תפקוד חלבון לימוד ותפקיד ביטוי חלבון לשנות על ידי הפרעת נוגדן שחזור תלת ממדי

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Derlig, K., Gießl, A., Brandstätter, J. H., Enz, R., Dahlhaus, R. Studying Protein Function and the Role of Altered Protein Expression by Antibody Interference and Three-dimensional Reconstructions. J. Vis. Exp. (110), e53049, doi:10.3791/53049 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

ניהול קפדני של ביטוי חלבון הוא לא רק חיוני כל אורגניזם חי, אלא גם אסטרטגיה חשובה לחקור פונקציות חלבון במודלים הסלולר. לכן, מחקר שנעשה לאחרונה המציא כלים שונים למקד ביטוי חלבון בשורות תא יונקים או אפילו במודלים של בעלי חיים, כולל RNA והפרעת נוגדן. בעוד האסטרטגיה הראשונה אסף תשומת לב רבה במהלך שני העשורים האחרונים, פפטידים בתיווך טרנסלוקציה של מטעני נוגדן פני ממברנות הסלולר לתאים, השיגו עניין הרבה פחות. בפרסום זה, אנו מספקים פרוטוקול מפורט כיצד לנצל נשאית פפטיד בשם המרכבה בתאי כליה עובריים אנושיים כמו גם נוירונים בהיפוקמפוס העיקרי לבצע ניסויים התערבות נוגדן ובהמשך להדגים את יישום שחזורים תלת מימדי בניתוח תפקוד החלבון. הממצאים שלנו מראים כי המרכבה הוא, ככל הנראה בשל אות לוקליזציה הגרעין שלה, particularly היטב מתאים למקד חלבונים המתגוררים סומה הגרעין. למרבה הפלא, כאשר פונים מרכבה לתרבויות בהיפוקמפוס עיקרית, מגיב התברר להתקבל באופן מפתיע גם על ידי נוירונים ניתקו.

Introduction

פיקוח הדוק של ביטוי החלבון חיוני בכל אורגניזם חי לפקד פיתוח משלה, כמו גם להגיב לאותות סביבתיים. לפיכך, מספר רב של מנגנונים הומצא במהלך האבולוציה כדי לווסת את רמת הביטוי בדיוק של כל חלבון המקודד על ידי היישום. 20,000 גנים קיימים בכל תא אוקריוטים בכל זמן נתון של החיים שלה. המתרחשים בשלבים שונים של ייצור חלבונים, מנגנוני ויסות נעים מניהול מבנה הכרומטין, שעתוק RNA טיפול לכיוון שינויי חלבון posttranslational, תחבורה ושפלה.

לכן זה לא מפתיע כי תקלות מנגנונים מולקולריים שבבסיס ורמות ביטוי חלבון שינה נקשרו עם מחלות שונות כגון סרטן או מוגבל שכלי. ואכן, הסתכלות על המורכבות הבלתי המסולקות של התפתחות עצבית ואת תפקוד מוח יונק, Sensitivity של מערכות מתוחכמות אלו שינויים בביטוי חלבון מתבטא בגירעונות אינטלקטואלי כמה ידועים כולל אלצהיימר ומחלת פרקינסון (AD ו- PD) וכן הפרעות הספקטרום האוטיסטי (ASD) כמו תסמונת ה- X השביר (FXS). המחלה האחרונה מתאפיינת misexpression נרחב של מגוון של חלבונים, אשר בשל האובדן של חלבון מווסת תרגום יחיד, FMRP (חלבון ה- X שביר נפש הפיגור) 1-4. יתר על כן, rearrangements כרומוזומליות המשפיע על התשלום משתנה x חלבון צמוד (VCXA), חלבון, מנהלת יציבות mRNA ותרגום ידי שינוי mRNA מכסת 5, נקשר לאחרונה עם גירעונות רוחניים, ואילו מוטציות נקודתיות לא מזוהות בחולים בעלי מוגבלויות קוגניטיביות נכון לעכשיו 6, 7, הדבר המצביע על כך הליקויים הנפשיים ציינו מקורן ביטוי VCXA שינה וביטוי dysregulated של prote היעד שלהins. בקנה אחד עם ממצאים אלה, כך עולים ממחקר החוקר האם דה נובו וריאציות מספר עותק של גנים הקשורים ASD נקבע כי כפילויות ומחיקות גן ברומן הן גורמות סיכון משמעותי עבור 8 ASD, ובכך תומכות ברעיון כי רמות ביטוי חלבון גבוהות או פחתה עלולות לגרום גירעונות רוחניים.

למרבה הפלא, המחקרים האחרונים ספקו עוד ראיות כי רמת הביטוי של חלבון נתון מותאמת בדיוק כדי למנוע הצבירה שלה וכתוצאה מכך כמויות חלבון גבוהות עם כמעט ללא שולי בטיחות 9. לפיכך הוצע כי גם במרווחים קטנים הם מספיק כדי לגרום מחלות כמו אלצהיימר PD 9. למרות המגוון של מנגנונים מולקולריים תורמים לשליטת חלבון ביטוי מרמז תכנית תקנה מורכבת לאור ממצאים אלה, כך עולים ממחקר חוקר את רמת הביטוי של למעלה מ -5,000 גנים יונקים 10 הוכיח כיהטבע העדיף תכנית חסכנית יותר: השפע של החלבונים הוצג להיות מוסדרת בעיקר ברמה של תרגום 10, ובכך הממחיש שהנהלת זמינות RNA המשמשת בעיקר מכוונני ביטוי חלבון.

לימוד המנה של חלבונים בעלי עניין (POI) לכן זה לא חשוב רק על ההבנה של הפונקציות אנדוגני של חלבון, אלא גם כדי החקירה של מחלות רבות בפיתוח שיטות ריפוי. לפיכך, בעשורים האחרונים ראו התקדמות מספר אסטרטגיות באמצעות התערבות RNA לתמרן מינון POI. למרות התערבות RNA נעשה שימוש נרחב כדי ללמוד לתפקד חלבון ואף מוחל בניסויים קליניים לטיפול במחלות סרטן או עינית וכן להמשיך טיפולים אנטי בחולים 11-13, קשיים עלולים להתעורר אשר עלול להפוך את האסטרטגיה בלתי אפשרי. לדוגמא, רצף הזרע, אשר מניע את המציאה על ידי הומולוגיה הוא comparaקצר ble, ומכאן קידום השפעות חוץ-היעד. מאז רצפים יעילים ביותר הם נדירים צריכים להימצא בין אלף אפשרויות (הנסקרת ב 14), זיהוי הרצף הנכון יכולים להיות זמן רב ויקר, אך תוצאות עדיין עשויות להיות מאכזבות.

אסטרטגיה חלופית היא למקד את נקודת העניין ישירות על ידי נוגדנים. כאן, אנו ממחישים את השימוש המרכבה נושאת חלבון (מתוצרת Active Motif) כדי להפחית זמינות חלבון הסלולר, ואת העסקתם של שחזורים תלת מימדי ללמוד תפקוד החלבון הבאים עקום למטה.

המוטיב הפעיל של מרכבה, עצם פפטיד 2.8 kDa, משמש פפטידים הסעות, חלבונים ונוגדנים פני ממברנות של תאי יונקים 15. מקורבי פפטיד עם אתרים מעניינים על ידי יצירת מתחמי macromolecular מצמידים הלא קוולנטית ניצול אינטראקציות הידרופוביות, שבעקבותיה מתחמי המרכבה-POI הן הפנימו לתוך התאים בתוך ind-אנדוזוםבאופן ependent. חשוב לציין, המרכבה צוינה כדי לא להשפיע על הלוקליזציה התאית של חלבונים דלגו, ולא להפעיל השפעות ציטוטוקסיות או להשפיע על הפעילות הביולוגית של מטענה 15.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. פתרונות מניות

  1. Resuspend אבקת המוטיב הפעיל lyophilized ב סטרילי H 2 O לריכוז סופי של 2 מיקרוגרם / μl. הקש בזהירות לערבוב.
  2. הכן aliquots קטן (למשל, 12 μl כל, 2 μl נדרשים לכל תגובה) ולאחסן אותם ב -20 ° C.

2. הכנת תאים

  1. בתאי יונקים זרע כגון HEK293 תאים או נוירונים העיקרי על צלחת 24 היטב 500 μl מדיום הגידול כולל אנטיביוטיקה.
    הערה: בעת שימוש נוירונים, זרע התאים בצפיפות נמוכה ולהשתמש רק בשתי השורות באמצע 24 את הצלחת היטב. כל טוב תצטרך ובכך גרסה מקבילה ריק נמל המדיום במהלך הדגירה (שלב 4.2). בעת טיפול נוירונים, תמיד לוודא כי התאים אינם נשמרים מחוץ בחממה במשך יותר מכמה דקות.
  2. תרבות התאים בתנאים מתאימים (humidified, 5% CO 2 ו -37 מעלות צלזיוס) עד התאים הם אפליקציה. 50%ומחוברות.
    הערה: בעת שימוש נוירונים, תרבות התאים עד לשלב ההתפתחותי הרצוי הוא הגיע ולשנות אפליקציה. 25-50% של המדיום פעמיים בשבוע. בינוני: בינוני Neurobasal (המכיל 1x B27, 5 מ"מ L- גלוטמין ו 1x פניצילין סטרפטומיצין, להשוות עם נ"צ 16).

3. גיבוש קומפלקס מרכבה

  1. לכל תגובה, לדלל 0.1-2 מיקרוגרם של POI או הנוגדן המקביל כמו גם חלבון בקרה, או נוגדן שליטה, בהתאמה, ב 50 μl של PBS.
    הערה: הטכניקה פועלת גם עם מתחמי macromolecular המורכב נוגדנים מראש הנכנס יסודי ותיכון (cp 'נציג תוצאות', איור 1.). מערבבים ספין.
  2. עבור כל דגימה, לדלל פתרון מניות 2 μl המרכבה ב 50 μl של PBS באמצעות צינורות נפרדים כדי למנוע אסוציאציה עצמית של המרכבה. מערבבים ספין.
  3. מעבירים את POI מדולל או נוגדן (שלב 3.1) כדי דילול המרכבה ידי pipetטינג. מערבבים ספין.
  4. דגירה את התערובת למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר (מתחמי המרכבה-POI יהוו).

4. Transfection של תאים

  1. לדלל את מתחמי המרכבה (שלב 3.4) ב 100 μl מחומם מראש מדיום הגידול (37 ° C, ללא תוספים). הסר בינוני לשטוף את התאים פעם באמצעות מחומם מראש 1x PBS.
    הערה: בעת שימוש נוירונים, לא כדאי לזרוק את המדיום, זה יהיה לעשות בה שימוש חוזר. שמור את זה על 37 מעלות צלזיוס. לרחצה, השתמש PBS המכיל 0.5 מ"מ MgCl 2 ו CaCl 2.
    הצעה: לשמור המדיום בבארות ריקות בעוד דוגרי הצלחת (שלב 4.5).
  2. החל הפתרון מורכב המרכבה (שלב 4.1) אל התאים לטלטל את התאים בעדינות כדי להבטיח חלוקה שווה של הפתרון. לגדל את התאים בתנאים סטנדרטיים (שלב 2.2) במשך שעה 1. להוסיף סרום לריכוז סופי של 10%. בעת שימוש נוירונים, להוסיף את המדיום בשלב 4.1. לגדל את התאים במשך 1 עד 2 שעות יותר.
    הערה:זמן דגירה אופטימלי תלוי בגודל ומאפיינים של המטען ועשוי צריך להיות מותאם באופן אמפירי. ההצעות הבאות עשויות לשמש כקו מנחה: לקבלת פפטידים, hr 1 הוא בדרך כלל מספיק עבור חלבונים 1-2 שעות מומלצות עבור נוגדנים 2 hr, ועבור transfection של נוירונים עם נוגדנים 4 שעות.
  3. תאי תהליך לניתוח כרגיל. שים לב: הטכניקה היא תואמת ניסויים תוך שימוש בפרוטוקולי קיבעון וכן הדמיה לחיות.

הדמיה 5.

  1. באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר, לקחת Z- ערימות של תאים ו / או תאים תאים של עניין באמצעות כ 0.25-0.5 מיקרומטר המרחק. מרחק השכבה המדויק תלוי בגודל של המבנה להיות משוחזרים ועליו להיקבע בנפרד.

6. שחזור

  1. בשלבים הבאים, השתמש התחתון Esc כדי לעבור בין בחירה וניווט, CNTR כדי לבחור מספר אובייקטים על ידי לחיצה on אותם משמרת מפתח לחתוך אובייקטים (CP. צעד 6.10).
  2. פתח את הקובץ-LSM ב Imaris.
  3. באמצעות התאמת תצוגה לכל ערוץ, בניגוד לתמונה עד המבנים המבריקים להגיע רוויה. יש לציין כי התאמה זו לא תשפיע על בניית השטח, היא משמשת רק כדי לסייע למנהל הניסוי thresholding התמונה.
  4. הקש על סמל הוספת משטחים חדשים. אשף יפתח.
  5. בחר: מגזר רק אזור של עניין. המשך לשלב הבא.
  6. להתאים את השוליים של תיבת הבחירה כדי להתאים מושא ההתעניינות שלך. נא לזכור שהתמונה יש 3 ממדים וכי הבחירה צריכה להיות מותאמת על מטוס z גם כן. אם הצורה המלבנית של תיבת הבחירה לא צריכה להתאים את מושא העניין כהלכה, כבה את האובייקט ו / או להגדיל את התיבה עד שכל המבנים הדרושים מוטבעים. אובייקטים לא רצויים ניתן להסיר בהמשך (CP. צעד 6.10). לְהִתְקַדֵם.
  7. בחר את ch המתאיםannel. רמת הפירוט של שטח פנים או קוטר כדור צריך להיות מוגדר כדי להתאים את המבנים משוחזרים. בהתאם למאפייני האות, או אינטנסיביות מוחלטת או ניגודיות מקומיות יכולה לשמש. באופן כללי, ניגודיות מקומי עובד טוב יותר עבור אותות מפוזרים. בכל מקרה, את ההגדרות צריכות להיות מותאמות בנפרד עבור כל אות או מבנה של עניין, בהתאמה.
  8. שימוש באפשרות קביעת ערכי הסף, לשחזר את המבנה של עניין.
  9. השלם את השחזור על ידי לחיצה על החלק התחתון החץ הירוק.
  10. התאם את האובייקט עוד יותר על ידי שימוש באפשרות העיפרון כדי לחתוך ולהסיר משטחים כנדרש. אפשר רק לחתוך בכיוון צפון-דרום, ולכן, הטו את התמונה על מנת לחתוך את האובייקט הרצוי.
  11. להשיג מדידות של נפח, שטח ועוצמות לכל משטח ידי סטטיסטיקות בחירה, סטטיסטיקות מפורטות, וערכים ממוצעים.
  12. (שלב אופציונלי) כדי להתבונן הסטטיסטיקה בצבעים (CP. 2E איור F), בחרו את כרטיסיית הצבע של פני השטח המקבילים ולסמן 'סטטיסטיקה מקודדת' במקום 'המאגר'. מספר אפשרויות יוצג.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

בפסקאות הבאות, תוצאות למופת ממחישות מציאה תפקודית של POI (Simiate, לפרטים נוספים ראו 16, 17) באמצעות ריאגנט מרכבת הפרעת נוגדן מוצג. הממצאים מלמדים כי ביטוי פחתה של Simiate פוגע פעילות תעתיק, ו, בצורת מינון תלויה, גורם לאפופטוזיס, שהגיע לשיאה בשיעורי תמותה של מעל 99% אם כמויות נוגדנים גבוהות (> 1 מיקרוגרם נוגדן) מוחלות (תגליות אלה פורסמו בעבר 16). הנה, עכשיו אנחנו מציגים את הטכניקות ופרוטוקולים מועסקים בפירוט יתר להדגים כיצד מרכבה מגיב יכולים לשמש כדי transfect נוירונים בהיפוקמפוס ניתקו בתרבויות עיקריות.

על מנת לבדוק האם פפטידים מרכבה לאפשר עבור דילוגים יעילים של נוגדנים, בפרט, אם נוגדנים אלה להישאר תפקודיים במהלך ההליך, הבענו FLAG-Simiate למשך 24 שעות בתאים HEK293, ובהמשך transfected התאים ניצול המרכבה מצמידים מקרומולקולות rbαSimiate-gtαrbAlexa568 (איור 1). בונת FLAG-Simiate מתבטאת היטב על ידי HEK293 תאים localizes אל somata וכן הגרעינים של תאים אלה (איור 1 א). הנה, FLAG-Simiate אשכול משמעותי (איור 1B), ובכך שיקוף החלוקה המנומרת של אנדוגני Simiate בגרעין.

מתחמי הנוגדן דלגו על פני הממברנה התאית מופיעים מכלולים (איור 1 א, ב חצים אדומים, אדום), אבל הנוגדנים שוחררו לזהות FLAG-Simiate במיוחד כפי שמוצג על ידי colocalization עמוק של FLAG-Simiate ואת מקרומולקולות rbαSimiate-gtαrbAlexa568 (איור 1B , ב חץ צהוב, צהוב). נכון פתק, הניסוי לא רק מוכיח כי הנוגדנים להישאר תפקודיים במהלך מרכבה בתיווךמעבר קרום, אבל הם גם יכולים להיכנס לגרעין. מאז גודלם אינו כולל נוגדנים מן היציאה את הגרעין באמצעות דיפוזיה, סביר להניח כי אות הלוקליזציה הגרעינית נוכח המרכבה כשלעצמה מאפשרת את טרנסלוקציה של מקרומולקולות rbαSimiate-gtαrbAlexa568 לתוך הגרעין. ואכן, מכלולי נוגדנים הם נצפו גם באותם מקומות או, בהתאמה, את התא הגרעיני (איור 1 ב ', חיצים אדומים).

שימוש rbαSimiate-מרכבת קומפלקסים כדי לרוקן Simiate אנדוגני תפקודי בתאי HEK293 (איור 2), מצאנו כי הצלחנו למקד עד 80% מהאתרים מחייבים rbαSimiate, באמצעות 2.0 מיקרוגרם של נוגדנים 16. מעניין לציין כי בעוד shuttling נוגדנים gtαrbAlexa568 לבד לתוך HEK 293 תאים לא הייתה השפעה ברורה על הופעת כתמים גרעיני (איור 2 א-ג), אובדן Simiate פונקציונלי radiused כתמים גרעיני (איור 2 ד-F </ strong>, cp. 16) כפי שמודגם על ידי שחזורים תלת מימדי (תרשים 2B, C לעומת E, F), באופן תלוי מינון, אפופטוזיס (איור 3, cp. 16).

בהתחשב בכך תאים עצביים רגישים מאוד להשפעות רעילות, יש לנו גם ליישם את הטכניקה בתרבויות בהיפוקמפוס עיקרית (איור 4). שימוש assay TUNEL ו MAP2 מכתימים לנתח תא שלמות, לא מצאנו השפעה על הכדאיות של נוירונים כאשר משווים תאים מדומים או מטופל מרכבת מטופלים (אפליקציה. תאים חיוביים TUNEL 20-25% לאחר 1 + 4 שעות של הטיפול, cp. 4.4 -4.6). לפיכך, בדקנו נוגדן מרכבה בתיווך shuttling בתרבויות עצביות. בעקבות תכנית היישום אותו, מכלולי נוגדן gtαgpAlexa568 נראו שונים משתרעת על 83% מכלל התאים, שם הם התרחשו somata וכן גרעינים (איור 5 א). תצפיות אלה נתמכות עוד ביה ניתוח תלת ממדי (איור 5) והדוק להרכיב מחדש את התמונה הנראית בתאי HEK293, יחד ובכך הממחישות כי טכניקת המרכבה יכולה לשמש בהצלחה transfect ניתקה נוירונים בהיפוקמפוס עיקריים גם כן.

איור 1
איור 1. FLAG-Simiate הוא זוהה על ידי נוגדנים ספציפיים Simiate דלגו לתוך HEK293 תאים באמצעות ריאגנט מרכבה. בניסויי התערבות נוגדנים, נוגדני rbSimiate-gtrbAlexa568 היו preassembled לפני ההיווצרות מורכבת מרכבה-נוגדן. א) HEK293 תאים המבטאים מתויג FLAG Simiate. מכלולי נוגדן Simiate להיכנס סומה וכן הגרעין הבא יישום, שם הם colocalize במיוחד עם FLAG-Simiate. נקודות עגולות: מכלולי המרכבה-rbSimiate-gtrbAlexa568 (חצים אדומים). ב) גדלת מתח גבוהה של האזור התאגרףב (א) הממחיש את colocalization של FLAG-Simiate ו מרכבה בתיווך אות Simiate (חיצים צהובים). שימו לב לנוכחות של מכלול נוגדן המרכבה בגרעין (חץ אדום). סרגל קנה מידה: 10 מיקרומטר.

איור 2
איור 2. Simiate ספציפי נוגדנים דילג לתאים HEK293 להפריע תפקודים תאיים של אנדוגני Simiate. A, B) HEK293 תאים שטופלו המרכבה-gtrbAlexa568 (1 מיקרוגרם) לשמש מלאה. באדום, אנדוגני Simiate יוצג בצבע שווא, תוך מכלולי המרכבה-gtrbAlexa568 אינם מוצגים. כתמים גרעיני תויגו באמצעות SC35 חלבון סמן (בירוק), ואילו תאים אפופטוטיים זוהו על ידי assay TUNEL (בכחול). B) שחזור של כתמים גרעיניים מהאזור התאגרף C א) שחזור של אותו אזור ממחישות כרכי רבב ועל פני שטחיםבאופן צבע מקודד. D, E) HEK293 תאים בעקבות טיפול המרכבה-rbSimiate (0.5 מיקרוגרם). מכלולים אנדוגני Simiate וכן המרכבה-rbSimiate-gtrbAlexa568 מוצגים באדום, בעוד כתמים גרעיני תאים אפופטוטיים מוצגים על פי A ו- B. E) כתמים גרעיני משוחזר מאזור התאגרף ד F) האזור אותו מוצג אנא המתאימות ל- C. לציין את מראה radiused וצבירה של כתמים (כל השחזורים: תוכנת Imaris). בר סולם ב C, F: 2 מיקרומטר. כל ברים אחרים בקנה המידה: 10 מיקרומטר. 1) לשיקום תלת ממדים, תאים שאינם אפופטוטיים רק שמשו.

איור 3
איור 3. מינון גבוה של המרכבה-rbSimiate-gtrbAlexa568 לגרום מוות של תאים מסיביים. HEK293 תאים טופלו עם 2 מיקרוגרם של המרכבה-gtrbAlexa568 או מרכבה-rbSimiate-gtrbAlexa568, בהתאמה (הן comp lexes לראות בירוק מסומן בחצים כמו גם בהגדלה). תיוג TUNEL (בכחול) יושם כדי לזהות תאים אפופטוטיים. סרגל קנה מידה: 10 מיקרומטר.

איור 4
מרכבת איור 4. אינה רעילה נוירונים בהיפוקמפוס עיקריים. א.ב.) DIV 7 נוירונים היו או מטופלים ודגמים (בינוניים, א) או נתון הגיב מרכבה (B) כפי שמתוארים בפרוטוקול עבור נוגדן shuttling (1 + 4 שעות, cp. 4.4-4.6). בעוד SC-35, חלבון סמן כתם גרעיני, שמש לתייג את מכונות שעתוק שחבור, מכתים TUNEL יושם כדי לזהות תאים אפופטוטיים (חצים ירוקים). C) מטופל המרכבה מטופלים DIV 16/17 נוירונים. מכתים MAP2 יושם כדי להמחיש את העצים הדנדריטים. ברי סולם: 10 מיקרומטר.

pload / 53,049 / 53049fig5highres.jpg "width =" 700 "/>
איור 5. transfection בתיווך המרכבה תואם תרבויות העצבית. א) תא עצב בהיפוקמפוס העיקרי נציג div 5. התמונה מראה z-תחזיות של ערימות נלקח באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר (מיקרוסקופ סורק לייזר 710, Zeiss). סרגל קנה מידה: 10 מיקרומטר. שים לב קר מתחמי המרכבה-gtgpAlexa568 (אדום) בגרעין סומה של התא. B) שחזור תלת ממדי (תוכנת Imaris) של הגרעין וכן מכלולי gtgpAlexa568 שמוצג א סומה דנדריטים של הנוירון מסומנת על ידי נקודות אפורות, אשר מזוקקות מן התיוג של אנדוגני Simiate. סרגל קנה מידה: 10 מיקרומטר. כמות נוגדן transfected: 0.25 מיקרוגרם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כאן, אנו מציגים פרוטוקול ללמוד את המשמעות של רמות ביטוי חלבון בשליטת תפקודים תאיים באופן מונע מינון. הפרוטוקול המתואר מאפשר מניפולציה מכוילת של ביטוי חלבון סוגי תאים יונקים שונים, כוללים נוירונים בהיפוקמפוס, ומכאן להקל מחקרים מפורטים של תפקוד חלבון ברמה התאית.

למרות התערבות RNA מייצגת אסטרטגיה ידועה למטה להסדיר אתרים מעניינים, יש בה החסרונות שלה (CP. 14). לא רק זיהוי של רצף מסוים מאוד ויעיל יכול להיות יקר זמן רב, אלא גם biogenesis תמליל בתוך התא עלול לגרום לתוצאות לא צפויות מאז ההצטברות של מבני RNA רעילים, עומס יתר של מכונות יצוא הגרעיניות כמו גם רווי של מערכות עיבוד אנדוגני RNAi עלולות לגרום השפעות חוץ-יעד או יעיל. כמו כן, כמויות גדולות של וקטורי RNAi אקסוגניים עלולות לגרום unsתופעות pecific, וגם להפריע הומאוסטזיס תא.

נוגדנים, מצד השני, לא דורשים עיבוד נוסף ע"י מנגנונים אנדוגניים ברגע שהם נכנסו לתא, ייכנסו לתוקף באופן מיידי, ובכך לתמוך לא רק ניסויים חוסכים זמן, אבל גם חקירות של תהליכים תאיים מיידיים. למרות שהם עשויים להיות השפעות מחוץ יעד נוקבים, גם המספר הגדל והולך של מאופיין היטב מאוד ספציפי נוגדנים הזמינים עושה חלופה זו שווה מחשבה. מאז הלידה של מתחמי macromolecular לתאים מייצג מכשול מרכזי, טכניקות transfection שונים פותחו במהלך השנים האחרונות, כולל פפטידים R8 ו azoR8 18 וכן הדילוגים בתיווך microsphere 19. בעוד R8 ו azoR8 צוינו להתנהג בדומה המרכבה 18, נמצאו microspheres לדרוש 24 שעות לספיגה 19, שהינה ארוכה בהרבה מ המרכבה בתיווךקטעי טאי טענו עלולים לגרום לקשיים כאשר לומדים תגובות הסלולר תלויות מהר מנה.

למרבה הפלא, טכניקת המרכבה התבררה לחול על תרבויות בהיפוקמפוס עיקריות, אשר רגישות מאוד טיפולים קשים transfect. עד כה, ספקי מרכבה שמשו לנתח תפקוד חלבון בתרבויות אוסטאובלסטים עיקריות 20 וכן שורת תאי נוירובלסטומה-גליומה NG108-15 21, שורש הגבה חומוס תרבויות גרעיני 21, או בתאי PC12 22, אשר מקורם העצבי ציצה, אך לא דווח על כל יישום בתרביות תאים שמקורם במערכת העצבים המרכזי זמינה עדיין. מאז ריאגנטים transfection מסורתיים כגון Lipofectamine אינם יעילים בתאים אלה ויראלי transfections מסובך, מרכבה עשויה לייצג חלופה מעניינת.

יש לציין, המרכבה עצמה נצפתה למקם לגרעין 15, כנראהבשל PKKKRKV אות לוקליזציה הגרעין שלה (CP. 23). עולים בקנה אחד עם התצפיות הללו, מצאנו כי transfection בתיווך המרכבה של מקרומולקולות rbαSimiate-gtαrbAlexa568 הביא תיוג ברור של תאים גרעיניים כגון כתמים גרעיניים. ואכן, נוגדנים בקרה כגון gtαgpAlexa568 אותרו גם בגרעין של שניהם, HEK293 ותאי בהיפוקמפוס העיקרי. מאז נוגדנים, בפרט מכלולים, הם הרבה יותר מדי גדולים כדי לצאת הגרעין ידי דיפוזיה ומאז Simiate עצמו אינו מכיל אות לוקליזציה גרעינית ידועה, אלא נכנס הגרעין באמצעות דיפוזיה, סביר להניח כי אות המרכבה מעורבת לוקליזציה גרעינית של נוגדנים. לחלופין, תחבורת מכלולי חלבון גדולים יכולה להיות גם אפשרית, אם כי זה לא יסביר את נוכחותו של gtαgpAlexa568 בגרעין של נוירונים בהיפוקמפוס התרבותיים של חולדות, שכן אין יעד נוגדן זה בתאים אלה. יתר על כן, סיNCE המרכבה נמצאה לא להפריע לוקליזציה הטבעית של פפטידים וחלבונים דלגו 15, תצפיות אלה מראים כי נוגדנים מתנהגים באופן שונה.

ואכן, כאשר shuttling מתחמי נוגדנים כגון המרכבה-rbαSimiate-gtαrbAlexa568 (איור 1) או המרכבה-gtαgpAlexa568 (איור 5) על פני קרום התא, הם מופיעים באשכולות, אשר רק לפזר, כאשר חלבונים היעד המתאים כגון Simiate אנדוגני או FLAG-Simiate נוכחים (רק באיור 1). באמצעות מרכבת מתחמי נוגדן אוסטאובלסטים, סלים ומכללות ציינו את אותו האפקט 20. בהתחשב בכך המרכבה הודגמה שלא להפריע הלוקליזציה של פפטידים וחלבונים 15, תצפיות אלו מצביעות על כך המרכבה התאספה נוגדנים לפרק רק אם קיים מנגנון מולקולרי כגון אינטראקצית נוגדן-יעד, אשר מתגבר על היתר הידרופוביפעולות בין מרכבת מטען הנוגדן שלה, ולכן מעודד פירוק. בגלל נוגדנים כבדים יותר פפטידים או ביותר חלבונים אחרים ויש להם, בשל צורתם, משטח גדול, הם עשויים לשייך עם מספרים גבוהים יותר של מולקולות מרכבה / או אינטראקציה יותר קשוח עם פפטידים מרכבה, אשר ובכך יקדמו יותר מרכבה מונחה התנהגות של נוגדנים. חוסר מנגנון פירוק ולכן יביא מראה אשכולות וכן לוקליזציה גרעינית של מטען הנוגדנים (איור 5).

יחדיו, הנתונים מראים כי המרכבה מתאימה במיוחד גם כדי לענות על תפקודם של חלבונים המתגוררים בגרעין שזה ישים במגוון סוגי תאים היונקים כולל נוירונים בהיפוקמפוס עיקריים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

העבודה הציגה נתמכה בחלקים על ידי מימון מן המכון הקנדי לבריאות מחקר / X השביר הקרן למחקר של תוכנית שותפות קנדה ל- RD, את ג'רום לז קרן ל- RD, צנטרום Interdisziplinäres für klinische Forschung מאוניברסיטת ארלנגן-נירנברג RD ו מן דויטשה Forschungsgemeinschaft כדי RD ו RE. המחברים מבקשים להודות אינגריד Zenger לקבלת סיוע טכני עם תחזוקה תרבית תאים כמו גם פרופ 'מ ווגנר להכנת וקטור pCMV5-FLAG זמין. המחברים עוד רוצים במיוחד להודות נדיה שרדר על התמיכה המועילה ירי הווידאו.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chariot Active Motif 30025 store at -20 °C
Neurobasal medium Life technologies 21103-049 warm up to 37 °C before using
1x B27 Life technologies 17504044 store at -20 °C
L-glutamine Life technologies 25030-149 store at -20 °C
Penicillin and Streptomycin Life technologies 15140-122 store at -20 °C
Imaris software Bitplane n.a. expensive, but unmatched
Laser Scanning Microscope Zeiss n.a.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Santoro, M. R., Bray, S. M., Warren, S. T. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. Abbas, A. K., Galli, S. J., Howley, P. M. 7, Annual Review. 219-245 (2012).
  2. Jiang, T. F., Chen, S. D. Dysfunction of two lysosome degradation pathways of alpha-synuclein in Parkinson's disease: potential therapeutic targets? Neurosci Bull. 28, 649-657 (2012).
  3. Howlett, D. R., Richardson, J. C. The pathology of APP transgenic mice: a model of Alzheimer's disease or simply overexpression of APP? Histol Histopathol. 24, 83-100 (2009).
  4. Carlson, G. A., et al. Genetic Modification of the Phenotypes Produced by Amyloid Precursor Protein Overexpression in Transgenic Mice. Human molecular genetics. 6, 1951-1959 (1997).
  5. Jiao, X. F., Wang, Z., Kiledjian, M. Identification of an mRNA-secapping regulator implicated in X-linked mental retardation. Mol. Cell. 24, 713-722 (2006).
  6. Fukami, M., et al. A member of a gene family on Xp22.3, VCX-A, is deleted in patients with X-linked nonspecific mental retardation. Am. J. Med. Genet. 67, 563-573 (2000).
  7. Van Esch, H., et al. Deletion of VCX-A due to NAHR plays a major role in the occurrence of mental retardation in patients with X-linked ichthyosis. Human molecular genetics. 14, 1795-1803 (2005).
  8. Sebat, J., et al. Strong association of de novo copy number mutations with autism. Science. 316, 445-449 (2007).
  9. Tartaglia, G. G., Pechmann, S., Dobson, C. M., Vendruscolo, M. Life on the edge: a link between gene expression levels and aggregation rates of human proteins. Trends Biochem Sci. 32, 204-206 (2007).
  10. Schwanhausser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473, 337-342 (2011).
  11. Uchino, K., Ochiya, T., Takeshita, F. RNAi therapeutics and applications of microRNAs in cancer treatment. Jpn J Clin Oncol. 43, 596-607 (2013).
  12. Li, T., Wu, M., Zhu, Y. Y., Chen, J., Chen, L. Development of RNA interference-based therapeutics and application of multi-target small interfering RNAs. Nucleic Acid Ther. 24, 302-312 (2014).
  13. DeVincenzo, J. P. The promise, pitfalls and progress of RNA-interference-based antiviral therapy for respiratory viruses. Antivir Ther. 17, 213-225 (2012).
  14. Fellmann, C., Lowe, S. W. Stable RNA interference rules for silencing. Nat Cell Biol. 16, 10-18 (2014).
  15. Morris, M. C., Depollier, J., Mery, J., Heitz, F., Divita, G. A peptide carrier for the delivery of biologically active proteins into mammalian cells. Nat Biotechnol. 19, 1173-1176 (2001).
  16. Derlig, K., Gießl, A., Brandstätter, J. H., Enz, R., Dahlhaus, R. Identification and Characterisation of Simiate, a Novel Protein Linked to the Fragile X Syndrome. PLoS One. 8, e83007 (2013).
  17. Derlig, K., et al. Simiate is an Actin binding protein involved in filopodia dynamics and arborisation of neurons. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, (2014).
  18. Loudet, A., et al. Non-covalent delivery of proteins into mammalian cells. Org Biomol Chem. 6, 4516-4522 (2008).
  19. Nagel, D., et al. Polymeric microspheres as protein transduction reagents. Mol Cell Proteomics. 13, 1543-1551 (2014).
  20. Selim, A. A., et al. Anti-osteoactivin antibody inhibits osteoblast differentiation and function in vitro. Crit Rev Eukaryot Gene Expr. 13, 265-275 (2003).
  21. Jain, A., Brady-Kalnay, S. M., Bellamkonda, R. V. Modulation of Rho GTPase activity alleviates chondroitin sulfate proteoglycan-dependent inhibition of neurite extension. J Neurosci Res. 77, 299-307 (2004).
  22. Watanabe, S., Wakasugi, K. Neuroprotective function of human neuroglobin is correlated with its guanine nucleotide dissociation inhibitor activity. Biochem Biophys Res Commun. 369, 695-700 (2008).
  23. Eguchi, A., et al. Optimization of nuclear localization signal for nuclear transport of DNA-encapsulating particles. J Control Release. 104, 507-519 (2005).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics