Readout גורף פשוט של דיגיטלי מבחני כימות חומצות גרעין

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Morinishi, L. S., Blainey, P. Simple Bulk Readout of Digital Nucleic Acid Quantification Assays. J. Vis. Exp. (103), e52925, doi:10.3791/52925 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

מבחני דיגיטליים הם שיטות חזקות המאפשרות זיהוי של תאים וספירה של מולקולות חומצות גרעין בודדות נדירים. עם זאת, מבחני דיגיטליים עדיין לא מיושמים באופן שיגרתי, בשל העלות והציוד ספציפי הקשורות לשיטות זמינות מסחרי. כאן אנו מציגים שיטה פשוטה לקריאת נתונים של מבחני אגל דיגיטליים באמצעות מכשיר PCR בזמן אמת קונבנציונלי למדוד הקרינה בתפזורת של מבחני דיגיטליים מבוסס טיפה.

אנו מאפיינים את הביצועים של assay קריאת הנתונים בתפזורת באמצעות תערובות אגל סינתטיות וassay אגל דיגיטלי הגברה עקירה מרובה (מד"א). מד"א כמותי יתרונות במיוחד מפורמט דיגיטלי תגובה, אבל השיטה החדשה שלנו חלה על כל assay דיגיטלי. לפרוטוקולי assay דיגיטליים הוקמו כגון PCR הדיגיטלי, בשיטה זו משמשת כדי לזרז ולפשט קריאת נתוני assay.

המתודולוגיה קריאת הנתונים בתפזורת שלנו מביאה את היתרונות של partitioneמבחני ד ללא הצורך במכשור מיוחד קריאת נתונים. המגבלות העיקריות של המתודולוגיה קריאת נתונים בתפזורת מופחתות טווח דינמי בהשוואה לפלטפורמות אגל-ספירה ואת הצורך במדגם סטנדרטי, למרות שהדרישות לתקן זה הן פחות תובעניות מאשר לניסוי קונבנציונלי בזמן אמת. ההגברה הגנום כולו כמותי (WGA) משמשת לבדיקת מזהמים בתגובות WGA והיא הדרך הכי רגישה כדי לזהות הנוכחות של שברי DNA עם רצפים ידועים, נותנת הבטחה הגדולה השיטה בתחומי יישומים שונים, כולל בקרת איכות תרופות ואסטרוביולוגיה.

Introduction

מבחני דיגיטליים לכימות חומצות גרעין (PCR הדיגיטלי) 1-4 ובסיס הזמנה (רצף) הם מאוד משפיעים על מדעי החיים ורפואה. מבחני דיגיטליים מספקים כימות של ספירה מולקולרית בקנה מידה מוחלט (לא ביחס לשליטה), מתן רגישות גבוהה, המאפשרת השוואות שטחיות על פני ניסויים, ומכריע, המאפשר הבנייה של מסדי נתונים גדולים המכילים נתונים דומים 5 (טבלה 1).

במהלך 15 השנים האחרונות, ההגברה הגנום כולו (WGA) יצאה לצד PCR ככלי כללי להגברת חומצות גרעין. כמו PCR, WGA היא שימושית עבור יישומים אנליטיים וpreparative על ידי הגברת אלמנטי מדגם דקות עד לרמה שניתן לאתר או המשמש לניתוחים שלאחר מכן כמו רצף בסיס בקלות. שלא כמו ה- PCR, WGA היא לא ספציפית למוקד ה- DNA מסוים, ולא מאפשרת הגברה של כל הרצפים במדגם, כוללים רצפים ידועים.הבדל מהותי זה בין PCR וWGA הופך את השיטות משלימות זו לזו ויוצר אתגרים שונים ביישומם.

התשואה הגבוהה של תגובות WGA 6 מאפשרת הגברה שגרתית של הדנ"א הגנומי ממולקולות בודדות 7, 8 תאים בודדים ודגימות נמוכות ביומסה אחרות 9 לכימות או ניתוח נוסף. האתגרים המרכזיים הקשורים לכימית WGA הם רגישותו הקיצונית למזהמים וההגברה אחידה על פני מולקולות תבנית בודדות 6. פופולריות עם זאת, WGA צובר כרצף תא בודד התפתחה כ" יישום הרוצח "של WGA טכנולוגיה 10, וכימות תבנית על ידי WGA הוא חשוב בתחומים רבים של יישום 7.

מכשור לכימות חומצות גרעין דיגיטלית תואר בעבר במגוון Valved ופורם microfluidic valvelessTS 11-14, כולל מבחני מבוססי אגל 15,16 (טבלה 2). עם זאת, מערכות מייקרו-נוזליות מסחריות לניתוח דיגיטלי דורשות ציוד מיוחד להתקנת תגובה וזיהוי מוצר 17. מיקרופלואידיקה מותאמת אישית valved גמישה, אך דורשת microfabrication דיוק ומערכות בקרה פנאומטי 18. אמנם זה יחסית פשוט לעשות מיקרו-טיפות monodisperse למבחנים דיגיטליים מבוסס תחליב 19,20, צג דיגיטלי הוא מבחינה טכנית מעיק, הדורש גם הדמיה רחב בתחום בקנה מידה גדולה (בדומה לטכנולוגיות רצף של הדור הבא פופולריות) 21,22 או במהירות גבוהה זרימה מבוססת זיהוי אגל 23-25. באופן אידיאלי, assay דיגיטלי יהיה פשוט מהגדרה לreadout, הקטנת צורך המכשור מורכב ומאפשר למספר גדול של דגימות כדי לקרוא במהירות. כאן אנו מתארים שיטה פשוטה לקריאת נתונים של מבחני אגל דיגיטליים המשתמשת בזמן אמת קונבנציונלי PCR אניnstrument למדוד הקרינה בתפזורת של מבחני דיגיטליים מבוסס טיפה.

בעוד הגישה החדשה ניתן ליישם מבחני PCR דיגיטליים, זה יתרון במיוחד עבור מבחני WGA דיגיטליים לאנלוגיים שמבחני הגברה בזמן אמת (שנותנים תוצאות מצוינות לPCR) הם בעייתיים. WGA מיושם בדרך כלל לדגימות עם מולקולות תבנית שהטרוגנית ברצף, אורך, ותוכן בסיס. מולקולות תבנית שונות אלה מוגברים בשיעורים שונים 6, המחייבות את השימוש בהתייחסות ("סטנדרטי") מדגם עם מאפייני התאמה. לעתים קרובות, לא סטנדרטי כגון זמין, או המאפיינים של הדגימות הנכנסות אינם ידועים. ההטרוגניות של חומר ההזנה ורכוש אורך תלוי של chemistries WGA 26 גם לסבך את הפרשנות של תוצאות על ידי יצירת עמימות במה שלכמת - מסת הקלט, קלט מספר המולקולות, שילוב של השניים, או לא. Finally, רצף שאינו ספציפי הופך הגברה עקירה מרובה כמותית (מד"א) רגישה יותר לזיהום מאשר PCR כמו מאז מולקולות מזהמים של כל רצף יש פוטנציאל להפריע. מבחני דיגיטליים microfluidic לטפל זיהום על ידי הפרדת מולקולות תבנית וצמצום נפחי תגובה כזאת שפחות מזהם נדגמים.

כאן אנו משתמשים בשיטה פופולרית בידוד תרמי WGA, 27 מד"א. ראוי לציין, כמה chemistries WGA אחר כולל PicoPlex וMALBAC 28 תלוי באופן מכריע על צעדי עקירת גדיל בידוד תרמי ראשוניים. צעדי Isothermal להחמיר את האתגר של יישום מבחני אנלוגיים בזמן אמת לWGA כמותיים. WGA אינו יכול למנוע לחלוטין במהלך התקנה, שמוביל להגברה מראש משתנה לא רצויה, ולא discretized ("רכב על אופניו") באופן שבו שכפול של מולקולות הטרוגנית יכול להיות מונע להשלמה ועצר לפני המחזור הבא כמו 11 PCR (איור 1). פורמט assay דיגיטלי לWGA מסתגל נהלי התקנת תגובה אופייניים בשל ההפרדה של כל מולקולה לספירה בנקודת סיום assay (כך מראש הגברה אינה משפיעה על התוצאות) פירוש קריאת נתונים מקוריים דיוק יהיה בלתי תלוי בעיקר שינוי ביעילות הגברה.

Assay תלוי בטיפי שמן שהופקו בעם כמויות אחידות, כאות לרמת טיפה בנקודת סיום assay תהיה תלוי בטיפת הנפח, ואנחנו לא רוצים את העקביות של תוצאות תלויות בממוצע על פני חלוקת גדלי אגל. מה שהופך את טיפות monodisperse הוא כעת הליך סטנדרטי (כ -3,500 מסמכי אגל monodisperse פורסמו מאז 2013), אבל דורש מכשור microfluidic 25. למעשה, יותר משש חברות פיתחו מוצרים מסחריים עצמאיים המסתמכים על ייצור של טיפות כגון, ושבבי מייקרו-נוזליים קבלת אגל הםזמינים מסחרי 23,29. במחקר זה, השתמשנו מכשירי microfluidic מותאם אישית מיוצרים בבית (ראה פרוטוקול). מזרק משאבות לנהוג זרימה דרך המכשירים זמינים גם באופן מסחרי, אך לחלופין, ניתן להחליף עם מזרק חד פעמי יחיד לזרימה מונע ואקום כדי להפחית את העלויות 30.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הערה: בודה מכשיר microfluidic אין צורך לassay זה, כטיפין לפרוטוקול זה יכול להיווצר עם מקבלי אגל מסחריים קיימים 23,29.

1. הפוך את מכשיר microfluidic אגל יוצרי

  1. הכן עובש אב לערוצים עם פרוטוקול ייצור מאסטר SU-8 שתואר קודם לכן 31, אבל עם דפוס מסכת גנרטור אגל 32.
  2. לפברק מכשירים בPDMS תוך שימוש בטכניקות של הרכה ליתוגרפיה 32,33.

2. הכן תערובת תגובה לגורף אגל Readout


הערה: הפרוטוקול יכול לשמש כדי לכמת חומצות גרעין באמצעות סוגים רבים של תגובות הגברה. כדוגמא, מקבלים חומרים כימיים הנחוצים למד"א של כמה ריכוזי מבדה DNA. פרטי מגיב מפורטים בטבלה של חומרים כימיים מסוימים. ההפצה של תבנית בתוך הטיפות תלויות בsufficienערבוב לא של המדגם.

  1. להשיג או פולימראז לטהר Phi29 DNA.
    1. לטהר Phi29 כפי שתואר לעיל 7, או רכישה מהספק. Phi29 משמש לניסויים הראו היה מטוהר.
  2. הכן 10 מיליליטר של Denaturation מאגר בהיקף של 65 מ"מ KOH, 1.65 mM EDTA, ו -14 מ"מ DTT.
  3. הכן 10 מיליליטר ניטרול מאגר בהיקף של 65 מ"מ HCl, 0.21 מ 'טריס-Cl pH 7.0, ו- 9 מ"מ טריס-Cl pH 8.0.
  4. הכן שני תקנים, אחד אין שליטת תבנית (NTC) כגון מים nuclease חינם, וריכוז גבוהה אחד תבנית (כ -4 pg / מבדה DNA μl). לפגל 3.3 μl של כל תקן 3.3 μl של Denaturation מאגר בצינור qPCR. לדגור על RT במשך 3 דקות. להרוות כל אחד עם 3.3 μL ניטרול מאגר.
  5. לפגל 3.3 μl של התבנית של עניין עם 3.3 μl של Denaturation מאגר בצינור qPCR. לדגור על RT במשך 3 דקות. להרוות עם 3.3 μlניטרול מאגר.
  6. הכן 11 μl של תערובת הורים לדגימה על קרח. תערובת אב תגובת 2x מד"א מורכבת מגדילי דנ"א הכפול 2x צבע מחייב (dsDNA), צבע התייחסות 2x qPCR, אוליגו האקראי 50 מיקרומטר, 2 מ"ג / מיליליטר BSA, 2x Phi29 DNA פולימראז תגובת הצפת, 4.8 מ"מ dNTPs, nuclease ללא מים , ופולימראז / מיליליטר Phi29 DNA 40 מיקרוגרם. להוסיף פולימראז Phi29 DNA האחרון כדי להבטיח את פולימראז אינו נתקל רמות החומציות גבוהות בהרבה או נמוכות מ7.5.Mix גם.
  7. אופציונאלי: לתוצאות חיוביות שגויות פחות, לחשוף תערובת הורים עם אור UV לפני יצירת טיפות 34.
    1. הכן 10 μl של טרום-תערובת לדגימה בצינור ברור 0.5 מיליליטר או 1.5 מיליליטר על קרח. טרום התערובת מורכבת של 55 מיקרומטר אוליגו אקראי, 2.2 מ"ג / מיליליטר BSA, 1.1x Phi29 DNA פולימראז תגובת הצפת, 5.3 מ"מ dNTPs, וnuclease ללא מים.
    2. מניחים את הצינור במים על קרח כפי שתואר 34 ולחשוף לאור UV (254 ננומטר) לACCUמינון mulated של 5.7 J / 2 סנטימטר.
    3. להוסיף צבע dsDNA מחייב ל1x, צבע התייחסות ל1x, וPhi29 40 מיקרוגרם / מ"ל ​​בטרום התערובת. מערבבים היטב.
  8. לשלב 10 μl של תבנית מפוגל או סטנדרטית ו -10 μl של תערובת אב. מערבבים היטב.

3. היווצרות טיפה

הערה: טיפות יכולות להיות מאוד רגישות לחשמל סטטי ומאמץ גזירה. להסיר את הבגדים שעלולים לגרום לחשמל סטטי, ומעצמך לפני הקמת טיפות. ידית צינורות של תחליב מהחלק העליון של הצינור, כרחוק מתחליב ככל האפשר. תחליבי פיפטה לאט מאוד, רצוי עם קצה pipet נשא רחב. כאשר מחלק מקצה פיפטה, לצפות בתחליב בצד של הקצה כדי לקבוע מהירות pipetting.

  1. טיפות טופס. לניסויים הראו, יש המכשיר microfluidic כניסת שמן ושני פתחי הכניסה מימיות עם צומת התמקדות זרימה ליצירת טיפות. השתמש בשתי syringe משאבות לשלוט ספיקות של 55 μl של שמן עם חומרים פעילי שטח וμl 20 של תערובת תגובה דרך שבב מייקרו-הנוזלי כדי ליצור 20,000 1 טיפות NL.
  2. הערה: ניתן לייצר טיפות עם סוגים רבים של שמן עם חומרים פעילי שטח, אבל ההרכב ישפיע יציבות אגל מאוד בטמפרטורות גבוהות ולאורך זמן. שילוב אפשרי אחת הוא HFE שמן פלואור 7500 עם שטח אניוני 19,35.
  3. לייצר טיפות בכל גודל עם כל שיטה 13,36, אבל השתנות הגודל באוכלוסיית אגל תשפיע על הקרינה בכמות גדולה, ולכן הדיוק של assay. לניסויים הראו, טיפות היו monodisperse עם נפח של 1 NL.
  4. לאסוף את כל הטיפות ושמן לתוך צינורות PCR. עבור כל דגימה, aliquot 30 μl של שמן לתוך צינורות PCR טריים עם כובעים אופטיים, ולהעביר 20 μl של טיפות על גבי השמן. הכרכים עקביים להבטיח assay הוא כמו ACלאצור האפשר.
  5. צינור לסגור כובעים בחוזקה, כמו כובעים רופפים יאפשר השמן להתאדות.

4. Isothermal הגברה

  1. באמצעות thermocycler PCR, thermocycler qPCR, או צלחת חמה, דגירה הדגימות ב 30 מעלות צלזיוס למשך 7 שעות, ולהשבית דקות 1 על 75 מעלות צלזיוס. הצינורות של טיפות ניתן להשאיר במקרר מכוסה בנייר כסף לכמה שעות, בשלב זה.

5. רכישת נתונים וניתוח

  1. מייד לאחר איון תגובה, למדוד רמות הקרינה צבע לכל הדגימות באמצעות thermocycler qPCR. הגדרות מסנן אופטימליות יהיו תלויות בעירור צבע וספקטרום פליטה. בדוגמה זו, השתמש בננומטר-516 מסנן 492 ננומטר נקבע לצבע dsDNA מחייב, ומסנן ננומטר 585 ננומטר-610 שנקבע לצבע ההתייחסות. טכניקות מדידת ניאון אחרות עשויים לשמש כדי לכמת את הקרינה.
  2. עבור כל דגימה, לחלק את עוצמת הקרינה של הצבע dsDNA מחייב על ידיעוצמת הקרינה של צבע ההתייחסות. להפחית את הקרינה הרקע, או הקרינה המנורמלת של השליטה לא תבנית, מכל המדגמים.
  3. צור עקומה סטנדרטית ליניארי באמצעות מדידות הקרינה תיקנו מהסטנדרטים. סטנדרטי NTC מייצג את הקרינה למדגם עם טיפות ניאון 0% ("כל השלילית"), ומדידת הקרינה ריכוז הגבוהה תבנית היא הקרינה הצפויה למדגם עם טיפות ניאון 100% ("כל חיובית"). באמצעות העקומה סטנדרטית המתאימה, לחזות את יחסי ביניים של טיפות חיוביות ושליליות המבוססות על הקרינה בכמות גדולה שלהם.

6. טיפות הפקה למדידות עיקרון הוכחה של

  1. הפוך ניאון טיפות (חיוביות): הכן תערובת תגובת PCR בהיקף של 0.1 מבדה DNA, צבע 1x dsDNA מחייב, צבע התייחסות 1x, יחידות 1.5 פולימראז תקי DNA ng, 10 מ"מ טריס-HCl, 50mm KCl, 1.5 מ 'M MgCl 2, 0.2 מ"מ dNTP, ו -0.5 מיקרומטר פריימרים. Thermocycle תערובת 30 הפעמים (95 מעלות צלזיוס למשך 20 שניות, 55 מעלות צלזיוס למשך 20 שניות, 72 מעלות צלזיוס במשך 1 דקות), ולאחר מכן יוצרים טיפות כפי שתואר לעיל.
  2. הרווח Non-ניאון טיפות (שליליות): הכן תערובת תגובת PCR בהיקף של צבע 1x dsDNA מחייב, צבע התייחסות 1x, 1.5 יחידות פולימראז תקי DNA, 10 מ"מ טריס-HCl, 50mm KCl, 1.5 מ"מ MgCl 2, 0.2 מ"מ dNTP, ו 0.5 מיקרומטר פריימרים. Thermocycle תערובת 30 פעמים (95 מעלות צלזיוס למשך 20 שניות, 55 מעלות צלזיוס למשך 20 שניות, 72 מעלות צלזיוס במשך 1 דקות), ולאחר מכן יוצרות טיפות.
  3. יוצר יחסי אגל מראש מעורבים
    1. הפץ 20 μl נפט פלואור לתוך צינורות qPCR, מכסה בכובע אופטי כדי למנוע אידוי.
    2. בעדינות פיפטה 10 μl מעורבות היטב בטיפין חיוביים רצויים: יחסים שליליים על גבי השמן. בתוצאות הראו, חיוביים: יחסי אגל שליליים היו 1 (כל החיובי), 0.8, 0.5, 0.2, 0.1, 0.01, 0.001, 0.0001, ו0 (כל נגיצירתי).
  4. למדוד את רמות הקרינה צבע לכל הדגימות באמצעות thermocycler qPCR. לפרוטוקול זה, השתמש בננומטר-516 מסנן 492 ננומטר נקבע לצבע dsDNA מחייב, ומסנן ננומטר 585 ננומטר-610 שנקבע לצבע ההתייחסות.
    1. לנרמל dsDNA מחייב הקרינה צבע באמצעות הקרינה צבע התייחסות. נוסף לנרמל ידי הקרינה של "כל החיובי" המדגם.
  5. צור עקומה סטנדרטית ליניארי באמצעות מדידות הקרינה מנורמלות מ" כל השליליות "ו-" כל החיוביות "הדגימות. באמצעות העקומה סטנדרטית המתאימה, לחזות את יחסי ביניים של טיפות חיוביות ושליליות המבוססות על הקרינה בכמות גדולה שלהם.
  6. חזור על הניסוי עבור כל יחס (n = 3) עם היווצרות טיפה עצמאית וערבוב עבור כל לשכפל.

ניסוי מד"א 7. הוכחה של העיקרון

  1. למדוד את הריכוז של פתרון מניות מבדה DNA עם מפרטtrophotometer.
    1. חשב את ריכוז תבנית צורך מולקולות 10 תבנית ממוצעת לטיפה. לפרוטוקול זה, להניח כרכי אגל הם NL 1 וng 1 של מבדה DNA מכילים כ 1.9 x 10 7 עותקים. לכן, 10 תבניות לאגל יהיו 10 עותקים לNL, או 526 FG DNA למבדה לμl. התבנית תהיה מדוללת ~ 6x כאשר טיפות נוצרות, ולכן הריכוז הגבוהה ביותר התבנית הראשוני יהיה 3.2 pg / μl.
  2. סדרתי לדלל את ה- DNA למבדה כדי 3.2 pg / μl עם Denaturation הצפת ונפח שווה נטרול מאגר. לגורם לדילול של 0.1, לשלב מדגם 10 μl עם 45 μl של Denaturation הצפת ולדגור על RT במשך 3 דקות. להוסיף 45 LL ניטרול המאגר להרוות.
  3. בהמשך לדלל את המדגם כמתואר בשלב 7.2 לעשות את שאר הדגימות לצורך הניסוי. ריכוזי התבנית הראשוניים בתגובות הראו היו 3.2 PG, 320 FG,160 FG, 32 FG, 16 FG, 3.2 FG, ו -1.6 FG לכל microliter.
    הערה: ריכוזי התבנית הסופיים לאחר תוספת mastermix היו 526 FG, 52.6 FG, 26.3 FG, 5.26 FG, 2.63 FG, 526 AG, וAG 263 לכל microliter. 10, 1, 0.5, 0.1, 0.05, 0.01, ו0.005 עותקים צפויים למבדה לאגל, בהתאמה.
  4. ליצור ולנתח טיפות מכל מדגם כפי שמתואר בשלבים 2.5-5.3.
  5. לרכוש תמונות הקרינה המוצגות (איור 2,3) באמצעות מצלמה דיגיטלית רכובים על מיקרוסקופ פלואורסצנטי עלית עם מטרת 10x בRT. לרכוש עשרה שדות מבט לכל דגימה. תמונות הקרינה נכונות על ידי תמונת רקע שהושגה עם שקופיות ניאון.
  6. השתמש בתא הכיל הדמיה 37 כשמן תחליב יתאדה במהירות.
  7. לנתח עוצמות טיפה בודדות באמצעות מאקרו ImageJ (קובץ קוד נוסף).
    1. בחר עוצמת הקרינה סף שמפרידה בין טיפות הטובות ביותר שאינו ניאון בNתמונות TC מטיפי ניאון בתמונות הריכוז גבוהה תבנית. עבור כל מדגם לא ידוע, לחשב את החלק היחסי של טיפות עם עוצמת הקרינה מעל הסף.

8. תגובות תפזורת PCR ומד"א

  1. הכן תגובת PCR.
    1. סדרתי לדלל תבנית ה- DNA עם גורם לדילול של 0.1. עבור כל דילול, לשלב 10 μl של תבנית עם 45 μl של Denaturation הצפת ולדגור על RT במשך 3 דקות. מערבבים את הדילול עם 45 μl ניטרול מאגר.
    2. הכן 20 μl של mastermix PCR לדגימה. תערובת אב תגובת 1.1x PCR מורכבת של 60 יחידות / μl DNA פולימראז תקי, 11 מ"מ טריס-HCl, 55mm KCl, 1.65 מ"מ MgCl 2, 0.22 מ"מ dNTP, 1.1x dsDNA מחייב צבע, צבע התייחסות 1.1x, ו -550 ננומטר כל צבע יסוד.
    3. לשלב 2 μl של תבנית בדילול ו -20 μl של mastermix.
      הערה: ריכוזי התבנית הסופיים בtהוא PCR תגובות הראו היו 50 עמ ', עמ' 5, 500 FG, 50 FG, FG 5, 500 AG, ו0 גרם DNA למבדה לכל microliter, ובוצע בשלושה עותקים.
    4. תגובת Thermocycle PCR בqPCR מכונה עם התכנית הבאה. הפעל 40 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 57 מעלות צלזיוס למשך 20 שניות, 72 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות לפני 2 דקות ב 72 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות ומחזיק ב 4 מעלות צלזיוס.
    5. לנרמל dsDNA מחייב הקרינה צבע באמצעות הקרינה צבע התייחסות לפני ניתוח נוסף.
  2. הכן תגובת מד"א.
    1. לדלל דגימות כמתואר בשלב 8.1.1.
    2. הכן 11 μl של תערובת הורים לדגימה על קרח. תערובת אב תגובת 2x מד"א מורכבת מצבע 2x dsDNA מחייב, צבע התייחסות 2x, אוליגו האקראי 50 מיקרומטר, 2 מ"ג / מיליליטר BSA, 2x phi29 DNA פולימראז תגובת הצפת, 4.8 מ"מ dNTPs, nuclease ללא מים, ו -40 מיקרוגרם / מיליליטר Phi29 DNA פולימראז.
    3. מוסיף את פולימראז Phi29 DNA עד 40 מיקרוגרם / מ"ל ​​יימשך על מנת להבטיח ד פולימראזOES לא נתקל רמות החומציות גבוהות או נמוכות בהרבה מ -7.5. מערבבים היטב.
    4. לפגל 3.3 μL של תבנית מדוללת עם 3.3 μl של Denaturation מאגר בצינור qPCR. לדגור על RT במשך 3 דקות. להוסיף 3.3 μl ניטרול מאגר.
    5. לשלב 10 μL של תבנית מפוגל ו -10 μl של תערובת אב. מערבבים היטב.
    6. הפעל תגובת מד"א בqPCR מכונה עם התכנית הבאה.
    7. החזק על 30 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות, למדוד הקרינה בכל דקות 7.5.
    8. להשבית ב 75 מעלות צלזיוס במשך 1 דקות.
    9. לנרמל dsDNA מחייב הקרינה צבע באמצעות הקרינה צבע התייחסות. נוסף לנרמל ידי הקרינה המרבית עבור כל דגימה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

בעוד קריאות בתפזורת קונבנציונלית / בזמן אמת יכולות לשמש לPCR כמו מבחני כמותיים WGA (איור 1), מבחני כמותיים דיגיטליים מספקים יתרונות (טבלה 1). בשיטה המתוארת, אנו קוראים את מבחני דיגיטליים בפורמט מיקרו טיפה עם מדידה פשוטה בתפזורת נקודות קצה (איור 2). למרות ששיטה זו היא רחב ישימה, אנו מתמקדים בWGA כמותית (מד"א), כי שיטה זו מציבה אתגרים מיוחדים למבחנים מקובלים בזמן אמת.

כדי לבדוק אם מכשיר PCR בזמן אמת שלנו יכול לזהות שברים שונים של microdroplets הניאון מפוזר בשמן, מדדנו את הקרינה בתפזורת של תערובות סינתטיות של ניאון וטיפין שאינם ניאון (איור 2). הקרינה בתפזורת וספירת טיפה חיובית (העריך באופן עצמאי על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי) בקנה מידה באופן ליניארי עם חלק הקלט של טיפות ניאון כצפוי (איור 3 א). הניסוי בוצע שלוש פעמים, עם היווצרות עצמאית אגל וערבוב עבור כל קבוצה.

על מנת להעריך את ביצועי כימות התיאורטי לדוגמאות "לא ידועות", שהוקמנו עקומות סטנדרטית ליניארי באמצעות דגימות שליטה לגמרי חיוביות ושליליות לחלוטין. עם עקומות סטנדרטי אגל-הרבה-ספציפיים, כגון, חישבנו את החלק היחסי של תערובות אגל סינתטיות חיוביות ושליליות המבוססות על הקרינה בכמות גדולה של כל מדגם. התוצאות מראות ביצועים טובים בכימות יחס טיפה על פני שני יומנים של טווח הדינמי (R 2 = 0.984; איור 3). ריכוז אנליטי הקלט מחושב בקלות מכל החלק של טיפות חיוביות או שליליות 38.

כדי לבדוק את השיטה שלנו בassay WGA כמותית אמיתי, מדדנו רמות הקרינה ושבריר של טיפות חיוביות של assay מד"א אגל דיגיטלי עם ה- DNA למבדה על פני wi מגוון דה ריכוזים (איור 4). באיור 4, תמונות ניאון נציג של הטיפות מוצגות. שתי הקרינה בתפזורת וחלק טיפה חיובית מדגימות מד"א הדיגיטליות בקנה מידה כצפוי עם התבנית הממוצעת לאגל, המצביעים על כך את ההודעה בתפוצה רחבה בנאמנות יכולה ללכוד את התוצאה של assay דיגיטלי (R 2 = .927). אנחנו חזרנו על הניסוי עבור כל ריכוז, עצמאי ויוצר טיפות וביצוע WGA עבור כל לשכפל.

טבלת 1
טבלה 1. סיכום של זמן אמת ומבחנים דיגיטליים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

able2.jpg "/>
טבלה 2. סיכום של שיטות קיימות לquantitating חומצות גרעין. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 1
איור 1. PCR כמו בזמן אמת ומד"א של מבדה DNA. מד"א לא discretized באמצעות רכיבה על אופניים טמפרטורה כמו PCR, והוא נוטה preamplification אם לא הוכנו בקפידה על קרח. כאן, כמותי PCR ומד"א בוצעו עם הגדלת ריכוזים של מבדה DNA. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
Figurדואר 2. סכמטי של קריאת נתונים אנלוגיות של טיפות ותמונות נציג. () טיפות חיוביות ושליליות שנוצרו מחומרים כימיים ניאון ולא פלורסנט במכשיר microfluidic. הטיפות היו מראש מעורבות בחיוביים שונים: יחסים שליליים. רמות הקרינה בכמות גדולה נמדדו עם thermocycler סטנדרטי בזמן אמת, וחלק קטן של טיפות חיוביות נקבע על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. ניאון נציג (B) מעולף תמונות של הגדלת יחס של טיפות חיוביות (בר = 200 מיקרומטר בקנה מידה). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3. הקרינה בכמות גדולה וחלק ניאון של שילובים של drople החיובי והשלילי שהוכן בנפרדTS. () פלורסנט (חיובי) ולא פלורסנט טיפות (שליליות) היו מראש מעורבות ביחסים שונים. השוואה של חלק הקלט של טיפות חיוביות עם הקרינה שנמדדה בתפזורת וחלק טיפה חיובית נמדד (n = 3, ברים מייצגים +/- SD). הקו המקווקו מייצג את חלק הניאון הצפוי ניתנו קשר לינארי. השוואה (B) של יחסים חזו מבוססים על תקנים לשבריר קלט הניאון הצפוי. הקו מציין את הערך הצפוי ניתנו קשר לינארי. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4. הקרינה בכמות גדולה וחלק ניאון של assay מד"א הדיגיטלי אגל. הדיגיטלי מד"א בוצעו עם increריכוזים שיבקשו מן התבנית למבדה DNA (n = 3, ברים שגיאה מייצגים SD) ונמדד כמפורט באיור 2 א. הקו מציין את חלק הניאון הצפוי באמצעות התפלגות פואסון מודל נתונים מהניסוי שלנו. ב) ניאון נציג מעולף תמונות של טיפות לאחר איון תגובה (בר = 200 מיקרומטר בקנה מידה) להגדלת מולקולות ה- DNA למבדה צפויות לאגל (NTC, 0.005, 0.05, 0.5, ו -10). אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מבחני דיגיטליים הם שיטות חזקות המאפשרות זיהוי של תאים נדירים וספירה של פרט של מולקולות חומצות גרעין. עם זאת, מבחני דיגיטליים עדיין לא מיושמים באופן שיגרתי במעבדות אנליטיות, נובעים בחלקו את העלות של ציוד מיוחד הקשורים לשיטות זמינות מסחרי. כאן אנו מתארים assay דיגיטלי נקודות קצה לכימות חומצות גרעין עם קריאת נתונים אנלוגיים פשוטה באמצעות מכונה PCR כמו סטנדרטית בזמן אמת. שיטה זו היא מהירה להגדרה, וקריאת נתונים היא הרבה יותר פשוט מאשר שיטות ספירת טיפה.

assay שלנו מאבד את רגישות מולקולה בודדת (Single-טיפה) של מדידות טיפה בודדות לפשטות של מדידה בהמוניהם נקודת סיום באמצעות מכשור סטנדרטי. בניסוי מד"א הדיגיטלי שלנו, אנחנו לא יכולים להבחין פחות מ 1 טיפה חיובית לשליליות 200 טיפות מהרקע, למרות אישור על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי שFRA בפועלction של טיפות החיוביות כצפוי (איור 4). הרגישות והרקע בגבול מדידת הקרינה בתפזורת הרגישות של assay המדידה בתפזורת לשברי אגל חיוביים נמוכים. אם נדרש רגישות גבוהה יותר, צג דיגיטלי מומלץ. הבדלים ברמות שמן או כרכי אגל בתפזורת יכולים להשפיע על נתוני הקרינה מדגם מאוד. גם נורמליזציה עם צבע התייחסות לא יכולה לפצות על הבדלי כרכי נפט לעשות בקרינה קוראת. ייתכן שאופטימיזציה assay מסננים אופטיים נפח, פרמטרים רכישת מכשיר, גיאומטריה microwell, או עשויה לשפר את ביצועי assay.

הרגישות והטווח דינמי של מבחני דיגיטליים תפזורת גם ניתן לשפר על ידי אופטימיזציה של גודל המחיצה. טיפות גדולות יותר יניבו כמות גדולה יותר של מוצרי ניאון מכל מולקולת תבנית, מה שיכול לעזור להתגבר על רקע אינסטרומנטלית ולשפר את הרגישות לריכוזים נמוכים קלט. במצד השני, טיפות קטנות מאפשרות הבידוד של יותר מולקולות לכל נפח assayed. אם ריכוז תבנית הוא משתנה מאוד על פני דגימות, יכולים להתבצע גם תגובות טיפה גדולות וקטנות במקביל להרחבת הטווח הדינמי assay 39.

כרכי אגל עקביים גם הכרחיים למדידה מדויקת. פתרונות מותאמים אישית microfluidic רבים קיימים למהירות להרכיב טיפות monodisperse ממדגם, הן בסדרה 19,40 וב41,42 מקבילים. בעוד כמה לאפשר דור אגל ממספר דגימות נפרדות במקביל, שינויים פשוטים לעיצובים קיימים יאפשר לדור אגל בו זמנית של מספר הרב של דגימות. לדוגמא, מערכת ddPCR Bio-Rad 23 חלה לחץ אחיד לפתחי הכניסה של סדרה של מקבלי אגל עצמאיים, המאפשרת היווצרות טיפה בו זמנית מדוגמאות רבות.

המתודולוגיה קריאת הנתונים בתפזורת שלנו כניסות מפתחיתרונות של מבחני דיגיטליים למחיצות ללא הצורך במכשור מיוחד וקריאת נתונים הוא מתאימים היטב לWGA כמותיים. כאן, אנו מתמקדים בWGA כמותיים, שהוא רגיש מאוד למזהמי רקע בשל חוסר סגוליות רצף 7. בנוסף, חלוקת המשקל המולקולרית ידועה ורחבה פוטנציאלי של מוצרים ממבחנים כמותיים WGA בזמן אמת להפוך את הפרשנות קשה ביישומים שבם מספר התבניות המקוריות הוא של עניין. כתובות עיצוב assay דיגיטליות שתי הבעיות הללו. מזהמים נמצאים בתוך מחיצות תגובת פרט, מניעה הדומיננטית של analytes נמוך משקל מולקולרי-ידי מזהמים גבוה מולקולרי משקל-כפי שהיה קורה בassay קונבנציונלי בזמן אמת. ב2B דמויות ו4B, מזהמים אפשריים, נראה ככתמים בהירים בתוך הטיפות, הם נפרדים ולא להגביר או לתרום באופן משמעותי לקרינה כוללת. יתר על כן,אות שנוצרה במבחנים דיגיטליים היא פרופורציונלית למספר התבניות, לא בגודל של תבניות או שיעור ההגברה שלהם. למרות שהשיטה שלנו מסתמכת על תקנים לכייל את המדידה הדיגיטלית בתפזורת, הדרישה להתאים מדגם ויכול להיות רגוע מאפיינים סטנדרטיים באופן משמעותי.

WGA כמותי משמש בדרך כלל כדי לכמת מזהמים בתגובות WGA 7,34, והיא השיטה רגישה ביותר הידוע ללכמת את נוכחותו של ה- DNA של רצף לא ידוע, נותן הבטחה הגדולה השיטה בתחומי יישומים מגוונת כמו תרופות בקרת איכות, זיהוי פלילי, ו אסטרוביולוגיה. צג דיגיטלי גורף יכול ליהנות פרוטוקולי assay הדיגיטלי אחרים כגון דיגיטלי PCR, על ידי זרוז, parallelizing, ולפשט את קריאת נתוני assay.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Evagreen Dye Biotium 31000
Bovine serum albumin New England Biotechnologies B9000S
Phi29 DNA Polymerase Reaction Buffer New England Biotechnologies B0269S Vortex periodically until aggregate dissolves
Lambda DNA New England Biotechnologies N3011S Heated to 50 oC and quenched on ice prior to dilution
Randomized MDA oligos Integrated DNA Technologies 5'-NNNNN*N-3'
PCR primers Integrated DNA Technologies 5’-CGGCAAACGGGAATGAAACGCC-3’ and 5’-TGCGGCAAAGACAGCAACGG-3’
UltraPure Nuclease-free water Life Technologies 10977-015 UV-treated for 30 min in Stratalinker 2400 before use (optional)
ROX reference dye Life Technologies 12223-012
PCR optical strip caps Life Technologies 4323032
PCR tubes Agilent Technologies 401428
dNTP (25 micromolar each) Agilent Technologies 200415
Thermocycler - Mx3000P qPCR system Agilent Technologies 401403
Barrier pipette tips VWR 89003-046
Bio-rad oil for evagreen Bio-rad 186-4005
JumpStart Taq ReadyMix Sigma-Aldrich P2893-100RXN

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sykes, P. J., Neoh, S. H., Brisco, M. J., Hughes, E., Condon, J., Morley, A. A. Quantitation of targets for PCR by use of limiting dilution. Biotechniques. 13, (3), 444-449 (1992).
  2. Kalinina, O., Lebedeva, I., Brown, J., Silver, J. Nanoliter scale PCR with TaqMan detection. Nucleic Acids Res. 25, (10), 1999-2004 (1997).
  3. Vogelstein, B., Kinzler, K. W. Digital PCR. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.. 96, (16), 9236-9241 (1999).
  4. Day, E., Dear, P. H., McCaughan, F. Digital PCR strategies in the development and analysis of molecular biomarkers for personalized medicine. Methods. 59, (1), 101-107 (2013).
  5. Tatusova, T., Ciufo, S., Fedorov, B., O'Neill, K., Tolstoy, I. RefSeq microbial genomes database: new representation and annotation strategy. Nucleic Acids Res. 42, (Database issue), D553-D559 (2014).
  6. Blainey, P. C. The future is now: single-cell genomics of bacteria and archaea. FEMS Microbiol. Rev. 37, (3), 407-427 (2013).
  7. Blainey, P. C., Quake, S. R. Digital MDA for enumeration of total nucleic acid contamination. Nucleic Acids Res. 39, (4), e19 (2011).
  8. Blainey, P. C., Quake, S. R. Dissecting genomic diversity, one cell at a time. Nat. Methods. 11, (1), 19-21 (2014).
  9. Binga, E. K., Lasken, R. S., Neufeld, J. D. Something from (almost) nothing: the impact of multiple displacement amplification on microbial ecology. ISME J. 2, (3), 233-241 (2008).
  10. Method of the Year 2013. Nature Methods. 11, (1), 1 (2014).
  11. Ottesen, E. A., Hong, J. W., Quake, S. R., Leadbetter, J. R. Microfluidic digital PCR enables multigene analysis of individual environmental bacteria. Science. 314, (5804), 1464-1467 (2006).
  12. OpenArray Technology Overview. Life Technologies. http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/pcr/real-time-pcr/real-time-openarray/open-array-technology.html (2014).
  13. Shen, F., Du, W., Kreutz, J. E., Fok, A., Ismagilov, R. F. Digital PCR on a SlipChip. Lab Chip. 10, (20), 2666-2672 (2010).
  14. Heyries, K. A., et al. Megapixel digital PCR. Nat. Methods. 8, (8), 649-651 (2011).
  15. Dressman, D., Yan, H., Traverso, G., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. Transforming single DNA molecules into fluorescent magnetic particles for detection and enumeration of genetic variations. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, (15), 8817-8822 (2003).
  16. Kiss, M. M., et al. High-throughput quantitative polymerase chain reaction in picoliter droplets. Anal. Chem. 80, (23), 8975-8981 (2008).
  17. Baker, M. Digital PCR hits its stride. Nat. Methods. 9, (6), 3 (2012).
  18. Marcus, J. S., Anderson, W. F., Quake, S. R. Parallel picoliter rt-PCR assays using microfluidics. Anal. Chem. 78, (3), 956-958 (2006).
  19. Lee, M., et al. Synchronized reinjection and coalescence of droplets in microfluidics. Lab Chip. 14, (3), 509-513 (2014).
  20. Rhee, M., et al. Pressure stabilizer for reproducible picoinjection in droplet microfluidic systems. Lab Chip. 14, (23), 4533-4539 (2014).
  21. Hatch, A. C., et al. 1-Million droplet array with wide-field fluorescence imaging for digital PCR. Lab Chip. 11, (22), 3838-3845 (2011).
  22. Illumina. Technology. http://www.illumina.com/technology.html (2014).
  23. Droplet digital PCR applications guide. Bio-Rad. Available from: http://www.bio-rad.com/en-us/category/digital-pcr (2014).
  24. Hindson, B. J., et al. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Anal. Chem. 83, (22), 8604-8610 (2011).
  25. Guo, M. T., Rotem, A., Heyman, J. A., Weitz, D. A. Droplet microfluidics for high-throughput biological assays. Lab Chip. 12, (12), 2146-2155 (2012).
  26. Lage, J. M., et al. Whole genome analysis of genetic alterations in small DNA samples using hyperbranched strand displacement amplification and array-CGH. Genome Res. 13, (2), 294-307 (2003).
  27. Dean, F. B., et al. Comprehensive human genome amplification using multiple displacement amplification. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, (8), 5261-5266 (2002).
  28. Zong, C., Lu, S., Chapman, A. R., Xie, X. S. Genome-wide detection of single-nucleotide and copy-number variations of a single human cell. Science. 338, (6114), 1622-1626 (2012).
  29. Mitos Dropix Systems. Dolomite. http://www.dolomite-microfluidics.com/webshop/mitos_dropix_system (2014).
  30. Abate, A. R., Weitz, D. A. Syringe-vacuum microfluidics: A portable technique to create monodisperse emulsions. Biomicrofluidics. 5, 14107 (2011).
  31. Eyer, K., Kuhn, P., Stratz, S., Dittrich, P. S. A microfluidic chip for the versatile chemical analysis of single cells. J Vis Exp. (80), e50618 (2013).
  32. Fainman, Y. Optofluidics : fundamentals, devices, and applications. McGraw-Hill. (2010).
  33. Xia, Y. W. G.M. Softlithographie. Angew Chem. 110, (5), 26 (1998).
  34. Woyke, T., et al. Decontamination of MDA reagents for single cell whole genome amplification. PLoS One. 6, (10), e26161 (2011).
  35. System for hot-start amplification via a multiple emulsion. US patent. Hindson, B. J. (2014).
  36. Utada, A. S., et al. Monodisperse double emulsions generated from a microcapillary device. Science. 308, (5721), 537-541 (2005).
  37. Eastburn, D. J., Sciambi, A., Abate, A. R. Picoinjection enables digital detection of RNA with droplet rt-PCR. PLoS One. 8, (4), e62961 (2013).
  38. Dube, S., Qin, J., Ramakrishnan, R. Mathematical analysis of copy number variation in a DNA sample using digital PCR on a nanofluidic device. PLoS One. 3, (8), e2876 (2008).
  39. Shen, F., et al. Multiplexed quantification of nucleic acids with large dynamic range using multivolume digital RT-PCR on a rotational SlipChip tested with HIV and hepatitis C viral load. J Am. Chem. Soc. 133, (44), 17705-17712 (2011).
  40. Link, D. R., Anna, S. L., Weitz, D. A., Stone, H. A. Geometrically mediated breakup of drops in microfluidic devices. Phys. Rev. Lett. 92, (5), 054503 (2004).
  41. Nisisako, T., Torii, T. Microfluidic large-scale integration on a chip for mass production of monodisperse droplets and particles. Lab Chip. 8, (2), 287-293 (2008).
  42. Romanowsky, M. B., Abate, A. R., Rotem, A., Holtze, C., Weitz, D. A. High throughput production of single core double emulsions in a parallelized microfluidic device. Lab Chip. 12, (4), 802-807 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics