Studere Protein Funktion og rolle ændret protein Expression af antistof Interferens og Tre-dimensionelle rekonstruktioner

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Derlig, K., Gießl, A., Brandstätter, J. H., Enz, R., Dahlhaus, R. Studying Protein Function and the Role of Altered Protein Expression by Antibody Interference and Three-dimensional Reconstructions. J. Vis. Exp. (110), e53049, doi:10.3791/53049 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

En stram styring af proteinekspression er ikke kun vigtigt for enhver organisme i live, men også en vigtig strategi at undersøge protein fungerer i cellulære modeller. Derfor nyere forskning opfundet forskellige værktøjer til at målrette protein ekspression i mammale cellelinier eller endda dyremodeller, herunder RNA og antistof interferens. Mens den første strategi har indsamlet meget opmærksomhed i løbet af de seneste to årtier, peptider medierer en translokation af antistof laster tværs cellemembraner og ind i celler, opnået meget mindre interesse. I denne publikation giver vi en detaljeret protokol, hvordan man udnytter et peptid luftfartsselskab ved navn Chariot i humane embryonale nyreceller samt i primære hippocampus neuroner til at udføre antistof interferenseksperimenter og yderligere illustrere anvendelsen af ​​tredimensionelle rekonstruktioner analysere protein funktion. Vores resultater antyder, at Chariot er sandsynligvis på grund af dets nukleare lokaliseringssignal, particularly velegnet til at målrette proteiner bopæl i soma og kernen. Bemærkelsesværdigt, når de anvender Chariot til primære hippocampus kulturer, reagenset viste sig at være overraskende godt accepteret af dissocierede neuroner.

Introduction

En stram styring af proteinekspression er afgørende for alle levende organismer til kommando sin egen udvikling samt at reagere på miljømæssige signaler. Derfor har en mangfoldighed af mekanismer blevet opfundet under evolution til præcist at regulere ekspressionsniveauet af hvert protein kodet af app. 20.000 gener eksisterer i en eukaryot celle på et givet tidspunkt af sit liv. Finder sted på forskellige stadier af protein produktion, reguleringsmekanismer spænder fra forvaltningen af ​​kromatin struktur, transskription og RNA håndtering til retningen af ​​posttranslationelle protein modifikationer, transport og nedbrydning.

Det er derfor ikke overraskende, at funktionsfejl i den underliggende molekylære machineries og ændrede protein ekspressionsniveauerne har været forbundet med diverse sygdomme såsom kræft eller intellektuelle handicap. Faktisk ser på udestående kompleksitet neuronal udvikling og pattedyr hjernefunktion, den sensitivitet af disse avancerede systemer til ændringer i proteinekspression manifesterer sig i flere kendte intellektuelle underskud herunder Alzheimers og Parkinsons sygdom (AD og PD) samt autisme spektrum forstyrrelser (ASF) ligesom Fragile X Syndrome (FXS). Sidstnævnte sygdom er kendetegnet ved en lang misexpression af en række proteiner, som skyldes tabet af en enkelt oversættelse regulering protein, FMRP (fragilt X mental retardering protein) 1-4. Desuden x kromosomale omlejringer påvirker variabel afgift forbundet protein A (VCXA), et protein, der styrer mRNA stabilitet og translation ved at ændre mRNA capping 5, er for nylig blevet sat i forbindelse med intellektuel underskud, mens punktmutationer ikke blev identificeret hos patienter med kognitive handicap allerede nu 6, 7, hvilket tyder på, at de observerede mentale svækkelser stammer fra ændret VCXA udtryk og dysreguleret udtryk for sit mål proteins. I overensstemmelse med disse resultater, en undersøgelse, at undersøge, om de novo kopital variationer af gener forbundet med ASF fastslået, at nye genduplikationer og sletninger er en væsentlig risikofaktor for ASD 8, hvilket understøtter ideen om, at forhøjede eller formindskede protein udtryk niveauer kan forårsage intellektuelle underskud.

Bemærkelsesværdigt, nyere forskning yderligere bevis for, at ekspressionsniveauet af et givent protein præcist justeres for at forhindre sin sammenlægning som følge af højt proteinindhold mængder med næsten ingen sikkerhedsmarginer 9. Det er derfor blevet foreslået, at selv små stigninger er tilstrækkelige til at fremkalde sygdomme som AD og PD 9. Selvom de mange forskellige molekylære machineries bidrager til proteinekspression kontrol tyder på en kompleks regulering ordningen på baggrund af disse resultater en undersøgelse undersøger ekspressionsniveauet af over 5.000 pattedyrsgener 10 viste, atnatur foretrukket en mere påholdende ordning: Det cellulære overflod af proteiner viste sig at være overvejende reguleres på niveau med oversættelse 10, hvilket illustrerer, at forvaltningen af RNA tilgængelighed primært tjener til at finjustere protein-ekspression.

Undersøgelse af dosis af proteiner af interesse (POI), er derfor ikke kun vigtigt for forståelsen af ​​de endogene funktioner af et protein, men også til undersøgelse af mange sygdomme og udvikling af terapier. Således har sidste årtier set forud for flere strategier via RNA-interferens til at manipulere POI dosering. Selvom RNA-interferens er almindeligt anvendt til at studere protein funktion og er endda anvendes i kliniske forsøg til behandling af cancer eller øjensygdomme samt at forfølge antivirale behandlinger i patienter 11-13, kan der opstå nogle vanskeligheder, der kan gøre det umuligt strategien. For eksempel frøet sekvens, som driver knockdown ved homologi er sammenlignelighedble kort, dermed fremme off-target effekter. Siden højeffektive sekvenser er sjældne og skal findes blandt tusindvis af muligheder (anmeldt i 14), at identificere den rigtige rækkefølge kan være tidskrævende og dyrt, men resultaterne kan stadig være skuffende.

En alternativ strategi er at direkte målrette POI med antistoffer. Her viser vi brug af proteinbærestoffet Chariot (fremstillet af Active Motif) for at reducere cellulære protein tilgængelighed, og ansættelse af tredimensionelle rekonstruktioner til at studere protein funktion efter knock-down.

Det aktive motiv af Chariot, selv en 2,8 kDa peptid, anvendes til at shuttle peptider, proteiner og antistoffer over membraner af pattedyrceller 15. Peptid associerede virksomheder med POI'er ved at danne ikke-kovalent koblede makromolekylære komplekser udnytte hydrofobe interaktioner, hvorefter Chariot-POI komplekser internaliseres i celler i en endosom-independent måde. Vigtigere er det, Chariot var angivet til hverken påvirke den intracellulære lokalisering af pendlet proteiner, eller til at udøve cytotoksiske virkninger eller for at påvirke den biologiske aktivitet af sin last 15.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Stock Solutions

  1. Resuspender lyofiliseret aktive motiv pulver i sterilt H2O til en endelig koncentration på 2 pg / pl. Tap forsigtigt til blanding.
  2. Forbered små portioner (f.eks 12 pi hver, der kræves 2 pi per reaktion) og opbevares ved -20 ° C.

2. Forberedelse af celler

  1. Seed pattedyrceller, såsom HEK293-celler eller primære neuroner på en plade 24 brønd i 500 pi vækstmedium herunder antibiotika.
    BEMÆRK: Når du bruger neuroner, frø cellerne ved lav tæthed og bruger kun de to midterste rækker af 24 brønds plade. Hver brønd vil således have en tom pendant til havnen mediet under inkubation (trin 4.2). Ved håndtering neuroner, altid sørge for, at cellerne ikke holdes uden for inkubatoren i mere end et par minutter.
  2. Kultur cellerne ved passende betingelser (befugtet, 5% CO2 og 37 ° C), indtil cellerne er app. 50%sammenflydende.
    BEMÆRK: Når du bruger neuroner, kultur cellerne indtil den ønskede udviklingsstadiet er nået og ændre app. 25-50% af mediet to gange om ugen. Medium: Neurobasal medium (indeholdende 1x B27, 5 mM L-glutamin og 1 x penicillin og streptomycin; sammenlign med ref 16).

3. Chariot Complex Dannelse

  1. Per reaktion, fortyndes 0,1-2 ug af IP eller det tilsvarende antistof samt kontrolprotein, eller kontrol-antistof, henholdsvis i 50 pi PBS.
    BEMÆRK: Teknikken virker også med makromolekylære komplekser bestående af præ-bundne primære og sekundære antistoffer (cp 'repræsentative resultater «, figur 1.). Mix og spin.
  2. For hver prøve fortyndes 2 pi Chariot stamopløsning i 50 pi PBS ved anvendelse separate rør for at undgå selvassociation af Chariot. Mix og spin.
  3. Overfør den fortyndede POI eller antistof (trin 3.1) til Chariot fortynding med pipetteting. Mix og spin.
  4. Inkuber blandingen i 30 minutter ved stuetemperatur (Chariot-POI komplekser vil danne).

4. Transfektion af celler

  1. Fortynd vognen komplekser (trin 3.4) i 100 pi forvarmet vækstmedium (37 ° C, ingen tilsætningsstoffer). Fjern mediet og vask cellerne en gang ved hjælp af forvarmet 1x PBS.
    BEMÆRK: Når du bruger neuroner, ikke skille sig af mediet, vil det blive genbrugt. Hold det ved 37 ° C. Til vask, bruge PBS indeholdende 0,5 mM MgCl2 og CaCl2.
    Forslag: holde mediet i tomme brønde, mens inkubere pladen (trin 4.5).
  2. Påfør Chariot kompleks opløsning (trin 4.1) til cellerne og rock cellerne forsigtigt for at sikre en jævn fordeling af opløsningen. Grow cellerne under standardbetingelser (trin 2.2) i 1 time. Tilføj serum til en slutkoncentration på 10%. Ved brug neuroner, tilføj mediet fra trin 4.1. Grow cellerne i 1 til 2 timer mere.
    BEMÆRK:optimale inkuberingstid afhænger af størrelsen og egenskaberne af last og skal muligvis justeres empirisk. Følgende forslag kan tjene som en rettesnor: For peptider, 1 time er normalt tilstrækkelig, for proteiner 1-2 timer anbefales, for antistoffer 2 timer, og for transfektion af neuroner med antistoffer 4 timer.
  3. Proces celler til analyse som sædvanlig. Bemærk venligst: teknikken er kompatibel med eksperimenter ved hjælp af fiksering protokoller samt levende billeddannelse.

5. Imaging

  1. Ved hjælp af en laser scanning mikroskop, tage z-stakke af celler og / eller celle rum i interesse ved anvendelse af ca. 0,25-0,5 um afstand. Den præcise lag afstand afhænger af størrelsen af ​​den struktur, der skal rekonstrueres, og skal bestemmes individuelt.

6. Genopbygning

  1. I de følgende trin, skal du bruge Esc bunden for at skifte mellem valg og navigation, Cntr at vælge flere objekter ved at klikke on dem og shift-tasten til at skære objekter (sml. trin 6.10).
  2. Åbn LSM-filen i Imaris.
  3. Anvendelse af skærmen Regulering for hver kanal, kontrast billedet, indtil de lyseste strukturer nå mætning. Bemærk, at denne justering vil ikke påvirke overfladen konstruktion, det tjener kun til at hjælpe forsøgslederen i tærsklingsrutine billedet.
  4. Klik på ikonet Tilføj nye overflader. En guide vil åbne.
  5. Vælg: kun Segment et område af interesse. Fortsæt til næste trin.
  6. Juster tilknytning valgboksen til at passe dit objekt af interesse. Bemærk venligst, at billedet har 3 dimensioner og at valget skal justeres på Z-planet også. Hvis den rektangulære form af udvælgelsesboksen ikke skal matche genstand for interesse korrekt, skal objektet og / eller forstørre feltet, indtil alle nødvendige strukturer er indlejret. Uønskede genstande kan fjernes senere (sml. Trin 6.10). Fortsæt.
  7. Vælg den relevante lmannel. Overfladearealet Detail Level eller kugle diameter skal indstilles til at matche de strukturer bliver rekonstrueret. Afhængigt af signalet egenskaber, kan anvendes enten Absolut Intensitet eller Lokal kontrast. Generelt Lokal kontrast fungerer bedre for diffuse signaler. Under alle omstændigheder skal justeres separat for hvert signal eller struktur af interesse, henholdsvis indstillingerne.
  8. Brug af Thresholding værktøj, rekonstruere strukturen af ​​interesse.
  9. Gennemfør rekonstruktionen ved at klikke på den grønne pil nederst.
  10. Juster objektet yderligere ved hjælp af blyant værktøj til at klippe og fjerne overflader efter behov. Det er kun muligt at skære i nord-syd retning, derfor vippe billedet for at skære det ønskede objekt.
  11. Få målinger af volumen, areal og intensiteter for hver overflade ved at vælge Statistik og detaljerede statistikker og gennemsnitsværdier.
  12. (Valgfrit trin) At observere farvekodede statistik (sml. Figur 2E F), skal du vælge fanen farve af den pågældende flade og markere 'Statistik Coded' i stedet for 'Base'. Flere muligheder vil blive vist.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I de følgende afsnit, eksemplariske resultater illustrerer en funktionel knockdown af en POI (Simiate, for yderligere detaljer se 16, 17) ved hjælp af Chariot reagens og antistof interferens præsenteres. Resultaterne viser, at formindsket udtryk for Simiate svækker transkriptionel aktivitet, og i en dosis afhængig måde, inducerer apoptose, der kulminerede i dødelighed på over 99%, hvis højere antistof beløb (> 1 mg antistof) anvendes (disse opdagelser blev offentliggjort tidligere i 16). Her har vi nu præsentere de teknikker og protokoller anvendes i detaljer og endvidere vise, hvordan Chariot reagens kan anvendes til transfektion af dissocierede hippocampale neuroner i primære kulturer.

For at undersøge, om Chariot peptider mulighed for en effektiv shuttling af antistoffer, og især, hvis disse antistoffer forbliver funktionel under proceduren, vi udtrykte FLAG-Simiate I 24 timer i HEK293-celler, og efterfølgende transficeres cellerne under anvendelse Chariot koblet rbαSimiate-gtαrbAlexa568 makromolekyler (figur 1). FLAG-Simiate konstrukt er godt udtrykt af HEK293-celler og lokaliserer til somata samt kernerne i disse celler (figur 1A). Her FLAG-Simiate klynger markant (Figur 1B), og derved spejling den spættede fordeling af endogen Simiate i kernen.

De antistof-komplekser pendlet over cellemembranen vises i assemblager (figur 1A, i rød, røde pile), men de frigivne antistoffer registrerer FLAG-Simiate specifikt som vist ved en dyb colokalisering af FLAG-Simiate og rbαSimiate-gtαrbAlexa568 makromolekyler (figur 1B i gul, gul pil). Som bemærke, eksperimentet ikke blot viser, at de antistoffer forbliver funktionel i løbet af en Chariot-medieretmembran passage, men at de også i stand til at trænge ind i kernen. Siden deres størrelse udelukker antistoffer i at påbegynde kernen via diffusion, er det sandsynligt, at kernelokaliseringssignalet stede i selve Chariot letter translokationen af ​​rbαSimiate-gtαrbAlexa568 makromolekyler ind i kernen. Faktisk er antistof-samlinger også observeret ved eller i henholdsvis den nukleare rum (figur 1B, røde pile).

Brug af rbαSimiate-Chariot komplekser til funktionelt nedbryder endogen Simiate i HEK293-celler (figur 2), konstaterede vi, at vi var i stand til at målrette op til 80% af de rbαSimiate bindingssteder, anvendelse af 2,0 ug af antistoffer 16. Interessant, mens shuttling gtαrbAlexa568 antistoffer alene ind i HEK 293 celler havde nogen indlysende effekt på udseendet af nukleare prikker (figur 2A-C), tab af funktionel Simiate afrundet nukleare prikker (figur 2D-F </ strong>, sml. 16) som illustreret af tredimensionelle rekonstruktioner (figur 2B, C vs E, F) og i en dosisafhængig måde, induceret apoptose (figur 3, sml. 16).

Da neuronale celler er meget følsomme over for toksiske virkninger, vi anvendte også teknikken i primære hippocampale kulturer (figur 4). Brug TUNEL assay og MAP2 farvning til at analysere celle integritet, fandt vi ingen virkning på levedygtigheden af ​​neuroner, når man sammenligner mock eller ubehandlede og Chariot behandlede celler (app. 20-25% TUNEL positive celler efter 1 +4 timers behandling, cp. 4.4 -4.6). Derfor testede vi Chariot medieret antistof shuttling i neuronale kulturer. Efter samme ansøgningsordning blev gtαgpAlexa568 antistof-assemblager set i varierende strækker sig i omkring 83% af cellerne, hvor de forekom i somata samt kerner (figur 5A). Disse observationer er yderligere understøttet bya tredimensional analyse (figur 5B) og nøje samle billedet ses i HEK293-celler, sammen og illustrerer, at Chariot teknik kan anvendes med succes til transfektion dissocieret primære hippocampale neuroner samt.

figur 1
Figur 1. FLAG-Simiate detekteres af Simiate specifikke antistoffer pendlet ind HEK293 celler ved anvendelse Chariot reagens. For antistof interferenseksperimenter, rbSimiate-gtrbAlexa568 antistoffer blev formonterede før Chariot-antistof-kompleksdannelse. A) HEK293-celler der udtrykker FLAG-mærket Simiate. Simiate antistof assemblager ind i soma samt kernen efter ansøgning, hvor de colocalize specifikt med FLAG-Simiate. Runde prikker: Chariot-rbSimiate-gtrbAlexa568 assemblager (røde pile). B) En stor forstørring af boxed regioni (A), der viser en lokalisering af FLAG-Simiate og Chariot medieret Simiate signal (gule pile). Bemærk tilstedeværelsen af ​​en Chariot antistof assemblage i kernen (rød pil). Målestokken: 10 um.

Figur 2
Figur 2. Simiate-specifikke antistoffer sendt ind HEK293-celler interferere med cellulære funktioner af endogen Simiate. A, B) HEK293-celler behandlet med Chariot-gtrbAlexa568 (1 ug) tjener som kontrol. I rød, er endogen Simiate vist i falske farver, mens Chariot-gtrbAlexa568 assemblager ikke vises. Nukleare prikker blev mærket under anvendelse markørproteinet SC35 (med grønt), hvorimod apoptotiske celler blev identificeret ved TUNEL-assay (med blåt). B) Rekonstruktion af nukleare prikker fra indrammede område i A. C) Rekonstruktion af samme region illustrerer speckle mængder og arealeri en farvekodet måde. D, E) HEK293 celler efter Chariot-rbSimiate behandling (0,5 ug). Endogen Simiate samt Chariot-rbSimiate-gtrbAlexa568 assemblager er vist i rødt, mens nukleare prikker og apoptotiske celler vises i overensstemmelse med A og B. E) Nuclear prikker rekonstrueret fra den indrammede område i D. F) Det samme region er vist som skitseret for C. Bemærk afrundede udseende og sammenlægning af prikker (alle rekonstruktioner: Imaris software). Scale bar i C, F: 2 um. Alle andre skala søjler: 10 pm. 1) For tre-dimensionelle genopbygning, blev kun ikke-apoptotiske celler anvendes.

Figur 3
Figur 3. Høje doser af Chariot-rbSimiate-gtrbAlexa568 fremkalde massiv celledød. HEK293 celler blev behandlet med 2 ug Chariot-gtrbAlexa568 eller Chariot-rbSimiate-gtrbAlexa568 henholdsvis (begge comp lexes vist i grøn og angivet med pile samt forstørrelser). TUNEL mærkning (i blåt) blev påført for at identificere apoptotiske celler. Målestokken: 10 um.

Figur 4
Figur 4. Chariot er ikke giftig for primære hippocampus neuroner. AB) DIV 7 neuroner var enten mock behandlet (medium, A) eller udsættes for Chariot reagens (B) som skitseret i protokollen for antistof shuttling (1 + 4 timer, cp. 4,4-4,6). Mens SC-35, en markør protein til nukleare prikker, tjente til at mærke transskription og splejsning maskiner blev TUNEL farvning anvendt til at identificere apoptotiske celler (grønne pile). C) Ubehandlet og Chariot behandlet DIV 16/17 neuroner. MAP2 farvning blev anvendt til at visualisere de dendritiske træer. Scale bars: 10 um.

pload / 53049 / 53049fig5highres.jpg "width =" 700 "/>
Figur 5. Chariot transfektion er kompatibel med neuronale kulturer. A) En repræsentant primære hippocampus neuron fra div 5. Billedet viser z-fremskrivninger af stakke taget med en laser scanning mikroskop (Laser Scanning Microscope 710, Zeiss). Målestokken: 10 um. Bemærk forekomsten af ​​Chariot-gtgpAlexa568 komplekser (rød) i kernen og soma af cellen. B) Tre-dimensionel rekonstruktion (Imaris software) af kernen samt gtgpAlexa568 assemblager vist i A. Soma og dendritter af neuron er angivet med grå prikker, som er fremstillet af mærkning af endogent Simiate. Målestokken: 10 um. Antistof mængde transficeret: 0,25 ug.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her præsenterer vi en protokol til at studere betydningen af ​​protein ekspressionsniveauerne kontrollere cellulære funktioner i en dosis drevet måde. Den beskrevne protokol giver mulighed for en finjusteret manipulation af protein-ekspression i forskellige mammale celletyper, herunder neuroner fra hippocampus, hvilket letter brugen detaljerede undersøgelser af proteinfunktion på det cellulære niveau.

Selvom RNA-interferens udgør en velkendt strategi at nedregulere POI'er, det har sin ulemper (sml. 14). Ikke kun identifikationen af ​​en yderst specifik og effektiv sekvens kan være dyrt og tidskrævende, men også transkript biogenese inde i cellen kan forårsage uforudsigelige resultater siden akkumuleres giftige RNA-konstruktioner, en overbelastning af den nukleare eksport maskiner samt en mætning af det endogene RNAi-systemer kan resultere i off-target effekter eller ineffektivitet. Desuden kan høje mængder af eksogene RNAi vektorer fremkalde unsPECIFIKKE effekter så godt, og forstyrre cellehomeostase.

Antistoffer, på den anden side, kræver ingen yderligere behandling af endogene machineries når de har indtastet i cellen, og er med øjeblikkelig virkning, og derved støtte ikke kun tidsbesparende eksperimenter, men også undersøgelser af umiddelbare cellulære processer. Selvom de kan have uspecifikke off-target effekter, også det stigende antal velkarakteriserede og meget specifikke antistoffer til rådighed gør denne alternative værd en tanke. Da levering af makromolekylære komplekser i celler udgør en væsentlig hindring, har forskellige transfektionsteknikker blevet udviklet inden for de seneste år, herunder peptider R8 og azoR8 18 samt mikrosfære 19 medieret shuttling. Mens R8 og azoR8 blev angivet til at opføre sig på samme måde som Chariot 18 blev mikrosfærer sig at kræve 24 timer for optagelse 19, som er betydeligt længere end Chariot-medieret membrane passager og kan forårsage problemer, når studerer hurtigere og dosisafhængige cellulære reaktioner.

Bemærkelsesværdigt, Chariot teknik viste sig at være anvendelig til primære hippocampale kulturer, som er meget følsomme over for behandlinger og vanskelige at transficere. Hidtil har Chariot luftfartsselskaber blevet brugt til at analysere protein funktion i primære osteoblastkulturer 20 samt i neuroblastom-gliom cellelinje NG108-15 21, chick dorsalrodsganglier kulturer 21, eller i PC12 celler 22, der stammer fra det neurale crest, men ingen rapporter om nogen anvendelse i cellekulturer afledt fra centralnervesystemet er tilgængelige endnu. Eftersom de traditionelle transfektionsreagenser såsom Lipofectamine er ineffektive i disse celler og virale transfektioner indviklede, kan Chariot repræsenterer et interessant alternativ.

Især blev Chariot selv observeret at lokalisere til kernen 15, sandsynligvispå grund af dets nukleare lokaliseringssignal PKKKRKV (sml. 23). I overensstemmelse med disse observationer, fandt vi, at Chariot medieret transfektion af rbαSimiate-gtαrbAlexa568 makromolekyler resulterede i en tydelig mærkning af nukleare rum såsom nukleare prikker. Faktisk blev kontrol- antistoffer, såsom gtαgpAlexa568 også påvist i kernen af ​​både, HEK293 og primære hippocampale celler. Siden antistoffer, navnlig i assemblager, er alt for store til at gå i gang kernen ved diffusion og da Simiate selv ikke indeholder nogen kendt kernelokaliseringssignal, men snarere ind i kernen via diffusion, er det sandsynligt, at Chariot signalet er involveret i kernelokalisering af antistoffer. Alternativt kunne en transport i større protein assemblager også være muligt, selv om dette ikke ville forklare tilstedeværelsen af ​​gtαgpAlexa568 i kernen af ​​dyrkede hippocampale neuroner fra rotter, da der ikke er mål for dette antistof i disse celler. Endvidere since Chariot blev fundet ikke at interferere med den naturlige lokalisering af shuttled peptider og proteiner 15, disse observationer antyder, at antistoffer opfører sig anderledes.

Faktisk, når shuttling antistof-komplekser såsom Chariot-rbαSimiate-gtαrbAlexa568 (figur 1) eller Chariot-gtαgpAlexa568 (figur 5) på tværs cellemembraner, de optræder i klynger, som kun opløses, når passende target proteiner såsom endogene Simiate eller FLAG-Simiate er til stede (kun i figur 1). Brug Chariot antistof komplekser i osteoblaster, Selim og gymnasier observeret den samme effekt 20. Eftersom Chariot blev påvist ikke at interferere med lokalisering af peptider og proteiner 15, indikerer disse observationer, at Chariot samles antistoffer demontere kun hvis der er en molekylær mekanisme, såsom et antistof-target interaktion, der overvinder den hydrofobe interaktioner mellem Chariot og dets antistof last og dermed fremmer demontering. Fordi antistoffer er tungere end peptider eller de fleste andre proteiner og har, på grund af deres form, en stor overflade, kan de forbinder med højere antal Chariot molekyler og / eller interagere mere fast med Chariot peptider, hvilket ville fremme en mere Chariot-drevet opførsel af antistoffer. En mangel på en demontering mekanisme ville derfor resultere i et cluster udseende og en kernelokalisering af antistoffet fragt (figur 5).

Tilsammen viser dataene, at Chariot især er velegnet til at løse funktionen af ​​proteiner, der er bosiddende i kernen, og at den er anvendelig i mange forskellige mammale celletyper, herunder primære hippocampale neuroner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

Den præsenterede arbejde blev støttet i dele af finansiering fra den canadiske Institutes of Health Research / Fragile X Research Foundation of Canada partnerskab program til RD, Jerome Lejeune Foundation til RD, er Interdisziplinäres Zentrum für klinische Forschung fra University Erlangen-Nürnberg til Rd og fra Deutsche Forschungsgemeinschaft til RD og RE. Forfatterne vil gerne takke Ingrid Zenger for teknisk assistance til vedligeholdelse cellekulturer samt professor M. Wegner for at gøre en pCMV5-FLAG vektor rådighed. Forfatterne yderligere ønsker at særligt takke Nadja Schroeder for den hjælpsomme støtte på det videooptagelse.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chariot Active Motif 30025 store at -20 °C
Neurobasal medium Life technologies 21103-049 warm up to 37 °C before using
1x B27 Life technologies 17504044 store at -20 °C
L-glutamine Life technologies 25030-149 store at -20 °C
Penicillin and Streptomycin Life technologies 15140-122 store at -20 °C
Imaris software Bitplane n.a. expensive, but unmatched
Laser Scanning Microscope Zeiss n.a.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Santoro, M. R., Bray, S. M., Warren, S. T. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. Abbas, A. K., Galli, S. J., Howley, P. M. 7, Annual Review. 219-245 (2012).
  2. Jiang, T. F., Chen, S. D. Dysfunction of two lysosome degradation pathways of alpha-synuclein in Parkinson's disease: potential therapeutic targets? Neurosci Bull. 28, 649-657 (2012).
  3. Howlett, D. R., Richardson, J. C. The pathology of APP transgenic mice: a model of Alzheimer's disease or simply overexpression of APP? Histol Histopathol. 24, 83-100 (2009).
  4. Carlson, G. A., et al. Genetic Modification of the Phenotypes Produced by Amyloid Precursor Protein Overexpression in Transgenic Mice. Human molecular genetics. 6, 1951-1959 (1997).
  5. Jiao, X. F., Wang, Z., Kiledjian, M. Identification of an mRNA-secapping regulator implicated in X-linked mental retardation. Mol. Cell. 24, 713-722 (2006).
  6. Fukami, M., et al. A member of a gene family on Xp22.3, VCX-A, is deleted in patients with X-linked nonspecific mental retardation. Am. J. Med. Genet. 67, 563-573 (2000).
  7. Van Esch, H., et al. Deletion of VCX-A due to NAHR plays a major role in the occurrence of mental retardation in patients with X-linked ichthyosis. Human molecular genetics. 14, 1795-1803 (2005).
  8. Sebat, J., et al. Strong association of de novo copy number mutations with autism. Science. 316, 445-449 (2007).
  9. Tartaglia, G. G., Pechmann, S., Dobson, C. M., Vendruscolo, M. Life on the edge: a link between gene expression levels and aggregation rates of human proteins. Trends Biochem Sci. 32, 204-206 (2007).
  10. Schwanhausser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473, 337-342 (2011).
  11. Uchino, K., Ochiya, T., Takeshita, F. RNAi therapeutics and applications of microRNAs in cancer treatment. Jpn J Clin Oncol. 43, 596-607 (2013).
  12. Li, T., Wu, M., Zhu, Y. Y., Chen, J., Chen, L. Development of RNA interference-based therapeutics and application of multi-target small interfering RNAs. Nucleic Acid Ther. 24, 302-312 (2014).
  13. DeVincenzo, J. P. The promise, pitfalls and progress of RNA-interference-based antiviral therapy for respiratory viruses. Antivir Ther. 17, 213-225 (2012).
  14. Fellmann, C., Lowe, S. W. Stable RNA interference rules for silencing. Nat Cell Biol. 16, 10-18 (2014).
  15. Morris, M. C., Depollier, J., Mery, J., Heitz, F., Divita, G. A peptide carrier for the delivery of biologically active proteins into mammalian cells. Nat Biotechnol. 19, 1173-1176 (2001).
  16. Derlig, K., Gießl, A., Brandstätter, J. H., Enz, R., Dahlhaus, R. Identification and Characterisation of Simiate, a Novel Protein Linked to the Fragile X Syndrome. PLoS One. 8, e83007 (2013).
  17. Derlig, K., et al. Simiate is an Actin binding protein involved in filopodia dynamics and arborisation of neurons. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, (2014).
  18. Loudet, A., et al. Non-covalent delivery of proteins into mammalian cells. Org Biomol Chem. 6, 4516-4522 (2008).
  19. Nagel, D., et al. Polymeric microspheres as protein transduction reagents. Mol Cell Proteomics. 13, 1543-1551 (2014).
  20. Selim, A. A., et al. Anti-osteoactivin antibody inhibits osteoblast differentiation and function in vitro. Crit Rev Eukaryot Gene Expr. 13, 265-275 (2003).
  21. Jain, A., Brady-Kalnay, S. M., Bellamkonda, R. V. Modulation of Rho GTPase activity alleviates chondroitin sulfate proteoglycan-dependent inhibition of neurite extension. J Neurosci Res. 77, 299-307 (2004).
  22. Watanabe, S., Wakasugi, K. Neuroprotective function of human neuroglobin is correlated with its guanine nucleotide dissociation inhibitor activity. Biochem Biophys Res Commun. 369, 695-700 (2008).
  23. Eguchi, A., et al. Optimization of nuclear localization signal for nuclear transport of DNA-encapsulating particles. J Control Release. 104, 507-519 (2005).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics