प्रोटीन समारोह का अध्ययन और एंटीबॉडी हस्तक्षेप और तीन आयामी पुनर्निर्माण द्वारा बदल प्रोटीन अभिव्यक्ति की भूमिका

1Institute for Biochemistry, Emil-Fischer Centre, University of Erlangen-Nuremberg, 2Department of Biology, Animal Physiology, University of Erlangen-Nuremberg
Published 4/21/2016
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Bioengineering

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Derlig, K., Gießl, A., Brandstätter, J. H., Enz, R., Dahlhaus, R. Studying Protein Function and the Role of Altered Protein Expression by Antibody Interference and Three-dimensional Reconstructions. J. Vis. Exp. (110), e53049, doi:10.3791/53049 (2016).

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Abstract

प्रोटीन अभिव्यक्ति की एक सख्त प्रबंधन जिंदा हर जीव के लिए न केवल आवश्यक है, लेकिन यह भी एक महत्वपूर्ण रणनीति सेलुलर मॉडल में प्रोटीन कार्यों की जांच करने के लिए है। इसलिए, हाल के शोध स्तनधारी सेल लाइनों या यहां तक ​​कि पशु मॉडल, शाही सेना और एंटीबॉडी हस्तक्षेप सहित प्रोटीन अभिव्यक्ति लक्ष्य विभिन्न उपकरणों का आविष्कार किया। पहली रणनीति पिछले दो दशकों के दौरान ज्यादा ध्यान इकट्ठा किया है, वहीं सेलुलर झिल्ली के पार और कोशिकाओं में एंटीबॉडी cargos के एक translocation मध्यस्थता पेप्टाइड्स, बहुत कम ब्याज प्राप्त की। इस प्रकाशन में, हम एक विस्तृत प्रोटोकॉल कैसे एंटीबॉडी हस्तक्षेप प्रयोगों प्रदर्शन करने के लिए एक पेप्टाइड वाहक मानव भ्रूण गुर्दे की कोशिकाओं में और साथ ही प्राथमिक hippocampal न्यूरॉन्स में रथ नामित उपयोग करने के लिए और आगे प्रोटीन समारोह का विश्लेषण करने में तीन आयामी पुनर्निर्माण के आवेदन को वर्णन प्रदान करते हैं। हमारे निष्कर्ष बताते हैं कि रथ शायद अपने परमाणु स्थानीयकरण संकेत, particula के कारण हैरेलवे सोमा और नाभिक में रहने वाले प्रोटीन को निशाना बनाने अच्छी तरह से अनुकूल। उल्लेखनीय है, जब प्राथमिक हिप्पोकैम्पस संस्कृतियों के रथ को लागू करने, अभिकर्मक निकला आश्चर्यजनक रूप से अच्छी तरह से अलग न्यूरॉन्स द्वारा स्वीकार किया जाना है।

Introduction

प्रोटीन अभिव्यक्ति की एक तंग नियंत्रण रहने वाले हर जीव अपने स्वयं के विकास को आदेश करने के लिए और साथ ही पर्यावरण के संकेतों पर प्रतिक्रिया करने के लिए आवश्यक है। इसलिए, तंत्र की एक भीड़ के विकास के दौरान आविष्कार किया गया है ठीक प्रत्येक प्रोटीन एप्लिकेशन द्वारा इनकोडिंग की अभिव्यक्ति के स्तर को विनियमित करने के लिए। 20,000 जीन अपने जीवन के किसी भी समय में किसी भी यूकेरियोटिक सेल में मौजूदा। प्रोटीन के उत्पादन के विभिन्न चरणों में जगह ले रहा है, विनियामक तंत्र क्रोमेटिन संरचना, प्रतिलेखन और शाही सेना के प्रबंधन posttranslational प्रोटीन संशोधनों, परिवहन और गिरावट की दिशा को संभालने से लेकर।

इसलिए यह आश्चर्य की बात है कि अंतर्निहित आणविक मशीनरी और बदल प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर में खराबी इस तरह के कैंसर या बौद्धिक विकलांग के रूप में विविध रोगों के साथ संबद्ध किया गया है नहीं है। दरअसल, न्यूरोनल विकास और स्तनधारी मस्तिष्क समारोह के बकाया जटिलता को देख, Sensiप्रोटीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन करने के लिए इन अत्याधुनिक प्रणालियों के tivity अल्जाइमर और पार्किंसंस रोग (ई और पीडी) के साथ ही आत्मकेंद्रित स्पेक्ट्रम विकार (एएसडी) नाजुक एक्स सिंड्रोम (FXS) जैसे सहित कई जाने-माने बौद्धिक घाटे में ही प्रकट होता है। उत्तरार्द्ध रोग प्रोटीन की एक किस्म है, जो एक ही बात को विनियमित प्रोटीन, FMRP (नाजुक एक्स मानसिक मंदता प्रोटीन) 1-4 की कमी के कारण है की एक व्यापक misexpression की विशेषता है। इसके अलावा, गुणसूत्र चर प्रभारी को प्रभावित करने rearrangements जुड़े x एक प्रोटीन (VCXA), एक प्रोटीन, कि mRNA स्थिरता और कैपिंग 5 mRNA संशोधित करके अनुवाद का प्रबंधन करता है, हाल ही में, बौद्धिक घाटे के साथ संबद्ध किया गया है, जबकि बिंदु उत्परिवर्तन संज्ञानात्मक विकलांग के साथ रोगियों में पहचान नहीं कर रहे थे अब के रूप में 6, 7, सुझाव है कि मनाया मानसिक विकृतियों बदल VCXA अभिव्यक्ति है और अपने लक्ष्य prote की dysregulated अभिव्यक्ति से ही शुरूइन। इन निष्कर्षों की जांच नए सिरे से जीन एएसडी के साथ जुड़े रहे हैं की प्रतिलिपि संख्या रूपों की स्थापना की है कि क्या उस उपन्यास जीन दोहराव और विलोपन एएसडी 8 के लिए एक महत्वपूर्ण जोखिम कारक हैं, इस प्रकार विचार ऊंचा या कम प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर के कारण हो सकता है कि समर्थन के लिए एक अध्ययन के साथ लाइन में बौद्धिक घाटे।

उल्लेखनीय है, हाल के शोध से आगे सबूत है कि एक दिया प्रोटीन की अभिव्यक्ति के स्तर ठीक लगभग कोई सुरक्षा मार्जिन 9 के साथ उच्च प्रोटीन की मात्रा का एक परिणाम के रूप में अपनी एकत्रीकरण को रोकने के लिए निकाला जाता है प्रदान की है। इसलिए यह प्रस्ताव किया गया है कि यहां तक कि छोटे वेतन वृद्धि इस तरह के विज्ञापन और पीडी 9 जैसे रोगों को उत्पन्न करने के लिए पर्याप्त हैं। हालांकि प्रोटीन अभिव्यक्ति पर नियंत्रण के लिए योगदान आणविक मशीनरी के विभिन्न प्रकार के इन निष्कर्षों के आलोक में एक जटिल विनियमन योजना का सुझाव है, 5,000 से अधिक स्तनधारी जीनों की अभिव्यक्ति के 10 के स्तर की जांच के लिए एक अध्ययन प्रदर्शन किया है किप्रकृति को प्राथमिकता एक अधिक किफ़ायती योजना: प्रोटीन के सेलुलर बहुतायत मुख्य रूप से अनुवाद 10 के स्तर पर नियंत्रित किया जा सकता है, इस प्रकार की व्याख्या की गयी है कि शाही सेना उपलब्धता के प्रबंधन के मुख्य रूप से ठीक धुन प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए कार्य करता दिखाया गया था।

ब्याज की प्रोटीन की खुराक का अध्ययन (POI) इसलिए केवल एक प्रोटीन की अंतर्जात कार्यों की समझ के लिए महत्वपूर्ण नहीं है, बल्कि कई बीमारियों की जांच और उपचार के विकास के लिए है। इस प्रकार, पिछले दशकों कई रणनीतियों शाही सेना के हस्तक्षेप का उपयोग कर POI खुराक में हेरफेर करने के अग्रिम देखा है। शाही सेना के हस्तक्षेप को व्यापक रूप से प्रोटीन समारोह का अध्ययन करने के लिए प्रयोग किया जाता है और यहां तक कि कैंसर या नेत्र रोगों का इलाज करने के साथ ही रोगियों 11-13 में एंटीवायरल उपचारों का पीछा करने के लिए नैदानिक ​​परीक्षण में लागू किया जा रहा है हालांकि, कुछ मुश्किलें पैदा हो सकती है रणनीति असंभव प्रस्तुत करना हो सकता है। उदाहरण के लिए, बीज दृश्य है, जो अनुरूपता द्वारा पछाड़ना ड्राइव compara हैble कम है, इसलिए बढ़ावा देने के बंद लक्ष्य प्रभाव। चूंकि अत्यधिक कुशल दृश्यों दुर्लभ हैं और सही अनुक्रम की पहचान करने के लिए समय लेने वाली और महंगा हो सकता है विकल्प के हजारों (14 में समीक्षा) के बीच पाया जा करने की जरूरत है, लेकिन परिणाम अभी भी निराशाजनक हो सकता है।

एक वैकल्पिक रणनीति सीधे एंटीबॉडी द्वारा POI लक्ष्य है। यहाँ, हम प्रोटीन वाहक रथ (सक्रिय आकृति द्वारा निर्मित) के उपयोग का वर्णन सेलुलर प्रोटीन की उपलब्धता को कम करने, और तीन आयामी पुनर्निर्माण के रोजगार प्रोटीन समारोह तोड़े नीचे निम्नलिखित अध्ययन करने के लिए।

रथ, अपने आप में एक 2.8 केडीए पेप्टाइड के सक्रिय आकृति, स्तनधारी कोशिकाओं 15 की झिल्ली भर में शटल पेप्टाइड्स, प्रोटीन और एंटीबॉडी के लिए प्रयोग किया जाता है। गैर covalently मिलकर macromolecular हाइड्रोफोबिक बातचीत, रथ-POI परिसरों जिस उपयोग परिसरों के गठन से POIs के साथ पेप्टाइड एसोसिएट्स एक अतः इसके लिए इंडस्ट्रीज़ में कोशिकाओं में भली भाँति रहे हैंependent तरीके से। महत्वपूर्ण बात है, रथ न shuttled प्रोटीन के intracellular स्थानीयकरण प्रभावित करता है, और न ही साइटोटोक्सिक प्रभाव डालती करने के लिए या अपनी कार्गो 15 की जैविक गतिविधि को प्रभावित करने के लिए संकेत दिया गया था।

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Protocol

1. स्टॉक समाधान

  1. 2 माइक्रोग्राम / μl के अंतिम एकाग्रता के लिए बाँझ एच में lyophilized सक्रिय मूल भाव पाउडर 2 हे Resuspend। मिश्रण के लिए ध्यान से टैप करें।
  2. छोटे aliquots (जैसे, 12 μl प्रत्येक, 2 μl प्रतिक्रिया प्रति आवश्यक हैं) तैयार है और उन्हें -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।

2. कोशिकाओं की तैयारी

  1. ऐसे HEK293 कोशिकाओं या एंटीबायोटिक दवाओं सहित एक 500 μl में 24 अच्छी तरह से थाली मध्यम विकास पर प्राथमिक न्यूरॉन्स के रूप में बीज स्तनधारी कोशिकाओं।
    नोट: न्यूरॉन्स का उपयोग करते हैं, कम घनत्व पर कोशिकाओं बीज के लिए और 24 अच्छी तरह से थाली में से सिर्फ दो मध्य पंक्तियों का उपयोग करें। हर अच्छी तरह से इस प्रकार ऊष्मायन (4.2 कदम) के दौरान मध्यम बंदरगाह के लिए एक खाली समकक्ष होगा। जब न्यूरॉन्स हैंडलिंग, हमेशा यकीन है कि कोशिकाओं के कुछ मिनट से अधिक के लिए इनक्यूबेटर बाहर रखा नहीं कर रहे हैं।
  2. संस्कृति उपयुक्त परिस्थितियों में कोशिकाओं (, humidified 5% सीओ 2 और 37 डिग्री सेल्सियस) तक कोशिकाओं app कर रहे हैं। 50%मिला हुआ।
    ध्यान दें: न्यूरॉन्स का उपयोग करते हैं, संस्कृति वांछित विकास मंच तक कोशिकाओं पर पहुंच गया और एप्लिकेशन को बदल रहा है। दो बार माध्यम के 25-50% एक सप्ताह। मध्यम: Neurobasal मध्यम (1x B27, 5 मिमी एल glutamine और 1x पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन युक्त; रेफरी 16 के साथ तुलना)।

3. रथ जटिल गठन

  1. प्रति प्रतिक्रिया है, POI या इसी एंटीबॉडी के साथ ही नियंत्रण प्रोटीन, या नियंत्रण एंटीबॉडी क्रमश: 0.1-2 माइक्रोग्राम पतला, पीबीएस के 50 μl में।
    नोट: तकनीक को भी macromolecular परिसर पूर्व बाध्य प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी (। सी.पी. 'प्रतिनिधि परिणाम', चित्रा 1) से मिलकर साथ काम करता है। मिक्स और स्पिन।
  2. प्रत्येक नमूना के लिए, क्रम में रथ की स्वयं संघ से बचने के लिए अलग ट्यूब का उपयोग पीबीएस के 50 μl में 2 μl रथ शेयर समाधान पतला। मिक्स और स्पिन।
  3. pipet द्वारा रथ कमजोर पड़ने को पतला POI या एंटीबॉडी (3.1 कदम) स्थानांतरणटिंग। मिक्स और स्पिन।
  4. कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए मिश्रण को सेते (रथ-POI परिसरों बनेगी)।

4. कोशिकाओं के अभिकर्मक

  1. रथ परिसरों 100 μl पूर्व गर्म मध्यम विकास (37 डिग्री सेल्सियस, कोई योजक) में (3.4 कदम) पतला। मध्यम निकालें और कोशिकाओं एक बार पूर्व गर्म 1x पीबीएस का उपयोग कर धो लें।
    ध्यान दें: न्यूरॉन्स का उपयोग करते हैं, मध्यम त्यागने नहीं है, यह पुन: उपयोग किया जायेगा। यह 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें। कपड़े धोने के लिए, पीबीएस युक्त 0.5 मिमी 2 MgCl और 2 CaCl का उपयोग करें।
    सुझाव: खाली कुओं में मध्यम रखने, जबकि प्लेट (4.5 कदम) incubating।
  2. कोशिकाओं को रथ जटिल समाधान (4.1 कदम) को लागू करें और धीरे कोशिकाओं रॉक समाधान का एक भी वितरण सुनिश्चित करने के लिए। 1 घंटे के लिए मानक स्थितियों (2.2 कदम) के तहत कोशिकाओं को विकसित। 10% की एक अंतिम एकाग्रता के लिए सीरम जोड़ें। न्यूरॉन्स का उपयोग करते हैं, 4.1 कदम से मध्यम जोड़ें। 1 से 2 घंटे के लिए कोशिकाओं को विकसित।
    ध्यान देंइष्टतम ऊष्मायन समय आकार और माल के गुणों पर निर्भर करता है और अनुभव से समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है। निम्नलिखित सुझाव एक दिशानिर्देश के रूप में सेवा कर सकते हैं: पेप्टाइड्स के लिए, 1 घंटा प्रोटीन के लिए 1-2 घंटा सिफारिश कर रहे हैं, एंटीबॉडी के लिए 2 घंटा, और एंटीबॉडी के साथ न्यूरॉन्स के अभिकर्मक 4 घंटे के लिए आमतौर पर पर्याप्त है।
  3. सामान्य रूप से विश्लेषण के लिए प्रक्रिया कोशिकाओं। कृपया ध्यान दें: तकनीक निर्धारण प्रोटोकॉल के साथ ही रहते इमेजिंग का उपयोग कर प्रयोगों के साथ संगत है।

5. इमेजिंग

  1. एक लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप का उपयोग करना, लगभग 0.25-0.5 माइक्रोन दूरी का उपयोग कोशिकाओं और / या ब्याज की सेल के डिब्बों के Z ढेर ले। सटीक परत दूरी संरचना खंगाला जा के आकार पर निर्भर करता है और व्यक्तिगत रूप से निर्धारित किया जाना चाहिए।

6. पुनर्निर्माण

  1. निम्न चरणों में, का चयन करें और नेविगेट, Cntr के बीच स्विच करने के लिए ESC नीचे का उपयोग क्लिक करके कई वस्तुओं का चयन करने के लिए ओn उन्हें और शिफ्ट कुंजी वस्तुओं (सीपी। कदम 6.10) में कटौती करने के लिए।
  2. Imaris में एल एस एम-फ़ाइल खोलें।
  3. प्रत्येक चैनल के लिए प्रदर्शन समायोजन का उपयोग कर, तस्वीर विपरीत जब तक प्रतिभाशाली संरचनाओं संतृप्ति तक पहुँचने। कृपया ध्यान दें कि इस समायोजन सतह निर्माण को प्रभावित नहीं करेगा, यह केवल छवि thresholding में प्रयोगकर्ता की सहायता के लिए कार्य करता है।
  4. नए सतहों जोड़े आइकन पर क्लिक करें। एक जादूगर खुल जाएगा।
  5. चयन करें: खंड केवल ब्याज की एक क्षेत्र। अगले कदम के लिए आगे बढ़ें।
  6. ब्याज की अपने उद्देश्य फिट करने के लिए चयन बॉक्स के हाशिये समायोजित करें। ध्यान रखें कि छवि 3 आयाम है और है कि चयन Z विमान पर समायोजित करने की जरूरत है और साथ ही सहन करें। चयन बॉक्स के आयताकार आकार ठीक से ब्याज की वस्तु से मेल नहीं करना चाहिए, तो ऑब्जेक्ट की बारी है और / या बॉक्स विस्तार जब तक सभी आवश्यक संरचनाओं एम्बेडेड रहे हैं। अवांछित वस्तुओं पर बाद में हटाया जा सकता है (सीपी। कदम 6.10)। आगे बढ़ें।
  7. उचित चर्चा का चयन करेंAnnel। सतह क्षेत्र विवरण स्तर या क्षेत्र व्यास मैच के लिए संरचनाओं खंगाला जा रहा स्थापित किया जाना चाहिए। संकेत विशेषताओं पर निर्भर करता है, या तो निरपेक्ष तीव्रता या स्थानीय कंट्रास्ट का इस्तेमाल किया जा सकता है। आम तौर पर, स्थानीय कंट्रास्ट फैलाना संकेतों के लिए बेहतर काम करता है। किसी भी मामले में, सेटिंग्स, क्रमश: प्रत्येक संकेत या ब्याज की संरचना के लिए अलग से समायोजित करने की जरूरत है।
  8. थ्रेशोल्डिंग उपकरण का उपयोग, ब्याज की संरचना के पुनर्निर्माण।
  9. हरी तीर तल पर क्लिक करके पुनर्निर्माण पूरा करें।
  10. पेंसिल उपकरण का उपयोग कर में कटौती और आवश्यक के रूप में सतहों को दूर करने के द्वारा आगे की वस्तु को समायोजित करें। यह आदेश इच्छित वस्तु में कटौती करने में उत्तर-दक्षिण दिशा में कटौती करने के लिए है, इसलिए, झुकाव छवि ही संभव है।
  11. का चयन सांख्यिकी, विस्तृत सांख्यिकी, और औसत मूल्यों से प्रत्येक की सतह के लिए मात्रा, क्षेत्र के मापन और तीव्रता प्राप्त करते हैं।
  12. (वैकल्पिक कदम) कलर-कोडेड के आंकड़ों को देख करने के लिए (सीपी। चित्रा 2 ई एफ), इसी सतह का रंग टैब का चयन करें और निशान 'आँकड़ा कोडित' के बजाय 'आधार' की। कई विकल्प प्रदर्शित किया जाएगा।

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Representative Results

निम्नलिखित पैराग्राफ में, एक POI के एक कार्यात्मक पछाड़ना illustrating अनुकरणीय परिणाम (Simiate, अधिक जानकारी के लिए कृपया 16, 17 देखें) का उपयोग रथ अभिकर्मक और एंटीबॉडी हस्तक्षेप प्रस्तुत कर रहे हैं। निष्कर्षों को दिखाना है कि Simiate के कम अभिव्यक्ति ट्रांसक्रिप्शनल गतिविधि को बाधित, और, एक खुराक निर्भर तरीके से, apoptosis लाती है, 99% से अधिक की मृत्यु दर में बनी है, तो उच्च एंटीबॉडी मात्रा (> 1 माइक्रोग्राम एंटीबॉडी) लागू कर रहे हैं (इन खोजों में पहले से प्रकाशित किए गए थे 16)। यहाँ, हम अब तकनीक और प्रोटोकॉल में विस्तार से कार्यरत मौजूद है और इसके अलावा प्रदर्शन कैसे रथ अभिकर्मक प्राथमिक संस्कृतियों में अलग hippocampal न्यूरॉन्स transfect करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

आदेश में जांच करने के लिए है कि क्या रथ पेप्टाइड्स, एंटीबॉडी के एक कुशल चक्कर के लिए अनुमति देते हैं और विशेष रूप से यदि ये एंटीबॉडी प्रक्रिया के दौरान कार्यात्मक रहने में, हम झंडा व्यक्तHEK293 कोशिकाओं में 24 घंटे के लिए -Simiate, और बाद में कोशिकाओं के रथ का उपयोग rbαSimiate-gtαrbAlexa568 अणुओं मिलकर (चित्रा 1) ट्रांसफ़ेक्ट। झंडा Simiate का निर्माण अच्छी तरह से HEK293 कोशिकाओं द्वारा व्यक्त की और somata के साथ ही इन कोशिकाओं के नाभिक (चित्रा 1 ए) के लिए localizes है। इधर, झंडा Simiate समूहों काफी (चित्रा 1 बी), जिससे नाभिक में अंतर्जात Simiate की धब्बेदार वितरण mirroring।

एंटीबॉडी परिसरों सेलुलर झिल्ली भर shuttled assemblages (चित्रा 1 ए, लाल, लाल तीर में) में दिखाई देते हैं, लेकिन जारी की एंटीबॉडी झंडा Simiate विशेष रूप से पता लगाने के रूप में ध्वज-Simiate और rbαSimiate-gtαrbAlexa568 अणुओं का एक गहरा colocalization (चित्रा 1 बी द्वारा दिखाए , पीला, पीले तीर में)। नोट के रूप में, प्रयोग न केवल यह दर्शाता है कि एंटीबॉडी एक रथ की मध्यस्थता के दौरान कार्यात्मक रहनाझिल्ली मार्ग है, लेकिन लगता है कि वे भी नाभिक में प्रवेश करने में सक्षम हैं। चूंकि उनके आकार प्रसार के माध्यम से नाभिक तैयार कर से एंटीबॉडी शामिल नहीं है, यह है कि परमाणु स्थानीयकरण संकेत रथ अपने आप में उपस्थित नाभिक में rbαSimiate-gtαrbAlexa568 अणुओं के translocation की सुविधा होने की संभावना है। दरअसल, एंटीबॉडी assemblages भी कम या क्रमशः में मनाया जाता है, परमाणु डिब्बे (चित्रा 1 बी, लाल तीर)।

का प्रयोग rbαSimiate-रथ कार्यात्मक HEK293 कोशिकाओं में अंतर्जात Simiate (चित्रा 2) व्यय करना परिसरों, हमने पाया कि हम rbαSimiate बाध्यकारी साइटों का 80% करने के लिए लक्ष्य कर रहे थे, एंटीबॉडी 16 के 2.0 माइक्रोग्राम का उपयोग कर। दिलचस्प बात यह है gtαrbAlexa568 एंटीबॉडी HEK में अकेले चक्कर जबकि 293 कोशिकाओं परमाणु speckles (चित्रा 2A सी) की उपस्थिति पर कोई स्पष्ट प्रभाव नहीं पड़ा, कार्यात्मक Simiate के नुकसान परमाणु speckles radiused (चित्रा 2 डी-एफ </ strong>, सी.पी.। 16) के रूप में तीन आयामी पुनर्निर्माण (चित्रा 2 बी, सी बनाम ई, एफ) और, एक खुराक निर्भर तरीके से, प्रेरित apoptosis (चित्रा 3, सी पी। 16) से यह साफ।

यह देखते हुए कि neuronal कोशिकाओं विषाक्त प्रभाव के प्रति संवेदनशील हैं, हम भी प्राथमिक हिप्पोकैम्पस संस्कृतियों में तकनीक (चित्रा 4) लागू होता है। TUNEL परख और MAP2 धुंधला का उपयोग सेल अखंडता का विश्लेषण करने के लिए, हम जब इलाज, सीपी की 1 + 4 घंटे के बाद नकली या इलाज और रथ इलाज किया कोशिकाओं (एपीपी। 20-25% TUNEL पॉजिटिव कोशिकाओं की तुलना न्यूरॉन्स की व्यवहार्यता पर कोई प्रभाव नहीं पाया। 4.4 -4.6)। इसलिए, हम रथ मध्यस्थता एंटीबॉडी neuronal संस्कृतियों में चक्कर परीक्षण किया। एक ही आवेदन इस योजना के बाद, gtαgpAlexa568 एंटीबॉडी assemblages अलग-अलग करने के लिए देखा गया था कोशिकाओं, जहां वे somata के साथ ही नाभिक (चित्रा 5 ए) में हुई 83% के बारे में फैली हुई है। इन टिप्पणियों आगे ख समर्थन कर रहे हैंफिर तीन आयामी विश्लेषण (चित्रा 5 ब) और बारीकी के चित्र HEK293 कोशिकाओं में देखा पुनः, एक साथ इस प्रकार की व्याख्या की गयी है कि रथ तकनीक को सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया जा सकता है के रूप में अच्छी तरह से प्राथमिक hippocampal न्यूरॉन्स अलग transfect करने के लिए।

आकृति 1
चित्रा 1. झंडा Simiate रथ अभिकर्मक का उपयोग HEK293 कोशिकाओं में shuttled Simiate विशिष्ट एंटीबॉडी से पता चला है। एंटीबॉडी हस्तक्षेप प्रयोगों, rbSimiate-gtrbAlexa568 एंटीबॉडी रथ-एंटीबॉडी जटिल गठन से पहले preassembled थे। ए) HEK293 कोशिकाओं को व्यक्त झंडा टैग Simiate। Simiate एंटीबॉडी assemblages सोमा के साथ ही नाभिक आवेदन, जहां वे झंडा Simiate के साथ विशेष रूप colocalize निम्न दर्ज करें। दौर डॉट्स: रथ-rbSimiate-gtrbAlexa568 assemblages (लाल तीर)। बी) बॉक्सिंग क्षेत्र के एक उच्च शक्ति बढ़ाई(ए) झंडा Simiate और रथ मध्यस्थता Simiate संकेत (पीले तीर) की colocalization illustrating में। कृपया नाभिक (लाल तीर) में एक रथ एंटीबॉडी जमावड़ा की उपस्थिति ध्यान दें। स्केल पट्टी: 10 माइक्रोन।

चित्र 2
चित्रा 2. Simiate विशेष HEK293 कोशिकाओं में shuttled एंटीबॉडी अंतर्जात Simiate।के सेलुलर कार्यों के साथ हस्तक्षेप, बी) HEK293 कोशिकाओं रथ-gtrbAlexa568 के साथ इलाज (1 माइक्रोग्राम) नियंत्रण के रूप में सेवा करते हैं। लाल रंग में, अंतर्जात Simiate, झूठे रंग में दिखाया गया है, जबकि रथ-gtrbAlexa568 assemblages प्रदर्शित नहीं कर रहे है। परमाणु speckles, मार्कर प्रोटीन SC35 (हरे रंग में) का उपयोग लेबल जबकि apoptotic कोशिकाओं TUNEL परख (नीले रंग में) द्वारा की पहचान की गई थे। बी) ए सी में बॉक्सिंग क्षेत्र से) एक ही क्षेत्र के पुनर्निर्माण परमाणु speckles illustrating बिंदु मात्रा और सतह क्षेत्रों के पुनर्निर्माणएक रंग कोडित तरीके से। डी, ई) HEK293 कोशिकाओं रथ-rbSimiate उपचार (0.5 ग्राम) के बाद। अंतर्जात Simiate के साथ ही रथ-rbSimiate-gtrbAlexa568 assemblages, लाल रंग में दिखाया जाता है, जबकि परमाणु speckles और apoptotic कोशिकाओं) ए और बी ई के अनुसार प्रदर्शित कर रहे हैं डी एफ में बॉक्सिंग क्षेत्र से खंगाला) परमाणु speckles के एक ही क्षेत्र के रूप में दिखाया गया है सी के लिए उल्लिखित radiused उपस्थिति और एकत्रीकरण speckles के (: Imaris सॉफ्टवेयर सभी पुनर्निर्माण) कृपया ध्यान दें। 2 माइक्रोन: सी, एफ में स्केल बार। अन्य सभी पैमाने सलाखों: 10 माइक्रोन। 1) तीन आयामी पुनर्निर्माण के लिए, केवल गैर apoptotic कोशिकाओं का इस्तेमाल किया गया था।

चित्र तीन
चित्रा 3. रथ-rbSimiate-gtrbAlexa568 की उच्च खुराक भारी कोशिका मृत्यु प्रेरित। HEK293 कोशिकाओं के साथ 2 रथ-gtrbAlexa568 या रथ-rbSimiate-gtrbAlexa568 क्रमश माइक्रोग्राम (दोनों कंप्यूटर अनुप्रयोग इलाज किया गया LEXES हरे रंग में दिखाया गया है और तीर के रूप में अच्छी तरह से आवर्धन ने संकेत दिया)। TUNEL लेबलिंग (नीले रंग में) apoptotic कोशिकाओं की पहचान करने के लिए लागू किया गया था। स्केल पट्टी: 10 माइक्रोन।

चित्रा 4
चित्रा 4. रथ प्राथमिक hippocampal न्यूरॉन्स को विषाक्त नहीं है। एबी) DIV के रूप में एंटीबॉडी चक्कर (1 + 4 घंटे, सी.पी. के लिए प्रोटोकॉल में उल्लिखित 7 न्यूरॉन्स या तो नकली इलाज (मध्यम, ए) या ​​रथ अभिकर्मक (बी के अधीन थे)। 4.4-4.6)। अनुसूचित जाति-35, परमाणु speckles के लिए एक मार्कर प्रोटीन, प्रतिलेखन और splicing मशीनरी लेबल करने के लिए कार्य किया, वहीं TUNEL के धुंधला apoptotic कोशिकाओं (हरी तीर) की पहचान करने के लिए लागू किया गया था। सी) इलाज और रथ DIV 16/17 न्यूरॉन्स का इलाज किया। MAP2 धुंधला वृक्ष के समान पेड़ कल्पना करने के लिए लागू किया गया था। स्केल सलाखों: 10 माइक्रोन।

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चित्रा 5. रथ मध्यस्थता अभिकर्मक न्यूरोनल संस्कृतियों के साथ संगत है। ए) div 5. तस्वीर से एक प्रतिनिधि प्राथमिक हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन एक लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप (लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप 710, जीस) का उपयोग कर लिया ढेर के जेड के अनुमानों से पता चलता है। स्केल पट्टी: 10 माइक्रोन। कृपया नाभिक में रथ-gtgpAlexa568 परिसरों (लाल) की घटना और सेल के सोमा ध्यान दें। नाभिक के साथ ही ए सोमा और न्यूरॉन के dendrites में दिखाया गया gtgpAlexa568 assemblages के बी) के तीन आयामी पुनर्निर्माण (Imaris सॉफ्टवेयर) ग्रे डॉट्स, जो अंतर्जात Simiate की लेबलिंग से डिस्टिल्ड रहे हैं के संकेत हैं। स्केल पट्टी: 10 माइक्रोन। एंटीबॉडी राशि ट्रांसफ़ेक्ट: 0.25 माइक्रोग्राम।

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Discussion

यहाँ, हम एक खुराक संचालित ढंग से सेलुलर कार्यों को नियंत्रित करने में प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर के महत्व का अध्ययन करने के लिए एक प्रोटोकॉल उपस्थित थे। प्रोटोकॉल वर्णित इसलिए सेलुलर स्तर पर प्रोटीन समारोह के विस्तृत अध्ययन की सुविधा, hippocampal न्यूरॉन्स सहित विभिन्न प्रकार के स्तनधारी सेल में प्रोटीन अभिव्यक्ति का एक ठीक-देखते हेरफेर के लिए अनुमति देता है।

हालांकि शाही सेना के हस्तक्षेप नीचे विनियमित करने के लिए POIs एक प्रसिद्ध रणनीति का प्रतिनिधित्व करता है, यह अपने नुकसान (सीपी। 14) है। इतना ही नहीं एक अत्यंत विशिष्ट और कुशल अनुक्रम की पहचान महंगा है और समय लेने वाली है, लेकिन यह भी सेल के अंदर प्रतिलेख जीवजनन विषाक्त आरएनए निर्माणों का संचय, परमाणु निर्यात मशीनरी की एक अधिभार के साथ ही एक संतृप्ति के बाद से अप्रत्याशित परिणामों के कारण हो सकता है हो सकता है अंतर्जात आरएनएआई की प्रोसेसिंग सिस्टम बंद लक्ष्य प्रभाव या अक्षमता का परिणाम हो सकता। इसके अलावा, बहिर्जात आरएनएआई वैक्टर की उच्च मात्रा UNS उत्पन्न हो सकता हैpecific प्रभाव के रूप में अच्छी तरह से, और सेल homeostasis उपद्रव।

एंटीबॉडी, दूसरे हाथ पर, अंतर्जात मशीनरी द्वारा कोई आगे की प्रक्रिया के लिए एक बार वे सेल में प्रवेश किया है तत्काल सेलुलर प्रक्रियाओं की जांच की आवश्यकता होती है, और तुरंत प्रभावी रहे हैं, इस प्रकार न केवल समय की बचत प्रयोग का समर्थन है, लेकिन यह भी। हालांकि वे unspecific बंद लक्ष्य प्रभाव पड़ सकता है, भी, उपलब्ध अच्छी तरह से विशेषता है और बहुत ही विशिष्ट एंटीबॉडी की बढ़ती संख्या इस विकल्प एक विचार के लायक बनाता है। चूंकि कोशिकाओं में macromolecular परिसर के वितरण के लिए एक प्रमुख बाधा का प्रतिनिधित्व करता है, विभिन्न अभिकर्मक तकनीक हाल के वर्षों के भीतर विकसित किया गया है, पेप्टाइड्स R8 और azoR8 18 के रूप में अच्छी तरह से microsphere 19 मध्यस्थता चक्कर भी शामिल है। R8 और azoR8 18 रथ को इसी तरह से व्यवहार करने के लिए संकेत दिया गया, जो काफी लंबे समय तक microspheres है रथ की मध्यस्थता मेम से, तेज 19 के लिए 24 घंटे की आवश्यकता पाए गएbrane मार्ग और कठिनाइयों जब तेजी से और खुराक निर्भर सेलुलर प्रतिक्रियाओं का अध्ययन कर सकता है।

उल्लेखनीय है, रथ तकनीक निकला प्राथमिक हिप्पोकैम्पस संस्कृतियों, जो उपचार के लिए बहुत ही संवेदनशील और transfect करने के लिए मुश्किल हो जाता है के लिए लागू किया जाना है। अब तक, रथ के वाहक NG108-15 21, लड़की पृष्ठीय रूट ganglia संस्कृतियों 21, या 22 PC12 कोशिकाओं में है, जो तंत्रिका से ही शुरू neuroblastoma-glioma सेल लाइन में प्राथमिक अस्थिकोरक संस्कृतियों 20 में प्रोटीन समारोह का विश्लेषण करने के साथ ही इस्तेमाल किया गया है शिखा, लेकिन केंद्रीय तंत्रिका तंत्र से प्राप्त होता सेल संस्कृतियों में किसी भी आवेदन की कोई रिपोर्ट अभी तक उपलब्ध हैं। चूंकि इस तरह के रूप में पारंपरिक Lipofectamine अभिकर्मक अभिकर्मकों इन कोशिकाओं और वायरल transfections जटिल में अक्षम हैं, रथ एक दिलचस्प विकल्प का प्रतिनिधित्व हो सकता है।

विशेष रूप से, रथ खुद नाभिक से 15 स्थानीयकरण करने के लिए मनाया गया, शायदअपने परमाणु स्थानीयकरण संकेत PKKKRKV के कारण (सीपी। 23)। इन टिप्पणियों के साथ लाइन में, हमने पाया है कि rbαSimiate-gtαrbAlexa568 अणुओं के रथ की मध्यस्थता अभिकर्मक जैसे परमाणु speckles के रूप में परमाणु डिब्बों की एक स्पष्ट लेबलिंग में हुई। दरअसल, इस तरह के रूप में gtαgpAlexa568 नियंत्रण एंटीबॉडी भी दोनों के नाभिक, HEK293 और प्राथमिक हिप्पोकैम्पस कोशिकाओं में पाया गया। एंटीबॉडी के बाद से, assemblages में विशेष रूप से, अभी तक भी प्रसार द्वारा और नाभिक लगना करने के लिए बड़े होते हैं, क्योंकि Simiate ही किसी भी नाम से जाना जाता परमाणु स्थानीयकरण संकेत शामिल नहीं है, बल्कि प्रसार के माध्यम से नाभिक में प्रवेश करती है, यह है कि रथ संकेत में शामिल है की संभावना है एंटीबॉडी के परमाणु स्थानीयकरण। वैकल्पिक रूप से, बड़ा प्रोटीन assemblages में एक परिवहन भी संभव है, हालांकि यह, चूहों से संवर्धित hippocampal न्यूरॉन्स के नाभिक में gtαgpAlexa568 की उपस्थिति की व्याख्या नहीं होता वहाँ के रूप में इन कोशिकाओं में इस एंटीबॉडी के लिए कोई लक्ष्य नहीं है हो सकता है। इसके अलावा, Since रथ shuttled पेप्टाइड्स और प्रोटीन 15 की प्राकृतिक स्थानीयकरण के साथ हस्तक्षेप नहीं करने के लिए मिला था, इन टिप्पणियों कि एंटीबॉडी अलग ढंग से व्यवहार सुझाव देते हैं।

दरअसल, जब इस तरह की रथ-rbαSimiate-gtαrbAlexa568 (चित्रा 1) या रथ-gtαgpAlexa568 के रूप में एंटीबॉडी परिसरों (चित्रा 5) सेलुलर झिल्ली भर में चक्कर, वे समूहों में दिखाई देते हैं, जो केवल भंग, जब इस तरह के अंतर्जात Simiate या ध्वज-Simiate के रूप में उपयुक्त लक्ष्य प्रोटीन मौजूद हैं (केवल चित्र 1 में)। रथ अस्थिकोरक में एंटीबॉडी परिसरों का उपयोग करना, सलीम और कॉलेजों में एक ही प्रभाव 20 मनाया। यह देखते हुए कि रथ पेप्टाइड्स और प्रोटीन 15 के स्थानीयकरण के साथ हस्तक्षेप नहीं करने का प्रदर्शन किया गया था, इन टिप्पणियों से संकेत मिलता रथ इकट्ठे कि एंटीबॉडी जुदा तभी एक एंटीबॉडी लक्ष्य बातचीत के रूप में एक आणविक तंत्र में इस तरह के, कि हाइड्रोफोबिक अंतर पर काबू पा हैरथ और उसके एंटीबॉडी माल और, के बीच कार्यों का प्रकार, disassembly के लिए प्रोत्साहित करती है। क्योंकि एंटीबॉडी पेप्टाइड्स या सबसे अन्य प्रोटीन से भारी होते हैं और उनके आकार, एक बड़े सतह के कारण है, वे रथ के अणुओं की अधिक संख्या के साथ संबद्ध और / या रथ पेप्टाइड्स के साथ अधिक फर्म बातचीत, जो इस प्रकार बढ़ावा मिलेगा सकता है एक और अधिक रथ संचालित एंटीबॉडी का व्यवहार। एक disassembly तंत्र की कमी इसलिए एक संकुल उपस्थिति और एंटीबॉडी माल (चित्रा 5) के एक परमाणु स्थानीयकरण पर नतीजा होगा।

साथ में ले ली, आंकड़ों से पता चलता है कि रथ विशेष रूप से अच्छी तरह से नाभिक में रहने वाले प्रोटीन के समारोह को संबोधित करने के लिए अनुकूल है और यह प्राथमिक hippocampal न्यूरॉन्स सहित स्तनधारी सेल प्रकार की एक किस्म में लागू है।

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Acknowledgements

/, जेरोम Lejeune फाउंडेशन आरडी, Interdisziplinäres Zentrum फर विश्वविद्यालय Erlangen-न्यूरेमबर्ग के klinische Forschung को आरडी के लिए प्रस्तुत काम स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थान कनाडा से धन के द्वारा भागों में समर्थन किया था आरडी करने के लिए कनाडा साझेदारी कार्यक्रम की नाजुक एक्स रिसर्च फाउंडेशन और ड्यूश Forschungsgemeinschaft से आरडी और फिर से करने। लेखकों सेल संस्कृति रखरखाव के साथ तकनीकी सहायता के साथ ही एक pCMV5 झंडा वेक्टर उपलब्ध बनाने के लिए प्रो एम Wegner के लिए इंग्रिड Zenger का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं। लेखकों आगे चाहते हैं विशेष रूप से वीडियो की शूटिंग में सहायक समर्थन के लिए Nadja श्रोएडर का शुक्रिया अदा करने के लिए।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chariot Active Motif 30025 store at -20 °C
Neurobasal medium Life technologies 21103-049 warm up to 37 °C before using
1x B27 Life technologies 17504044 store at -20 °C
L-glutamine Life technologies 25030-149 store at -20 °C
Penicillin and Streptomycin Life technologies 15140-122 store at -20 °C
Imaris software Bitplane n.a. expensive, but unmatched
Laser Scanning Microscope Zeiss n.a.

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References

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