Isolamento e caratterizzazione di neutrofili con proprietà antitumorali

1Department of Developmental Biology and Cancer Research, Institute for Medical Research Israel-Canada, Hebrew University Medical School, 2Institute of Pulmonary Medicine, Hadassah-Hebrew University Medical Center
Published 6/19/2015
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Immunology and Infection

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Sionov, R. V., Assi, S., Gershkovitz, M., Sagiv, J. Y., Polyansky, L., Mishalian, I., et al. Isolation and Characterization of Neutrophils with Anti-Tumor Properties. J. Vis. Exp. (100), e52933, doi:10.3791/52933 (2015).

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Abstract

Neutrofili, il più abbondante di tutte le cellule bianche del sangue nella circolazione umana, svolgono un ruolo importante nella difesa dell'ospite contro microrganismi invasori. Inoltre, i neutrofili giocano un ruolo centrale nella sorveglianza immunitaria di cellule tumorali. Essi hanno la capacità di riconoscere le cellule tumorali e indurre la morte delle cellule tumorali tramite un meccanismo di contatto-dipendente delle cellule coinvolgono il perossido di idrogeno o attraverso citotossicità cellulo-mediata anticorpo-dipendente (ADCC). I neutrofili con attività anti-tumorale possono essere isolate dal sangue periferico di pazienti affetti da cancro e di topi portatori di tumore. Questi neutrofili sono chiamati neutrofili tumore trascinato (TEN) per distinguerli dai neutrofili di soggetti sani o topi ingenua che non mostrano una significativa attività citotossica tumorale. Rispetto ad altri globuli bianchi, neutrofili mostrano diversa galleggiabilità rendendo così possibile ottenere a> 98% popolazione neutrofili puro quando sottoposto ad un gradiente di densità. Tuttavia, in aggiuntaalla popolazione normale neutrofili alta densità (HDN), in pazienti affetti da cancro, in topi portatori di tumore, come pure in condizioni infiammatorie croniche, popolazioni neutrofili bassa densità distinti (LDN) appaiono nella circolazione. LDN co-purificare con la frazione mononucleare e può essere separato dalle cellule mononucleari utilizzando sia strategie di selezione positiva o negativa. Una volta che la purezza dei neutrofili isolati è determinata mediante citometria di flusso, possono essere utilizzati per in vitro e in vivo saggi funzionali. Descriviamo tecniche per il monitoraggio dell'attività antitumorale di neutrofili, la loro capacità di migrare e per produrre specie di ossigeno reattive, così come il controllo della loro capacità fagocitica ex vivo. Descriviamo ulteriormente le tecniche per etichettare i neutrofili per il monitoraggio in vivo, e di determinare la loro capacità anti-metastatica in vivo. Tutte queste tecniche sono essenziali per capire come ottenere e caratterizzare neutrofili con antitumoralefunzione.

Introduction

I neutrofili sono stati inizialmente caratterizzati come le cellule immunitarie innate che servono come prima linea di difesa contro i microrganismi invasori. Oggi è noto che i neutrofili hanno più funzioni di vasta portata, essere coinvolti in montaggio le risposte immunitarie adattive contro antigeni estranei 1,2, regolando emopoiesi 3, l'angiogenesi e la guarigione delle ferite 4 5. Inoltre, i neutrofili possono influenzare la crescita tumorale e nella progressione metastatica in virtù delle loro pro e anti-tumorali attività 6,7. I neutrofili sono caratterizzati da un nucleo segmentato polimorfico (quindi definito polimorfonucleati (PMN) leucociti) e contenere almeno tre sottoclassi distinte di granuli e vescicole secretorie 8 (Figura 1A-C).

I neutrofili possiedono elevata capacità fagocitica e alta NADPH ossidasi critico per l'eliminazione microbica, e secernono una vasta gamma di chemochine importanti da untrazione dei neutrofili supplementari e di altre cellule immunitarie al sito di infiammazione 8,9. I neutrofili si caratterizzano per l'espressione di una grande quantità di recettori di superficie, tra cui i recettori Toll-like (TLR), C-type lectina recettori (CLR), completano il recettore 3 (CD11b / CD18) e altre molecole di adesione (per esempio, L-selectina, LFA-1, VLA-4 e Carcinoembrionario legati molecola di adesione delle cellule 3 (CEACAM3 / CD66b)), recettori per chemochine (ad esempio, CXCR1, CXCR2, CCR1, CCR2), i recettori chemotattiche (ad esempio, PAFR, LTB 4 R e C5aR) , i recettori delle citochine (ad esempio, G-Cecoslovacchia, IL-1R, IL-4R, IL-12R, IL-18R, TNFR), formil-peptidi recettori (ad esempio, FPR1-3) e recettori Fc (ad esempio, CD16 (FcγRIII ), CD32 (FcγRII) e CD64 (FcγRI) 10. Nei topi, i neutrofili sono solitamente identificati come CD11b + Ly6G +, mentre neutrofili umani vengono identificati utilizzando i marcatori di leucociti CD11b, CD15, CD16 e CD66b. Inoltre, è generalmente accettato di macchia per il proteine ​​granuli mieloperossidasi (MPO) e neutrofila (NE) per la rilevazione dei neutrofili nei tessuti.

Non è ancora chiaro se le diverse funzioni dei neutrofili sono mediate dalla stessa cellula o di cellule distinte sottopopolazioni. Dati accumulando suggeriscono la presenza di una popolazione eterogenea neutrofili che presenta un elevato grado di plasticità colpiti da stimoli pro-infiammatori e il microambiente 11,12. Fridlender et al. 13 hanno grossolanamente diviso i neutrofili nel cancro in due grandi sotto-popolazioni chiamato N1 con proprietà anti-tumorali e N2 con proprietà pro-tumorali. Nel cancro, nonché in infiammazione cronica, vi è una sotto-popolazione supplementare composto di cellule mieloidi granulocitari derivate soppressori (G-MDSCs) che sopprimono le risposte delle cellule T 14. G-MDSCs sono considerati cellule mieloidi immature caratterizzate da un CD11b + Ly6Cbasso Ly6G fenotipo hi nei topi 15, pur avendo una CD15 + / CD16 basso fenotipo in umano 16. G-MDSCs esprimono alti livelli di arginasi e mieloperossidasi, mentre bassi livelli di citochine e chemochine che normali neutrofili circolanti. Sono meno fagociti e migratoria, ma producono alti livelli di ROS 15,17,18. Nel presente lavoro descriveremo alcune metodologie di base per l'isolamento e la caratterizzazione dei neutrofili con proprietà antitumorali.

Mentre neutrofili costituiscono la più grande popolazione di tutte le cellule bianche del sangue nella circolazione umana (45 - 70%; 1.800 - 6.000 / ml), nei topi, in condizioni normali, sono piuttosto scarse (10 - 15%; 300-500 / ml ). La conta dei neutrofili aumenta costantemente su infiammazione e, occasionalmente, nel cancro, che rappresenta uno stato di infiammazione cronica 7. I neutrofili si sviluppano da multipotenti precursore mieloide comune (CMP) cells nel midollo osseo, attraverso un processo di differenziazione che passano le fasi di mieloblasti (MB), promielociti (PM), mielociti (MC), metamielociti (MM) e cellule della band (BC) 8. I maturi, neutrofili post-mitotico possono rimanere all'interno del midollo osseo per 4-7 giorni prima di essere rilasciati alla circolazione 8. Fatturato dei neutrofili nel sangue è di solito rapido con una emivita media di 6-12 ore, che può essere prolungata in condizioni infiammatorie. Neutrofili non stimolate hanno limitato l'attività anti-cancerogena, una caratteristica che può essere acquisita esponendo i neutrofili naïve alle chemochine IL-8 (CXCL2), CCL2, CCL5 e CXCL5 6,19 o artificialmente, esponendoli a estere phorbol phorbol 12 -myristate 13-acetato (PMA) 6.

La breve emivita di neutrofili nel sangue insieme con il basso numero di neutrofili (~ 3-5 x 10 5) ottenuto da 1 ml di sangue di un ingenuo 6-8 settimane di età del mouse, l'hanno fattadifficile da esplorare la funzione di far circolare il mouse neutrofili in vitro. Per superare questa difficoltà, sono state utilizzate altre fonti. Per esempio, un gran numero di neutrofili possono essere ottenute dal midollo osseo 20 o il peritoneo dopo l'induzione dell'infiammazione sterile (ad esempio, dopo l'iniezione intraperitoneale di tioglicolato brodo o Zymosan A). Va notato che i neutrofili ottenuti dalla cavità peritoneale non esercitano alcuna attività anti-cancerogena (osservazioni non pubblicate).

. Granot et al 6 osservato che i topi BALB / c inoculati ortotopicamente con il mouse 4T1 seno linea cellulare di carcinoma sviluppare neutrofilia che aggrava con progressione tumorale 6 (Figura 2A), tale che 20-40.000.000 neutrofili sangue possono essere facilmente isolati da 1 ml di sangue 3 - 4 settimane dopo l'inoculazione del tumore. Questi neutrofili hanno acquisito le attività anti-tumorali, e di conseguenza sono stati coineutrofili ned tumorali trascinato (TEN), al fine di distinguerli dai neutrofili naïve 6 (Figura 2B). Mentre neutrofili alta densità (HDN, Figura 1A) sono altamente anti-oncogeno, neutrofili a bassa densità (LDN, Figura 1B) generate nel contesto di cancro non sono 21. Inoltre, i neutrofili ad alta densità del midollo osseo e milza di topi portatori di tumore hanno attività anti-tumorale (dati non pubblicati). Va notato che, con progressione tumorale milza diventa gradualmente (splenomegalia), con quantità crescenti di neutrofili.

Va notato che TEN vengono generati anche in altri modelli di cancro inclusi sia spontanei (MMTV-PyMT e MMTV-Wnt1 tumori mammari e k-Ras tumori polmonari motrice) e iniettato (AT-3 (MMTV-PyMT) e carcinoma mammario E0771 cellule, LLC Lewis cellule di carcinoma del polmone e cellule B16-F10 melanoma). Tuttavia, la misura di neutrofili mobilitazione in questi tumo modelli è molto meno di topi 4T1-inoculati, raggiungendo 5 - 10 x 10 6 neutrofili in 1 ml di sangue dopo 3 settimane.

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Protocol

Animali: 5-7 settimane BALB / c topi sono acquistati da Harlan (Israele). Tutti gli esperimenti su animali sono stati approvati dalla Istituzionale Cura e Comitato uso degli animali della Hebrew University (IACUC). Campioni umani: Raccolta di sangue da pazienti oncologici e volontari sani è stato approvato dal Hadassah Medical Center Institutional Review Board (IRB).

1. Induzione di neutrofili con proprietà anti-tumorali in vivo, utilizzando un modello murino del cancro della mammella.

Nota: Tutti i passaggi devono essere eseguiti utilizzando soluzioni sterili in un flusso d'aria laminare mobile (LAF) Bio-sicurezza.

  1. Seed 5 x 10 5 cellule 4T1 a 100 millimetri piastra di coltura tissutale in ml di modificata medio Eagle Dulbecco (DMEM) contenente 4,5 g / L di D-glucosio addizionato con siero fetale bovino inattivato al calore del 10% (FBS), 2 D- 10 mM glutammina, 1 mM sodio piruvato, 100 U / ml di penicillina G e 100 ug / ml di solfato di streptomicina. Incubare the cellule a 37 ° C in un incubatore umidificato contenente il 5% di CO 2 per 3 o 4 giorni. Assicurarsi che le cellule sono 50 - 100% confluenti il ​​giorno dell'esperimento.
  2. Per staccare le cellule tumorali dalla piastra di coltura tissutale, aspirare il terreno di coltura, lavare le cellule con 5 ml di PBS, aspirare il PBS e aggiungere 3 ml di una soluzione di tripsina 2,5 g / L. Incubare le cellule 2-3 minuti con tripsina a 37 ° C.
  3. Aggiungere 10 ml di mezzo contenente siero di neutralizzare la tripsina e pipetta su e giù fino a che tutte le cellule sono state staccate. Trasferire la sospensione delle cellule di un 15 ml provetta da centrifuga conica.
  4. Centrifugare le cellule a 200 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. Aspirare il mezzo lasciando 200 microlitri medio sopra il pellet. Risospendere le cellule nel volume residuo e aggiungere 10 ml di PBS. Invertire la provetta 2-3 volte per ottenere una sospensione cellulare omogenea e togliere 10 ml per contare le cellule in un emocitometro. Utilizzare trypan blu per distinguere tra cellule vive e morte. Centrifugare la sospensione cellulare per 5 minuti a 200 xg a RT. Aspirare il PBS e risospendere le cellule in PBS ad una concentrazione finale di 2 x 10 6 cellule / ml. Assicurarsi che la sospensione singola cellula non ha aggregazione.
  5. Iniettare 1 x 10 6 4T1 cellule o luciferasi che esprimono 4T1 cellule in 50 microlitri PBS ortotopicamente nella sinistra inguinale cuscinetto adiposo mammario di donne topi BALB / c con una siringa da 0,3 ml con un otto millimetri ago 30G x.
    1. Prima dell'iniezione, anestetizzare i topi in una camera di induzione che ricevono un flusso lento di isoflurano (3 - 5%) in 100% di ossigeno.
    2. Posare il mouse su un tampone sterile chirurgico e assicurarsi che la testa sia correttamente posizionato all'interno del cono naso isoflurano. Confermare anestesia corretta pizzicando la zampa. Utilizzare veterinario pomata sugli occhi per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia. Radersi i capelli intorno al sito di iniezione e disinfettare con il 70% EtOH.
    3. Utilizzare un set sterile di strumenti chirurgici per fare una piccola incisione orizzontale (5 mm) ca.a metà strada tra il imately inguinale ei capezzoli addominali, esporre il cuscinetto adiposo e iniettare 1 x 10 6 cellule 4T1 in 50 microlitri. Chiudere le incisioni con 9 millimetri clip che dovrebbero essere rimossi una settimana dopo. L'iniezione di cellule che esprimono luciferasi permette il monitoraggio della dimensione del tumore e metastasi da immagini bioluminescenza.
      NOTA: Questa procedura minimamente invasiva non richiede alcun trattamento post-chirurgico e di topi iniettati recuperare entro 2 - 3 min.
    4. Monitorare i topi fino a che non riprendano conoscenza, e fare in modo che ritrovare la piena consapevolezza prima di entrare nella compagnia di altri topi.
  6. Dopo 3 - 4 settimane, quando il tumore primario ha raggiunto un volume di 2 cm 3, sacrificare i topi da un lento flusso di CO 2, e subito dopo l'ultimo respiro, ottenere sangue mediante puntura cardiaca usando una 25G x 5/8 'ago collegato ad una siringa da tubercolina da 1 ml pretrattata con eparina. Mantenere la bocca dell'ago verso l'alto quando si inserisce ilsiringa in posizione orizzontale attraverso il diaframma verso il cuore, e lentamente e gradualmente disegnare il sangue evitando sovrappressione (figura 3).

2. Neutrofili isolamento

  1. Isolamento di neutrofili citotossici dal sangue di topi portatori di tumore.
    1. Diluire 1 ml di sangue prelevato da un topo portatore di tumore (vedi protocollo 1.11) in PBS contenente 0,5% (w / v) di albumina di siero bovino (BSA) per un volume finale di 6 ml.
    2. Frazionamento di sangue diluito su un gradiente discontinuo di saccarosio appena preparato:
      1. Aggiungere 3 ml di filtrata sterile saccarosio 1.119 g / ml a fondo di un 15 ml polipropilene conica provetta da centrifuga.
      2. Lentamente e con attenzione, di livello 3 ml di sterile filtrata saccarosio 1.077 g / ml in cima alla g / ml livello 1.119. Successivamente, aggiungere lentamente e con attenzione le 6 ml di sangue diluito (Protocollo 2.1.1) in cima al 1.077 g / ml strato (Figura 4A). Si raccomanda di tenere il tubo inclinato eggiunta i diversi componenti da un flusso lento, ma continuo, mantenendo la bocca della pipetta verso la parete inferiore del tubo, in modo tale che nessuna turbolenza è formato.
    3. Centrifugare la provetta contenente il sangue diluito sul gradiente di saccarosio a 700 xg per 30 min a temperatura ambiente senza freno.
    4. Rimuovere delicatamente la provetta dalla centrifuga senza causare turbolenze. La maggior parte degli eritrociti sarà sul fondo della provetta. Neutrofili ad alta densità (HDN) si trovano come un anello bianco a rosso all'interfaccia tra 1.119 g / ml e 1.077 g / ml (strati attorno al 3 ml), mentre i leucociti bassa densità si trovano in un anello bianco all'interfaccia tra la 1.077g / ml strato e la BSA contenente PBS (circa il marchio 6 ml, vedi Figura 4B).
    5. Aspirare il BSA PBS + 0,5% fino a raggiungere 5 mm sopra lo strato di cellule a bassa densità. Pipettare le cellule a bassa densità di lenta aspirazione in una punta di 1 ml attraverso lentamente turbinano intorno alle cellule.Trasferire le cellule in 30 ml di PBS con 0,5% BSA.
    6. Aspirare lo strato superiore nello stesso tubo gradiente fino 5 mm sopra la banda cellulare ad alta densità. Pipettare le cellule ad alta densità, che sono per lo neutrofili ad alta densità, e trasferire le cellule in 30 ml di PBS contenente 0,5% BSA.
    7. Centrifugare le cellule a 400 xg per 10 min a RT.
    8. Aspirare il surnatante e Lyse eritrociti risospendendo cellule in 36 ml di acqua per HPLC sterile per 30 sec. Isotonicità devono essere ripristinati aggiungendo 9 ml di un concentrato 5x PBS integrato con 2,5% (w / v) BSA.
    9. Centrifugare le cellule a 400 xg per 10 min a RT.
    10. Aspirare il surnatante e sospendere nuovamente le cellule in PBS-BSA. Contare il numero di neutrofili in un emocitometro e utilizzare trypan blu per distinguere tra cellule vive e morte.
    11. Centrifugare le cellule a 400 xg per 10 min a RT e risospendere le neutrofili nel mezzo di incubazione desiderata densità cellulare finale. Usoneutrofili immediatamente.
    12. Poi, dopo l'altro centrifugazione, risospendere le neutrofili nel mezzo di incubazione di densità cellulare finale. Utilizzare immediatamente i neutrofili.
  2. Isolamento di neutrofili circolanti da pazienti affetti da cancro.
    1. Mescolare 10 ml di eparina (20 U / ml) di sangue umano con un volume uguale di 3% destrano T500 in soluzione salina e incubare per 30 minuti a RT. Durante questa incubazione eritrociti saranno sedimentare.
    2. Preparare un tubo di polipropilene da 50 ml con 10 ml di saccarosio 1.077 g / ml e lentamente strato supernatante ricco leucociti in cima al 1.077 g / ml strato di saccarosio (Figura 4C).
    3. Centrifugare a 400 xg per 30 min a temperatura ambiente senza freno. I neutrofili ad alta densità (HDN) appariranno nel pellet. Neutrofili a bassa densità (LDN) co-purificano con linfociti e monociti all'interfaccia tra il 1.077 g / ml strato di saccarosio e plasma (Figura 4D).
    4. Risospendere i neutrofili in 10 ml 0.2% NaCl per 30 sec per lisare gli eritrociti contaminanti, e ripristinare isotonicità aggiungendo 10 ml di 1,6% NaCl e capovolgere volta.
    5. Centrifugare 5 min a 160 xg a temperatura ambiente, e lavare tre volte in 20 ml di soluzione salina bilanciata Hanks '. Centrifugare dopo ogni lavaggio e aspirare il surnatante.
    6. Contare i neutrofili e sospendere nuovamente le cellule in RPMI-1640 integrato con il 2% FBS a 2 x 10 6 neutrofili / ml o come desiderato.

3. Arricchimento di Sangue neutrofili utilizzando biglie magnetiche

  1. Selezione positiva
    1. Prendere 1 ml di sangue da un mouse come descritto nel protocollo 1.8, con una siringa eparinizzata.
    2. Centrifugare il sangue in una provetta conica da 15 ml a 400 xg per 5 minuti a temperatura ambiente.
    3. Aspirare il surnatante o mantenere il plasma sanguigno per ulteriori studi.
    4. Lyse gli eritrociti di risospendere le cellule in acqua HPLC 8 ml. Dopo 30 sec ripristinare isotonicità aggiungendo 2 ml di 5x concentrated PBS contenente 2,5% di BSA. Contare le cellule.
    5. Centrifugare a 400 xg per 5 minuti a temperatura ambiente.
    6. Risospendere il pellet di cellule in 200 microlitri di PBS contenente 0,5% di BSA e EDTA 2 mM per 10 8 cellule.
    7. Aggiungere 50 ml di anticorpo biotinilato anti-Ly6G. Mescolare bene e incubare per 10 min in frigorifero (non su ghiaccio).
    8. Aggiungere 150 ml PBS freddo contenente 0,5% di BSA e 2 mM EDTA.
    9. Vortex lo stock soluzione anti-biotina microperla magnetico rivestito. Trasferire 100 microlitri di sospensione cellulare. Mescolare bene e incubare per 15 min in frigorifero (non su ghiaccio).
    10. Lavare le cellule aggiungendo 10 ml di PBS contenente 0,5% di BSA e 2 mM EDTA e centrifugare a 400 xg per 10 min a RT.
    11. Aspirare il surnatante completamente, e risospendere in 500 microlitri freddo PBS contenente 0,5% di BSA e 2 mM EDTA.
    12. Inserire una colonna di separazione magnetica in un supporto magnetico che è collegato a un supporto magnetico, e risciacquare con 500 microlitri PBS freddo contenente 0.5% BSA e 2 mM EDTA.
    13. Applicare la sospensione cellulare sulla colonna. Il flusso continuo contiene cellule LyG6-negativo senza etichetta.
    14. Lavare la colonna con 500 microlitri di PBS contenente 0,5% di BSA e 2 mM EDTA. Cellule non marcate aggiuntivi saranno nel flusso attraverso.
    15. Ripetere la fase di lavaggio con un altro 500 microlitri di PBS contenente 0,5% di BSA e 2 mM EDTA.
    16. Rimuovere la colonna dal magnete e posizionarlo su un tubo di raccolta 15 ml. Aggiungere 1 ml di PBS contenente 0,5% di BSA e 2 mM EDTA, e scovare le cellule magneticamente marcate con fermezza spingendo lo stantuffo nella colonna. Il flusso contiene attraverso neutrofili Ly6G +.
  2. Selezione negativa
    1. Preparare leucociti del sangue secondo le misure 3.1.1 a 3.1.5.
    2. Risospendere 1 x 10 8 cellule in 1 ml di PBS contenente 0,5% di BSA e 2 mM EDTA in una provetta a fondo rotondo da 5 ml polistirene.
    3. Aggiungere 50 ml di siero di ratto normale.
    4. Aggiungere 50 ml di neutrofili arricchimento cocktail (contenenti anticorpi biotinilati specifico per le cellule bianche del sangue non neutrofili), mescolare bene e incubare per 15 minuti in frigorifero.
    5. Lavare le cellule aggiungendo 4 ml di PBS contenente 0,5% di BSA e 2 mM EDTA, e centrifugare 400 xg per 10 min.
    6. Eliminare il surnatante e risospendere le cellule in 1 ml di PBS contenente 0,5% di BSA e 2 mM EDTA.
    7. Aggiungere 50 ml di anticorpo tetramerici diretti contro biotina e destrano. Mescolare bene e incubare per 10 minuti in frigorifero.
    8. Vortex bene la provetta contenente microsfere magnetiche destrano rivestite prima di aggiungere 150 ml di sospensione cellulare. Mescolare bene e incubare 10 minuti in frigorifero.
    9. Portare la sospensione cellulare ad un volume totale di 2,5 ml aggiungendo PBS contenente 0,5% di BSA e 2 mM EDTA. Mescolare delicatamente per ottenere una sospensione cellulare omogenea.
    10. Inserire il tubo (senza il tappo) nel magnete, e lasciare riposare per 3 min.
    11. Invertire il magnete con il tubo in una continuamoto tale che le cellule non legato nel liquido saranno trasferiti in una nuova provetta. Lasciare il magnete e tubo invertito per 2-3 secondi, poi tornare alla posizione eretta. Le cellule indesiderate marcate magneticamente resteranno vincolati alla parete del tubo originale, mentre i neutrofili sciolti saranno nel fluido trasferito.

4. citologico colorazione di neutrofili

  1. Risospendere 1x10 5 neutrofili in 50 microlitri di PBS e trasferire la sospensione cellulare in un adattatore preparazione cellulare su strato sottile, come un Cytospin. Centrifugare l'adattatore a 150 g per 5 min. Separare il vetrino pre-etichettati dall'adattatore.
  2. Fissare cellule immergendo i vetrini in etanolo al 70% per 2 min. Lasciare i preparativi dalla scheda (vedi punto 4.1) ad asciugare a temperatura ambiente prima della colorazione. Immergere i vetrini 5 - 6 volte in acqua distillata.
  3. Macchia 1-2 min in soluzione ematossilina di Mayer. Sciacquare 1 min in acqua di rubinetto. Macchia 10 sec in soluzione eosina Y . Lavare in acqua del rubinetto. Disidratare sciacquando i vetrini in concentrazioni crescenti di etanolo (70%, 96% e 100%). Lasciate che il vetrini asciugare a breve e ispezionare i vetrini al microscopio ottico.
    NOTA: ematossilina ha un colore blu-viola profondo e macchie acidi nucleici, mentre eosina è rosa e le macchie proteine ​​in maniera non specifica. I granuli citoplasmatici dei neutrofili rimangono non colorati da coloranti acidi o basici, che è l'origine del nome 'amorevole di essere neutrale'. Mentre basofilo granulociti macchia blu scuro con ematossilina eosina e eosinophilc granulociti luminoso rosso, neutrofili appaiono rosa neutro (vedere Figura 1A). Neutrofili maturi sono caratterizzati da un nucleo polimorfonucleati, che in generale è grande con 2 - 5 'neutrofili segmentati' lobi (Figura 1A e 1C). Neutrofili immaturi sono caratterizzati da un nucleo curvo o anulare uno lobi (Figura 1B).
ve_title "> 5. Determinazione della purezza di neutrofili mediante citometria di flusso.

  1. Risospendere 1x10 6 cellule in 100 microlitri di tampone FACS (PBS contenente 0,5% di BSA, 2 mM EDTA e 0,02% NaN 3). Per i campioni di sangue intero, emolisi è necessario prima di colorazione (passaggi da 3.1.1 a 3.1.5). Aggiungere 10 ml di FcR reagente di blocco per 5 min.
  2. Aggiungere 0,5 mg di immunofluorescenza marcato con una specificità di Ly-6G per i neutrofili del mouse o CD11b e CD66b per neutrofili umani, mescolare bene e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente.
  3. Regolare il volume a 500 ml con PBS contenente 0,5% di BSA e 2 mM EDTA e analizzare la colorazione mediante citometria a flusso.

6. Seguire neutrofili Porta in vivo

  1. In etichettatura BrdU vivo di neutrofili
    1. Iniettare 100 ul di una soluzione 10 mg / ml bromodeossiuridina (BrdU) in PBS sterile per via intraperitoneale a topi portatori di tumore.
    2. Isolare neutrofili nel sangue 48 ore dopo l'iniezione di unecondo protocollo 2.1. Neutrofili utilizzando un kit di flusso BrdU Stain BrdU-etichettati.
  2. Etichettatura CFSE di neutrofili
    1. Risospendere 10 7 neutrofili in 1 ml di PBS preriscaldata.
    2. Aggiungere 2 ml di una soluzione madre 5 CFSE mM ai neutrofili sospese ad una concentrazione finale di 10 pM. Mescolare bene e incubare per 15 minuti a 37 ° C. 5 CFSE mM viene preparata sciogliendo 2,8 mg di CFSE (5- (e 6 -) - carbossifluoresceina diacetato, estere succinimidyl) in 1 ml di DMSO. Dividere in 10 microlitri aliquote in sterili 200 microlitri tubi e conservare al buio a -20 ° C.
    3. Neutralizzare eccesso CFSE aggiungendo un volume uguale di RPMI-1640 contenente 10% FBS. Incubare per 10 minuti a 37 ° C. Centrifugare i neutrofili a 400 xg per 10 min a RT. Lavare le neutrofili due volte in 10 ml di RPMI-1640 contenente 10% FBS.
    4. Centrifugare a 400 xg per 10 min e risospendere in un volume appropriato di PBS. I neutrofili (es, 1 x 10 7

7. In vitro luciferasi test per monitorare l'attività antitumorale di neutrofili isolati.

  1. Coltivare cellule tumorali luciferasi marcato come descritto per 4T1 cellule in 1,1-1,5 protocollo, ma sospendere nuovamente le cellule tripsina dissociati in ottimizzato medio siero ridotto integrato con 2% FBS. Regolare la densità cellulare di 5 x 10 4 cellule per ml.
  2. Seme 5.000 luciferasi marcato cellule tumorali in 100 microlitri ottimizzati medio siero ridotto contenente 0,5% FBS in ciascun pozzetto di una piastra ben tessuti cultura 96-a fondo piatto bianco.
  3. 4 ore dopo la semina delle cellule tumorali, aggiungere 1 x 10 5 neutrofili in 50 microlitri ottimizzati medio siero ridotto contenenti 0,5% FBS, e incubare O / N. Preparare una sospensione cellulare neutrofili con una densità di 2 x 10 6 cellule / ml. Pozzetti di controllo dovrebbero ottenere 50 ml di media senza neutrofili. Farepiù ripetizioni di ogni impostazione sperimentale.
  4. La mattina seguente, aspirare delicatamente il surnatante e lavare i pozzetti con 200 l di PBS. Aspirare il PBS e aggiungere 50 ml di tampone di lisi passivo. Per le cellule facilmente distaccanti (come AT-3 celle), non lavare in PBS e aggiungere la soluzione tampone di lisi coltura cellulare subito dopo l'aspirazione del mezzo di crescita.
  5. Coprire la piastra con un foglio di alluminio e incubare su agitatore orbitale a 150 rpm per 20 minuti a RT.
  6. Porre la piastra in un lettore di luminescenza. Iniettare ben saggio-50 soluzione test luciferasi microlitri, e leggere la chemiluminescenza per 10 secondi per pozzetto.
  7. Calcolare la lisi% tumorale dalla seguente formula:% lisi tumorale = (1- [luminescenza di campioni con neutrofili] / [luminescenza di campioni in media]) x 100%.

NOTA: Per valutare il contributo dei neutrofili a semina metastatico, i neutrofili possono essere scariche, come descritto nel protocollo 8.1. Per depl efficaceetion amministrare anticorpi neutrofili riducono a partire dal giorno 7 dopo il tumore attecchimento.

Attività 8. anti-metastatico di neutrofili in una Breast Cancer modello murino.

  1. In vivo deplezione dei neutrofili.
    1. Appena preparare 12,5 mg di anticorpo anti-topo Ly6G (anticorpi che riducono neutrofili) o di ratto anticorpo di controllo isotipo (IgG 2a, Κ) in soluzione salina ad un volume finale di 100 microlitri per topo.
    2. A partire dal giorno 3 post-tumore attecchimento iniettare ogni giorno una dose intraperitoneale di 12,5 mcg di ratto anti-Ly6G anticorpi (100 l). Iniettare topi di controllo con o 12,5 mg (100 mL) di anticorpi derattizzazione isotipo (IgG 2a, Κ).
    3. A partire dal giorno 14, amministrare gli anticorpi due volte al giorno, come il tasso di produzione di neutrofili aumenta notevolmente quando il tumore 4T1 cresce.
    4. Ogni altro giorno, di ottenere un campione di sangue (2-3 gocce) per intaccare il laterale coda vena. Raccogliere il sangue in un anti-coagulant contenente tubo (eparina, citrato o EDTA).
    5. Verificare neutrofili esaurimento citometria a flusso, come descritto nel protocollo 5.
  2. Tumore test di neutralizzazione (Modificata Winn Assay)
    1. Isolare neutrofili da topi portatori di tumore. Mescolare 1 x 10 6 cellule tumorali e 3 x 10 6 neutrofili nel 50 microlitri soluzione salina (per il mouse).
    2. Iniettare le cellule per via sottocutanea al fianco di 6-8 settimane ingenui topi BALB / c. Shave il fianco prima di tumore attecchimento per permettere misurazioni accurate delle dimensioni del tumore. Misurare le dimensioni del tumore di partenza tutti i giorni il giorno 5 post-attecchimento.
  3. Neutrofili trasferimento adottivo
    1. Iniettare 2 x 10 4 cellule tumorali-luciferasi che esprimono in 200 l di PBS alla vena della coda.
    2. Trasferimento dei neutrofili deve essere eseguita 4 ore dopo l'iniezione delle cellule tumorali. Da qui, inizia la purificazione di MEN da topi portatori di tumore (protocollo 2.1) circa 2 ore prima del loro previsto intrasferimento vivo. Risospendere neutrofili in PBS ad una concentrazione finale di 2,5 x 10 7 cellule / ml.
    3. 4 ore dopo l'introduzione delle cellule tumorali posto i topi sotto una lampada di calore per 5 min. Mettere i topi in un dispositivo di immobilizzazione e iniettare 5 x 10 6 HDN (200 microlitri) attraverso la vena della coda. Topi di controllo sono iniettati con veicolo (PBS).
    4. Monitorare la formazione di metastasi polmonari a vari intervalli di tempo utilizzando un sistema di imaging bioluminescenza in vivo o mediante immunoistochimica.
  4. Lung metastatico test semina
    1. Iniettare 0,5-1 x 10 6 cellule 4T1 parentali ortotopicamente nella inguinale cuscinetto di grasso mammaria sinistra come descritto nel protocollo 1.
    2. Il giorno 10, risospendere-GFP che esprimono 4T1 cellule in PBS ad una concentrazione finale di 5 x 10 5 cellule / ml. Posizionare i topi sotto una lampada di calore per 5 min.
    3. Mettere i topi in un dispositivo di immobilizzazione e iniettare 1x10 5-GFP che esprimono 4T1 cellule (200 microlitri) per via endovenosa a 4T1 topi portatori di tumore o topi naive.
    4. Il giorno seguente, l'eutanasia i topi e perfusione polmoni con 20 ml di PBS per rimuovere residui globuli rossi.
    5. Accise i polmoni per l'analisi di cellule GFP-positive mediante immunoistochimica.
      NOTA: Per valutare il contributo dei neutrofili a semina metastatico, i neutrofili possono essere scariche, come descritto nel protocollo 8.1. Per esaurimento efficace somministrare anticorpi-neutrofili riducono a partire dal giorno 7 dopo il tumore attecchimento.

9. Soppressione di T proliferazione cellulare da neutrofili da topi portatori di tumore cuscinetto.

  1. Rimuovere la milza da una eutanasia ingenuo topo BALB / c e posto in 10 ml di PBS.
  2. Posizionare la milza su un colino cella 40 micron che è adatto in una capsula di Petri riempita con RPMI-1640. Utilizzando la fine stantuffo della siringa, schiacciare la milza attraverso le cellule colino nella capsula di Petri. Risciacquare il filtro cella con 5 ml di RPMI. Eliminare il filtro.
  3. Trasferire le cellule risospese in una provetta conica da 50 ml e centrifugare 400 xg per 10 min.
  4. Eliminare il supernatante e lisare gli eritrociti sospendendo le cellule in 36 ml di acqua pura per 20 secondi, e regolare di isotonicità aggiungendo 4 ml di PBS concentrata x 10. Alternativamente, lisare gli eritrociti sospendendo le cellule in 5 ml di eritrociti lisi tampone (ACK) e incubare 5 minuti a temperatura ambiente. Neutralizzare il ACK aggiungendo 10 ml di terreno RPMI-1640. Centrifugare a 400 xg per 10 min a RT. Risospendere le cellule in 5 ml di PBS e contare le cellule.
  5. Risospendere le splenociti in PBS ad una densità finale di 4 x 10 7 cellule / 2 ml a 15 ml di tubo. Aggiungere 2 ml di una soluzione CFSE 2,5 micron in PBS. Invertire rapidamente la provetta e incubare per 10 minuti a 37 ° C con miscelazione occasionale (ogni 2 min), al riparo dalla luce.
  6. Quench eccesso CFSE aggiungendo 4 ml di pre-riscaldato FBS (100%) e incubare per 1 min a RT. Aggiungere 3 ml di PBS e centrifugare a 400 xg per 10min.
  7. Lavare le cellule con 30 ml di PBS e centrifugare a 400 xg per 10 min.
  8. Filtrare le cellule attraverso un colino cella 40 micron e lavare nuovamente con PBS.
  9. Risospendere le cellule in terreno RPMI-1640 supplementato con 10% FBS a una densità finale di 2 x 10 7 cellule / ml.
  10. Seed 2 x 10 6 / pozzetto (200 ml) in una piastra di coltura tissutale-24-bene.
  11. Stimolare le cellule aggiungendo 1 mg di purificato criceto armeno anticorpo anti-topo CD3ε in 500 microlitri RPMI-1640 con il 10% FBS.
  12. Aggiungere 2 x 10 6 HDN o LDN in 300 ml RPMI-1640 con il 10% FBS agli splenociti CFSE etichettati, e incubare per 3 giorni a 37 ° C. Wells senza neutrofili dovrebbero ottenere 300 microlitri di media. Volume totale in ciascun pozzetto dovrebbe essere di 1 ml.
  13. Raccogliere le cellule e prepararli per citometria a flusso. Risospendere le cellule in 100 microlitri tampone FACS (Protocollo 5), e aggiungere 10 ml di FcR reagente bloccante. Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
  14. Aggiungere 1 &# 956; l di anticorpo APC-coniugato anti-CD8α e incubare per 15 minuti a RT.
  15. Determinare l'intensità di fluorescenza CFSE sulle cellule CD8 + T mediante citometria di flusso (figura 5). L'intensità CFSE si dimezza ad ogni divisione cellulare. Così, il numero di divisioni cellulari può essere determinata dall'intensità del CFSE colorazione.

10. neutrofili Migration Assay

  1. Seme 5x10 5 cellule 4T1 in 7 ml ottimizzato medio siero ridotto integrato con 0,5% FBS in 25 cm 2 pallone di coltura tissutale e incubare 24 ore a 37 ° C.
  2. Trasferire 800 ml di surnatante alla camera inferiore di una piastra di migrazione con una porosità di 5 micron.
  3. Risospendere 2 x 10 5 neutrofili in 400 ml di ottimizzato medio siero ridotto integrato con 0,5% FBS. Applicare la sospensione cellulare nella camera superiore e incubare per 2 ore a 37 ° C.
  4. Al termine dell'incubazione, togliere la camera superiore econtare il numero di neutrofili che sono emigrati per la camera inferiore.

11. Il monitoraggio dei neutrofili produzione di specie reattive dell'ossigeno (ROS).

  1. Preparare 1,1 x 10 6 neutrofili / ml in soluzione salina bilanciata di Hank senza rosso fenolo. Piatto 180 ml ​​contenenti 2 x 10 5 neutrofili in ciascun pozzetto di una piastra da 96 pozzetti a fondo piatto-bianco.
  2. Porre la piastra in un lettore di luminescenza. Aggiungere 20 ml di una soluzione luminol 500 mM in PBS a ciascun pozzetto per ottenere una concentrazione finale di 50 pM. Leggere la chemiluminescenza basale per 1 sec in un corso a tempo di 5 minuti con intervalli di 10 sec.
  3. Aggiungere uno stimolante (es PMA ad una concentrazione di 10 nM e 100 nM o fMLP ad una concentrazione di 10 mM). Preparare una soluzione concentrata 10x di ogni agente in soluzione salina bilanciata di Hank senza rosso fenolo e aggiungere 22 microlitri di rispettivi pozzetti. Per controllare i pozzi aggiungere 22 ml veicolo.
  4. Measure la chemiluminescenza del lettore di piastre. Fate entrambi a breve (ogni 10 secondi per 5 minuti) e un lungo (ogni minuto per 1 ora) decorso.

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Representative Results

In un recente studio abbiamo identificato una funzione anti-metastatico per i neutrofili 6. I neutrofili da topi portatori di tumore acquisire un fenotipo citotossico e hanno la capacità di uccidere le cellule tumorali 6. Questo è in contrasto con neutrofili da topi naive che non hanno alcun significativo effetto antitumorale 6. Molte delle tecniche descritte nella sezione protocollo sono stati utilizzati per studiare la funzione dei neutrofili antitumorale in vitro e in vivo 6.

Neutrofili Tumore citotossici possono essere ottenute da topi portatori di tumore 6. Per raggiungere questo obiettivo, i topi sono stati iniettati con ortotopicamente 4T1 cellule nel inguinale cuscinetto di grasso mammaria sinistra (protocollo 1). Di giorno 21 post-inoculazione del tumore, il tumore primario ha raggiunto una dimensione di 1 - 2 cm 3 (Figura 3 - il tumore è evidente nell'addome inferiore sinistro). In questo momento, i topi sono stati eutanasia e 1 ml di sangue è stato elaborato (per mouse)mediante puntura cardiaca (Figura 3). In parallelo, il sangue da un topo ingenuo, non tumorali-cuscinetto è stato redatto. HDN stati poi purificato su gradiente di densità (Protocol 2.1 e Figura 4) per ottenere un elevato grado di purezza (> 98%) popolazione di neutrofili. La vitalità dei neutrofili è stato determinato Trypan Blue colorazione (protocollo 2.1). I neutrofili sono state poi risospese in mezzo ottimizzato siero ridotto contenente 0,5% FBS a 2 x 10 6 / ml neutrofili.

Per testare il grado di neutrofili citotossicità, abbiamo aggiunto 10 5 neutrofili (50 ml da un x 10 6 neutrofili / ml di soluzione madre 2) a luciferasi che esprimono 4T1 cellule bersaglio (5.000 cellule / pozzetto in 100 ml), in un fondo piatto bianco 96 Piastra be '(protocollo 7). Dopo un'incubazione O / N, le cellule sono state lavate in PBS e lisate in tampone di lisi cellulare passivo e l'attività luciferasica in ciascun campione è stato testato per valutare l'entità del neutrofili citotossicità ( (Figura 2B, tumore gratuito), neutrofili purificato da topi portatori di tumore mostrano significative citotossicità (Figura 2B, cuscinetto tumore).

Per testare le proprietà immunosoppressivi a LDN e HDN abbiamo usato il saggio di proliferazione delle cellule T (protocollo 9). Abbiamo valutato lanumero di cellule CD8 + in splenociti non trattati e in splenociti trattati con un anticorpo αCD3, che erano coltivate solo e le cellule sono state coltivate in presenza di LDN o in presenza di HDN (Figura 5A-D). Si noti il drammatico aumento delle cellule CD8 + CFSE + in seguito a stimolazione anti-CD3 (confrontare riquadro in alto a destra in A e B), il drammatico effetto inibitorio di soppressivo LDN (confrontare riquadro in alto a destra in B e C) e la mancanza di effetto inibitorio di HDN (pannello D). Abbiamo anche valutato il grado di ritenzione CFSE, come indicazione per la proliferazione. In Figura 5E, la curva arancione presenta CD8 + cellule non trattate, la curva blu CD8 + cellule, trattate con anticorpi αCD3, la curva rossa CD8 + cellule stimolate con αCD3 in presenza di LDN e la curva verde rappresenta cellule CD8 + stimolate con α, CD3 in presenza di HDN. Nota lo spostamento a sinistra nelle celle αCD3 trattate (curva blu) e il αCD3 trattati cellule in coltura con HDN (curva verde), che indicano la proliferazione delle cellule CD8 +.

Figura 1
Immagine immagine Figura Luce microscopia ad alta densità (A) e neutrofili a bassa densità (B) colorati con ematossilina e eosina (H & E) dopo la preparazione delle cellule a strato sottile 1. neutrofili morfologia.. (C) A microscopia elettronica a trasmissione (TEM) di neutrofili alta densità. La barra rappresenta 1.000 nm. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2
Figura 2. Sangue conta dei neutrofili aumentano con il tumore progression e neutrofili acquisiscono un fenotipo citotossico. (A) Il numero dei neutrofili circolanti per 1 ml è stato contato mediante FACS a vari giorni seguenti tumore inoculazione delle cellule in topi BALB / c. Il numero di circolanti CD11b + Ly6G + neutrofili aumenta continuamente con la progressione tumorale 4T1. (B) 4T1 cellule del seno carcinoma sono state co-coltura con neutrofili ad alta densità da entrambi i topi naïve (Tumor gratuito) o 4T1 topi portatori di tumore (cuscinetti Tumor) topi, o incubate in mezzo in assenza di neutrofili (Cont.) a 37 ° C per 20 ore. I neutrofili per tumore cuscinetto topi, ma non dal tumore topi liberi, mostrano una significativa citotossicità verso 4T1 cellule tumorali. Barre di errore rappresentano ± SEM ** p <0.01 con t-test di uno studente. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

"Figura Figura 3. Raccolta di sangue murino tramite puntura cardiaca. Il mouse è stato abbattuto in una camera di induzione sotto lenta flusso di CO 2. Subito dopo il topo ha preso il suo respiro terminale, viene disteso sul dorso e una siringa da 1 ml eparina viene inserito alla base dello sterno fino a raggiungere il cuore. Tirare lentamente lo stantuffo per aspirare il sangue. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4. neutrofili purificazione da sangue intero. (A) 3 ml di 1.077 g / ml di saccarosio è accuratamente sovrapposto di 3 ml 1.119 g / ml di saccarosio per formare un gradiente discontinuo. Sangue murino intero, diluito in PBS-BSA (0,5%) ad un volume finale di 6 ml, è quindi stratificati sopra del 1,077 g / ml di saccarosio (B) A seguito di un 30 minuti di rotazione a 700 xg senza interruzione, 3 frazioni distinte possono essere osservati.; R - globuli rossi nel pellet, G - la frazione granulocitica contenente neutrofili alta densità, M -. Frazione mononucleate contenenti cellule mononucleari e neutrofili a bassa densità (C) appena prelevato sangue umano viene mescolato con un volume uguale di destrano 500 ( 3%) e incubate a temperatura ambiente per 30 min. La frazione superiore contenente i globuli bianchi (buffy coat) viene quindi sovrapposto di 10 ml 1.077 g / ml di saccarosio (D) Dopo 30 min girare a 400 xg senza interruzione, può essere osservato 2 frazioni distinte.; R + G - pellet contenente i globuli rossi e dei neutrofili ad alta densità, M -. Mononucleate frazione contenente cellule mononucleari e neutrofili a bassa densità Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 5
Figura 5. soppressione della proliferazione delle cellule T. Citometria a flusso analizza che mostra il numero di cellule CD8 + CFSE marcati coltivate in assenza dello stimolo (A), in seguito a stimolazione con anticorpi αCD3 in assenza (B) o la presenza di LDN (C) o HDN (D) (E) presentazione Istogramma di intensità CFSE in CD8 + da pannelli A -.. D Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Discussion

I neutrofili sono la più abbondante di tutte le cellule bianche del sangue e sono i primi interventi in caso di infezioni e infiammazioni. Come tali, essi sono molto sensibili a segnali esterni e sono facilmente attivati. Inoltre, i neutrofili hanno una breve emivita e un rapido turnover. Insieme, queste caratteristiche sollevano varie difficoltà nel lavorare con neutrofili, tale che sono richieste uniche strategie sperimentali. Per esempio, ci sono diverse strategie di purificazione dei neutrofili, ognuno con i suoi pro e contro.

Un passo fondamentale nel lavoro con i neutrofili è la loro purificazione dal sangue intero. I neutrofili possono essere efficientemente purificati usando sia gradienti di densità o strategie a base di anticorpi (positivi o negativi) di selezione. Il nostro metodo di scelta è l'uso di gradienti di densità poiché produce un elevato numero di neutrofili altamente purificate con minima attivazione non specifica. Tuttavia, come si vedrà in un recente studio 21, il motto di spiritoh tumorali neutrofili progressione accumulano in grandi numeri nella frazione mononucleare a bassa densità. In queste condizioni l'uso di un gradiente di densità fornisce una frazione neutrofili altamente puro ad alta densità, che non rappresenta l'intero repertorio circolante neutrofili, e una frazione neutrofili a bassa densità che è fortemente contaminato con altre cellule mononucleate (linfociti e monociti). In queste circostanze, il metodo di scelta è una purificazione a base di anticorpi, selezione preferibilmente negativo. L'uso di anticorpi per purificare neutrofili produce neutrofili altamente puri e meglio rappresenta l'intera circolazione neutrofili repertorio. Tuttavia, abbiamo notato che il più a lungo i neutrofili vengono incubati con gli anticorpi, le possibilità di aumento aspecifico di attivazione. Pertanto suggeriamo che per ottenere i migliori risultati, a base di anticorpi purificazione neutrofili deve essere eseguita il più rapidamente possibile. A base di anticorpi purificazione dei neutrofili è anche il metodo di scelta quando purifying neutrofili da tessuti o tumori.

Indipendentemente dalla procedura di purificazione prescelta, la purezza, vitalità e integrità funzionale deve essere rigorosamente valutate. La purezza dei neutrofili può essere determinata mediante citometria di flusso usando anticorpi che reagisce con marcatori di superficie neutrofili. Nel topo, Ly-6G è specifico per i neutrofili, che sono caratterizzati da un CD11b + Ly-6C bassa Ly-6G + F4 / 80 - fenotipo. Neutrofili umani non esprimono un indicatore analogo a Ly-6G e sono spesso caratterizzate dall'espressione di CD11b, CD15, CD16 e CD66b. Dal momento che i neutrofili hanno recettori Fc, queste devono essere bloccati prima immunocolorazione. I neutrofili possono anche essere distinti dagli altri globuli bianchi avendo un SSC superiore. Redditività dovrebbe essere determinato alla fine del processo di purificazione (trypan blue, protocollo 2.1) e deve essere costantemente superiore al 98%. Integrità funzionale dovrebbe essere determinato dal purizione dei neutrofili di topi naïve. Questi neutrofili non sono attivati, e controllano non citotossico per i neutrofili tumore trascinato in un ambiente co-coltura con cellule tumorali (protocollo 7).

La breve emivita di neutrofili nel sangue insieme con il basso numero di neutrofili (~ 3-5 x 10 5) ottenuto da 1 ml di sangue di un ingenuo 6-8 settimane di età del mouse, hanno reso difficile da esplorare funzione dei neutrofili nel sangue mouse vitro. Numeri neutrofili aumentano costantemente negli stati di infiammazione e, occasionalmente, nel cancro, che rappresenta uno stato di infiammazione cronica 7. Alcuni ricercatori hanno cercato di trovare fonti alternative per neutrofili, come il midollo osseo 20. Un elevato numero di neutrofili topo può essere ottenuto entro 4-24 ore dopo un'iniezione intraperitoneale di 1 ml di una soluzione di brodo di tioglicolato 3% o 1 ml di 1 mg / ml Zymosan Una soluzione salina. Ma questi neutrofili suscitato non esercitino unny attività anti-cancerogena (osservazione inedito).

. Granot et al 6 osservato che i topi BALB / c inoculati ortotopicamente con carcinoma mammario topo 4T1 sviluppare neutrofilia che aggrava sul tempo (Figura 2A), tale che 20-40.000.000 neutrofili sangue possono essere facilmente isolati da 1 ml di sangue 3 - 4 settimane inoculazione post-tumore. Questi neutrofili hanno acquisito le attività anti-tumorali, e sono stati di conseguenza chiamati neutrofili tumore trascinato (TEN), al fine di distinguerli dai neutrofili naïve (Figura 2B). Mentre neutrofili alta densità (HDN) sono altamente anti-oncogeno, neutrofili a bassa densità (LDN) generate nel contesto di cancro non sono 21. Neutrofili ad alta densità di midollo osseo e milza di topi portatori di tumore hanno anche attività anti-tumorale (dati non pubblicati). Va notato che, con progressione tumorale milza diventa gradualmente (splenomegalia), con incordonatura quantità di neutrofili.

Al fine di monitorare il destino dei neutrofili dopo il loro trasferimento adottivo, questi devono essere etichettati. I neutrofili possono essere etichettati in vivo iniettando bromodeossiuridina (BrdU) nel tumore fruttifero o topi naïve 2 giorni prima l'isolamento. BrdU è un analogo del precursore timidina DNA che viene incorporato nel DNA di nuova sintesi in cellule proliferanti. Nel caso di neutrofili, BrdU saranno inseriti in cellule proliferanti precursori che conservano BrdU colorazione quando differenziarsi in mature neutrofili post-mitotico. Il BrdU incorporato può essere colorato con anticorpi fluorescenti anti-BrdU specifici. Le cellule BrdU + possono poi essere analizzati mediante citometria a flusso. Un altro approccio è quello di etichettare i neutrofili isolati con un colorante inseguitore cellulare come 5-carboxyfluorescein N-succinimidil estere (CFSE). CFSE è un composto di estere che può passare attraverso le membrane delle cellule vitali. Ha un succinimid ammino-reattivagruppo yl che porta al legame di fluoresceina alle proteine ​​e altri gruppi amminici nella cella e la superficie cellulare covalente. Le cellule CFSE marcato possono essere analizzati mediante citometria di flusso con il laser ad argon 488 nm. Le due tecniche di etichettatura differiscono per il fatto che l'etichettatura BrdU dipende proliferanti cellule precursori, e non tutti i neutrofili circolanti saranno etichettati, mentre CFSE verranno colorati tutti neutrofili. Rilevazione di CFSE è più semplice di BrdU colorazione, tuttavia etichettatura BrdU è un buon mezzo per seguire il immaturo a maturare la conversione dei neutrofili.

Abbiamo anche descritto diversi metodi per determinare la funzione anti-tumorale e anti-metastatica di neutrofili. Questi includono neutrofili esaurimento, neutrofili trasferimento adottivo, tumore test di neutralizzazione e metastasi polmonari seeding test. Ciascuno di questi test compie un aspetto specifico di funzioni neutrofili antitumorali. Per esempio, Granot et al. 6 osservato che dopo depletion dei neutrofili, è aumentato il numero delle metastasi polmonari in 4T1 topi portatori di tumore, suggerendo un ruolo di anti-metastatico dei neutrofili. Su neutrofili trasferimento adottivo, le cellule tumorali vengono iniettate per via endovenosa 4 ore prima dell'iniezione di purificato HDN. La capacità delle cellule tumorali di formare metastasi polmonari e epatici sono seguiti in uno studio decorso temporale utilizzando un sistema di imaging in vivo ottico. I topi trattati con HDN mostrato meno foci metastatici di fatto topi di controllo 6. Nel test di neutralizzazione del tumore, le cellule tumorali vengono iniettate per via sottocutanea con o senza HDN, la presenza di HDN riduce la crescita tumorale 21. Nel saggio semina metastatico, le cellule tumorali GFP-etichettata vengono iniettate per via endovenosa in controllo o pre-metastatici topi portatori di tumore neutrofili impoverito, e la capacità delle cellule GFP marcato a seme nel polmone è determinata. I polmoni di topi portatori di tumore pre-metastatiche sono caratterizzati da alta infiltrazione dei neutrofili che impedisce tumoresemina delle cellule nell'organo specifico 6. Questo si traduce in più focolai metastatico in topi neutrofili impoverito rispetto ai topi di controllo di tumore.

I protocolli descritti attenzione per studiare la funzione dei neutrofili nel contesto del cancro e fornire strategie per valutare correlati al cancro proprietà neutrofili sia in vitro che in vivo. Tuttavia, le strategie di purificazione neutrofili così come alcune delle procedure sperimentali descritte possono essere utilizzati per studiare la funzione dei neutrofili in una vasta gamma di impostazioni sperimentali dove neutrofili giocano un ruolo critico (cioè, infiammazione e infezione).

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Acknowledgements

ZG è sostenuta da sovvenzioni dal Programma I-CORE di The Science Foundation Israele (Grant No. 41/11), la Fondazione Abisch-Frenkel, il Rosetrees Trust, la Israel Cancer Research Foundation (ICRF - Research Career Development Award) e il fondazione PREOCCUPAZIONE. ZGF è sostenuto da sovvenzioni dal Israel Cancer Research Foundation (ICRF - Research Career Development Award), Chief Scientist del Ministero della Salute di Israele e la Israel Lung Association.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CELL LINES
Mouse 4T1 breast carcinoma cells ADCC CRL-2539 Growth medium: DMEM + 10 % heat-inactivated FBS
PLASTIC WARES AND EQUIPMENTS
24-well Tissue Culture Plate  Falcon 353047 Sterile
100 mm Tissue Culture Plate  Corning 430167 Sterile
25 cm2 Tissue Culture Flask Nunc 156340 Sterile
90 mm Bacterial Grade Culture Dish  Miniplast, Ein Shemer, Israel 20090-01-017 Sterile
15 ml Sterile Conical Centrifuge Tube  Miniplast, Ein Shemer, Israel 835015-40-111 Sterile
50 ml Sterile Conical Centrifuge Tube  Miniplast, Ein Shemer, Israel 835050-21-111 Sterile
Falcon 12 x 75 mm Round-Bottom Polystyrene Tube  Becton Dickinson 352058 Sterile
Millicell 24 Migration Plate with a pore size of 5μm  Merck Millipore PSMT010R1 Sterile
White 96-Flat-Bottom Well Plate  Costar 3917 Sterile
Cell Strainer (40 mm)  BD Falcon 352340 Sterile
20G x 1.5" Needle BD Microlance 3  301300 Sterile
23G x 1" Needle  BD Microlance 4 300800 Sterile
25G x 5/8" Needle  BD Microlance 5 300600 Sterile
0.3 ml Syringe with a 30G x 8mm Needle BD Micro-Fine Plus Demi 320829 Sterile
9 mm Clips  BD, AutoClip  427631 Sterile
EasySep Magnet  STEMCELL Technologies 18000
MACS LS Separation Column  Miltenyi Biotech 130-042-201 Sterile
MidiMACS Separator Magnet Miltenyi Biotech 130-042-302
MACS MultiStand Miltenyi Biotech 130-042-303
Microscope Glass Slide  Menzel-Gläser Superfrost  Plus Thermo J1800AMNZ
Orbital Shaker  Sky line, ELMI S-3.02.10L
Plate Reader  TECAN InfiniteF200Pro
POWDER
Bovine serum albumin (BSA), fraction V Sigma A7906
Bromodeoxyuridine (BrdU)  BD Pharmingen 550891 Sterile
CFSE (5-(and 6-)-Carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl ester) Molecular Probes C1157
Dextran T500 Sigma 31392
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa  Sigma H3149
Sodium azide (NaN3) Sigma S8032 Highly toxic, handle with care
Thioglycollate powder  Difco 225650
Zymosan A Sigma Z4250
MEDIA AND SUPPLEMENTS
Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) Sigma D5796 Sterile
Opti-MEM® I reduced serum medium  Life Technologies 31985062 Sterile
Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 medium Sigma R8758 Sterile
Foetal bovine serum (FBS), heat-inactivated Sigma F9665 Sterile
L-Glutamine Biological Industries, Beth HaEmek, Israel 03-020-1A Sterile
Sodium pyruvate Biological Industries, Beth HaEmek, Israel 03-042-1B Sterile
Penicillin Streptomycin x 1000 solution Biological Industries, Beth HaEmek, Israel 03-031-5 Sterile
Phosphate buffered saline (PBS) without Mg2+ and Ca2+  Biological Industries, Beth HaEmek, Israel 02-023-1 Sterile
PBS x 10 without Ca2+ and Mg2+  Biological Industries, Beth HaEmek, Israel 02-023-5A Sterile
HPLC grade water  J.T. Baker 4218-03 Autoclave
SOLUTIONS
ACK – Ammonium-Chloride-Potassium Life Technologies  A10492-01
Bromodeoxyuridine (BrdU) solution (10 mg/ml) in PBS Dissolve 10 mg of BrdU in 1 ml PBS and sterile filter.
CFSE, 5 mM in DMSO Dissolve 2.8 mg of CFSE in 1 ml DMSO. Divide into 10 ml aliquots in sterile 200 ml tubes and store in the dark at -20oC.
Eosin Y solution Sigma HT110-2-32
Hanks' balanced salt solution Biological Industries, Beth HaEmek, Israel 02-016-1A Sterile
Heparin, 20 mg/ml in PBS Dissolve 100 mg Heparin in 5 ml sterile PBS, and sterile filter through a 0.2 mm filter. 
Histopaque-1119  Sigma 11191 Sterile filter through a 0.2 mm filter.
Histopaque-1077  Sigma 10771 Sterile filter through a 0.2 mm filter.
Luciferase cell culture lysis buffer x5 Promega E153A Dilute 1:5 in sterile water just before use.
Luciferase assay solution Promega E1501 Contains luciferase assay substrate powder (E151A) and luciferase assay buffer (E152A)
Mayer's Hematoxylin solution  Sigma MHS-32
PBS + 0.5% BSA Dissolve 2.5 g BSA in 500 ml PBS, and sterile filter through a 0.2 mm filter.
PBS + 1% BSA Dissolve 1g BSA in 100 ml PBS, and sterile filter through a 0.2 mm filter.
5x PBS with 2.5% BSA Dissolve 12.5g BSA in a mixture of 250 ml sterile HPLC-grade water and 250 ml PBSx10, and sterile filter through a 0.2 mm filter.
PBS containing 0.5% BSA and 2 mM EDTA Dissolve 250 mg BSA in 50 ml sterile PBS and add 200 ml of 0.5M EDTA pH 8.0, sterile filter through a 0.2 mm filter.
FACS buffer (PBS containing 0.5% BSA, 2 mM EDTA and 0.02% NaN3) Dissolve 250 mg BSA in 50 ml sterile PBS  and add 200 ml of 0.5M EDTA pH 8.0 and 500 ml of 2% NaN3, sterile filter through a 0.2 mm filter.
Saline (0.9% NaCl) Dissolve 9 g NaCl in 1,000 ml ddw, autoclave
0.2% NaCl solution Dissolve 2 g NaCl in 1,000 ml ddw, autoclave
1.6% NaCl solution Dissolve 16 g NaCl in 1,000 ml ddw, autoclave
2 % Sodium azide Dissolve 1g sodium azide in 50 ml sterile ddw, keep at 4oC. Highly toxic.
3% Thioglycollate solution                                        Dissolve 3 g of thioglycollate powder in 100 ml ddw.                                        Boil until solution becomes yellow and autoclave.
Trypan blue solution (0.4%) Sigma T8154 Dilute 1:10 in PBS to get a 0.04% solution.
Trypsin solution B  Biological Industries, Beth HaEmek, Israel 03-046-1 Sterile
1 mg/ml Zymosan A Resuspend 1 mg Zymosan A in 1 ml sterile PBS in an Eppendorf tube. Vortex vigorously and incubate the tube at 37 oC for 30 min. Do not autoclave. Prepare the solution freshly before use.
KITS
EasySep PE selection kit STEMCELL Technologies 18557
EasySep PE selection cocktail  STEMCELL Technologies 18151
the EasySep magnetic nanoparticles  STEMCELL Technologies 18150
Anti-Ly6G mouse MicroBead Kit Miltenyi Biotec 130-092-332
EasySep Mouse Neutrophil Enrichment Kit STEMCELL Technologies 19762
EasySep Human Neutrophil Enrichment Kit STEMCELL Technologies 19257
FITC BrdU flow kit BD Pharmingen  559619
MACS Neutrophil isolation kit Miltenyi Biotec 130-097-658
Phagocytosis Assay Kit  Cayman Chemical Company  500290
ANTIBODIES
FcR blocking antibody  Biolegend 101302
Purified rat anti-Ly6G antibody  BD Pharmingen  551459 Clone 1A8
PE-conjugated rat anti-mouse Ly6G antibody  Biolegend 127608 Clone 1A8
FITC-conjugated rat anti-mouse Ly6G BD Pharmingen  551460 Clone 1A8
PerCP-Cy5.5 rat anti-mouse Ly6G  TONBO Biosciences 65-1276 Clone 1A8
violetFluor 450-conjugated rat anti-mouse Ly6G  TONBO Biosciences 75-1276 Clone 1A8
FITC-conjugated rat anti-mouse CD11b BD Pharmingen  553310 Clone M1/70
FITC-conjugated rat anti-mouse Ly-6G and Ly-6C (GR-1) BD Pharmingen  553127 Clone RB6-8C5
PE-conjugated rat anti-mouse CD45 BD Pharmingen  553081 Clone 30-F11
FITC-conjugated rat anti-mouse F4/80  Abcam ab60343 Clone BM8
FITC-conjugated mouse anti-human CD66b  Biolegend 305103 Clone G10F5
Purified rat isotype control antibody (IgG2a, k)  BD Pharmingen  553927 Clone R35-95
LEAF purified Armenian hamster anti-mouse CD3e antibody BioLegend 100314 Clone 145-2C11

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References

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