此处查看该图的放大版本。

able2.jpg“/>
表现有方法的定量核酸(2)摘要。 请点击此处查看该图的放大版本。

图1
图1.实时定量PCR和Lambda DNA。MDA的MDA不是通过温度循环像PCR离散,并且很容易出现前置放大器,如果不是在冰上精心准备。在这里,定量PCR和MDA进行随LAMBDA DNA的浓度。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2
FIGUR阳性和阴性液滴从在一个微流体装置的荧光和非荧光试剂生成的电子邮件2.示意图液滴和代表性图像的模拟读出的。(A)中。的液滴的预混合在不同的正:阴性比率。散装荧光水平测定用标准的实时温度循环器,和正液滴的级分通过荧光显微镜来确定。 二)代表荧光覆盖越来越积极的液滴(比例尺= 200微米)的比率的图像。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3
图3.散装荧光和的分别制备的正,负drople组合荧光分数TS。(A)的荧光(正)和非荧光(负)的液滴进行预混合比例不同。阳性液滴与实测散装荧光输入分数进行比较,测得的阳性微滴级分(n = 3时,棒代表+/- SD)。虚线代表给出的线性关系的预期荧光分数。预测比率基于标准的预期荧光输入级分(B)的比较。该行表示给出的线性关系的预期值。 请点击此处查看该图的放大版本。

图4
图4.散装荧光和数字的MDA 的液滴数字的MDA测定。荧光部分用 incre进行的模板是Lambda DNA(n = 3时,误差棒代表标准差)ASING浓度如图2A所述进行测量。该线表示利用泊松分布将数据从我们的实验模型的预期荧光分数。二)代表荧光覆盖水滴图像反应失活(比例尺= 200微米)后,每滴(NTC,0.005,0.05,0.5,和10)增加预期的lambda DNA分子。 请点击此处查看该图的放大版本。 。

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Discussion

数字测定是强大的方法,使检测稀有细胞的计数和个体的核酸分子组成。但是,数字实验仍然不是常规分析实验室应用,部分原因是由于与市售的方法相关联的专门设备的成本。在这里,我们描述端点数字测定用于定量核酸与使用标准的实时定量PCR机器的简化模拟读出。这种方法是快速建立,和读出比液滴计数方法简单得多。

我们的分析将丧失独立液滴测量的单分子(单滴)灵敏度集体终点测量使用标准仪器简单。在我们的数字的MDA的实验中,我们不能区分小于每从背景200负液滴-1阳性微滴,尽管确认荧光显微镜的实际离阳性液滴ction被预期图4)。灵敏度和背景中的散装荧光测量极限为低阳性液滴馏分大头测量测定的灵敏度。如果更高的灵敏度是必需的,一个数字读出建议。在油中的水平或散装液滴体积的差异可以大大影响样品的荧光数据。即使正常化与参比染料无法弥补的分歧油量荧光读作。这是可能的优化测定体积,仪器采集参数,微孔几何形状,或光过滤器可以提高检测性能。

灵敏度和散装数字测定的动态范围,也可以通过优化分区大小提高。较大的液滴得到的荧光制品的一个较大的量,从每一个模板分子,它可以帮助克服仪器的本底,并提高对低输入浓度灵敏度。在另一方面,较小的液滴允许每体积测定多个分子的分离。如果模板浓度是横跨样品高度可变的,小型和大墨滴反应可以平行进行扩大检测的动态范围39。

一致的液滴体积也是必要进行精确测量。从样品中迅速形成单分散的液滴的多个自定义微流体溶液存在,无论是在系列19,40和并联41,42。虽然很少有使液滴形成从几个并联的单独的样品,简单的修改现有的设计将允许同时产生液滴的任何数量的样本。例如,Bio-Rad公司ddPCR系统23施加均匀的压力到的一系列独立的液滴制造商的入口,使来自多个样品的同时形成液滴。

我们的批量读取的方法访问键的隔离的数字分析,而不需要专门的读出仪器和优点是非常适合的定量WGA。这里,我们针对定量WGA,这是很容易受到污染物背景由于其缺乏序列特异性7。另外,从实时定量的WGA实验产品的未知的和潜在的宽分子量分布使解释难以在应用中的原始模板的数量是感兴趣。数字分析格式,同时解决这些问题。污染物包含各个反应分区中,防止低分子量的分析物的主导地位由高分子量污染物会想到在常规的实时检测。在图2B和4B所示,可能的污染物,视为液滴内亮点,被隔离,并且不放大或基本上整体荧光贡献。此外,该在数字测定法产生的信号成比例的模板,模板不是大小或它们的扩增率的数目。虽然我们的方法依赖于标准来校准散装数字测量,要求以匹配样品和标准特性显著放宽。

定量WGA是常用来量化WGA反应7,34污染物,而且是最灵敏的方法已知的量化未知序列的DNA的存在,给该方法很大的希望在应用领域广泛,包括药物质量控制,法医,和天体生物学。散装数字读数可以享受其他数字分析方案,如数字PCR,通过加快,并行化,并简化检测读数。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Evagreen Dye Biotium 31000
Bovine serum albumin New England Biotechnologies B9000S
Phi29 DNA Polymerase Reaction Buffer New England Biotechnologies B0269S Vortex periodically until aggregate dissolves
Lambda DNA New England Biotechnologies N3011S Heated to 50 oC and quenched on ice prior to dilution
Randomized MDA oligos Integrated DNA Technologies 5'-NNNNN*N-3'
PCR primers Integrated DNA Technologies 5’-CGGCAAACGGGAATGAAACGCC-3’ and 5’-TGCGGCAAAGACAGCAACGG-3’
UltraPure Nuclease-free water Life Technologies 10977-015 UV-treated for 30 min in Stratalinker 2400 before use (optional)
ROX reference dye Life Technologies 12223-012
PCR optical strip caps Life Technologies 4323032
PCR tubes Agilent Technologies 401428
dNTP (25 micromolar each) Agilent Technologies 200415
Thermocycler - Mx3000P qPCR system Agilent Technologies 401403
Barrier pipette tips VWR 89003-046
Bio-rad oil for evagreen Bio-rad 186-4005
JumpStart Taq ReadyMix Sigma-Aldrich P2893-100RXN

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References

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