Выделение и характеристика нейтрофилов с Противоопухолевые свойства

1Department of Developmental Biology and Cancer Research, Institute for Medical Research Israel-Canada, Hebrew University Medical School, 2Institute of Pulmonary Medicine, Hadassah-Hebrew University Medical Center
Published 6/19/2015
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Sionov, R. V., Assi, S., Gershkovitz, M., Sagiv, J. Y., Polyansky, L., Mishalian, I., et al. Isolation and Characterization of Neutrophils with Anti-Tumor Properties. J. Vis. Exp. (100), e52933, doi:10.3791/52933 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Нейтрофилы, наиболее распространенным из всех белых кровяных клеток в кровотоке человека, играют важную роль в защите хозяина против вторжения микроорганизмов. Кроме того, нейтрофилы играют центральную роль в иммунной наблюдения опухолевых клеток. Они обладают способностью распознавать опухолевые клетки и индуцировать гибель клеток опухоли или через контакт-зависимого механизма клеток с участием перекиси водорода или через антитело-зависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (ADCC). Нейтрофилы с противоопухолевой активностью, могут быть выделены из периферической крови больных раком и опухоли мышей. Эти нейтрофилы называются опухолевых захваченных нейтрофилов (ДЕСЯТЬ), чтобы отличить их от нейтрофилов здоровых субъектов или наивного мышей, которые не показывают никакого существенного опухоли цитотоксическую активность. По сравнению с другими лейкоцитов, нейтрофилов показывают другую плавучесть делает возможным получение> 98% населения чистый нейтрофилов при воздействии на градиенте плотности. Однако, в дополнениек нормальной высокой плотности нейтрофилов населения (ГДН), у больных раком, в опухоли мышей, а также при хронических воспалительных состояний, отдельные популяции низкой плотности нейтрофилов (LDN) появляются в обращении. LDN совместно очищают с мононуклеарных фракции и может быть отделена от мононуклеарных клеток, используя положительный или отрицательный алгоритмов выбора. После того, как чистота выделенных нейтрофилов определяется с помощью проточной цитометрии, они могут быть использованы для ин витро и ин виво функциональных анализов. Мы опишем методы для мониторинга противоопухолевую активность нейтрофилов, их способность мигрировать и продуцировать активные формы кислорода, а также мониторинг их фагоцитарную способность экс VIVO. Мы также описать методы, чтобы пометить нейтрофилов для отслеживания в естественных условиях, и определить их антиметастатическую потенциала в естественных условиях. Все эти методы имеют важное значение для понимания того, как получить и охарактеризовать нейтрофилов с анти-опухолифункция.

Introduction

Нейтрофилы вначале были охарактеризованы как врожденных иммунных клеток, которые служат в качестве первого линия обороны против вторжения микроорганизмов. Сегодня известно, что нейтрофилы имеют более далеко идущие функции, будучи вовлеченным в монтаже адаптивного иммунного ответа против чужеродных антигенов 1,2, регулирующих кроветворение 3, 4 и ангиогенез ранозаживляющее 5. Кроме того, нейтрофилы могут повлиять на рост опухоли и метастазов прогрессирование в силу своих сторонников и противоопухолевых деятельности 6,7. Нейтрофилы характеризуются полиморфной сегментированные ядра (следовательно, называют полиморфно (PMN лейкоцитов)) и содержат по крайней мере три различных подклассов гранул, а также секреторные везикулы 8 (1А-C).

Нейтрофилы обладают высокой фагоцитарной способности и высокой активности НАДФН-оксидазы критической для устранения микробной и секретируют широкий спектр важных хемокинов, по крайнейтяги дополнительных нейтрофилов и других иммунных клеток к месту воспаления 8,9. Нейтрофилы характеризуются экспрессии большого количества поверхностных рецепторов, включая Toll-подобных рецепторов (TLR,), С-типа рецепторов лектинов (Clrs), дополняют рецептор 3 (CD11b / CD18) и другие адгезивные молекулы (например, L-селектина, LFA-1, VLA-4 и карциноэмбриональный антиген-связанных молекулы клеточной адгезии 3 (CEACAM3 / CD66b)), рецепторы хемокинов (например, CXCR1, CXCR2, CCR1, CCR2), хемоаттрактант рецепторы (например, PAFR, LTB 4 R и C5aR) , рецепторов цитокинов (например, G-ЧСФР, ИЛ-1R, IL-4R, IL-12R, IL-18R, ФНО), формил-пептид рецепторов (например, FPR1-3), и Fc рецепторы (например, CD16 (FcγRIII ), CD32 (FcγRII) и CD64 (FcγRI) 10. У мышей, нейтрофилов, как правило, определены как CD11b + Ly6G +, тогда как нейтрофилы человека, идентифицируют с использованием лейкоцитов маркеры CD11b, CD15, CD16 и CD66b, Также общепринятым для окрашивания для миелопероксидазы белков гранул (МРО) и эластазы нейтрофилов (NE) для обнаружения нейтрофилов в тканях.

Он по-прежнему неясно, будет ли разнообразные функции нейтрофилов при посредничестве той же клетке или отдельных клеток субпопуляций. Накопление данные позволяют предположить, на наличие гетерогенной популяции нейтрофилов, который проявляет высокую степень пластичности, пострадавших от провоспалительных стимулов и микросреды 11,12. Фридлендер и др. 13 грубо разделить нейтрофилов в рак в двух основных групп населения называют N1 с противоопухолевыми свойствами и N2 со свойствами про-опухолей. При раке, а также при хроническом воспалении, имеется дополнительный субпопуляция состоит из гранулоцитарного миелоидных полученных клеток-супрессоров (G-MDSCs), которые подавляют Т-клеточные ответы 14. G-MDSCs считаются незрелые миелоидные клетки характеризуются CD11b + Ly6Cнизкий Ly6G привет фенотип у мышей 15, имея CD15 + CD16 / низкий фенотип человека 16. Г-MDSCs выразить более высокие уровни аргиназой и миелопероксидазы, а более низкие уровни цитокинов и хемокинов, чем нормальных циркулирующих нейтрофилов. Они меньше фагоцитарной и миграционной, но дают более высокие уровни АФК 15,17,18. В настоящей работе мы опишем некоторые основные методики выделения и характеристики нейтрофилов с противоопухолевыми свойствами.

В то время как нейтрофилы составляют самое многочисленное население всех белых кровяных клеток в кровотоке человека (45 - 70%; 1800 - 6000 / мкл), у мышей, при нормальных условиях, они довольно редкие (10 - 15%; 300 - 500 / мкл ). Число нейтрофилов увеличивается неуклонно Upon воспаления, а иногда и в рак, который представляет собой состояние хронического воспаления 7. Нейтрофилы развиваются из общего миелоидного мультипотентны предшественника (CMP) CEзаполняет в костном мозге, с помощью процесса, дифференциации, проходящие этапы миелобласты (МБ), промиелоциты (ТЧ), миелоциты (MC), метамиелоцитов (мм) и диапазона ячеек (BC) 8. Зрелые, постмитотические нейтрофилы могут оставаться в костном мозге в течение 4 - 7 дней, прежде чем они будут освобождены в обращении 8. Оборот нейтрофилов в крови, как правило, быстрое со средним периодом полураспада 6 - 12 часов, который может быть продлен при воспалительных процессах. Нестимулированные нейтрофилы имеют ограниченный анти-онкогенного активности, особенность, которая может быть приобретена подвергая наивные нейтрофилов к хемокинов IL-8 (CXCL2), CCL2, CCL5 и CXCL5 6,19 или искусственно, подвергая их к форбол эфира форбол 12 -myristate 13-ацетата (РМА) 6.

Короткий период полувыведения из крови нейтрофилов вместе с низким числом нейтрофилов (~ 3 - 5 х 10 5) достигается с 1 мл крови наивного 6 - 8 недель старой мыши, сделали этотрудно исследовать функцию циркулирующих нейтрофилов мыши в пробирке. Чтобы преодолеть эту трудность, другие источники были использованы. Например, большое число нейтрофилов, могут быть получены из костного мозга 20 или брюшины после индукции стерильного воспаления (например, после внутрибрюшинного введения тиогликолевой бульон или Зимозан А). Следует отметить, что нейтрофилы, полученные из брюшной полости не оказывает какого-либо анти-онкогенного активностью (неопубликованное наблюдение).

. Granot др 6 отмечено, что линии BALB / C мышей, инокулированных ортотопически с помощью мыши 4T1 молочной клеточной линии карциномы разработки нейтрофилию что усугубляет прогрессированию опухоли 6 (Фигура 2А), так что 20 - 40 миллионов нейтрофилов крови можно легко выделить из 1 мл крови 3 - 4 недели после прививки опухоли. Эти нейтрофилы приобрели противоопухолевой активностью, и, соответственно, был ИСПNED опухолевые захваченных нейтрофилы (ДЕСЯТЬ), для того, чтобы отличить их от наивных нейтрофилов 6 (рис 2b). В то время как нейтрофилы высокой плотности (СЗР, 1А) обладают высокой анти-онкогенными, нейтрофилы низкой плотности (LDN, рис 1б), генерируемые в контексте рака не 21. Кроме того, высокой плотности нейтрофилы из костного мозга и селезенки мышей с опухолями имеют противоопухолевую активность (неопубликованные данные). Следует отметить, что прогрессированию опухоли селезенки становится постепенно увеличена (спленомегалия), с увеличением количества нейтрофилов.

Следует отметить, что десять также генерируются в других моделях рака, включая как спонтанных (MMTV-PyMT и MMTV-Wnt1 опухолей молочной железы и K-Ras приводом опухолей легких) и вводили (АТ-3 (MMTV-PyMT) и E0771 карциномы молочной железы клетки, ООО карциномы легкого Льюиса клетки и В16-F10, клетки меланомы). Тем не менее, степень мобилизации нейтрофилов в этих свою очередьили модели гораздо меньше, чем от 4T1-инокулированных мышей, достигая 5 - 10 х 10 6 нейтрофилы в 1 мл крови через 3 недели.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Животные: 5-7 недель BALB / C мышей приобрести Харлан (Израиль). Все эксперименты с участием животных были одобрены Институциональные уходу и использованию комитета животных Еврейского университета (IACUC) по. Человека образцы: Коллекция крови от пациентов рака и здоровых добровольцев было одобрено Медицинский центр Хадасса Institutional Review Board (IRB).

1. Индукционная нейтрофилов с анти-опухолевых Недвижимость в естественных условиях, используя рака молочной железы мыши Модель.

ПРИМЕЧАНИЕ: Все шаги должны быть выполнены с использованием стерильных растворов в ламинарный воздушный поток шкафа (LAF) Био-безопасности.

  1. Семенной 5 х 10 5 клеток 4T1 в 100 мм планшет для тканевых культур в 10 мл модифицированной Дульбекко среде Игла (DMEM), содержащей 4,5 г / л D-глюкозы с добавлением 10% инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки (FBS), 2 мМ D- глутамина, 1 мМ пирувата натрия, 100 ед / мл пенициллина G и 100 мкг / мл стрептомицина сульфата. Выдержите йе клетки при 37 ° С в увлажненном инкубаторе, содержащем 5% СО 2 в течение 3 до 4 дней. Убедитесь, что клетки 50 - 100% сплошности на день эксперимента.
  2. Для отсоединения опухолевые клетки из культуры ткани пластины, аспирация культуральной среды, промыть клетки с 5 мл PBS, аспирации PBS и добавляют 3 мл 2,5 г / л раствора трипсина. Выдержите клеток 2 - 3 мин с трипсином при 37 ° C.
  3. Добавьте 10 мл среде, содержащей сыворотку, чтобы нейтрализовать трипсина и пипетку вверх и вниз, пока все клетки не были отделены. Передача суспензии клеток в 15 мл коническую центрифужную пробирку.
  4. Центрифуга клетки при 200 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре. Аспирируйте среду, оставляя 200 мкл среды выше клеточного осадка. Ресуспендируют клеток в остаточном объеме и добавляют 10 мл PBS. Переверните пробирку 2 - 3 раза, чтобы получить однородную суспензию клеток и вывезти 10 мкл для подсчета клеток в гемоцитометра. Использование трипановым синим различать живых и мертвых клеток. Центрифуга клеточной суспензии в течение 5 мин при 200 х г при комнатной температуре. Аспирируйте PBS и клетки вновь суспендируют в PBS до конечной концентрации 2 × 10 6 клеток / мл. Убедитесь, что суспензию отдельных клеток не имеет комков.
  5. Вводите 1 х 10 6 4Т1 клетки или люциферазы-экспрессирующих клеток 4Т1 в 50 мкл PBS ортотопически в левой паховой молочной жировой ткани женщин BALB / с мышей с использованием 0,3 мл шприц с 30G х 8 мм иглы.
    1. Перед инъекцией, анестезию мышей в индукционной камере, получающих низкую скорость потока изофлуран (3 - 5%) в 100% кислорода.
    2. Положите мышь на стерильный хирургический площадку и убедиться, что голова должным образом размещены внутри ИФ носового конуса. Подтвердите правильное анестезии, зажимая лапу. Используйте ветеринар мазь на глазах, чтобы предотвратить сухость под наркозом. Бритье волос вокруг места инъекции и дезинфицировать с 70% этанола.
    3. Используйте стерильный набор хирургических инструментов, чтобы сделать небольшой горизонтальный разрез (5 мм) окмерно на полпути между паховой и брюшной соски, подвергать жировой ткани и вводят 1 х 10 6 клеток 4Т1 в 50 мкл. Закрыть разрезы с 9 мм клипов, которые должны быть удалены через неделю. Инъекции люциферазы-экспрессирующих клеток позволяет контролировать размер опухоли и метастазов с помощью визуализации биолюминесценции.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это минимально инвазивная процедура не требует после хирургического лечения и вводили мышам восстановить в течение 2 - 3 мин.
    4. Монитор мышей, пока они не приходя в сознание, и убедиться, что они полностью восстановить сознание До прихода в компанию других мышей.
  6. Через 3 - 4 недели, когда первичная опухоль достигла объема 2 см 3, пожертвовать мышей медленным потоком СО 2, и сразу же после последнего дыхания, получить кровь путем сердечной пункции с использованием 25G х 5/8 "иглу подключен к 1 мл туберкулина шприца, предварительно обработанной гепарином. Держите рот иглы вверх при вставкеШприц в горизонтальном положении через диафрагму к сердцу, и медленно и постепенно обратить кровь избежать избыточного давления (рисунок 3).

2. Выделение нейтрофилов

  1. Изоляция цитотоксических нейтрофилов из крови мышей с опухолями.
    1. Развести 1 мл крови, отобранных из несущей опухоль мыши (см протокол 1.11) в PBS, содержащем 0,5% (вес / объем) бычьим сывороточным альбумином (БСА) до конечного объема 6 мл.
    2. Фракционирование разбавленной крови на свежеприготовленного прерывистой градиенте сахарозы:
      1. Добавить 3 мл стерилизованного фильтрацией сахарозы 1,119 г / мл на дно 15 мл конической полипропиленовой центрифужной пробирке.
      2. Медленно и осторожно, слой 3 мл стерилизованного фильтрацией сахарозы 1,077 г / мл на верхней части г / мл 1,119 слоя. После этого добавить медленно и осторожно 6 мл разбавленной крови (протокол 2.1.1) в верхней части 1,077 г / мл слоя (фиг.4А). Рекомендуется провести наклона трубки иdding различные компоненты медленным, но непрерывным потоком, сохраняя рот пипетки к нижней стенке трубы, таким образом, что турбулентность отсутствует формируется.
    3. Центрифуга трубки, содержащей разбавленную кровь на градиенте сахарозы при 700 х г в течение 30 мин при комнатной температуре без тормоза.
    4. Осторожно снимите трубку из центрифуги, не вызывая турбулентность. Большинство эритроцитов будет в нижней части трубы. Нейтрофилы высокой плотности (СЗР) находятся в виде белой-на-красного кольца на границе между 1.119 г / мл и 1,077 мкг / мл слоев (около отметки 3 мл), в то время как низкой плотности лейкоциты обнаруживаются в белое кольцо на границе между слоем 1.077g / мл и BSA-PBS, содержащего (около отметки 6 мл, рис 4В).
    5. не Аспирируйте PBS + 0,5% BSA до достижения 5 мм выше слоя с низкой плотностью клеток. Пипетировать вне низкой плотности клеток путем медленного всасывания в наконечнике в 1 мл через медленно закрученной вокруг клеток.Передача клеток в 30 мл PBS с 0,5% BSA.
    6. не Аспирируйте верхний слой в той же трубе градиента до достижения 5 мм выше диапазона высокой плотности клеток. Пипетировать из высокой плотности клеток, которые в основном нейтрофилы высокой плотности, и передачи клеток в 30 мл PBS, содержащем 0,5% БСА.
    7. Центрифуга клетки при 400 х г в течение 10 мин при комнатной температуре.
    8. Аспирата супернатант и лизировать эритроциты ресуспендированием клеток в 36 мл стерильной воды для ВЭЖХ в течение 30 сек. Изотоничность должны быть восстановлены путем добавления 9 мл в 5х сосредоточены ФБР с добавкой 2,5% (вес / объем) БСА.
    9. Центрифуга клетки при 400 х г в течение 10 мин при комнатной температуре.
    10. Аспирата супернатант и ресуспендирования клеток в PBS-BSA. Подсчитайте количество нейтрофилов в гемоцитометре и использовать трипановым синим различать живых и мертвых клеток.
    11. Центрифуга клетки при 400 мкг в течение 10 мин при комнатной температуре и ресуспендируют нейтрофилов в желаемом инкубационной среде до конечной плотности клеток. Использованиенейтрофилы немедленно.
    12. Затем, после того, как другой центрифугированием, ресуспендируют нейтрофилов в инкубационной среде до конечной плотности клеток. Использовать немедленно нейтрофилов.
  2. Выделение циркулирующих нейтрофилов у больных раком.
    1. Смешайте 10 мл гепаринизированной (20 ед / мл) крови человека с равным объемом 3% декстрана T500 в физиологическом растворе и инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре. Во время этой инкубации эритроцитов будет оседать.
    2. Подготовка 50 мл коническую полипропиленовую пробирку с 10 мл сахарозы 1,077 г / мл и медленно слой лейкоцитов богатых супернатант сверху г / мл сахарозы слоя 1,077 (фиг.4С).
    3. Центрифуга при 400 х г в течение 30 мин при комнатной температуре без тормоза. С высокой плотностью нейтрофилы (СЗР) появится в осадке. Нейтрофилы низкой плотности (LDN) совместно очищают с моноциты и лимфоциты на границе между 1,077 г / мл сахарозы слоя и плазмы (рис 4D).
    4. Ресуспендируют нейтрофилов в 10 мл 0.2% NaCl в течение 30 сек, чтобы лизировать загрязняющих эритроцитов, и восстановить изотоничность добавлением 10 мл 1,6% NaCl и инвертировать один раз.
    5. Центрифуга 5 мин при 160 мкг при комнатной температуре, и мыть три раза в 20 мл сбалансированного солевого раствора Хэнкса. Центрифуга после каждой промывки и аспирации супернатант.
    6. Количество нейтрофилов и ресуспендирования клеток в RPMI-1640 с добавлением 2% ФТС в 2 × 10 6 / мл нейтрофилов или по желанию.

3. Обогащение крови нейтрофилов, используя магнитные шарики

  1. Положительный отбор
    1. Принимать по 1 мл крови из мышей, как описано в протокола 1,8, с гепаринизированной шприца.
    2. Центрифуга крови в 15 мл коническую пробирку при 400 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
    3. Аспирируйте супернатант или сохранить плазму крови для дальнейших исследований.
    4. Лизировать эритроциты путем ресуспендирования клеток в 8 мл ВЭЖХ-сорт воды. Через 30 сек восстановить изотоничность добавлением 2 мл 5-кратным Concentrated PBS, содержащий 2,5% BSA. Граф клеток.
    5. Центрифуга при 400 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
    6. Ресуспендируют осадок клеток в 200 мкл PBS, содержащего 0,5% BSA и 2 мМ ЭДТА за 10 8 клеток.
    7. Добавить 50 мкл биотинилированного анти-Ly6G антитела. Все хорошо перемешать и выдержать в течение 10 мин в холодильник (не на льду).
    8. Добавить 150 мкл холодного PBS, содержащем 0,5% BSA и 2 мМ ЭДТА.
    9. Вихрь анти-биотин покрытием магнитного Microbead раствор. Передача 100 мкл к клеточной суспензии. Все хорошо перемешать и выдержать в течение 15 мин в холодильник (не на льду).
    10. Промыть клеток путем добавления 10 мл PBS, содержащем 0,5% BSA и 2 мМ ЭДТА, и центрифуге при 400 х г в течение 10 мин при комнатной температуре.
    11. Отберите супернатант полностью, и ресуспендируют в 500 мкл холодного PBS, содержащим 0,5% BSA и 2 мМ ЭДТА.
    12. Вставьте магнитную разделительную колонну в магнитный держатель, который прикреплен к магнитной подставке, и промыть его с 500 мкл холодного PBS, содержащим 0.5% БСА и 2 мМ ЭДТА.
    13. Применение клеточной суспензии на колонку. Проточный содержит немеченые LyG6-отрицательных клеток.
    14. Промыть колонку с 500 мкл PBS, содержащего 0,5% BSA и 2 мМ ЭДТА. Дополнительные немаркированные клетки будут в потоке через.
    15. Повторите стадии промывки еще 500 мкл PBS, содержащего 0,5% BSA и 2 мМ ЭДТА.
    16. Удалить столбец из магнита и поместить его на 15 мл пробирку. Добавить 1 мл PBS, содержащем 0,5% BSA и 2 мМ ЭДТА, и промойте магнитно меченых клеток, плотно нажимая на поршень в колонну. Поток через содержит Ly6G + нейтрофилы.
  2. Отрицательный подбор
    1. Подготовка лейкоциты крови в соответствии с шагами 3.1.1 3.1.5.
    2. Ресуспендируют 1 х 10 8 клеток в 1 мл PBS, содержащего 0,5% BSA и 2 мМ ЭДТА в 5 мл полистирола с круглым дном трубки.
    3. Добавить 50 мкл нормальной сыворотки крыс.
    4. Добавить 50 мкл обогащения нейтрофилов Сocktail (содержащий биотинилированные антитела, специфичные для не-нейтрофильных лейкоцитов), хорошо перемешать и выдержать в течение 15 мин в холодильнике.
    5. Промыть клетки добавлением 4 мл PBS, содержащем 0,5% BSA и 2 мМ ЭДТА, и центрифуги 400 х г в течение 10 мин.
    6. Жидкость над осадком сливают и клетки вновь суспендируют в 1 мл PBS, содержащим 0,5% BSA и 2 мМ ЭДТА.
    7. Добавить 50 мкл тетрамерных комплексов антитело, направленное против биотина и декстрана. Все хорошо перемешать и выдержать в течение 10 мин в холодильник.
    8. Вихревой также трубки, содержащей покрытый декстраном магнитных шариков перед добавлением 150 мкл в клеточной суспензии. Все хорошо перемешать и инкубировать 10 мин в холодильник.
    9. Доведите клеточной суспензии до общего объема 2,5 мл добавлением ФБР, содержащим 0,5% BSA и 2 мМ ЭДТА. Осторожно перемешать, чтобы получить однородную суспензию клеток.
    10. Вставьте трубку (без крышки) в магнит, и дать постоять в течение 3 мин.
    11. Обратить магнит с трубкой в ​​одной непрерывнойдвижение таким образом, что несвязанные ячейки в жидкости будут переданы в новую пробирку. Оставьте магнит и трубу перевернутый для 2 - 3 сек, а затем вернуться к вертикальном положении. Магнитно-меченные нежелательные клетки остаются связанными со стенкой исходного трубки, в то время как несвязанные нейтрофилы будет передано в жидкости.

4. Цитологическое окрашивание нейтрофилов

  1. Ресуспендируют 1x10 5 нейтрофилы в 50 мкл PBS и передачи клеточной суспензии к адаптеру клеточного препарата тонкослойной таких как цитоспина. Центрифуга адаптер на 150 мкг в течение 5 мин. Отделите заранее помечены предметное стекло от адаптера.
  2. Fix клетки путем погружения стеклянные слайды в 70% этаноле в течение 2 мин. Позвольте препараты от адаптера (см шаг 4,1), чтобы высохнуть при комнатной температуре, прежде чем окрашивания. Опустите слайды 5 - 6 раз в дистиллированной воде.
  3. Пятно 1 - 2 мин в растворе Майера гематоксилин. Промыть 1 мин в водопроводной воде. Пятно 10 сек в эозином Y решения , Стирать в водопроводной воде. Высушить путем промывки слайды в возрастающих концентрациях этанола (70%, 96% и 100%). Пусть стеклах воздушно-сухой в ближайшее время и проверить слайды под световым микроскопом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: гематоксилин имеет глубокий синий цвет фиолетовый-и пятен нуклеиновых кислот, в то время как эозином розовый и окрашивает белки неспецифическим. Цитоплазматические гранулы нейтрофилов остаются запятнано кислотных или основных красителей, который является происхождение для имени «любящего быть нейтральным. В то время как базофильные гранулоциты пятно темно-синий с гематоксилином и эозином и eosinophilc гранулоцитов ярко-красные, появляются нейтрофилы нейтральный розовый (Смотрите рисунок 1А). Зрелые нейтрофилы характеризуется полиморфно ядра, которое в целом большая с 2 - 5 лепестков "сегментированных нейтрофилов (рис 1А и 1С). Незрелые нейтрофилы характеризуются одним-лопастным изогнутой или кольцевой ядра (Фиг.1В).
ve_title "> 5. Определение чистоты нейтрофилов методом проточной цитометрии.

  1. Ресуспендируют 1x10 6 клеток в 100 мкл FACS буфера (PBS, содержащим 0,5% БСА, 2 мМ ЭДТА и 0,02% NaN 3). Для образцов цельной крови, гемолиз необходимо до окрашивания (шаги 3.1.1 3.1.5). Добавить 10 мкл FcR блокирующий реагент в течение 5 мин.
  2. Добавить 0,5 мкг флуоресцентного меченных антител со специфичностью к LY-6G для нейтрофилов мыши или CD11b и CD66b на нейтрофилах человека, хорошо перемешать и выдержать в течение 15 мин при комнатной температуре.
  3. Настройка громкости в 500 мкл ЗФР, содержащим 0,5% BSA и 2 мМ ЭДТА и анализировать окрашивание с помощью проточной цитометрии.

6. Последующие нейтрофилов ворота в естественных условиях

  1. В естественных условиях BrdU маркировки нейтрофилов
    1. Вводите 100 мкл 10 мг / мл (бромдезоксиуридина BrdU) раствора в стерильной PBS внутрибрюшинно мышей с опухолями.
    2. Изолировать нейтрофилов крови 48 часов после инъекции Аогласно протоколу 2.1. Пятно BrdU-меченых нейтрофилов с использованием набора BrdU потока.
  2. CFSE маркировка нейтрофилов
    1. Ресуспендируют 10 7 нейтрофилов в 1 мл подогретого PBS.
    2. Добавьте 2 мкл 5 мМ исходного раствора CFSE к взвешенных нейтрофилов до конечной концентрации 10 мкМ. Хорошо перемешать и инкубировать в течение 15 мин при 37 ° С. 5 мМ CFSE получают растворением 2,8 мг CFSE (5- (и 6 -) - карбоксифлуоресцеина диацетат, сукцинимидил эфир) в 1 мл ДМСО. Разделить на 10 мкл аликвоты в стерильные 200 мкл труб и в магазине в темноте при -20 ° C.
    3. Нейтрализации избытка CFSE добавлением равного объема RPMI-1640, содержащей 10% FBS. Инкубируют в течение 10 мин при 37 ° С. Центрифуга нейтрофилов при 400 х г в течение 10 мин при комнатной температуре. Промыть нейтрофилов в два раза в 10 мл RPMI-1640, содержащей 10% FBS.
    4. Центрифуга при 400 х г в течение 10 мин и ресуспендируют в соответствующем объеме PBS. Нейтрофилы (например, 1 х 10 7

7. В пробирке анализа люциферазы для мониторинга противоопухолевую активность изолированных нейтрофилов.

  1. Выращивают люциферазы меченных опухолевых клеток, как описано в 4Т1 клеток в Протоколе 1.1-1.5, но ресуспендирования трипсина-диссоциированных клеток в среде оптимизированной пониженном сыворотки, с добавлением 2% ФТС. Отрегулируйте плотность клеток в 5 х 10 4 клеток на мл.
  2. Seed 5000 люциферазы меченных опухолевых клеток в 100 мкл среды оптимизирован снижение сыворотки, содержащей 0,5% FBS в каждую лунку 96-белой плоским дном ткани-луночного планшета культуры.
  3. 4 часа после посева клеток опухоли, добавить 1 х 10 5 нейтрофилы в 50 мкл оптимизированных снижается средний сыворотки, содержащих 0,5% FBS, и инкубируют O / N. Приготовьте суспензию клеток нейтрофилов с плотностью 2 × 10 6 клеток / мл. Контрольные лунки должны получить 50 мкл среды без нейтрофилов. Сделатьнесколько повторов каждой экспериментальной установки.
  4. На следующее утро, аккуратно аспирата супернатант и мыть каждую лунку по 200 мкл PBS. Аспирируйте PBS и добавить 50 мкл пассивного буфера для лизиса. Для легко отсоединение клеток (например, АТ-3 клеток), не мыть в PBS и немедленно добавить культивирования клеток лизис буфера после аспирации среды роста.
  5. Закройте планшет с алюминиевой фольгой и инкубируют ее на орбитальном шейкере при 150 оборотах в минуту в течение 20 мин при комнатной температуре.
  6. Поместите пластину в читателя люминесценции пластины. Вводите хорошо мудрый 50 мкл раствора люциферазы, и читать хемилюминесценции в течение 10 сек на лунку.
  7. Вычислить лизис% опухоли по следующей формуле:% лизиса опухоли = (1- [люминесценции образцов с нейтрофилами] / [люминесценции образцов в среде]) × 100%.

ПРИМЕЧАНИЕ: Для оценки вклада нейтрофилов метастатического посева, нейтрофилы могут быть истощены, как описано в протоколе 8.1. Для эффективного depletion управлять нейтрофилов разрушающих антитела, начиная с 7-й день после приживления опухоли.

8. антиметастатическую активность нейтрофилов в рак молочной железы мыши модели.

  1. В естественных условиях истощения нейтрофилов.
    1. Свежий подготовки 12,5 мкг крысиного анти-антитела (Ly6G нейтрофилов слой антител) или контрольного антитела изотипа IgG крыс (2а, Κ) в физиологическом растворе в конечном объеме 100 мкл на мышь.
    2. Начиная с 3-й день после приживления опухоли вводят ежедневно внутрибрюшинно дозу 12,5 мкг крыс анти-антитела Ly6G (100 мкл). Вводите контрольных мышей с 12,5 мкг или (100 мкл) контроля крыс изотипа (IgG 2a, Κ).
    3. Начиная с 14 дня, управлять антитела два раза в день, а уровень производства нейтрофилов резко возрастает, когда опухоль растет 4T1.
    4. Каждый день, получить образец крови (2 - 3 капли) по уменьшение поперечного сечения боковой хвост-вены. Соберите кровь в анти-coagulant содержащий трубку (гепарин, цитрат или ЭДТА).
    5. Убедитесь, истощение нейтрофилов с помощью проточной цитометрии, как описано в Протоколе 5.
  2. Опухоль Нейтрализация тест (модифицированный Winn анализ)
    1. Изолировать нейтрофилов из опухоли мышей. Смешайте 1 х 10 6 опухолевых клеток и 3 х 10 6 нейтрофилы в 50 мкл физиологического раствора (на мышь).
    2. Вводите клетки подкожно фланг 6 - 8 недель старые наивные линии BALB / C мышей. Бритье фланг до приживления опухоли, чтобы точные измерения размеров опухоли. Измерьте размер опухоли ежедневно, начиная на день 5 после приживления.
  3. Нейтрофилов приемных передачи
    1. Вводят 2 х 10 4 люциферазы экспрессирующих опухолевых клеток в 200 мкл PBS в хвостовую вену.
    2. Передача нейтрофилов следует проводить через 4 ч после инъекции опухолевых клеток. Следовательно, начать очистку ГБН от мышей, несущих опухоль (протокол 2.1) примерно 2 часа до их планируется вестественных передачи. Ресуспендируют нейтрофилов в PBS до конечной концентрации 2,5 х 10 7 клеток / мл.
    3. 4 часа после введения опухолевых клеток мышей разместить под тепловой лампой в течение 5 мин. Поместите мышей в фиксатор и вводят 5 × 10 6 ГБН (200 мкл) через хвостовую вену. Контрольные мыши инъецируют транспортного средства (PBS).
    4. Монитор образование метастазов в легких в различные моменты времени с помощью биолюминесценции в системе естественных изображений или иммуногистохимии.
  4. Легких метастатическим посев анализ
    1. Вводите 0,5 - 1 х 10 6 клеток 4Т1 родительских ортотопически в левой паховой молочной жировой ткани, как описано в Протоколе 1.
    2. На 10-й день, ресуспендируют GFP-экспрессирующих клеток 4Т1 в PBS до конечной концентрации 5 × 10 5 клеток / мл. Поместите мышей под тепловой лампой в течение 5 мин.
    3. Поместите мышей в фиксатор и вводят 1x10 5 GFP-экспрессирующих клеток 4T1 (200 мкл) внутривенно 4T1 опухоль мышей или наивные мышей.
    4. На следующий день, усыпить мышей и заливать легкие с 20 мл PBS, чтобы удалить оставшиеся эритроциты.
    5. Вырезания легкие для анализа GFP-положительных клеток с помощью иммуногистохимии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для оценки вклада нейтрофилов метастатического посева, нейтрофилы могут быть истощены, как описано в протоколе 8.1. Для эффективного управления истощения нейтрофилов разрушающих антитела, начиная с 7-й день после приживления опухоли.

9. Подавление Т клеточной пролиферации нейтрофилами от мышей с опухолями.

  1. Удалить селезенки от эвтаназии наивного BALB / с мыши и место в 10 мл PBS.
  2. Поместите селезенки на сито 40 мкм клетки, которая помещается на чашку Петри, заполненную RPMI-1640. Использование конец поршня шприца, пюре селезенки через клетки сетчатый фильтр в чашку Петри. Промойте фильтр клеток с 5 мл RPMI. Откажитесь сетчатый фильтр.
  3. Передача ресуспендировали клетки в 50 мл коническую пробирку и центрифуги 400 х г в течение 10 мин.
  4. Жидкость над осадком сливают и лизировать эритроциты путем суспендирования клеток в 36 мл чистой воды в течение 20 сек, и приспособиться к изотоничности добавлением 4 мл PBS сконцентрированы х 10. В качестве альтернативы, лизировать эритроциты путем суспендирования клеток в 5 мл эритроцитов лизиса буфер (ACK), и инкубируют 5 мин при комнатной температуре. Нейтрализовать ACK добавлением 10 мл RPMI-1640. Центрифуга при 400 х г в течение 10 мин при комнатной температуре. Ресуспендируют клеток в 5 мл PBS и считать клетки.
  5. Ресуспендируют спленоцитов в PBS до конечной концентрации 4 × 10 7 клеток / мл в 2 мл пробирку 15. Добавить 2 мл 2,5 мкМ CFSE раствора в PBS. Быстро инвертировать трубку и инкубировать в течение 10 мин при 37 ° С с периодическим перемешиванием (каждые 2 мин), защищенном от света месте.
  6. Погасить избыток CFSE добавлением 4 мл подогретого FBS (100%) и инкубируют в течение 1 мин при комнатной температуре. Добавить 3 мл PBS и центрифуге при 400 мкг в течение 10минимум
  7. Промыть клетки с 30 мл PBS и центрифуге при 400 х г в течение 10 мин.
  8. Фильтр клетки через сетчатый фильтр 40 мкм клеток и мыть снова PBS.
  9. Ресуспендируют клеток в среде RPMI-1640 с добавлением 10% FBS до конечной плотностью 2 х 10 7 клеток / мл.
  10. Семенной 2 × 10 6 / лунку (200 мкл) в 24-луночного культурального планшета-.
  11. Стимулирование клеток путем добавления 1 мкг очищенного Армении хомяка против мышиного антитела CD3ε в 500 мкл RPMI-1640 с добавлением 10% FBS.
  12. Добавьте 2 × 10 6 ГБН или LDN в 300 мкл RPMI-1640 с добавлением 10% FBS с CFSE-меченых спленоцитов, и инкубируют в течение 3 дней при 37 ° С. Уэллс без нейтрофилов должен получить 300 мкл среды. Общий объем в каждой лунке должен быть 1 мл.
  13. Сбор клеток и подготовить их к проточной цитометрии. Ресуспендируют клеток в 100 мкл FACS буфера (протокол 5), и добавить 10 мкл FcR блокирующий реагент. Инкубировать в течение 5 минут при комнатной температуре.
  14. Добавить 1 &# 956; л APC-сопряженных анти-CD8α антитела и инкубируют в течение 15 мин при комнатной температуре.
  15. Определите интенсивность флуоресценции CFSE на CD8 + Т-клеток с помощью проточной цитометрии (рис 5). Интенсивность CFSE уменьшается вдвое при каждом делении клетки. Таким образом, количество клеточных делений может быть определена по интенсивности окрашивания CFSE.

10. Анализ миграции нейтрофилов

  1. Семенной 5x10 5 клеток 4Т1 в 7 мл среды оптимизированных уменьшается сыворотки с добавкой 0,5% FBS в 25 см 2 тканевой культуральной колбы и инкубируют 24 ч при 37 ° С.
  2. Передача 800 мкл супернатанта к нижней камере миграции пластины с размером пор 5 мкм.
  3. Ресуспендируют 2 х 10 5 нейтрофилов в 400 мкл среды оптимизированной пониженном сыворотки, с добавлением 0,5% FBS. Применение клеточной суспензии в верхней камере и инкубируют в течение 2 часов при 37 ° С.
  4. В конце инкубации, удалить верхнюю камеру иподсчитать количество нейтрофилов, которые мигрировали в нижнюю камеру.

11. Мониторинг нейтрофилов продукцию активных форм кислорода (АФК).

  1. Готовят 1,1 × 10 6 нейтрофилы / мл в сбалансированном солевом растворе Хенкса без фенолового красного. Пластина 180 мкл, содержащие 2 × 10 5 нейтрофилы в каждую лунку 96-белой плоским нижней пластине так.
  2. Поместите пластину в читателя люминесценции пластины. Добавьте 20 мкл раствора люминола 500 мкМ в PBS в каждую лунку, чтобы получить конечную концентрацию 50 мкМ. Читайте базальной хемилюминесценции для 1sec в течение времени, 5 мин с 10-секундными интервалами.
  3. Добавить стимулятор (например, РМА в концентрации 10 нМ или 100 нМ или ФМЛФ в концентрации 10 мкМ). Подготовка 10x концентрированный раствор каждого агента в сбалансированном солевом растворе Хенкса без фенолового красного и добавить 22 мкл в соответствующие лунки. Чтобы контрольные лунки добавляют 22 мкл транспортного средства.
  4. MeasuRe хемилюминесценции в планшет-ридере. У обоих короткий (каждые 10 сек в течение 5 мин) и долго (каждую минуту в течение 1 часа) время, конечно.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

В недавнем исследовании мы определили антиметастатическую функцию нейтрофилов 6. Нейтрофилы от опухоли мышей приобрести фенотип цитотоксическое и имеют потенциал, чтобы убить опухолевые клетки 6. Это в отличие от нейтрофилов из наивного мышей, которые не имеют существенного влияния анти-опухоли 6. Несколько из методов, описанных в разделе протокола были использованы для изучения функции нейтрофилов противоопухолевую в пробирке и в естественных условиях 6.

Опухоль цитотоксические нейтрофилы могут быть получены из опухоли мышей 6. Для достижения этой цели, мышей ортотопически вводили 4Т1 клеток в левой паховой молочной жировой ткани (Протокол 1). К 21 дню после прививки опухоли, первичная опухоль достигла размера 1 - 2 см 3 (Рисунок 3 - опухоль проявляется в нижней левой части живота). В это время, мышей умерщвляли и 1 мл брали кровь (на мышь)сердечной пункции (рис 3). Параллельно кровь из наивно, не содержащей опухоли мыши было обращено. ГДН затем очищают на градиенте плотности (протокол 2.1 и Рисунок 4) с получением высокой чистоты (> 98%) население нейтрофилов. Нейтрофилов жизнеспособность была определена путем окрашивания трипановым синим (протокол 2.1). Нейтрофилы ресуспендировали в среде оптимизированной пониженном сыворотки, содержащей 0,5% FBS в 2 × 10 6 / мл нейтрофилов.

Чтобы проверить степень нейтрофилов цитотоксичности, мы добавили 10 5 нейтрофилы (50 мкл из 10 х 6 нейтрофилов / мл маточного раствора 2) для выражения люциферазы 4T1 клеток-мишеней (5000 клеток / лунку в 100 мкл) в плоским дном белый 96 -Ну пластины (Протокол 7). После O / N инкубации клетки промывали в PBS и лизировали в буфере пассивного лизиса клеток и активность люциферазы в каждый образец подвергают испытанию, чтобы оценить степень цитотоксичности нейтрофилов ( (фиг.2В, Опухоль бесплатно), нейтрофилы очищают от опухоли мышей показать значительный цитотоксичность (рис 2B, подшипник опухоли).

Чтобы проверить иммуносупрессивной свойствами в LDN и ГДН мы использовали анализ пролиферации Т-клеток (протокол 9). Мы оценилиКоличество CD8 + клеток в необработанных, так и в спленоцитов спленоцитов, обработанных антителом αCD3, которые культивировали в покое и клеток, которые культивировали в присутствии LDN или в присутствии ГДН (5А-D). Обратите внимание на резкое увеличение CD8 + клеток CFSE + следующий анти-CD3 стимуляции (сравните верхний правый панель в А и B) драматической тормозящее влияние подавляющих LDN (сравните верхний правой панели в B и C) и отсутствие ингибирующего эффекта ГБН (панель D). Мы также оценили степень удержания CFSE, как указание на распространение. На фиг 5Е, оранжевый кривая представляет необработанные клетки CD8 +, синюю кривую CD8 + клеток, обрабатывали αCD3 антител, красную кривую CD8 + клеток, стимулированных с αCD3 в присутствии LDN и зеленой кривой представляет CD8 + клетки, стимулированные с α; CD3 в присутствии ГДН. Примечание сдвиг влево в αCD3 обработанных клеток (синяя кривая) и αCD3 лечение клеток, культивируемых с ГБН (зеленая кривая), которые указывают распространения CD8 + клеток.

Фигура 1
Рисунок 1. нейтрофилов морфологии. Оптическое микроскопическое изображение высокой плотности (А) и нейтрофилов низкой плотности (В) окрашивали гематоксилином и эозином (H & E) следующим получением тонкого слоя клеток. (С) просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) изображения из высокой плотности нейтрофилов. Бар представляет 1000 нм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2
Рисунок 2. нейтрофилов крови увеличивается с опухолью рrogression и нейтрофилы приобрести фенотип цитотоксическую. (А) циркулирующих нейтрофилов число в 1 мл FACS подсчитывали на различных дней после инокуляции опухолевых клеток в линии BALB / C мышей. Количество циркулирующих CD11b + Ly6G + нейтрофилов непрерывно увеличивается с прогрессированием опухоли 4T1. (B) 4T1 клетки карциномы молочной железы культивировали с высокими нейтрофилов плотности от наивного или мышей (опухоли) или бесплатно 4Т1 мышей с опухолями (опухоли подшипников) мышей или инкубируемых в среде в отсутствие нейтрофилов (прод.) при 37 ° С в течение 20 часов. Нейтрофилы для мышей, несущих опухоли, но не от опухолей мышей, показывают значительное цитотоксичность по отношению к опухолевым клеткам 4Т1. Усы представляют ± SEM ** р <0,01, используя Т-тест студента. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3. Коллекция мышиного крови с помощью пункции сердца. Мышь эвтаназии в индукции камеры при медленном СО 2 потока. Сразу после того, как мышь заняла свое терминальное дыхание, она лежала на спине, и 1 мл гепаринизированной шприц вставлен в основание грудины до достижения сердце. Медленно потяните на поршень для аспирации крови. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 4
Рисунок 4. нейтрофильных очистку от всей крови. (А) 3 мл 1,077 г / мл сахарозы тщательно слой поверх 3 мл 1,119 г / мл сахарозы чтобы образовать прерывистый градиент. Всего мышиный крови, разбавленной в PBS-BSA (0,5%) до конечного объема 6 мл, затем слоистый сверху 1,077 г / мл сахарозы (Б) После 30 мин спина при 700 х г без перерыва, 3 различных фракций может наблюдаться. R - эритроциты в осадке, G - гранулоцитарный фракцию, содержащую нейтрофилы высокой плотности, м. - Мононуклеарных фракцию, содержащую мононуклеарные клетки и нейтрофилы низкой плотности (С) свежеотобранным человеческой крови смешивали с равным объемом декстрана (500 3%), и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин. Головную фракцию, содержащую лейкоциты (лейкоцитарную пленку), затем слой поверх 10 мл 1,077 г, можно наблюдать различные фракции 2 / мл сахарозы (D) После 30 мин спина при 400 х г без перерыва. R + G - осадок, содержащий эритроциты и нейтрофилы высокой плотности, м. - Мононуклеарных фракции, содержащей одноядерные клетки и нейтрофилы низкой плотности Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 5
Рисунок 5. Подавление пролиферации Т-клеток. Проточная цитометрия анализ показывает количество CFSE меченных CD8 + клеток, культивированных в отсутствие стимула (A), после стимуляции αCD3 антитела в отсутствии (B) или в присутствии LDN (С) или ГБН (D) (E) Гистограмма презентация CFSE интенсивности в CD8 + клеток из панелей А -.. D Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Нейтрофилы являются наиболее распространенными из всех белых кровяных клеток и первыми отвечают в случаях инфекции и воспаления. Как таковые, они очень чувствительны к внешним сигналам и легко активированы. Кроме того, нейтрофилы имеют очень короткий период полураспада и быстрый оборот. Вместе, эти характеристики вызывают ряд трудностей в работе с нейтрофилов, таких, что уникальные экспериментальные стратегии требуется. Например, есть несколько нейтрофилов стратегии очистки, каждый со своими плюсами и минусами.

Важным шагом в работе с нейтрофилов является их очистка от всей крови. Нейтрофилы могут быть эффективно очищен с использованием либо градиентов плотности или стратегии на основе антител (положительный или отрицательный отбор). Наш способ выбора является использование градиентов плотности, так как это дает большое число высоко очищенных нейтрофилов с минимальной неспецифической активации. Тем не менее, как мы покажем в недавнем исследовании 21, остроумиепрогрессия опухоли нейтрофилы ч накапливаться в больших количествах в мононуклеарных фракции низкой плотности. В этих условиях использование градиента плотности обеспечивает высокой чистоты высокой плотности нейтрофилов фракции, которая не представляют всю циркулирующую нейтрофилов репертуар, и низкой плотности нейтрофилов фракции, которая была сильно загрязнена другие одноядерные клетки (лимфоциты и моноциты). В этих условиях методом выбора является очистка на основе антител, предпочтительно негативный отбор. Использование антител для очистки нейтрофилы получают с высокой степенью чистоты нейтрофилы и лучше представляет всю циркулирующую нейтрофилов репертуар. Тем не менее, мы заметили, что больше нейтрофилы инкубировали с антителами, шансов на неспецифической увеличение активации. Поэтому мы предлагаем, что для достижения наилучших результатов, на основе антител очистки нейтрофилов должна быть выполнена как можно быстрее. На основе антител очистки нейтрофилов также методом выбора при ПУrifying нейтрофилов из тканей или опухолей.

Независимо от процедуры очистки выбранного, чистота, жизнеспособность и функциональную целостность должны быть тщательно оценены. Чистота нейтрофилов может быть определено с помощью проточной цитометрии с использованием антитела, которые реагируют с нейтрофилов поверхностных маркеров. В мыши, Ли-6G является специфичным для нейтрофилов, которые характеризуются CD11b + Ly-6C минимума Ли-6G + F4 / 80 - фенотип. Человеческие нейтрофилы не экспрессируют маркер, аналогичный LY-6G и часто характеризуются экспрессией CD11b, CD15, CD16, CD66b и. Так нейтрофилы имеют Fc-рецепторы, они должны быть заблокированы до иммуноокрашивания. Нейтрофилы также можно отличить от других белых кровяных клеток, имеющих высокую SSC. Жизнеспособность должны быть определены в конце процесса очистки (трипанового синего, протокол 2.1) и должны быть последовательно более чем 98%. Функциональная целостность должна определяться пурификация нейтрофилов из наивных мышей. Эти нейтрофилы не активирован и обеспечить не-цитотоксический контроль за опухоли захваченных нейтрофилов в условиях совместного культивирования с опухолевыми клетками (протокол 7).

Короткий период полувыведения из крови нейтрофилов вместе с низким числом нейтрофилов (~ 3 - 5 х 10 5) достигается с 1 мл крови наивного 6 - 8 недель старой мыши, сделали это трудно исследовать функции нейтрофилов крови мышей в пробирке. Число нейтрофилов неуклонно возрастать в состояниях воспаления, а иногда и в рак, который представляет собой состояние хронического воспаления 7. Некоторые исследователи пытались найти альтернативные источники для нейтрофилов, такие как костный мозг 20. Большое количество нейтрофилов мыши могут быть получены в течение 4 - 24 ч после внутрибрюшинной инъекции 1 мл 3% раствора тиогликолевой бульон или 1 мл 1 мг / мл зимозана раствора в физиологическом растворе. Но эти вызываемые нейтрофилы не оказываютНью-Йорк против онкогенными деятельность (неопубликованные наблюдения).

. Granot др 6 отмечено, что линии BALB / C мышей, инокулированных ортотопически с раком молочной железы мыши 4Т1 разработки нейтрофилию что усугубляет от времени (фиг.2А), таким образом, что 20 - 40 миллионов нейтрофилов крови можно легко выделить из 1 мл крови 3 - 4 недели после прививки опухоли. Эти нейтрофилы приобрели противоопухолевой активностью, и, соответственно, были названы опухолевые захваченных нейтрофилов (TEN), для того, чтобы отличать их от наивных нейтрофилов (фиг.2В). В то время как нейтрофилы высокой плотности (СЗР) обладают высокой анти-онкогенными, нейтрофилы низкой плотности (LDN), генерируемые в контексте рака не 21. Высокой плотности нейтрофилы костного мозга и селезенки мышей с опухолями также противоопухолевую активность (неопубликованные данные). Следует отметить, что прогрессированию опухоли селезенки становится постепенно увеличена (спленомегалия), с вскладок количество нейтрофилов.

Для того, чтобы отслеживать судьбу нейтрофилов после их приемных передачи, они должны быть помечены. Нейтрофилы могут быть помечены в естественных условиях путем введения бромдезоксиуридин (BrdU) в опухоли подшипнике или наивного мышей за 2 дня до изоляции. BrdU является аналогом тимидина в ДНК предшественника, который включен во вновь синтезированную ДНК в пролиферирующих клетках. В случае нейтрофилов, BrdU будут включены в пролиферирующих клеток-предшественников, которые сохраняют окрашивание BrdU при дифференциации в зрелые постмитотических нейтрофилов. Включены BrdU могут быть окрашены с использованием конкретных анти-BrdU флуоресцентные антитела. В BrdU + клетки затем могут быть проанализированы с помощью проточной цитометрии. Другой подход заключается в маркировать отдельные нейтрофилы с сотового трекера красителя, такие как 5-карбоксифлуоресцеин N-сукцинимидил эфира (CFSE). CFSE это соединение сложного эфира, который может пройти через жизнеспособных клеточных мембран. Он имеет succinimid амино-реактивныйильную группу, которая приводит к ковалентного связывания флуоресцеина с белками и другими аминогруппами в клетке и клеточной поверхности. В CFSE-меченых клеток могут быть проанализированы с помощью проточной цитометрии с использованием аргонового лазера 488 нм. Два методы маркировки отличаются тем, что BrdU маркировки зависит от пролиферации клеток-предшественников, и не все циркулирующие нейтрофилы будут помечены, в то время как CFSE окрасит все нейтрофилы. Обнаружение CFSE проще, чем окрашивание BrdU, однако BrdU маркировки является хорошим средством, чтобы следовать незрелых, чтобы созреть преобразование нейтрофилов.

Мы также описано несколько методов, чтобы определить противоопухолевую и анти-метастатический функцию нейтрофилов. Они включают в себя нейтрофилов истощение, нейтрофилов приемных передачи, тест нейтрализации опухоли и метастазов в легких посева анализа. Каждый из этих анализов выполняет конкретный аспект функций нейтрофилов противоопухолевых. Например, Granot др. 6 отмечено, что при DEPletion нейтрофилов, число легочных метастазов в 4Т1 опухоли мышей увеличивается, указывая на антиметастатическую роли нейтрофилов. При нейтрофилов приемных передачи, опухолевые клетки вводили внутривенно 4 ч перед инъекцией очищенной ГДН. Способность опухолевых клеток с образованием легких и метастазами в печень следуют в исследовании времени курса с помощью оптического виво системы визуализации в. Мыши, получающие ГБН показали меньше метастатических очагов, чем сделал мышей 6 управления. В тесте нейтрализации опухоли, опухолевые клетки вводили подкожно или без ГДН, присутствие ГДН уменьшает рост опухоли 21. В метастатического посева анализа, GFP-меченные опухолевые клетки вводили внутривенно управления или предварительно метастатических опухоли мышей обедненный нейтрофилов и способность GFP-меченых клеток на семена в легких определяется. Легкие предварительно метастатических опухолевых мышей, несущих характеризуются высокой инфильтрацией нейтрофилов, что предотвращает опухолипосева клеток в конкретном органе 6. Это приводит к более метастатических очагов в нейтрофильных обедненного мышей по сравнению с контрольными опухоли мышей.

Протоколы описаны акцент на изучении функции нейтрофилов в контексте рака и обеспечить стратегий для оценки связанных с раком свойства нейтрофилов в пробирке и в естественных условиях. Однако стратегии очистки нейтрофилов, а также некоторые из экспериментальных методик, описанных может быть использован для изучения функции нейтрофилов в широком диапазоне экспериментальных условиях, когда нейтрофилы играют важную роль (т.е., воспаления и инфекции).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

З. поддерживается грантами от I-CORE программу Израиля научного фонда (грант № 41/11), Abisch-Френкеля Фонд Rosetrees Доверие, Фонд исследований рака Израиль (ICRF - Исследование Карьера премии развития) и КОНЦЕРН фундамент. ZGF поддерживается грантами от Cancer Research Foundation Израиля (ICRF - Исследование Карьера Award развития), главный научный сотрудник Израильского Министерства здравоохранения и Израильской ассоциации легких.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CELL LINES
Mouse 4T1 breast carcinoma cells ADCC CRL-2539 Growth medium: DMEM + 10 % heat-inactivated FBS
PLASTIC WARES AND EQUIPMENTS
24-well Tissue Culture Plate  Falcon 353047 Sterile
100 mm Tissue Culture Plate  Corning 430167 Sterile
25 cm2 Tissue Culture Flask Nunc 156340 Sterile
90 mm Bacterial Grade Culture Dish  Miniplast, Ein Shemer, Israel 20090-01-017 Sterile
15 ml Sterile Conical Centrifuge Tube  Miniplast, Ein Shemer, Israel 835015-40-111 Sterile
50 ml Sterile Conical Centrifuge Tube  Miniplast, Ein Shemer, Israel 835050-21-111 Sterile
Falcon 12 x 75 mm Round-Bottom Polystyrene Tube  Becton Dickinson 352058 Sterile
Millicell 24 Migration Plate with a pore size of 5μm  Merck Millipore PSMT010R1 Sterile
White 96-Flat-Bottom Well Plate  Costar 3917 Sterile
Cell Strainer (40 mm)  BD Falcon 352340 Sterile
20G x 1.5" Needle BD Microlance 3  301300 Sterile
23G x 1" Needle  BD Microlance 4 300800 Sterile
25G x 5/8" Needle  BD Microlance 5 300600 Sterile
0.3 ml Syringe with a 30G x 8mm Needle BD Micro-Fine Plus Demi 320829 Sterile
9 mm Clips  BD, AutoClip  427631 Sterile
EasySep Magnet  STEMCELL Technologies 18000
MACS LS Separation Column  Miltenyi Biotech 130-042-201 Sterile
MidiMACS Separator Magnet Miltenyi Biotech 130-042-302
MACS MultiStand Miltenyi Biotech 130-042-303
Microscope Glass Slide  Menzel-Gläser Superfrost  Plus Thermo J1800AMNZ
Orbital Shaker  Sky line, ELMI S-3.02.10L
Plate Reader  TECAN InfiniteF200Pro
POWDER
Bovine serum albumin (BSA), fraction V Sigma A7906
Bromodeoxyuridine (BrdU)  BD Pharmingen 550891 Sterile
CFSE (5-(and 6-)-Carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl ester) Molecular Probes C1157
Dextran T500 Sigma 31392
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa  Sigma H3149
Sodium azide (NaN3) Sigma S8032 Highly toxic, handle with care
Thioglycollate powder  Difco 225650
Zymosan A Sigma Z4250
MEDIA AND SUPPLEMENTS
Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) Sigma D5796 Sterile
Opti-MEM® I reduced serum medium  Life Technologies 31985062 Sterile
Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 medium Sigma R8758 Sterile
Foetal bovine serum (FBS), heat-inactivated Sigma F9665 Sterile
L-Glutamine Biological Industries, Beth HaEmek, Israel 03-020-1A Sterile
Sodium pyruvate Biological Industries, Beth HaEmek, Israel 03-042-1B Sterile
Penicillin Streptomycin x 1000 solution Biological Industries, Beth HaEmek, Israel 03-031-5 Sterile
Phosphate buffered saline (PBS) without Mg2+ and Ca2+  Biological Industries, Beth HaEmek, Israel 02-023-1 Sterile
PBS x 10 without Ca2+ and Mg2+  Biological Industries, Beth HaEmek, Israel 02-023-5A Sterile
HPLC grade water  J.T. Baker 4218-03 Autoclave
SOLUTIONS
ACK – Ammonium-Chloride-Potassium Life Technologies  A10492-01
Bromodeoxyuridine (BrdU) solution (10 mg/ml) in PBS Dissolve 10 mg of BrdU in 1 ml PBS and sterile filter.
CFSE, 5 mM in DMSO Dissolve 2.8 mg of CFSE in 1 ml DMSO. Divide into 10 ml aliquots in sterile 200 ml tubes and store in the dark at -20oC.
Eosin Y solution Sigma HT110-2-32
Hanks' balanced salt solution Biological Industries, Beth HaEmek, Israel 02-016-1A Sterile
Heparin, 20 mg/ml in PBS Dissolve 100 mg Heparin in 5 ml sterile PBS, and sterile filter through a 0.2 mm filter. 
Histopaque-1119  Sigma 11191 Sterile filter through a 0.2 mm filter.
Histopaque-1077  Sigma 10771 Sterile filter through a 0.2 mm filter.
Luciferase cell culture lysis buffer x5 Promega E153A Dilute 1:5 in sterile water just before use.
Luciferase assay solution Promega E1501 Contains luciferase assay substrate powder (E151A) and luciferase assay buffer (E152A)
Mayer's Hematoxylin solution  Sigma MHS-32
PBS + 0.5% BSA Dissolve 2.5 g BSA in 500 ml PBS, and sterile filter through a 0.2 mm filter.
PBS + 1% BSA Dissolve 1g BSA in 100 ml PBS, and sterile filter through a 0.2 mm filter.
5x PBS with 2.5% BSA Dissolve 12.5g BSA in a mixture of 250 ml sterile HPLC-grade water and 250 ml PBSx10, and sterile filter through a 0.2 mm filter.
PBS containing 0.5% BSA and 2 mM EDTA Dissolve 250 mg BSA in 50 ml sterile PBS and add 200 ml of 0.5M EDTA pH 8.0, sterile filter through a 0.2 mm filter.
FACS buffer (PBS containing 0.5% BSA, 2 mM EDTA and 0.02% NaN3) Dissolve 250 mg BSA in 50 ml sterile PBS  and add 200 ml of 0.5M EDTA pH 8.0 and 500 ml of 2% NaN3, sterile filter through a 0.2 mm filter.
Saline (0.9% NaCl) Dissolve 9 g NaCl in 1,000 ml ddw, autoclave
0.2% NaCl solution Dissolve 2 g NaCl in 1,000 ml ddw, autoclave
1.6% NaCl solution Dissolve 16 g NaCl in 1,000 ml ddw, autoclave
2 % Sodium azide Dissolve 1g sodium azide in 50 ml sterile ddw, keep at 4oC. Highly toxic.
3% Thioglycollate solution                                        Dissolve 3 g of thioglycollate powder in 100 ml ddw.                                        Boil until solution becomes yellow and autoclave.
Trypan blue solution (0.4%) Sigma T8154 Dilute 1:10 in PBS to get a 0.04% solution.
Trypsin solution B  Biological Industries, Beth HaEmek, Israel 03-046-1 Sterile
1 mg/ml Zymosan A Resuspend 1 mg Zymosan A in 1 ml sterile PBS in an Eppendorf tube. Vortex vigorously and incubate the tube at 37 oC for 30 min. Do not autoclave. Prepare the solution freshly before use.
KITS
EasySep PE selection kit STEMCELL Technologies 18557
EasySep PE selection cocktail  STEMCELL Technologies 18151
the EasySep magnetic nanoparticles  STEMCELL Technologies 18150
Anti-Ly6G mouse MicroBead Kit Miltenyi Biotec 130-092-332
EasySep Mouse Neutrophil Enrichment Kit STEMCELL Technologies 19762
EasySep Human Neutrophil Enrichment Kit STEMCELL Technologies 19257
FITC BrdU flow kit BD Pharmingen  559619
MACS Neutrophil isolation kit Miltenyi Biotec 130-097-658
Phagocytosis Assay Kit  Cayman Chemical Company  500290
ANTIBODIES
FcR blocking antibody  Biolegend 101302
Purified rat anti-Ly6G antibody  BD Pharmingen  551459 Clone 1A8
PE-conjugated rat anti-mouse Ly6G antibody  Biolegend 127608 Clone 1A8
FITC-conjugated rat anti-mouse Ly6G BD Pharmingen  551460 Clone 1A8
PerCP-Cy5.5 rat anti-mouse Ly6G  TONBO Biosciences 65-1276 Clone 1A8
violetFluor 450-conjugated rat anti-mouse Ly6G  TONBO Biosciences 75-1276 Clone 1A8
FITC-conjugated rat anti-mouse CD11b BD Pharmingen  553310 Clone M1/70
FITC-conjugated rat anti-mouse Ly-6G and Ly-6C (GR-1) BD Pharmingen  553127 Clone RB6-8C5
PE-conjugated rat anti-mouse CD45 BD Pharmingen  553081 Clone 30-F11
FITC-conjugated rat anti-mouse F4/80  Abcam ab60343 Clone BM8
FITC-conjugated mouse anti-human CD66b  Biolegend 305103 Clone G10F5
Purified rat isotype control antibody (IgG2a, k)  BD Pharmingen  553927 Clone R35-95
LEAF purified Armenian hamster anti-mouse CD3e antibody BioLegend 100314 Clone 145-2C11

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tangye, S. G., Brink, R. A helping hand from neutrophils in T cell-independent antibody responses. Nat Immunol. 13, 111-113 (2012).
  2. Mantovani, A., Cassatella, M. A., Costantini, C., Jaillon, S. Neutrophils in the activation and regulation of innate and adaptive immunity. Nat Rev Immunol. 11, 519-531 (2011).
  3. Pruijt, J. F., et al. Neutrophils are indispensable for hematopoietic stem cell mobilization induced by interleukin-8 in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 6228-6233 (2002).
  4. Tecchio, C., Cassatella, M. A. Neutrophil-derived cytokines involved in physiological and pathological angiogenesis. Chem Immunol Allergy. 99, 123-137 (2014).
  5. Liu, M., et al. Formylpeptide receptors mediate rapid neutrophil mobilization to accelerate wound healing. PloS one. 9, e90613 (2014).
  6. Granot, Z., et al. Tumor entrained neutrophils inhibit seeding in the premetastatic lung. Cancer Cell. 20, 300-314 (2011).
  7. Sionov, R. V., Fridlender, Z. G., Granot, Z. The Multifaceted Roles Neutrophils Play in the Tumor Microenvironment. Cancer Microenviron. (2014).
  8. Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33, 657-670 (2010).
  9. Yamashiro, S., et al. Phenotypic and functional change of cytokine-activated neutrophils: inflammatory neutrophils are heterogeneous and enhance adaptive immune responses. J Leukoc Biol. 69, 698-704 (2001).
  10. Futosi, K., Fodor, S., Mocsai, A. Neutrophil cell surface receptors and their intracellular signal transduction pathways. Int Immunopharmacol. 17, 638-650 (2013).
  11. Scapini, P., Cassatella, M. A. Social networking of human neutrophils within the immune system. Blood. 124, 710-719 (2014).
  12. Fridlender, Z. G., et al. Transcriptomic analysis comparing tumor-associated neutrophils with granulocytic myeloid-derived suppressor cells and normal neutrophils. PloS one. 7, e31524 (2012).
  13. Fridlender, Z. G., et al. Polarization of tumor-associated neutrophil phenotype by TGF-beta: 'N1' versus 'N2. TAN. Cancer Cell. 16, 183-194 (2009).
  14. Talmadge, J. E., Gabrilovich, D. I. History of myeloid-derived suppressor cells. Nat Rev Cancer. 13, 739-752 (2013).
  15. Youn, J. I., Nagaraj, S., Collazo, M., Gabrilovich, D. I. Subsets of myeloid-derived suppressor cells in tumor-bearing mice. J Immunol. 181, 5791-5802 (2008).
  16. Choi, J., et al. CD15+/CD16low human granulocytes from terminal cancer patients: granulocytic myeloid-derived suppressor cells that have suppressive function. Tumour Biol. 33, 121-129 (2012).
  17. Brandau, S., et al. Myeloid-derived suppressor cells in the peripheral blood of cancer patients contain a subset of immature neutrophils with impaired migratory properties. J Leukoc Biol. 89, 311-317 (2011).
  18. Pillay, J., Tak, T., Kamp, V. M., Koenderman, L. Immune suppression by neutrophils and granulocytic myeloid-derived suppressor cells: similarities and differences. Cell Mol Life Sci. 70, 3813-3827 (2013).
  19. Lopez-Lago, M. A., et al. Neutrophil chemokines secreted by tumor cells mount a lung antimetastatic response during renal cell carcinoma progression. Oncogene. 32, 1752-1760 (2013).
  20. Boxio, R., Bossenmeyer-Pourie, C., Steinckwich, N., Dournon, C., Nusse, O. Mouse bone marrow contains large numbers of functionally competent neutrophils. J Leukoc Biol. 75, 604-611 (2004).
  21. Sagiv, J., et al. Phenotypic Diversity and Plasticity in Circulating Neutrophil Subpopulations in Cancer. Cell Reports. (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats