Simples massa de Leitura Digital de Ácido Nucleico Quantificação Assays

Biology

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Morinishi, L. S., Blainey, P. Simple Bulk Readout of Digital Nucleic Acid Quantification Assays. J. Vis. Exp. (103), e52925, doi:10.3791/52925 (2015).

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Abstract

Ensaios digitais são poderosos métodos que permitem a detecção de células raras e contagem de moléculas de ácido nucleico individuais. No entanto, ensaios digitais ainda não são rotineiramente aplicados, devido ao custo e equipamento específico associado com métodos comercialmente disponíveis. Aqui apresentamos um método simplificado de leitura dos ensaios de gotículas digitais usando um real-time PCR convencional instrumento para medir a fluorescência maior parte dos ensaios digitais baseadas em gotículas.

Nós caracterizar o desempenho do ensaio de leitura, utilizando misturas de grandes quantidades de gotículas de síntese e amplificação por deslocamento de um múltiplo (MDA) ensaio digitais gotícula. Quantitativa MDA particular beneficia de uma reação formato digital, mas o nosso novo método se aplica a qualquer ensaio digital. Para estabelecidos protocolos de ensaio digitais, tais como PCR digital, este método serve para acelerar e simplificar ensaio de leitura.

Nossa metodologia de grandes quantidades de leitura traz as vantagens de partitioned ensaios sem a necessidade de uma instrumentação especializada leitura. As principais limitações da metodologia de leitura em massa são reduzidos alcance dinâmico em comparação com plataformas de gotículas de contagem e a necessidade de uma amostra padrão, embora os requisitos para este padrão são menos exigentes do que para uma experiência em tempo real convencional. Quantitativa genoma inteiro de amplificação (WGA) é usado para testar contaminantes em reacções WGA e é a forma mais sensível para detectar a presença de fragmentos de ADN com sequências desconhecidas, dando ao método uma grande promessa em diversas áreas de aplicação farmacêutica incluindo o controlo de qualidade e astrobiology.

Introduction

Ensaios digitais para quantificação de ácidos nucleicos (PCR digital) 1-4 e com base em ordem (sequência) estão impactando fortemente as ciências da vida e medicina. Ensaios digitais fornecem quantificação de contagens moleculares numa escala absoluta (não relativamente a um controlo), fornecimento de alta sensibilidade, permitindo comparações entre experiências fáceis, e crucialmente, permitindo a construção de grandes bases de dados contendo dados comparáveis ​​5 (Tabela 1).

Ao longo dos últimos 15 anos, a amplificação do genoma inteiro (WGA) surgiram ao lado de PCR como uma ferramenta geral para a amplificação de ácido nucleico. Como PCR, o WGA é útil para aplicações analíticas e preparativas por amplificar elementos da amostra minuto até um nível que pode ser facilmente detectado ou utilizados para análises posteriores, como a sequenciação base. Ao contrário de PCR, WGA não é específico para um locus de ADN particular, em vez permitindo a amplificação de todas as sequências da amostra, incluindo seqüências desconhecidas.Esta diferença fundamental entre PCR e WGA torna os métodos complementares um ao outro e dá origem a diferentes desafios na sua aplicação.

O alto rendimento das reações WGA 6 permite amplificação rotina de DNA genômico a partir de moléculas individuais 7, 8 células individuais e outras amostras de baixa biomassa 9 para a quantificação ou análise posterior. Os principais desafios associados com a WGA química são a sua extrema sensibilidade à contaminantes e a amplificação desigual entre moléculas do molde 6 individuais. No entanto, WGA está ganhando popularidade como sequenciamento de uma única célula emergiu como o "aplicativo matador" da tecnologia WGA 10, e modelo de quantificação por WGA é importante em muitos campos de aplicação 7.

Instrumentação para a quantificação de ácido nucleico digital foi anteriormente descrito em uma variedade de valvulado e valveless forma de microfluidosTS 11-14, incluindo ensaios baseados em gotículas 15,16 (Tabela 2). No entanto, os sistemas microfluídicos comerciais para análise digital exige equipamento especializado para a configuração de reação e detecção do produto 17. Microfluídica costume valvulados são flexíveis, mas requerem microfabricação de precisão e sistemas de controle pneumático 18. Embora seja relativamente simples de fazer micro-gotas monodispersas para sistemas baseados em emulsão ensaios digitais 19,20, leitura digital é tecnicamente onerosa, exigindo tanto em larga escala em todo o campo de imagem (similar às tecnologias de sequenciamento de próxima geração populares) ou 21,22 alta velocidade de fluxo baseado em detecção de gotículas 23-25. Idealmente, um ensaio digitais seria simples de ajustar-se a leitura, reduzindo a necessidade de instrumentação complexa e permite que um grande número de amostras a ser lida rapidamente. Aqui nós descrevemos um método simplificado para a leitura de ensaios de gotículas digitais que usa um real-time PCR convencional iINSTRUMENTO para medir a fluorescência de grandes quantidades de ensaios digitais baseados em gotículas.

Enquanto a nova abordagem pode ser aplicada para ensaios de PCR digitais, é particularmente vantajoso para os ensaios de WGA digitais para analógico que os ensaios de amplificação em tempo real (que dão excelentes resultados para PCR) são problemáticos. WGA é comumente aplicado a amostras com moléculas do molde que são heterogêneos em sequência, comprimento e conteúdo base. Estas moléculas do molde diferentes são amplificados em diferentes taxas de 6, necessitando da utilização de uma referência ("standard") de uma amostra com características correspondentes. Muitas vezes, há tal padrão é disponível, ou as características das amostras de entrada são desconhecidos. A heterogeneidade do material de entrada e da propriedade dependente do comprimento de químicas de WGA 26 também complicar a interpretação dos resultados, criando ambiguidade em que está a ser quantificado - a massa de entrada, o número de moléculas de entrada, de uma combinação dos dois, ou nenhum deles. Finalmente, a sequência não-especificidade torna amplificação por deslocamento de múltiplos quantitativa (MDA) mais sensíveis à contaminação de PCR quantitativa uma vez que as moléculas de contaminantes de qualquer sequência tem um potencial de interferir. Ensaios digitais microfluídicos abordar a contaminação por segregar moléculas do molde e reduzindo volumes de reacção tais que menos contaminantes são amostrados.

Aqui usamos um método WGA isotérmico popular, MDA 27. De nota, várias outras químicas WGA incluindo PicoPlex e MALBAC 28 dependem crucialmente passos iniciais de deslocamento isotérmico Strand. Etapas isotérmicas exacerbar o desafio de aplicar ensaios em tempo real analógicos para WGA quantitativa. WGA não pode nem ser totalmente impedida durante a instalação, levando a pré-amplificação variável indesejada, nem discretizado ("ciclo") de uma forma em que a replicação de moléculas heterogêneas pode ser conduzido até a conclusão e parou antes do próximo ciclo como PCR 11 (Figura 1). Um formato de ensaio digital para WGA acolhe procedimentos de configuração típica reação devido à segregação de cada molécula para enumeração no ponto final do ensaio (para pré-amplificação não afeta os resultados) leitura inicial significa precisão seria largamente independente da variação na eficiência de amplificação.

O ensaio depende de gotículas produzidas em óleo com volumes uniformes, como o nível do sinal por gota no ponto final do ensaio vai depender do volume de gotículas, e nós não queremos que a consistência dos resultados que depender de média através de uma distribuição de tamanhos de gotas. Fazendo gotas monodispersas agora é um procedimento padrão (cerca de 3.500 documentos de gotas monodispersas foram publicados desde 2013), mas requer instrumentação microfluídico 25. Na verdade, mais de seis empresas desenvolveram produtos comerciais independentes, que dependem da produção de tais gotas, e chips microfluídicos de tomada de gotículas sãocomercialmente disponível 23,29. Para este estudo, foram utilizados dispositivos microfluídicos personalizados produzidos internamente (veja Protocol). Bombas de Seringa para dirigir escoamento através dos dispositivos estão também disponíveis comercialmente, mas em alternativa, podem ser substituídos com uma única seringa descartável para o fluxo orientado a vácuo para reduzir os custos de 30.

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Protocol

Nota: Fabrico do Dispositivo de microfluidos não é necessário para este ensaio, como gotas para este protocolo pode ser formado com os fabricantes de gotículas comerciais existentes 23,29.

1. Verifique o dispositivo micro-gota de formação

  1. Prepare molde mestre para os canais com o protocolo de Fabricação Mestre SU-8 delineado anteriormente 31, mas com um padrão de máscara gerador de gota 32.
  2. Fabricar dispositivos em PDMS utilizando as técnicas de litografia macia 32,33.

2. Prepare mistura de reacção para massa Gota Leitura


Nota: O protocolo pode ser utilizado para quantificar os ácidos nucleicos, utilizando vários tipos de reacções de amplificação. Como um exemplo, os reagentes necessários para MDA de várias concentrações de DNA de lambda são dadas. Detalhes reagentes estão listadas na Tabela de reagentes específicos. A distribuição de molde dentro das gotas depende sufficienT de mistura da amostra.

  1. Obter ou polimerase de ADN Purificar phi29.
    1. Purificar phi29 como descrito anteriormente 7, ou compra de fornecedor. O phi29 usado para as experiências mostradas foi purificado.
  2. Preparar 10 ml de tampão consistindo de desnaturação de KOH 65 mM, EDTA 1,65 mM e DTT 14 mM.
  3. Preparar 10 ml de tampão consistindo de Neutralização de 65 mM de HCl, 0,21 M de Tris-Cl pH 7,0, e Tris-Cl 9 mM, pH 8,0.
  4. Prepare dois padrões, um nenhum controle modelo (NTC), tais como água livre de nuclease, e uma alta concentração de modelo (em torno de 4 pg / l DNA Lambda). Desnaturar 3,3 mL de cada padrão com 3,3 ul de tampão de desnaturação em um tubo de qPCR. Incubar à temperatura ambiente durante 3 min. Extingue-se cada um com 3,3 mL de tampão de neutralização.
  5. Desnaturar 3,3 ul do modelo de interesse com 3,3 ul de tampão de desnaturação em um tubo de qPCR. Incubar à temperatura ambiente durante 3 min. Extingue-se com 3,3 mLTampão de neutralização.
  6. Prepare 11 mL de mistura de mestre por amostra em gelo. A mistura mestre reação 2x MDA consiste de DNA de cadeia dupla 2x (dsDNA) corante vinculativo, corante de referência 2x qPCR, 50 mM oligo randomizados, 2 mg / ml BSA, 2x phi29 DNA polimerase Reaction Buffer, dNTPs 4,8 mM, água livre de nuclease , e 40 ug de polimerase / mL de ADN de phi29. Adicionar polimerase ADN phi29 último para garantir a polimerase não encontrar níveis de pH muito mais elevado ou mais baixo que 7.5.Mix bem.
  7. Opcional: Para menos falsos positivos, expor mistura principal com luz UV antes de formar gotículas 34.
    1. Prepare 10 ml de pré-mistura por amostra em um 0,5 ml ou 1,5 ml tubo transparente no gelo. A pré-mistura é composta de 55 �M oligo randomizado, 2,2 mg / ml BSA, 1.1x phi29 DNA polimerase Reaction Buffer, 5,3 mM dNTPs, e de água livre de nuclease.
    2. Colocar o tubo em água em gelo tal como descrito 34 e expor à luz UV (254 nm) para um acumuladormulado de dose de 5,7 J / cm 2.
    3. Adicionar corante dsDNA de ligação a 1x, corante de referência para 1x, phi29 e a 40 ug / ml na pré-mistura. Misture bem.
  8. Combine 10 ul de modelo ou padrão desnaturado e 10 ul de mistura de mestre. Misture bem.

3. Gota Formação

Nota: Gotas pode ser muito sensível à eletricidade estática e tensão de cisalhamento. Remover as roupas que podem causar eletricidade estática, e aterre-se antes de formar gotas. Manipular tubos de emulsão a partir do topo do tubo, na medida do possível emulsão. Emulsões de pipetas muito lentamente, de preferência com uma grande ponta furo pipeta. Quando a distribuição a partir de uma ponta de pipeta, assistir a emulsão no lado da ponta para determinar a velocidade de pipetagem.

  1. Gotículas de formulário. Para as experiências apresentadas, o dispositivo de microfluidos tem uma entrada de óleo e aquosas com duas entradas de fluxo de uma junção de focagem para a geração de gotículas. Use duas syriESL bombas para controlar as taxas de fluxo de 55 ul de óleo e um agente tensioactivo com 20 ul de mistura de reacção através do chip de microfluidos para gerar gotículas 20000 1 nl.
  2. Nota: É possível a produção de gotículas, com muitos tipos de óleo com agente tensioactivo, mas a composição irá afectar grandemente a estabilidade a altas temperaturas gota e ao longo do tempo. Uma combinação possível é HFE óleo fluorado 7500 com um surfactante aniónico 19,35.
  3. Produzir gotas em qualquer tamanho, com qualquer método de 13,36, mas a variabilidade do tamanho da população de gotículas irá afectar a fluorescência grandes quantidades, e, portanto, a exactidão do ensaio. Para as experiências apresentadas, as gotas foram monodisperso com um volume de 1 nl.
  4. Recolha todas as gotas de óleo e em tubos de PCR. Para cada amostra, alíquota de 30 ul de óleo em tubos de PCR fresco com tampas ópticos, e transferir 20 ul de gotas na parte superior do óleo. Os volumes consistentes assegurar o ensaio é como se accuradoria possível.
  5. Fechar tubo de tampões com força, como tampas soltas permitirá que o óleo evapore.

4. A amplificação isotérmica

  1. Usando um termociclador de PCR, qPCR termociclador, ou placa quente, incubar as amostras a 30 ° C durante 7 h, e inactivar durante 1 min a 75 ° C. Os tubos de gotículas pode ser deixado em frigorífico coberto com folha durante algumas horas a este ponto.

5. Aquisição de Dados e Análise

  1. Imediatamente após inactivação reação, medir os níveis de fluorescência de corante para todas as amostras utilizando o termociclador qPCR. Configurações de filtro ideais dependerá excitação corante e espectros de emissão. Para este exemplo, utilizar o filtro 516 nm-492 nm para o corante definido dsDNA de ligação, e o filtro 585 nm 610 nm-definido para o corante de referência. Outras técnicas de medição de fluorescência pode ser utilizado para quantificar a fluorescência.
  2. Para cada amostra, dividir a intensidade de fluorescência do corante por ligação de ADNcd-a intensidade de fluorescência do corante de referência. Subtrair a fluorescência de fundo, ou a fluorescência do controlo normalizado nenhum modelo, a partir de todas as amostras.
  3. Criar uma curva padrão linear utilizando as medições de fluorescência corrigida dos padrões. A norma NTC representa a fluorescência de uma amostra com 0% de gotas fluorescentes ("todos negativos"), e a medição de fluorescência de concentração alta é a fluorescência de modelo esperado para uma amostra com 100% gotas fluorescentes ("todos positivos"). Usando a curva padrão correspondente, prever as proporções intermédias de gotículas positivos e negativos com base na sua fluorescência grandes quantidades.

6. produzem gotas do princípio de prova de Medidas

  1. Adicione fluorescentes gotículas (positivo): Prepara-se uma mistura de reacção de PCR que consiste em 0,1 ng de ADN lambda, corantes 1x dsDNA de ligação de corante de referência, 1x, 1,5 unidades de ADN-polimerase Taq, 10 mM de Tris-HCl, 50 mM de KCl, 1,5 mM de MgCl2, 0,2 mM de dNTP, 0,5 uM e iniciadores. Thermocycle a mistura 30 vezes (95 ° C durante 20 seg, 55 ° C durante 20 seg, 72 ° C durante 1 min), em seguida, formar gotículas tal como descrito acima.
  2. Adicione não fluorescentes gotículas (negativo): Prepara-se uma mistura reaccional de PCR consistindo de corante 1x dsDNA de ligação, corante de referência 1x, 1,5 unidades de DNA-polimerase Taq, 10 mM de Tris-HCl, 50 mM de KCl, 1,5 mM de MgCl2, dNTP 0,2 mM, e 0,5 uM iniciadores. Thermocycle a mistura 30 vezes (95 ° C durante 20 seg, 55 ° C durante 20 seg, 72 ° C durante 1 min), em seguida, formar gotículas.
  3. Formando rácios de gotículas pré-misturados
    1. Distribuir 20 l de óleo fluorado em tubos de qPCR, cubra com uma tampa óptica para evitar a evaporação.
    2. Suavemente Pipetar 10 ul de gotas bem misturadas em proporções desejadas positivas: negativas no topo do óleo. Nos resultados mostrados, positivas: negativas foram rácios de gotículas 1 (todas positivas), 0,8, 0,5, 0,2, 0,1, 0,01, 0,001, 0,0001, e 0 (todos Negative).
  4. Medir os níveis de corante de fluorescência para todas as amostras utilizando o termociclador qPCR. Para este protocolo, utilize o nm-516 filtro 492 nm definido para o corante dsDNA vinculativo, eo filtro nm 585 nm-610 definido para o corante de referência.
    1. Normalizar ligação dsDNA fluorescência corante utilizando corante de referência de fluorescência. Além disso por normalizar a fluorescência da "todos positivos" amostra.
  5. Criar uma curva padrão linear utilizando as medições de fluorescência normalizados a partir de todos os "positivos" e "negativos" todas as amostras. Usando a curva padrão correspondente, prever as proporções intermédias de gotículas positivos e negativos com base na sua fluorescência grandes quantidades.
  6. Repita a experiência para cada relação (n = 3) com a formação de gotículas e de mistura independente para cada replicado.

7. A prova de princípio MDA Experiment

  1. Medir a concentração da solução de DNA de lambda com uma especificaçãotrophotometer.
    1. Calcula-se a concentração necessária para molde média 10 moléculas de molde por gota. Para este protocolo, assumir volumes de gotículas são 1 nl e 1 ng de DNA Lambda contém aproximadamente 1,9 x 10 7 cópias. Portanto, 10 modelos por gotícula será de 10 cópias por nl, ou 526 fg de DNA Lambda per il. O modelo será diluída ~ 6x quando gotículas são formadas, portanto, a concentração inicial mais elevada molde será de 3,2 pg / ul.
  2. Em série diluir o DNA Lambda para 3,2 pg / mL com tampão de desnaturação e volume igual Neutralização Buffer. Para um factor de diluição de 0,1, 10 ul de amostra combinar com 45 ul de tampão de desnaturação e incubar à TA durante 3 min. Adicionar 45 LL de Neutralização de buffer para saciar.
  3. Diluir a amostra, tal como descrito no passo 7.2 para fazer o resto das amostras para o experimento. As concentrações iniciais do modelo nas reações apresentadas foram de 3,2 pg, 320 fg,160 fg, 32 fg, 16 fg, 3,2 fg e 1,6 fg por microlitro.
    Nota: As concentrações de modelo finais depois disso mastermix foram 526 fg, 52,6 fg, 26,3 fg, 5,26 fg, 2,63 fg, ag 526 e 263 ag por microlitro. 10, 1, 0,5, 0,1, 0,05, 0,01, 0,005 e Lambda esperados cópias por gota, respectivamente.
  4. Gerar e analisar gotículas a partir de cada amostra, tal como descrito nos passos 2.5-5.3.
  5. Adquirir as imagens fluorescentes mostrados (Figura 2,3), utilizando uma câmera digital acoplada a um microscópio epi-fluorescência com um objetivo 10x em RT. Adquirir doze campos de visão para cada amostra. Imagens de fluorescência corretas por uma imagem de fundo obtido com um slide fluorescente.
  6. Use uma câmara continha 37 para geração de imagens como o óleo de emulsão irá evaporar rapidamente.
  7. Analisar intensidades de gotículas individuais usando uma macro ImageJ (arquivo de código Suplementar).
    1. Escolha uma intensidade de limiar de fluorescência que melhor separa gotículas não fluorescentes no NImagens de CT das gotículas fluorescentes nas imagens de alta concentração de modelo. Para cada amostra desconhecida, calcular a fracção de gotículas com uma intensidade de fluorescência acima do limiar.

8. PCR e reacções de MDA a granel

  1. Prepare a reacção de PCR.
    1. Serialmente diluídas ADN molde com um factor de diluição de 0,1. Para cada diluição, combinar 10 ul de molde com 45 ul de tampão de desnaturação e incubar à TA durante 3 min. Combinar a diluição com 45 ul de tampão de neutralização.
    2. Prepare 20 l de PCR mastermix por amostra. A mistura de reacção 1,1x mestre de PCR consiste em 60 unidades / ul de ADN de Taq, polimerase 11 mM de Tris-HCl, 55 mm de KCl, 1,65 mM de MgCl2, dNTP 0,22 mM, corante, corante de referência 1,1x e 550 nM de ligação de ADNcd 1,1x cada iniciador.
    3. Combinar 2 ul de modelo diluído e 20 l de mastermix.
      Nota: As concentrações finais no molde tele reacções PCR foram mostrados 50 pg, 5 pg, 500 fg, 50 fg, 5 fg, AG 500, 0 g e DNA de lambda por microlitro, e foram realizadas em triplicado.
    4. Thermocycle reação de PCR em máquina qPCR com o seguinte programa. Executar 40 ciclos de 95 ° C durante 30 seg, 57 ° C durante 20 seg, 72 ° C durante 30 segundos antes de 2 min a 72 ° C durante 2 minutos e manutenção a 4 ° C.
    5. Normalizar ligação dsDNA corante fluorescente usando referência corante fluorescente antes de uma análise mais aprofundada.
  2. Prepare reação MDA.
    1. Diluir as amostras tal como descrito no passo 8.1.1.
    2. Prepare 11 mL de mistura de mestre por amostra em gelo. A mistura mestre de reacção 2x MDA consiste de corante 2x dsDNA de ligação, corante de referência 2x, 50 | iM de oligo randomizado, 2 mg / ml de BSA, 2x phi29 ADN Polimerase Tampão de Reacção, 4,8 mM dNTPs, água livre de nuclease, e 40 ug / ml phi29 ADN polimerase.
    3. Adicionar a polimerase de ADN de phi29 a 40 ug / ml de duração para assegurar a polimerase dOES não encontrar níveis de pH muito mais elevado ou mais baixo do que 7,5. Misture bem.
    4. Desnaturar 3,3 mL de modelo diluída com 3,3 mL de tampão de desnaturação em um tubo de qPCR. Incubar à temperatura ambiente durante 3 min. Adicionar 3,3 uL de tampão de neutralização.
    5. Combinar 10 mL de modelo desnaturado e 10 ul de mistura mestre. Misture bem.
    6. Execute reação MDA na máquina qPCR com o seguinte programa.
    7. Segure a 30 ° C durante 4 horas, medir a fluorescência a cada 7,5 minutos.
    8. Inactivar a 75 ° C durante 1 min.
    9. Normalizar ligação dsDNA fluorescência corante utilizando corante de referência de fluorescência. Além disso normalizar a fluorescência máxima por para cada amostra.

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Representative Results

Embora as leituras granel convencional / em tempo real pode ser utilizado para ambos os ensaios de PCR quantitativa e quantitativa WGA (Figura 1), ensaios quantitativos digitais proporcionam vantagens (Tabela 1). No método descrito, podemos ler a ensaios digitais em formato de micro-gota com uma medição de ponto final a granel simples (Figura 2). Enquanto este método é amplamente aplicável, nos concentramos em WGA quantitativa (MDA), pois este método apresenta desafios especiais para os ensaios em tempo real convencionais.

Para verificar se o instrumento em tempo real de PCR pode detectar diferentes fracções de microgotículas fluorescentes dispersas em óleo, que mediu a fluorescência de grandes quantidades de misturas sintéticas de fluorescentes e não fluorescentes gotas (Figura 2). A fluorescência granel e contagens de gotículas positivos (avaliada de forma independente por microscopia de fluorescência) dimensionar linearmente com a fração de entrada de gotículas fluorescentes como esperado (Figura 3A). O experimento foi realizado três vezes, com a formação de gotículas independente e de mistura para cada conjunto.

Para avaliar o desempenho quantificação teórico para amostras "desconhecidas", estabelecemos curvas padrão lineares usando amostras de controlo inteiramente positivos e negativos inteiramente. Com tais curvas padrão gota-específicos do lote, nós calculamos a fração de misturas de gotículas positivos e negativos sintéticos baseados em fluorescência em massa de cada amostra. Os resultados mostram um bom desempenho em relação gota quantificação através de dois registros de faixa dinâmica (R 2 = 0,984; Figura 3B). A concentração do analito de entrada é facilmente calculado a partir da fracção de gotas de 38 positivos ou negativos.

Para testar nosso método em um ensaio quantitativo verdadeira WGA, medimos níveis de fluorescência e fração de gotículas positivos de um ensaio MDA gotícula digital com DNA Lambda através de uma wi de gama de concentrações (Figura 4). Na Figura 4B, as imagens fluorescentes representativos de as gotículas são mostrados. Ambos fluorescência granel e fracção positiva das gotículas a partir de amostras digitais de MDA escalar como esperado com o modelo de medio por gota, o que indica que a leitura de grandes quantidades pode capturar fielmente o resultado de um ensaio digitais (R 2 = 0,927). Repetimos o experimento para cada concentração, formando gotas independente e realização WGA para cada repetição.

tabela 1
Tabela 1. Resumo do real-time e ensaios digitais. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

able2.jpg "/>
Tabela 2. Resumo dos métodos existentes para quantificar os ácidos nucleicos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figura 1
Figura 1.-PCR em tempo real quantitativo e MDA de Lambda DNA. MDA não é discretizado através de ciclos de temperatura de PCR, como, e é sujeito a pré-amplificação não se preparado cuidadosamente em gelo. Aqui, PCR quantitativo e MDA foram realizados com concentrações crescentes de DNA Lambda. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figure 2. Esquema de leitura analógica de gotículas e imagens representativas. (A) gotículas positivos e negativos foram gerados a partir de reagentes fluorescentes e não fluorescentes em um dispositivo de microfluidos. As gotículas foram pré-misturadas em diferentes positivos: rácios negativo. Níveis de fluorescência foram medidos em massa com um termociclador em tempo real normal, e a fracção de gotas de positivos foi determinada por microscopia de fluorescência. (B) fluorescente Representante sobreposto imagens de aumentar os rácios de gotículas positivos (barra de escala = 200 m). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3. massa de fluorescência e fracção fluorescente de combinações de drople positivo e negativo preparado separadamentets. (A) fluorescente (positivo) e não-fluorescente gotículas (negativos) foram pré-misturadas em diferentes proporções. Comparação da fracção de entrada de gotículas de positivos, com a maior parte da fluorescência medido e medido fracção gota positivo (n = 3, barras representam +/- DP). A linha a tracejado representa a fracção fluorescente esperado dado uma relação linear. (B) Comparação de rácios previsto com base em padrões de entrada para a fracção fluorescente esperado. A linha indica o valor esperado dado uma relação linear. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Figura 4. massa de fluorescência e fracção fluorescente de um ensaio de MDA digital de gotícula. Digital MDA foi realizada com increasing concentrações de modelo Lambda DNA (n = 3, barras de erro representam DP) e medido como descrito na Figura 2A. A linha indica a fracção fluorescente esperado utilizando a distribuição de Poisson para modelar os dados do nosso experimento. b) fluorescente Representante sobreposto imagens de gotas após a inativação de reação (barra de escala = 200 mm) para aumentar a moléculas de DNA Lambda esperados por gota (NTC, 0,005, 0,05, 0,5 e 10). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura .

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Discussion

Ensaios digitais são poderosos métodos que permitem a detecção de células raras e de contagem individual das moléculas de ácido nucleico. No entanto, ensaios digitais são ainda não rotineiramente aplicados em laboratórios de análises, em parte devido ao custo de equipamento especializado associada com métodos comercialmente disponíveis. Descrevemos aqui um ensaio de ponto final para quantificar digital de ácidos nucleicos com uma leitura analógica simplificado utilizando uma máquina de PCR quantitativa em tempo real padrão. Este método é rápido de configurar, e leitura é muito mais simples do que os métodos de contagem de gotas.

Nosso ensaio perde a sensibilidade única molécula (single-gota) das medições de gotículas individuais para a simplicidade de massa endpoint medição usando instrumentação padrão. Em nosso experimento MDA digitais, não foi possível distinguir menos de 1 gota positiva por 200 gotas negativos de fundo, apesar da confirmação por microscopia de fluorescência que a fra realcção de gotículas positivas foi como esperado (Figura 4). A sensibilidade e de fundo no limite de medição de fluorescência maior a sensibilidade do ensaio de medição de massa para as frações de baixa positivos gota. Se uma sensibilidade mais elevada é necessária, recomenda-se uma leitura digital. As diferenças nos níveis de óleo ou volumes de gotículas granel podem afetar significativamente os dados de amostra de fluorescência. Mesmo normalização com um corante de referência não pode compensar as diferenças volumes de petróleo fazem da fluorescência lê. É possível que a optimização do volume de ensaio, os parâmetros de aquisição de instrumentos, geometria de micropoços, ou filtros ópticos pode melhorar o desempenho do ensaio.

A sensibilidade e a gama dinâmica de ensaios digitais granel também pode ser melhorada através da optimização do tamanho da partição. Gotas maiores produzir uma maior quantidade de produtos fluorescentes de cada molécula modelo, o que pode ajudar a superar fundo instrumental e melhorar a sensibilidade para baixas concentrações de entrada. LigarPor outro lado, pequenas gotículas permitem o isolamento de moléculas por mais de volume ensaiado. Se a concentração de molde é altamente variável entre as amostras, ambas as pequenas e grandes reacções de gotículas pode ser levada a cabo em paralelo para expandir a gama dinâmica do ensaio 39.

Volumes de gotículas consistentes são também necessários para a medição precisa. Existem muitas soluções personalizadas microfluídicos para formar rapidamente gotas monodispersas partir de uma amostra, tanto em série e em paralelo 19,40 41,42. Enquanto alguns permitir a geração de gotículas a partir de várias amostras independentes em paralelo, simples modificações aos modelos existentes, que permitem a geração de gotículas simultânea de qualquer número de amostras. Por exemplo, o sistema Bio-Rad ddPCR 23 aplica uma pressão uniforme para as entradas de uma série de fabricantes de gotículas independentes, permitindo a formação de gotículas a partir de múltiplas amostras em simultâneo.

Nossa metodologia granel leitura acessa chavevantagens de ensaios digitais particionadas sem a necessidade de uma instrumentação e leitura especializado é bem adequada para WGA quantitativa. Aqui, nós nos concentramos em WGA quantitativa, que é altamente suscetível a contaminantes fundo, devido à sua falta de especificidade da sequência 7. Além disso, a distribuição do peso molecular desconhecido e potencialmente vasto de produtos a partir de ensaios em tempo real quantitativos WGA tornar difícil interpretação em aplicações em que o número de modelos originais é de interesse. Endereços de formatação ensaio digitais ambos os problemas. Os contaminantes são contidos divisórias individuais de reacção, impedindo a dominância de analitos de baixo peso molecular, por contaminantes de alto peso molecular, como ocorreria num ensaio em tempo real convencional. Nas Figuras 2B e 4B, possíveis contaminantes, vista como pontos brilhantes dentro das gotículas, são segregados e não amplificar ou contribuir substancialmente para a fluorescência total. Além disso, osinal gerado em ensaios digitais é proporcional ao número de moldes, e não o tamanho dos moldes ou a sua taxa de amplificação. Embora o método se baseia em padrões para calibrar a medição digital de grandes quantidades, o requisito para combinar com a amostra e características padrão pode ser significativamente relaxada.

Quantitativa WGA é comumente utilizada para quantificar contaminantes em reacções WGA 7,34, e é o método mais sensível conhecido para quantificar a presença de ADN de sequência desconhecida, dando ao método uma grande promessa em áreas de aplicação tão diversas como o controlo de qualidade farmacêutica, forense, e astrobiologia. Leitura digital em massa pode beneficiar outros protocolos de ensaio digitais, tais como digitais PCR, através da aceleração, paralelização, e simplificando ensaio de leitura.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Evagreen Dye Biotium 31000
Bovine serum albumin New England Biotechnologies B9000S
Phi29 DNA Polymerase Reaction Buffer New England Biotechnologies B0269S Vortex periodically until aggregate dissolves
Lambda DNA New England Biotechnologies N3011S Heated to 50 oC and quenched on ice prior to dilution
Randomized MDA oligos Integrated DNA Technologies 5'-NNNNN*N-3'
PCR primers Integrated DNA Technologies 5’-CGGCAAACGGGAATGAAACGCC-3’ and 5’-TGCGGCAAAGACAGCAACGG-3’
UltraPure Nuclease-free water Life Technologies 10977-015 UV-treated for 30 min in Stratalinker 2400 before use (optional)
ROX reference dye Life Technologies 12223-012
PCR optical strip caps Life Technologies 4323032
PCR tubes Agilent Technologies 401428
dNTP (25 micromolar each) Agilent Technologies 200415
Thermocycler - Mx3000P qPCR system Agilent Technologies 401403
Barrier pipette tips VWR 89003-046
Bio-rad oil for evagreen Bio-rad 186-4005
JumpStart Taq ReadyMix Sigma-Aldrich P2893-100RXN

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References

  1. Sykes, P. J., Neoh, S. H., Brisco, M. J., Hughes, E., Condon, J., Morley, A. A. Quantitation of targets for PCR by use of limiting dilution. Biotechniques. 13, (3), 444-449 (1992).
  2. Kalinina, O., Lebedeva, I., Brown, J., Silver, J. Nanoliter scale PCR with TaqMan detection. Nucleic Acids Res. 25, (10), 1999-2004 (1997).
  3. Vogelstein, B., Kinzler, K. W. Digital PCR. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.. 96, (16), 9236-9241 (1999).
  4. Day, E., Dear, P. H., McCaughan, F. Digital PCR strategies in the development and analysis of molecular biomarkers for personalized medicine. Methods. 59, (1), 101-107 (2013).
  5. Tatusova, T., Ciufo, S., Fedorov, B., O'Neill, K., Tolstoy, I. RefSeq microbial genomes database: new representation and annotation strategy. Nucleic Acids Res. 42, (Database issue), D553-D559 (2014).
  6. Blainey, P. C. The future is now: single-cell genomics of bacteria and archaea. FEMS Microbiol. Rev. 37, (3), 407-427 (2013).
  7. Blainey, P. C., Quake, S. R. Digital MDA for enumeration of total nucleic acid contamination. Nucleic Acids Res. 39, (4), e19 (2011).
  8. Blainey, P. C., Quake, S. R. Dissecting genomic diversity, one cell at a time. Nat. Methods. 11, (1), 19-21 (2014).
  9. Binga, E. K., Lasken, R. S., Neufeld, J. D. Something from (almost) nothing: the impact of multiple displacement amplification on microbial ecology. ISME J. 2, (3), 233-241 (2008).
  10. Method of the Year 2013. Nature Methods. 11, (1), 1 (2014).
  11. Ottesen, E. A., Hong, J. W., Quake, S. R., Leadbetter, J. R. Microfluidic digital PCR enables multigene analysis of individual environmental bacteria. Science. 314, (5804), 1464-1467 (2006).
  12. OpenArray Technology Overview. Life Technologies. http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/pcr/real-time-pcr/real-time-openarray/open-array-technology.html (2014).
  13. Shen, F., Du, W., Kreutz, J. E., Fok, A., Ismagilov, R. F. Digital PCR on a SlipChip. Lab Chip. 10, (20), 2666-2672 (2010).
  14. Heyries, K. A., et al. Megapixel digital PCR. Nat. Methods. 8, (8), 649-651 (2011).
  15. Dressman, D., Yan, H., Traverso, G., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. Transforming single DNA molecules into fluorescent magnetic particles for detection and enumeration of genetic variations. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, (15), 8817-8822 (2003).
  16. Kiss, M. M., et al. High-throughput quantitative polymerase chain reaction in picoliter droplets. Anal. Chem. 80, (23), 8975-8981 (2008).
  17. Baker, M. Digital PCR hits its stride. Nat. Methods. 9, (6), 3 (2012).
  18. Marcus, J. S., Anderson, W. F., Quake, S. R. Parallel picoliter rt-PCR assays using microfluidics. Anal. Chem. 78, (3), 956-958 (2006).
  19. Lee, M., et al. Synchronized reinjection and coalescence of droplets in microfluidics. Lab Chip. 14, (3), 509-513 (2014).
  20. Rhee, M., et al. Pressure stabilizer for reproducible picoinjection in droplet microfluidic systems. Lab Chip. 14, (23), 4533-4539 (2014).
  21. Hatch, A. C., et al. 1-Million droplet array with wide-field fluorescence imaging for digital PCR. Lab Chip. 11, (22), 3838-3845 (2011).
  22. Illumina. Technology. http://www.illumina.com/technology.html (2014).
  23. Droplet digital PCR applications guide. Bio-Rad. Available from: http://www.bio-rad.com/en-us/category/digital-pcr (2014).
  24. Hindson, B. J., et al. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Anal. Chem. 83, (22), 8604-8610 (2011).
  25. Guo, M. T., Rotem, A., Heyman, J. A., Weitz, D. A. Droplet microfluidics for high-throughput biological assays. Lab Chip. 12, (12), 2146-2155 (2012).
  26. Lage, J. M., et al. Whole genome analysis of genetic alterations in small DNA samples using hyperbranched strand displacement amplification and array-CGH. Genome Res. 13, (2), 294-307 (2003).
  27. Dean, F. B., et al. Comprehensive human genome amplification using multiple displacement amplification. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, (8), 5261-5266 (2002).
  28. Zong, C., Lu, S., Chapman, A. R., Xie, X. S. Genome-wide detection of single-nucleotide and copy-number variations of a single human cell. Science. 338, (6114), 1622-1626 (2012).
  29. Mitos Dropix Systems. Dolomite. http://www.dolomite-microfluidics.com/webshop/mitos_dropix_system (2014).
  30. Abate, A. R., Weitz, D. A. Syringe-vacuum microfluidics: A portable technique to create monodisperse emulsions. Biomicrofluidics. 5, 14107 (2011).
  31. Eyer, K., Kuhn, P., Stratz, S., Dittrich, P. S. A microfluidic chip for the versatile chemical analysis of single cells. J Vis Exp. (80), e50618 (2013).
  32. Fainman, Y. Optofluidics : fundamentals, devices, and applications. McGraw-Hill. (2010).
  33. Xia, Y. W. G.M. Softlithographie. Angew Chem. 110, (5), 26 (1998).
  34. Woyke, T., et al. Decontamination of MDA reagents for single cell whole genome amplification. PLoS One. 6, (10), e26161 (2011).
  35. System for hot-start amplification via a multiple emulsion. US patent. Hindson, B. J. (2014).
  36. Utada, A. S., et al. Monodisperse double emulsions generated from a microcapillary device. Science. 308, (5721), 537-541 (2005).
  37. Eastburn, D. J., Sciambi, A., Abate, A. R. Picoinjection enables digital detection of RNA with droplet rt-PCR. PLoS One. 8, (4), e62961 (2013).
  38. Dube, S., Qin, J., Ramakrishnan, R. Mathematical analysis of copy number variation in a DNA sample using digital PCR on a nanofluidic device. PLoS One. 3, (8), e2876 (2008).
  39. Shen, F., et al. Multiplexed quantification of nucleic acids with large dynamic range using multivolume digital RT-PCR on a rotational SlipChip tested with HIV and hepatitis C viral load. J Am. Chem. Soc. 133, (44), 17705-17712 (2011).
  40. Link, D. R., Anna, S. L., Weitz, D. A., Stone, H. A. Geometrically mediated breakup of drops in microfluidic devices. Phys. Rev. Lett. 92, (5), 054503 (2004).
  41. Nisisako, T., Torii, T. Microfluidic large-scale integration on a chip for mass production of monodisperse droplets and particles. Lab Chip. 8, (2), 287-293 (2008).
  42. Romanowsky, M. B., Abate, A. R., Rotem, A., Holtze, C., Weitz, D. A. High throughput production of single core double emulsions in a parallelized microfluidic device. Lab Chip. 12, (4), 802-807 (2012).

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