פלטפורמת microfluidic לעיבוד מדגם Precision הקטן-נפח ושימוש בו לגודל חלקיקים הביולוגיים נפרדים עם Microdevice אקוסטי

1Materials Engineering Division, Lawrence Livermore National Laboratory, 2Department of Biomedical Engineering, Boston University
Published 11/23/2015
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Bioengineering
 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Fong, E. J., Huang, C., Hamilton, J., Benett, W. J., Bora, M., Burklund, A., et al. A Microfluidic Platform for Precision Small-volume Sample Processing and Its Use to Size Separate Biological Particles with an Acoustic Microdevice. J. Vis. Exp. (105), e53051, doi:10.3791/53051 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

יתרון עיקרי של מכשירי microfluidic הוא היכולת לתפעל כרכי מדגם קטנים, ובכך להקטין פסולת מגיב ושימור דגימה יקרה. עם זאת, כדי להשיג מניפולציה מדגם חזקה יש צורך לטפל בשילוב מכשיר עם סביבת macroscale. כדי לממש את הפרדת הדיר, רגישה חלקיקים עם מכשירי microfluidic, פרוטוקול זה מציג פלטפורמת מייקרו-נוזלית אוטומטית ומשולבת מלאה המאפשרת עיבוד מדויק של .15-1.5 מיליליטר דגימות באמצעות מכשירי microfluidic. היבטים חשובים של מערכת זו כוללים פריסת מודולרי מכשיר ואביזריו חזקים וכתוצאה מכך העולם אמין וגמיש שבב חיבורים, וטיפול נוזל אוטומטי לחלוטין שמשיג אוסף לולאה סגורה מדגם, ניקוי מערכת ויחול צעדים כדי להבטיח פעולת הדיר. ניתן להשתמש במכשירים microfluidic שונים לסירוגין עם ארכיטקטורה זו. כאן אנו משלבים מכשיר acoustofluidic, characteriz פירוטני, מיטוב ביצועים, ולהדגים את השימוש בו לגודל-הפרדה של דגימות ביולוגיות. על ידי שימוש במשוב בזמן אמת במהלך ניסויי הפרדה, אוסף מדגם מותאם לשימור ולהתרכז מדגם. למרות שדורש שילוב של מספר חתיכות של ציוד, יתרונות של ארכיטקטורה זו כוללים את היכולת לעבד דגימות ידועות ללא אופטימיזציה נוספת מערכת, קלות החלפת מכשיר, ועיבוד מדגם מדויק, חזק.

Introduction

הפרדת מדגם וחלוקה היא אחד התחומים המבטיחים ביותר של יישום טכנולוגיות מייקרו-נוזליות. צעדי טיפול מדגם כזה הם חלק בלתי נפרד לאבחון יעיל קליני, פיתוח תרופות, מאמצי biosurveillance, והתקדמות במחקר בתחום מדעי חיים וטכנולוגיה. אסטרטגיות הפרדת microfluidic עצום כבר הוכיחו לחלקיקים-מושעה נוזל וקולואידים, כמו גם עבור מינים כימיים וביולוגיים; כמה ביקורות לספק סקירות של התקדמות והתפתחויות האחרונות בתחומים אלה 1 - 9. למרות שרבים מטכנולוגיות אלה microfluidic ההפרדה (להלן כ" התקני ליבה ") מתאפיינים בהרחבה, כמה דיווחים שקלו מדגם הבעיה ההפרדה ברמת מערכת. התקני Core הם בדרך כלל שבבי סנטימטר בקנה מידה אישיים, ממשק לצינורות fluoropolymer, עם נוזל מועבר על ידי משאבת עקירה או לחץ.ובכל זאת, אם ההבטחה של מיקרופלואידיקה - לרבות מוגבר אוטומציה, אמינות, וירידה בהיקפי מדגם - הוא להפוך למציאות, לפחות מאמץ שווה ערך חייב להיות מוקדש לעיצוב של מערכת הפרדה מוחלטת שאליו מכשיר הליבה משולב .

בנוסף, אתגר גדול עבור גישות microfluidic לbiodetection הוא מאקרו לממשק מיקרו. זה מתייחס לא רק לחיבורים הפיזיים "עולם-לשבב" של מכשיר microfluidic לרכיבי macroscale, וחוסר ההתאמה בין כרכים טיפוסיים מדגם קליני או ניתוח (~ 0.1-10 מיליליטר) והנפח הפנימי של שבבי מייקרו-נוזליים (~ .01-10 Μl), אלא גם למגבלות הדגימה הסטטיסטיות הנובעות מגישור קשקשי גודל אלה. נושאים אלה תורמים לתפיסה שעיבוד מראש מדגם והכנה הם "החוליה החלשה" של biodetection. 10 הפלטפורמה המתוארת בעבודה זו ת"אשלבים עיקריים KES להתמודדות עם אתגרים אלה.

הסתכלות ברמת מערכת, פרוטוקול זה מפרט את העיבוד אמין של כרכים בדיוק-מודד האויר אנליטיות בקנה מידה (החל 0.15-1.5 מיליליטר) ב~ לוחות זמנים של 10 דקות. זוהי פעולה "בלחיצת כפתור": פעם אחת בקבוקון המקור המכיל את המדגם ויעד הבקבוקונים לאוסף חלק ממוקמים לתוך המערכת, את הפקודה "לרוץ" יוזמת את ההליך, וכל הצעדים הם בשליטת מחשב. בסוף הריצה, ניתן להסיר את בקבוקוני הגבייה מהמערכת לניתוח במורד הזרם של השברים המופרדים.

התקן הליבה במערכת זו הוא שבב acoustophoresis שתמציות חלקיקי יונקים תא בגודל (5-20 מיקרומטר) מהמדגם. הפרדת Acoustophoretic נבחרה כאן בעיקר כי זה תפוקה גבוהה (עד 100s של μl / min), ללא תווית, וללא מגע, ובכך מציעים יתרונות בהפרדת Viru קיימאSES מהתאים שכמה טכניקות microfluidic אחרות יכולות להתאים. הפיזיקה של חלקיקים אקוסטית התמקדות תוארה בהרחבה, 11 - 13 ולא במוקד של פרוטוקול זה, אבל סיכום קצר של מושגי היסוד הבא כדי לסייע בהבנה את הבקשה להפרדת microfluidic.

גלי אולטרסאונד מעמד מהדהדים בmicrochannels מלא נוזל לייצר שדות לחץ, אשר להצמיח כוחות המניעים את החלקיקים לכיוון בלוטות של לחץ נמוך. גודל הכוח תלוי בנפח של החלקיקים, ועל גורם אקוסטית ניגוד נובע מהצפיפות וcompressibilities של החלקיקים יחסי והנוזל המתלים. 14 ככזה, אקוסטי ההתמקדות הוא אידיאלי להפרדה של תא בגודל (~ 7-15 מיקרומטר) מחלקיקי נגיף בגודל (~ 50-200 ננומטר). החלקיקים הגדולים יותר נודדים לעבר צומת לחץ; עם זאת, מאז גודל הכוח הוא קטן מאוד לחלקיקים קטנים יותר מ 2-3 מיקרומטר, חלקיקים אלה קטנים או מינים מומסים בקושי זזו בכלל. היישום הספציפי שלנו של הפרדה אקוסטית, כפי שתואר לעיל, 15 משלב קיר דק לחלק את ערוץ הנוזל ומאפשר מתכונן, מיקום לא סימטרי של עמדת ההתמקדות. זה מוסיף גמישות בעיצוב מכשיר, ואת היתרונות-כוללים ביצועים באיכות הפרדה מוגברת ומהירים מתוארים באופן מלא במקום אחר. 16,17

עם זאת, יתרון עיקרי של גישת תכנון ברמת המערכת המתוארת בעבודה זו הוא שהיא ניתנת להתאמה למגוון גדול של מכשירי Core microfluidic. לדוגמא, רוב מצבי זרימה רציפה הפרדה אחרות, כולל אינרציה, חלוקה זרימת שדה, תזוזה לרוחב דטרמיניסטית (DLD), וסוגים שונים של מכשירי electrokinetic ניתן לשלב בקלות, עם ההתאמות מתאימות שבוצעו בחשבון שינויים בכניסה / יציאת תצורה , ספיקות,ונפחי דגימה. מכשירים עם סוגים שונים של שדות על-שבב (חשמלי, מגנטי) או הדרגתיים (תרמית, כימית) עשויים לדרוש חיבורים נוספים לשבב, או השילוב של חומרה נוספת, שפלטפורמה זו מתאימה.

פרוטוקול זה מספק את הצעדים הנדרשים כדי לעצב מכשיר הפרדת microfluidic, ולפברק שבבי סיליקון-זכוכית על ידי חריטת יון תגובתי עמוקה (DRIE, תהליך פלזמה לחרוט זמין במתקני microfabrication רבים, אשר משתמש לסירוגין מחזורים של תחריט ופסיבציה להשיג עמוק תכונות עם הצדדיים אנכיים 18). לאחר מכן, אנו מתארים את האפיון של מכשיר acoustofluidic כדי לקבוע את הפרמטרים התפעוליים אופטימליים להפרדה, ולבסוף פירוט מערכת הפרדת מלוא המשולב והליך לעיבוד דגימות ביולוגיות. תוצאות אפיון מכשיר טיפוסיות ועיבוד נתונים מדגם לאחר מכן הוצגו ונדונו, והיתרונות המרכזיים של appro זהאח מודגשים, כולל מודולריות, חוסן, דיוק ואוטומציה.

Protocol

1. עיצוב מכשיר Acoustophoretic ופריסת Photomask

ניתן למצוא שיקולים והדרכה לעיצוב תהליך microfabrication ופריסת מסכה כלליים בטקסטים על microfabrication והדרכות של עיצוב photomask 19-21: הערה.

  1. הנח את מסכת 1, שכבת fluidic (צד קדמי), תוך שימוש בתוכנות CAD מתאימות. בחר גיאומטריה המאפשרת הזרקת מדגם והפרדה מתאימה ליישום הרצוי.
    1. לאקוסטית התמקדות, להגדיר את רוחב ערוץ fluidic w לספק n f תדר תהודה יותר מ 1 מגה-הרץ פי המשוואה f n = NC / 2W, כאשר c היא מהירות קול בנוזל הרלוונטי וn הוא מספר צמתים מעמד-גל (לדוגמא, לערוץ רחב 900 מיקרומטר, שתיים תהודת צומת צפויה בF 2 = 1.65 MHz).
      הערה: חלקיקיםזה כובש עמדות רוחב שונות לקראת סוף ערוץ ההפרדה צריכה לצאת מהשקעים שונים. בפרוטוקול זה, חלקיקים מופרדים על ידי גודל, כך השקעים מיועדים SPO וLPO, לקטנים-חלקיקים ושקע גדולים חלקיקים, בהתאמה, כפי שמוצגים באיור 1.
    2. הגדר את אורך ערוץ הנוזל לשלוט באורך של חלקיקי זמן נחשפים לשדה ההפרדה בקצב זרימה ספציפי. עוד על שבב זמן מגורים לחלקיקים להגר בשל כוחות ההפרדה חייב להיסחר מעל נגד טביעת רגל השבב הנדרשת הגדולה יותר.
      הערה: במכשירים אקוסטיים ההתמקדות שלנו, ערוץ הזרימה עושה שלושה עוברת את השבב לזמן גדל מגורים (איור 2 א). בקצב זרימה כולל טיפוסי של 200 μl / דקה, חלקיקים זורמים דרך 300 x 200 מיקרומטר החתך, ערוץ הפרידה ארוכה 117 מ"מ להוציא על שניות 2.1 ממוצעת בתחום האקוסטי.
  2. כולל יציאות fluidic בlayo המסכהut לחיבורים לצינורות סטנדרטיים המסודרים על רשת סטנדרטית (המגרש 5 מ"מ). כוללים סימני fiducial מתאימים ליישור של מסכות לזה במהלך ייצור וחיתוך של מכשירים בודדים.
  3. הנח את מסכה 2, Layer Via (הצד אחורי), שכולל רק יציאות fluidic. כוללים סימני fiducial ליישור למסכת 1.

איור 1
איור 1. התקן Acoustofluidic. סקיצות סכמטי של ארכיטקטורת מכשיר acoustophoretic. (א) מבט למעלה, מראה את תצורת H-המסנן הכוללת (לא בקנה מידה). (ב) סכמטי של חתך הערוץ במיקום המסומן בקו מקווקו השחור ב( א), המציג את שדה הלחץ (כחול מנוקד קווים), והתחושה של הכוחות אקוסטית העיקריים הקרינה (PRF) המניע את החלקיקים לכיוון מטוסי קטרי (חצים אדומים). חתך הערוץהוא 900 × 200 מיקרומטר עם קיר כ -10 מיקרומטר עבה מפרידים הראשיים (300 מיקרומטר הרחב) וערוצים עוקפים. ייצוג 3D של הפרדת חלקיקים (ג). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

2. ייצור חדר נקי של שבבי microfluidic לAcoustophoresis

  1. דפוס יציאות נוזל בחזרה בצד שימוש במסכה 2 על דו-צדדי מלוטשת, קוטר 0.5 מ"מ עובי 100 מ"מ <100> פרוסות סיליקון בphotolithography חיובית-להתנגד סטנדרטית. לחרוט גיאומטריה זו על ידי תחריט יון תגובתי עמוק (DRIE) לעומק של 350-400 מיקרומטר.
  2. הפעל את הרקיק על, וגיאומטריה ערוץ דפוס החזית-צד נוזל באמצעות מסכה 1 על ידי תקן חיובי-להתנגד photolithography על הצד של סיליקון האחר. לאחר מכן, הר רקיק המכשיר לופל שני (סיליקון הריק) מוביל באמצעות photoresist.
  3. לחרוט ערוצים, גם על ידי DRIE, עד לעומק של 200 מיקרומטר, סיליקון במקומות היציאה (רקיק הספק מגן על משטח כלי DRIE) תחריט-דרך. דה-הר רקיק המכשיר מSi הרקיק הריק על ידי שריה בלהתנגד-הפשטת פתרון.
  4. נקה את רקיק המכשיר ורקיק זכוכית בורוסיליקט 0.5 מ"מ עובי תווים באמצעות פתרון Piranha (חומצה גופרתית ומי חמצן ביחס 3: 1).
  5. חותם את ערוצי נוזל על ידי anodically מליטה הוופלים הזכוכית וסיליקון באמצעות הפרמטרים הבאים: לחץ קאמרי בmTorr 3, לחץ בוכנה ב 1000 N, טמפרטורה ב 350 מעלות צלזיוס, ולהחיל 750 V עד הטיפות הנוכחיות מתחת 0.2 מילי-אמפר.
  6. חותך את השבבים הבודדים בנפרד עם להב יהלום במסור חיתוך.

3. התקן סופי עצרת

  1. קובץ מצורף Piezo מתמר
    הערה: אולטראסאונד מופק בשבב מייקרו-הנוזלי על ידי מתמר piezoceramic המצורפת לצד סיליקון.
    1. בוו-רכיב ערכת אפוקסי צמיגות נמוכה, לשקול את היחס המומלץ של שני הרכיבים ומערבבים אותם ביסודיות.
    2. לוותר תערובת אפוקסי עם טפטפת ולהתפשט באופן שווה על פני piezoceramic titanate zirconate להוביל (PZT) כדי ליצור אפילו שכבה דקה, (כ 10 μl של תערובת אפוקסי לpiezo עם ממדים של 37.5 × 10 × 0.5 מ"מ).
    3. באמצעות לנענע או למתקן מתאימים, ליישר את הצד של אפוקסי piezoceramic עם שבב מייקרו-הנוזלי, מתן אזור התלוי בצד אחד לקובץ מצורף חוט שלאחר מכן (ראה איור 2 א), ולהביא את שני מרכיבים במגע. הצמד את ההרכבה בסגן, נזהר שלא לשבור כל המרכיבים, ולרפא בטמפרטורה ומשך המומלץ על ידי יצרן אפוקסי.
    4. לאחר אפוקסי ריפא, לצרף בסדר-מד חוט מוביל לכל צד של piezoceramic, על ידי הלחמה עם מלחם עדין קצה, מה שהופך את הקשר האפשרי קצרצר עם piezo להימנע tזה קיטוב-דה hermally. לחלופין, להשתמש בדבק מוליך להדביק חוטים לpiezo.

איור 2
איור 2. fluidic קרשי חיתוך, שבב הרכבה, והעולם לצ'יפ ממשק. תמונות של (א) שבב microfluidic אקוסטי (מידות חיצוניות של 70 × 9 × 1 מ"מ) עם מוביל חוט מתמר piezo מצורף, מראה שלוש מסירות של ההפרדה ערוץ את השבב, (ב) אבזרי fluidic מותאם אישית בורג ורכיבי צינורות במכונה לממשק שבב לעולם, (ג) השבב רכוב על החלק התחתון של קרש החיתוך fluidic באמצעות גופי clamping, פורש פתיחה בקרש החיתוך כדי לאפשר קירור מאוורר, (ד) מבט מלמעלה של קרש החיתוך עם חיבורי צינורות מחוברים ומאוורר קירור, וסכמטי חתך של אבזרי הבורג (ה) כי ממשק Tubing עם שבב מייקרו-הנוזלי הרכובים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

  1. מכשיר התקנה והעולם-כדי-צ'יפ ממשק
    1. צרף את השבב ל" קרש חיתוך fluidic "(צלחת עם רשת של באופן קבוע ברווח מושחלת דרך חורים) באמצעות גופי הידוק. צרף מאוורר קירור לקרש החיתוך לווסת את הטמפרטורה במהלך ניסויי אקוסטי (ראה איור 2).
      הערה: הפעלה ללא מאוורר הקירור במתח כונן טיפוסי מעלה את טמפרטורת מכשיר 70-80 מעלות צלזיוס. זה עובר באופן משמעותי את תדירות התהודה בשל מהירות קול שינתה בנוזל, ועלול להשפיע לרעה על יכולת הקיום של כל חלקיקים ביולוגיים שנמצאים בעיבוד.
    2. בורג במחברי שבב לעולם, שתואר קודם לכן במקום אחר 22 ומוצגים באיור 2. הצטרף לאלה שצינורות nterface לצינורות נוספים בפתחי הכניסה ושקעים באמצעות סטנדרטי ¼ "-28 איגודים ל1/16" צינורות.

4. אפיון ביצועי התמקדות אקוסטי

הערה: רכיבי מערכת הנדרשים לאפיון אקוסטית התמקדות מקובצים יחד ברשימת חומרים. צעדים 4.1 ו -4.2 להלן יחולו על כל מכשיר ליבה בשימוש עם פלטפורמה זו, ואילו השלבים הבאים מתארים פעולות ספציפיות למכשיר acoustofluidic שנדון כאן.

  1. הגדרות מערכת
    1. להרכיב את שבב מייקרו-הנוזלי באמצעות חיבורי עולם-לשבב על קרש חיתוך fluidic, כפי שתואר בסעיף 3. קשרים להפוך את שימוש בצינורות (כגון 1/16 צינורות fluoropolymer "חיצוניים קוטר) לבקבוקוני משאבה והצטברות נוזלים. הר ההרכבה קרש החיתוך על הבמה של מיקרוסקופ מסוגל ההדמיה הקרינה מצוידת במצלמת CCD.
    2. חבר אורכים של diamete הפנימי הקטןr צינורות (ID) (0.006 "מומלץ) מייד לאחר השבב (ראה איור 4) לשמש כזרימת restrictors, אשר לייצב את המערכת ולשלוט על זרימת הפיצול בין שקעי השבב. השתמש בצינורות זיהוי גדולים יותר, כגון 0.01 "או 0.03", לכל חיבורים האחרים.
      1. להעריך את שעות R התנגדות זרימה הידרודינמית של כל חתיכה של צינורות עם L האורך ו- D קוטר הפנימי באמצעות h R המשוואה = 128 μL / πD 4, שבו μ הוא הצמיגות הדינמית של הנוזל. הירידה בלחץ Δ P בשל כל אורכו של צינור בקצב זרימה נתון ש ניתנת על ידי H Δ P = QR.
      2. בחר יחס של אורכי צמצם לפצל את הזרימה בין השקעים כמתאימים לשימוש בשיטת ההפרדה. הפרדה אופטימלית עם שבבי אקוסטי בפרוטוקול זה דורשת SPO: זרימת יחס LPO של approximately 65: 35%.
      3. בחר את משך הזרימה לשקע restrictors כך שהתנגדות fluidic היא לפחות 3-4 פעמים גדולה יותר מההתנגדות המוחלטת בשאר המערכת (סיכם כראוי בסדרה או במקביל). למכשיר acoustophoresis משמש בעבודה זו, אורכי צינורות של 35 ו- 65 סנטימטר לLPO וSPO מתאימים.
        הערה: בחינה קפדנית צריכה להינתן לh R של כל התקני Core microfluidic. לאקוסטית שלנו מתמקד שבב בעבודה זו, h R הוא נמוך בשל ממדי הערוץ הגדולים יחסית שלה, כך התנגדויות צינורות המחוברות בקלות יעלו על זה. עבור מכשירים עם ממדים קטנים יותר ערוץ, ההתנגדות של השבב עשויה להשתלט על שאר צינורות המערכת, ובמקרה עיצוב ושליטה של h R ערוץ על-שבב היא תמורה נוספת בשלב 1 של פרוטוקול זה. עקרונות תכנון מפורטים והנחיות זמינים בספרות. 23,24
  2. אימות מערכת
    1. בדוק דליפות כדי לוודא שיש לו את המכשיר microfluidic אין פגמים וכל חיבורי צינורות אטומים. לוותר מים דרך צינורות הכניסה כנדרש עם מזרק ולפקח על כל נוזל דולף בערוץ המרכזי.
    2. לוותר נפח ידוע באמצעות השבב, ולמדוד את הכמויות שנאספו מהחנויות כדי להבטיח שזרימת היחס הוא כצפוי. סטיות מיחס הנפח הצפוי עשויות להצביע על חסימות באחד מהשקעים או החיבורים דולפים.
      1. כדי לשמור על ניקיון מערכת ולמנוע סתימת רוקן את המערכת כולה (צינורות ושבב fluidic) עם פתרונות מתאימים ניקוי (למשל, אקונומיקה, אתנול, מים) לפני ואחרי ריצת כל ניסויים.
      2. במקרה של סתימות או חסימות באחד מהשקעים, לשטוף את המערכת תוך חיבור לשקע ברור כדי לנקות את החסימה. אם זה לא יצליח, להפוך את כיוון הזרימה במהלך שטיפה,אופציונלי החלת פולסים מהירים של זרימה הפוכה (באמצעות מזרק ידני-מונע). לבסוף, אם לא ניתן להסיר את החסימה עדיין, להחליף את צינורות או שבב, במידת צורך.
  3. הגדרת סריקת תדרים לאקוסטית התמקדות
    1. מלא את הערוץ העוקף (ראה איור 1) עם נוזל כמו מים ללא יונים, אתנול, או בופר פוספט (PBS) על ידי הזרקה ידנית עם מזרק. שים לב שנוזל זה אינו בא במגע עם המדגם בטיפול. הפרטים של התאמת עמדת צומת באמצעות נוזלים עוקפים שונים מתוארים במקומות אחרים 16,17. בקיצור, אם את הצומת צריכה להיות קרוב יותר לקיר המפריד, להשתמש בצפיפות נמוכה עוקף נוזל, כגון אתנול; עבור מיקום קרוב יותר לצומת נחל מדגם הקלט, לבחור נוזל צפוף יותר, כגון פתרון גליצרול.
    2. הפוך פתרון חרוז של כ 0.01% (w / v) 5-8 מיקרומטר חרוזים פולימר ניאון תלויים בחיץ כגון PBS עםTween-20 0.05% ולמלא את מדגם מזרק כניסה עם פתרון חרוז. מלא את מזרק כניסת חיץ עם אותו החיץ (זה לא צריך להיות זהה הנוזל כמו בערוץ העוקף). שים לב כי באופן כללי, למאגר נבחר כדי להתאים את היישום (ראה שלב 5.1).
    3. עם קרש חיתוך fluidic על הבמה מיקרוסקופ, להתמקד בערך באמצע דרך לעומק של הערוץ באזור ערוץ ישר ממש לפני היציאה עם שני הערוצים (הפרדה ומעקף) בשדה הראייה. מקור אור נוסף זווית אלכסונית חיצוני עשוי להידרש כדי להפוך את קירות הערוץ גלויים, שללאחר עיבוד מוצלח של נתוני תמונה.
  4. תדר אוטומטי סריקה ולכידה תמונה
    1. הפוך חיבורי חשמל באמצעות כבלים מסוככים (למשל, RG-58 מצוידים במחברי BNC) לגנרטור פונקציה עם תדר רדיו מגבר (RF), כדי לספק את אות העירור למתמר piezo. לחלופין, להתחבר לאוסצילוסקופהפלט של מחולל הפונקציה לניטור המתח בפועל פנה למתמר.
    2. הפעל את מאוורר הקירור, ולהגדיר את הגנרטור הפונקציה כזו שהפלט של מגבר RF למתמר piezo הוא בטווח של 12-25 וולט (עמ 'V) שיא-לשיא.
    3. הגדר את שני המזרקים לאותו קצב הזרימה בין 50 ל 200 μl / דקה. באמצעות משאבת מזרק יחידה לנהוג שני מזרקים עם אותו מנוע מומלץ כדי למזער הפרעות בזרימה.
    4. לבצע הליך סריקת תדרים על ידי ציון תדרי התחלה וסיום, את גודל הצעד בין ערכי תדר, ומתח כונן piezo באמצעות ערכת כלים אוטומציה מעבדה כגון מכשירים הלאומי LabVIEW.
    5. בכל שלב בתדירות, להחיל את המתח במשך 15 שניות כדי לאפשר למערכת כדי לאזן, אז ללכוד 10 תמונות של חרוזים זורמים דרך השבב לניתוח שלאחר מכן (זמני חשיפה בין 10 ל 100 אלפיות שניים מומלצות).
    6. בין האח מיושם צעד תדירות, כבה את המתח לכ 20 שניות כדי לאפשר לחרוזים להפיץ באופן אחיד על פני הערוץ ולהסיר הטיה בהתמקדות מהצעד התדירות מיושם בעבר.
  5. ניתוח תמונה כדי לקבוע תדר תהודה ומיקום התמקדות
    1. הפעל תסריט ניתוח תמונה (כגון תסריט AF_freqScanPlotter.m MATLAB מסופק עם פרוטוקול זה) והזן את המידע הדרוש בהנחיות: בחר את רשימת קבצי תמונה שנוצרו בשלב 4.4, להיכנס לתחילת הסריקה ולהפסיק תדרים וגודל צעד, רוחב מלא הערוץ, מיקום הקיר, ולבסוף לבחור את אזור התמונה לנתח, כולל הן את ההפרדה וערוצים עוקפים.
    2. שים לב לממוצע תסריט ניתוח הסט של תמונות שנתפסו בכל שלב בתדירות, וממוצע ערכי העצמה לאורך כיוון הזרימה. התוצאה היא קו-סריקת חתך של עוצמת הקרינה.
      הערה: התדר המתאים לhighe עוצמת רח מוגדרת כתדר התהודה (איור 3, שורה אמצעית), והעמדה בערוץ שבו בעוצמה הגבוהה ביותר מתרחשת היא עמדת ההתמקדות (איור 3, שורה תחתונה).

איור 3
איור 3. סריקת תדר נציג. דוגמא של נתוני סריקת תדרים לשילוב גם (א) וpiezo שילוב גרוע (B) ושבב. בשורה עליונה: עוצמת ניאון של חרוזים (אדומה מייצגת גבוהה, וכחול מייצג בעצימות נמוכות). בשורה אמצעית: עוצמה מקסימלית בכל תדר. שורה תחתונה: מיקום של עוצמה מקסימלית, שבו הקו מקווקו האדום מציין חזתה התמקדות עמדה, ויהלומים אדומים מצביעים על תדר תהודה כפי שנקבעו על ידי בעוצמה מקסימלית.ז "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

5. הפרדה אוטומטית

הערה: ניסוי ההפרדה האוטומטית מנוהל להפריד חלקיקים גדולים מחלקיקים קטנים בשל הכוחות אקוסטית התמקדות הגודל תלוי יושמו בשבב מייקרו-הנוזלי. רכיבי המערכת הנדרשות מקובצים יחד ברשימת חומרים.

  1. לקביעת תצורת מערכת והכנת דוגמאות
    1. חבר את שבב מייקרו-הנוזלי למשאבת המזרק, שסתומים בחירה מרובות יציאות מבוקרת מחשב, זרימת מטרים-ממשק מחשב, וצינורות, כפי שמוצג באיור 4. תצורה זו מאפשר עיבוד אוטומטי של דגימות באמצעות שבב הפרדת microfluidic, כמו גם אוטומטית ניקוי מדרגות בין ניסויים כדי להסיר זיהום צולב ומדגם לשאת על.
    2. השתמש במאגר מדגם מתאים לתאים או חלקיקים להיות מופרד, או כפי שנדרש על ידי assay הניתוח ללשמש לאחר הפרדה. כמו בשלב 4.3.2, חיץ ההתאוששות (אך לא בהכרח עוקף הנוזל) חייב להתאים את נוזל הדגימה.
      הערה: כל מאגרים מימיים משמשים בדרך כלל עם דגימות ביולוגיות (למשל, PBS) יש תכונות אקוסטיות דומות למים ולא במידה ניכרת לשנות את הביצועים של מכשיר אקוסטי. השימוש בנוזלי מדגם עם צפיפות וצמיגות שונה באופן משמעותי ממים הוא אפשרי, אבל מומלץ רק למפעילים עם ניסיון acoustophoresis משמעותי.


איור 4
תצורת איור 4. אקוסטיות מערכת לניסויים בהפרדה אוטומטיות. הקווים הכחולים לעקוב אחר נתיב הזרימה העיקרי במערכת. כל הקווים הירוקים ושחורים הם "צינורות בקוטר פנימי (ID), וכל הקווים הכחולים וצבע אפורים הם 0.01" 0.03 צינורות מזהה, עם הדוארxception של הסלילים מחזיקים, שהם 0.03 "זהות, והזרימה restrictors, שהם 0.006" זיהוי. המזרקים מלאים במאגר, ויש לי סלילי החזקת נפח מספיק (550 μl) כדי למנוע ספיגה של כל דגימות או חומרים כימיים ניקוי למזרקים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

  1. נוהל הפרדה
    1. מדינה טרום ריצה. לפני הפעלת ההפרדה, לוודא שיש לי המאגרים מגיב ניקוי (אקונומיקה, אתנול, חיץ) נוזל מספיק, מאגרי הפסולת אינם מלאים, וקווי הנוזל דרוכים (כלומר, מלא בפתרון). אם התנאי האחרון הוא בטוח, או אם המערכת מתנהלת בפעם הראשונה לאחר התבטלות (למשל, בפעם הראשונה ביום נתון), המנוהל על הליך ניקוי אוטומטי (ראה שלב 5.3 להלן). קבע שסתומים 3 ו -4 בשקעי השבב לזרום לבזבז reservoirs תחילה.
    2. הפעל את מאוורר הקירור, ולהגדיר את פונקציית המחולל בתדר התהודה לשבב אקוסטי בשימוש, כפי שנקבע בשלב 4.5. התאם את נקודת סט מתח על הגנרטור הפונקציה כך שיציאות מגבר RF בין עמ '12 ו -25 V, כמתאים להפרדה הרצויה.
    3. חבר את הקלט לדוגמא יאל, קלט ויאל הצפת, ובקבוקוני אוסף מתאימים למערכת. רק לפני הצמדה ויאל קלט הדוגמה לצינורות האיסוף שלו, המערבולת בקצרה הבקבוקון מחדש להשעות את כל חלקיקים שעשויות התיישבו. לאחר מכן, לצרף את הבקבוקון וליזום את שגרת ההפרדה ללא דיחוי.
      זהירות: אם המדגם להיות מעובד מכיל סוכני פוטנציאל מזהמים, הבקבוקונים צריכים להיות מסוג הבורג העליון, כדי לשמור על מערכת אטומה ולמנוע aerosolization מדגם. בנוסף, בעבודה עם חומרים ביולוגיים מסוכנים, להתמודד עם כל הבקבוקונים והצינורות בזמן שלובש ציוד מגן הדרוש ובאמצעות reqבקרות uired סיכון ונהלים לקבוצת הסיכון הביולוגית ורמת בטיחות ביולוגית מתאימות לחומר. התייעץ עם מדיניות ופרוטוקולים מוסדיות במקרה של אי-ודאות.
    4. השתמש בתכנית בערכת כלים אוטומציה מעבדה לשלוט ברזים, לזרום חיישנים ולשאוב לבצע את שגרת הפרדה מלאה אוטומטית.
      הערה: שגרת מתגים שסתומים, actuates נסיגת משאבת מזרק ועירוי, וצגי זרימת נתוני חיישן לכראוי תזמון האוסף של שברים מדגם פלט. השלבים העיקריים מסוכמים להלן ב5.2.4.1 דרך 5.2.4.3, כאילו בוצעו באופן ידני.
      1. ראש צינור האיסוף. למשוך כ -15 μl מהקלט לדוגמא יאל למלא את צינור חיבורו לValve 1. במקביל לחלוטין, ראש הצינור המחבר את בקבוקון קלט המאגר לשסתום 2. באופן דומה, ראש כניסת האוויר של Valve 1 כדי לוודא שהוא לא מכיל נוזל. לבסוף, לעבור סתום 1 ו -2 לגרש לבזבזעודף נוזלים או אוויר שנכנס לסליל הטעינה.
      2. טען את סליל המדגם, כפי שמוצג באיור 5 א. רצף טעינה אופייני לעיבוד מדגם 250-μl הוא למשוך 25 μl אוויר ב 50 μl / דקה, אז 250 μl של מדגם ב 200 μl / דקה, ואחריו 35 μl של חיץ מוביל ב 200 μl / דקה, ובסופו עוד 25 μl אוויר ב 50 μl / דקה.
        הערה: כל הכרכים וספיקות הם לבחירת משתמש. שים לב שרצף טעינה זה בסדר הפוך של איך תקעי הנוזל יזרמו דרך מכשיר ההפרדה.
      3. בגין עירוי מדגם. הגדר את משאבות המזרק להחדיר תקעי נוזל הטעונים בשיעור הרצוי (בדרך כלל 100 μl / min). צג הספיקות בSPO וLPO עם זרימת חיישנים כדי להבטיח זרימה שהיא יציבה וביחס שנקבע בשלב 4.1, והסתימה שלא התרחשה.
      4. לאסוף שברים נפרדים. כאשר זרימת החיישנים מזהים עלייה חדה בקצב זרימה, המצביע על הרשות הפלסטיניתssage של פער האוויר הראשון, לעבור את השסתום המקביל פלט מפסולת (שם זה התחיל בשלב 5.2.1) לבקבוקון אוסף מדגם.
      5. לאחר מעבר של מדגם מהשבב, להתבונן חיישני הזרימה לזהות את פער האוויר השני. בשלב זה, לעבור את שסתומי הפלט אחורי לבזבז. לאחר הנפח המלא הטעון משלב 5.2.4.2 הוא חילק, להפסיק את עירוי משאבת מזרק ולסיים את שגרת האוטומציה כאשר קצב הזרימה מגיע לאפס.
    5. לאחר ניסוי ההפרדה הוא מלא, נתק את SPO ובקבוקוני אוסף מדגם LPO ולאחסן אותם כראוי לניתוח שלאחר מכן.
  2. אוטומטי ניקוי וטיהור
    הערה: לפני עיבוד מדגם זה, סומק ולטהר את מערכת fluidic כל שימוש שיגרתי האוטומטיים הבא.
    1. Secure SPO וצינורות בקבוקון אוסף LPO, כמו גם צינור איסוף דגימה בבקבוקונים ריקים לאיסוף פתרונות ניקוי עודפים שיהיה סמוק throuGH הצינורות.
    2. התחל את שגרת ניקוי מערכת האוטומטית. כמו בהליך ההפרדה האוטומטית בשלב 5.2, התכנית צריך לשלוט ברזים ומשאבת מזרק ברצף לטעון סליל האחזקה עם ריאגנטים ניקוי, ולשטוף אותם באמצעות המערכת.
    3. בצע את שגרת הניקוי הבאה: סומק עם אקונומיקה 10%, ולאחר מכן עם 70% אתנול, וסופו במים או חיץ מלוח מתאים (למשל, 1x PBS או חיץ המשמש לעיבוד מדגם). השתמש בסומק הכרכים הבא: 450 μl לאקונומיקה ואתנול, ו1,000 μl למים / חיץ.
    4. במהלך שלבי שטיפה, לשטוף כל מגיב לSPO תוך שסתום שקע LPO מוגדר יציאה חסומה, אז להיפך, כדי להסיר כל סתימות פוטנציאל בזרימה לשקע restrictors. לשמור על שיעורי נסיגה וזרימת עירוי של 300-500 μl / דקה כדי למזער דור בועה בהצטברות צינורות וbackpressure כאשר גם SPO או LPO חסום.
    5. Discard פתרונות שטיפה העודפים ובקבוקונים שבו הם נאספו על ידי ביצוע הנהלים המתאימים לטיפול בפסולת ביולוגית או כימית.

Representative Results

תכונות עיקריות של עיצוב מכשיר אקוסטי-microfluidic מודגשים באיור 1, ותיארו במקום אחר לחלוטין. 15 ב, זרימת שני זרמי נוזל צד-ידי צד קצר בערוץ הפרדה, הופרדו ממקביל ערוץ עוקף על ידי קיר דק סיליקון. מאז את גודל כוח הקרינה העיקרי מאזניים עם חלקיקי נפח, חלקיקים גדולים להגר אל מחוץ למעורב מדגם זרם הקלט לכיוון צומת לחץ אקוסטי ממוקמת בזרם התאוששות הנוזל הסמוך, ואילו חלקיקים קטנים נשארים בזרם המקורי (איור 1 ב, ג). ארכיטקטורת שני הערוצים מחולקים משפרת הפרדת חלקיקי 17 ומאפשרת התאמה של עמדת הצומת באמצעות נוזלי ערוץ עוקף שונים. 16 קרש החיתוך ואבזרי fluidic מספק פלטפורמה איתנה לעולם שבב חיבורים, והעיצוב המודולרי מאפשר החלפה מהירה בין שבבי fluidic (איור 2). ג זהonfiguration כמו כן מאפשר חיבורי נוזל הפיכים, אשר עד 1,000 psi חותם, להתבצע במהירות ובאופן אמין (איור 2, E).

מיל ו תדר התהודה של שבב ניתן להעריך באמצעות חישובים אנליטיים 1D פשוטים (ראה שלב 1.1.1). ממודל 2D הסופי, אלמנט מלא יותר של חתכנו המכשיר, 16 צפוי עמדת ההתמקדות לתהודת 2-צומת היא 225 מיקרומטר מהקיר והתדירות הצפוי היא 1.68 MHz. עם זאת, במיל 'למכשירים אמיתיים יכול להשתנות לפי ± 100 kHz, תלוי בטמפרטורת הפעלה וצימוד של תהודות אורך ורוחב. לכן, לאחר הרכבה מכשיר, מיל F יש לוודא באופן אמפירי בשיעורי זרימה רלוונטיים ומתחי כונן piezo, כפי שמתוארים בשלב 4 של הפרוטוקול. איור 3 מראה סריקות תדירות נציג נלקחו ב 200 μl / דקה, עם מים בערוצים הראשיים ועוקפים, ו -20 עמ 'V שסופק לpiezo. כאשר הצימוד בין piezo ומכשיר microfluidic הוא טוב, חלקיקים יתמקדו בחוזקה בתדר התהודה, וכתוצאה מכך לשיא ברור בעוצמת הניאון וההגירה לעמדת ההתמקדות הצפויה (איור 3 א). לעומת זאת, כאשר יש צימוד עני, חלקיקים לא יתמקדו היטב ותוצאות סריקת התדר יהיו דומות לאיור 3. במכשירים כאלה, מתמר piezo ייתכן שיהיה צורך מחדש רכוב, אם דבק הפיך כבר בשימוש; אחרת, מכשיר זה אינו מתאים כאשר באיכות גבוהה תוך התמקדות או זרימה מהירה היא קריטיות ליישום הנדרש. הנתונים באיור 3 ליידע את הבחירה של תדירות הפעלה לניסויים הבאים, והמתח ולזרום טווח שיעור זמין להפרדת חלקיקים יעילה.

קבצים / ftp_upload / 53051 / 53051fig5.jpg "/>
איור 5. אוטומטי עיבוד לדוגמא. () סכמטי של המדגם הטעון בסליל המדגם. זרימת פרופיל נציג של ניסוי הפרדה מוצלח (ב '). (ג) זרימת פרופיל מהפרדה לרוץ שבמהלכו לשקע SPO סתום בכ 220 שניות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

לאחר זיהוי שבבים שמפרידים יעילים, הם שולבו במערכת המתוארת באיור 4. נפח מערכת סה"כ נסחף ממוזער באמצעות צינורות עם 0.01 "קוטר פנימי לאורך נתיב הזרימה העיקרי (קווים כחולים). איור 5 א 'ממחיש את האיפור של התוספת מדגם טיפוסית חדורה במערכת. כמות קטנה של "חיץ מוביל" (~ 35 μl) נדרשה ברת דודדה המדגם בזרימה לחסל זרימת תנודות תוך המדגם עובר דרך שבב ההפרדה. איור 5 מציג נתונים זרימה כתוצאה מניסוי מוצלח הפרדה אוטומטית אקוסטית. תכונות עיקריות של ריצה מוצלחת כוללות: (1) עלייה חולפת בקצב זרימה בשני LPO וSPO כלחץ בונה ונוזל מתחיל לזרום דרך מערכת, (2) עלייה חדה המציינת את המעבר של בועת אוויר ( הבלעה מציגה פרופיל מורחב של בועה יחידה), שאמור להגיע לSPO לפני LPO בשל זרימה בלתי שווה משני שקעים, (3) זרימה יציבה באמצעות שני השקעים שבין שתי בועות האוויר כמהלכי מדגם באמצעות המערכת, ו- (4) ירידה הדרגתית בקצב זרימה בשני השקעים לאחר נפח דגימה המלא מועברת למערכת. ריצות בעייתיות ניכרות מייד מזרימת פרופילים דומים לאיור 5 ג, שבו נראה כי SPO הפך סתום לאחר כ 220 שניות. בתי מקרה של, הליך ניקוי דומה לזה שתואר בשלב 5.3 יש להפעיל לסתימת הערוץ.

איור 6
Tunability 6. התקן איור: גודל חלקיקים ואפקטי מתח. אחוזים מהקלקר microspheres חולץ בLPO תלוי בגודל החלקיקים ומתח המסופק לpiezoceramic. כל שורה מתאימה למתח הפעלה שונה בתדר התהודה, נקבע כאמור בשלב 4. קצב זרימה סה"כ דרך המכשיר היא 200 μl / דקה, עם תדרי כונן שימושיים בין 1.62 ו1.64 MHz. ברים שגיאה מייצגים את סטיית התקן של לפחות שלושה ניסויים נפרדים. לשכפל ולשנות על ידי רשות של האגודה המלכותית לכימיה מhttp://pubs.rsc.org / he / תוכן / ArticleLanding / 2,014 / / c4an00034j.target = "_ blank"> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 6 מראה שנאסף תוצאות הפרדה באמצעות גדלי חלקיקי פוליסטירן שונים ומתחי piezo נהיגה הממחישים את הפרמטרים התפעוליים הנדרשים להפרדה יעילה. באופן כללי, מתח גבוה (כלומר, כוחות אקוסטית יותר) נדרשים כדי לחלץ חלקיקים קטנים יותר, כצפוי. מתחי כונן לא יכולים להיות מוגברים ללא הגבלת זמן, עם זאת, בשל פיזור חום גבוה יותר והשפעות גוברים של הזרמה אקוסטית. 13 העלילה משמשת כמדריך כללי לגדלי הפרדת חלקיקי חלקיקים המראים התאוששות שונה באופן משמעותי במתח כונן ספציפי (לדוגמא, 10 וחלקיקי 2-מיקרומטר על 8.8 V עמ ') יפרידו גם. באופן כללי, אוכלוסיות חלקיקים עם הבדל בגודל גדול, כגון וירוסים (~ 100 ננומטר) ותאים (~ 10 מיקרומטר) ניתן להפריד במהירות וביעילות, יכול כמו תאים של הבדלגדלי erent (למשל, 6-8 מיקרומטר אריתרוציטים דמוי דיסקוס ו8-15 מיקרומטר לויקוציטים). התנאים הספציפיים הנדרשים לעבוד עם סוגי תאים אחרים חייבים לקבוע באופן אמפירי, כצורת תא, צפיפות ודחיסות להשפיע הניגוד אקוסטית שלה, בנוסף לגודל תא. לשם כך, על פי ההליכים בשלב 4 הם שימושיים לקביעת תנאי הפרדה שמישה לכל סוג תא או חלקיק חדש, ולא רק להערכת האיכות של מכשיר acoustophoresis מסוים.

איור 7
איור 7. יעילות הפרדה של דוגמאות ממוסמר תא-וירוס. תוצאות הפרדה מתאי ראג'י () זינקו בנגיף קדחת הדנגי (DENV) ו- (ב) תאי ראג'י ותאי כליה בואה ממוסמר עם וירוס שער זהב (GGV). אחוזים נאספו מוגדרים כחלק מוירוסים או תאי יציאה מספציפילשקע בהשוואה לסכום הכולל יציאת השבב. הברים השגיאה ל() הם סטיית התקן של 3 ניסויים, ואילו הדגימות ב( B) עובדו רק פעם אחת בשל הכמויות נמוכות הזמינות. 1x PBS שימש כחיץ מדגם והתאוששות הנוזל, עם מים בערוץ העוקף לכל הניסויים. תדרי הפעלה שבב נע בין 1.60 ו1.64 MHz, עם מתחים בין כונן עמ '16 ו -20 V. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

כדי להדגים את התועלת של פלטפורמה זו להפרדת חלקיקים ביולוגית, השתמשנו ראשון זה לעבד דגימות מאופיינות היטב ביולוגיות: תאי ראג'י אנושיים (10 5 תאים / מיליליטר, קוטר ממוצע 8-10 מיקרומטר 25) זינק בוירוס דנגה (DENV, 10 5 מיליליטר pfu /, קוטר משוער 50 26 ננומטר). איור 7מציג את אחוז תאי ראג'י וDENV נאספו בשני SPO וLPO (המוגדר כחלק של כל אחד מסוגי החלקיקים שנאספו מכל שקע בהשוואה לסכום הכולל של כל חלקיק שנאסף מהשבב). הניסוי חזר על עצמו בשלושה עותקים, ותאי ראג'י היו לכמת באמצעות דלפק קולטר, בעוד DENV היה לכמת באמצעות תגובה הפוכה-שעתוק פולימראז כמותיים שרשרת (RT-qPCR).

בשלב הבא, הביצועים של המערכת נבדקו בתרחיש שהוא יותר מציאותי לעיבוד דגימות קליניות, שבו המאפיינים הפיזיים המדויקים של החלקיקים עשויים להיות לא ידועים, וכמויות המדגם הזמינות הן נמוכות יותר. כאן, אנו הערכנו הפרדת וירוס שער זהב לאחרונה המזוהה (GGV), תאי כליה נחש בואה הפתוגן נחש הדבקה. 27 גודל חלקיקי וירוס GGV טרם נמדדו, אבל מאז GGV שייך למשפחת Arenaviridae, זה סביר להניח שלגודל דומה, בין 100 ל 150 ננומטר. 28 אנחנו מעובד דגימות עם GGV ממוסמר (10 4 pfu / מיליליטר) לתוך תאי ראג'י אדם (לא יעד זיהום לנגיף), ותאי כליה חנק (יעד זיהום לGGV, גודל משוער 10 מיקרומטר 27), עם שני סוגי התאים ב 10 4 תאים / מיליליטר. כדוגמאות אלה היו זמינות בכמויות נמוכות, תוצאות הפרדה מרק אחד ניסיונית ריצה מדווחות בעבודה זו. איור 7 מציגה את אחוז תאי ראג'י, התאים בואה, וGGV נאסף מSPO וLPO. תאים היו לכמת בניסויים אלה על ידי סומכים על hemacytometer ווירוסים היו לכמת על ידי RT-qPCR.

Discussion

פרוטוקול זה מציג את האינטגרציה ברמת המערכת של מכשירי microfluidic לציוד macroscale לבצע עיבוד מדגם ביולוגי אוטומטי. המודולריות של פלטפורמה זו מאפשרת לה להיות מותאם לכל מכשיר זרימה רציף, ו, כדוגמא, הפרוטוקול המובא מתמקד באפיון ואופטימיזציה של הביצועים של מכשיר הפרדת חלקיקי acoustofluidic. שלושה יתרונות עיקריים של פרוטוקול זה מודגשים: מודולריות (i) ושבב לעולם ממשק, (ii) אפיון חזק של ביצועי מכשיר, וכן (iii) עיבוד אוטומטי של מדגם כרכים בדיוק מודד האויר להפרדת חלקיקים.

אני. המודולריות ושבב לעולם התממשקות

כפי שניתן לראות באיור 2, שבב microfluidic הוא רכוב על קרש חיתוך מותאם אישית כדי להתאים בקלות על במה מיקרוסקופ לתצפית ישירה. קרש החיתוך מכיל # 6-40 חורים UNF הליכי על 5 מ"מ רשת-המגרש, ENAבלינג השבב להיות מאובטח, וקשרי נוזל להתבצע. קשרי הנוזל להציץ צינורות עם קצוות במכונה, שחותם נגד שבב fluidic עם גומי איטום פנים אטם וצווארון נירוסטה. ערכת ממשק זה עושה להחלפה קלה שבב ועיצוב מחדש מכשיר מהיר, הדורשים מעט או ללא שינויים ברכיבי מערכת אחרים, עקבות שבב הניתנים להתאים לפורמט הרשת. לדוגמא, יש לנו להשתמש בפלטפורמה זו עם שבבי מייקרו-נוזליים לזרימה רציפה אלקטרופורזה, תמוגה תא תרמית, 29 ערבוב מהיר של חומרים כימיים לסינתזה כימית, ולכידת תא בודד וחקירה.

ii. אפיון חזק של ביצועי מכשיר

על מנת לייעל את הביצועים של כל מכשיר הפרדת microfluidic, הפעולה שלה חייבת להיות מאופיינת ראשונה ביסודיות. המערכת המתוארת כאן תומכת בפיתוח פרוטוקולים מהירים ואוטומטיים לעשות את זה. לexamp הספציפיle של התקנים אקוסטיים התמקדות, איכות ההתמקדות, תדירות הפעלה, ומיקום של חלקיקים התמקדו בערוץ microfluidic יש למדוד עבור כל התקן בודד. מדידות אלה דורשים גורפות באמצעות מגוון של תדרי כונן piezoceramic, מתחים וספיקות, לזהות שילובי פרמטר אופטימליים להפרדה באיכות גבוהה. הפרוטוקול שהוצג באופן אוטומטי משתנה פרמטרים מתכונן אלה ולוכד הרלוונטיים הדינאמי כלומר, תמונות ניאון של חלקיקים זורמים בערוץ ש- מעובד הודעה כדי ליצור את המדידות הנדרשות מחלקיקים המתמקדות באיכות, תדירות, ואת מיקום (איור 3).

אפיון מלא של ביצועי מכשיר אקוסטי דורש צעדים חוזרים 4.4 ו -4.5 כנדרש בתנאי ניסוי שונים. לדוגמא, עמדת ההתמקדות המוחלטת של שבב נמצאת על-ידי הפעלת סריקת התדרים בספיקות נמוכות יחסית ומתח גבוהים על מנת להבטיח הגירה מלאה למיקום הצומת. בנוסף, סריקות בתדירות כזו יכולה להעריך את איכות ההרכבה מכשיר (כאשר לרוץ עם חרוזי פוליסטירן בגודל ידוע), או כדי לקבוע כיצד סוג חלקיקים בעבר לא ידוע יתנהג במערכת (לאחר שבב התאפיין בחרוזים). שבב עם העברת אנרגיה טובה מpiezoceramic לערוץ microfluidic יגרום הדוק התמקדות בשיעורים גבוהים זרימה (> 1 מיליליטר / דקה) ומתח נמוך (12-15 עמ 'V), בעוד אלה עם העברת אנרגיה עניה לא יתמקדו גם בשיעורים נמוכים זרימה (<100 μl / min) ומתח גבוה (> עמ '20 V). מצאנו כי קשר אינטימי בין שבב מייקרו-הנוזלי וpiezoceramic הוא קריטי להעברת אנרגיה יעילה לנוזל. חקירה נוספת של השיטה האופטימלית של מליטה שבב מייקרו-הנוזלי וpiezoceramic יאפשר ייצור אמין של התקנים עתירים ביצועים.

לבסוף, מלאניתן להשיג תמונה של הפעולה של מכשיר acoustophoretic על ידי שילוב של מדידות סריקת תדרים מבוססי תמונה של שלב 4 (ואיור 3) עם ספירת חלקיקים שנאספו מSPO וLPO כפונקציות של הפרמטרים התפעוליים הרלוונטיים, מניסויי הפרדה מתבצעים עם microspheres , כפי שמתואר בשלב 5. כפי שניתן לראות באיור 6, סדרה כזו של ניסויים אוטומטיים יכולה במהירות לאפיין ביצועים של מכשיר בודד וtunability, להודיע ​​למשתמש של מרחב הפרמטרים האופטימלי להפעלת המכשיר להפרדת חלקיקים.

iii. קטן-מדגם עיבוד אוטומטי הפרדת חלקיקים

לעיבוד מדגם מוצלח ומדויק microfluidic מבוסס שבב, זה קריטי לאמין ומדויק מטר, עומס, לספק, ולאסוף את הכרכים של נוזל כשהם עוברים דרך. דיוק זה חשוב במיוחד כאשר נפח הדגימה קטן(~ 0.1-1 מיליליטר), שהוא נפוץ בהגדרות מעבדה קליניות או מחקר. 30 טיפול מדגם מדויק הוא מאתגר בניסויי microfluidic מסורתיים המעסיקים נסיגה ידנית של המדגם לתוך מזרק ועירוי לתוך מכשיר ללא משוב של כאשר המדגם הופרד וכאשר זה צריך להיות שנאסף. הפרוטוקול הציג מעסיק אוטומטי מדגם טעינת סליל וניפוק בשילוב עם משוב בזמן אמת מחיישני זרימה לאפשר הפרדות שחזור של כרכי מדגם קטנים.

איור 5 מראה את זרימת הפרופילים הנמדדים בSPO וLPO מניסוי הפרדה טיפוסי. ראשית, חיץ מוביל של לפחות 35 μl נטען על מנת להבטיח זרימה יציבה לפני המדגם מגיע השבב אקוסטית. כרכי מדגם פחות מ -100 μl אינם מומלצים לתצורת מערכת זו, בגלל דילול מדגם בשל החיץ המוביל הופך מוגזם. התוספת של האוויר משמשת בתחילת ההזרקה אלקטרוני לפני החיץ המוביל להפריד את תקע המדגם מהנוזל שלהלן, המונעים ערבוב ודילול של מדגם ומשמש כמדד לזרימת החיישנים. לאחר חולף ראשוני כנוזל מתחיל לנוע דרך מערכת, אותות עלייה חדים בשני השקעים לציין את המעבר של בועת האוויר הראשונה. ארעיים אלה ואחריו תקופה של זרימה יציבה עוד המדגם זורם דרך המערכת, ולאחר מכן עלייה חדה נוספת כאשר בועת האוויר השנייה עוברת, ולבסוף ירידה בסופו של דבר קצב זרימה לאפס לאחר הפסקת משאבת מזרק.

המעבר של תקעי האוויר דרך זרימת החיישנים משמש כנקודות הדק כדי לעבור את השסתומים כדי להתחיל ולהפסיק אוסף מדגם, ובכך לצמצם מדגם ודילול אבודים במחזורי נוזל שאינו מדגם. מדידת לולאה הסגורה של כרכי מדגם מעובד מבטלת את הצורך מחדש תכנית ערכים אלה לפני תחילת הניסוי בכל פעם מדגם הקלט משתנה. תכונה זוחשוב במיוחד כאשר נפח דגימה הוא מוגבל, למשל במקרה של דגימות קליניות רבות. זרימת ניטור בזמן אמת גם מסייע בפתרון בעיות; ריצה עלובה (לדוגמא, לסתום יוצרים באחד מהשקעים) ניכרה מייד מזרימת פרופילי תוצאה, כמו באיור 5.

כדי להדגים את הגמישות ויעילות של הפרדת acoustofluidic באמצעות ארכיטקטורת המערכת שהוצגה, DENV מטוהר ומניות וירוס GGV היו ממוסמרים למניות תא ומופרד על ידי עיבוד באמצעות שבב מייקרו-הנוזלי. 7 א איור מראה כי תאי ראג'י הופרדו היטב מפני וירוסים, כמו 97 % מתאי ראג'י יציאת השבב נמצאו בLPO, ובכך השאירו את המדגם מועשר של DENV בSPO. לשם השוואה, את היעילות של הפרדת DENV הייתה נמוכה, עם 70% מDENV יציאת השבב שנמצא בSPO. זו ניתן לייחס לערבוב הסעה קל הנגרם על ידי הסיבובים של separatiבערוץ, אבל יותר סביר שכמה חלקיקי DENV הנודדים יחד עם תאי ראג'י לLPO. תאים הנודדים רוחבי על פני מייעלים לגרור כמה נוזל איתם, אפילו במספר ריינולדס הנמוך. על ידי מנגנון זה, כמו גם משטח ספיחה ספציפי, חלקיקים נגיפיים להעביר לLPO. עם זאת, המדגם המועשר של DENV בSPO הוא יתרון משמעותי, למשל כאשר רצף דה נובו משמש כדי לאתר ולזהות וירוסים.

7b איור מראה כי באחד ניסויי ריצה, רק כ -70% מתאים בואה יציאת השבב נמצאו בLPO, לעומת כמעט 100% יעילות הפרדת תאי ראג'י. ההבדל בביצועי הפרדה בין שני סוגי התאים עשוי להיות מיוחס לגודל ממוצע קטן יותר או צפיפות נמוכה יותר של תאים בואה בהשוואה לתאי ראג'י, ולכן כתוצאה מכך כוחות אקוסטית קטנים יותר. כדי לאשר או להפריך השערות אלה, גודל, הצפיפות ומורפולוגיה של בואהתאים בתרחיף (אשר בדרך כלל לגדול חסיד) של תאים בואה יש למדוד בצורה מדויקת, מאמץ לחקירה נוספת. באותו הניסויים, בדומה לניסויים עם DENV, את חלק הארי של GGV התאושש יצא מSPO, המצביע על העשרה של חלק ויראלי.

הנתונים שהוצגו להדגיש את האתגרים הגלומים של פלטפורמות רחבה-ישימות הנדסה לעיבוד מגוון רחב של דגימות ביולוגיות. חשוב לציין, אינטראקציות הביולוגיות יכולות להתחיל לשחק כמו גדול תפקיד כהשפעות הפיזיות ומכאניות. עם זאת, הניסויים הראשוניים הללו גם להפגין את כוחו ואת ההבטחה של שימוש בארכיטקטורת מערכת זו לעיבוד מדגם ביישומים קליניים ומחקר. כהיטב מאופיין מערכת חזקה, מהונדסת, פלטפורמה זו מספקת את היכולת לחפש תשובות לשאלות מדעיות חדשות.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials required for Steps 1-3: Device Design, Fabrication and Assembly
Double Sided Polished Silicon Wafer Silicon Quest International, Inc. San Jose, CA, USA 100 mm <100>  prime wafer 1-20 ohm-cm, 495 ± 25 µm Double-side polished
Glass Wafer Bullen Ultrasonics, Eaton, OH, USA 100 mmx0.5 mm Boro
Photoresist, AZ 1518 MicroChemicals GmbH, Ulm, Germany AZ 1518 Photoresist used to adhere wafer to blank wafer for DRIE etching
Photoresist, AZ 4620 MicroChemicals GmbH, Ulm, Germany AZ 4620 Photoresist to define fluidic and via mask patterns
DRIE plasma etcher STPS, Newport, NP, United Kingdom Multiplex Advance Oxide Etch (AOE) ICP system
Wafer Bonder Electronic Visions Group,  St.Florian am Inn, Austria EVG 501
Dicing saw Kulicke & Soffa Industries, Singapore K&S 982
Epoxy kit Epoxy Technology, Billerica, MA, USA EPO-TEK 301 Epoxy used to couple piezo and microfluidic chip
PZT piezoceramic  Piezo Systems, Woburn, MA, USA PSI-5A4E 37.5 × 10 × 0.5 mm
28 AWG Kynar-insulated solid wire Squires Electronics, Cornelius, OR, USA UL1422
2-part silver epoxy  MG Chemicals, Surrey, BC, Canada 8331 Conductive adhesive for attaching wire leads to PZT
L-edit Tanner EDA, Monrovia, CA, USA Ledit v15.1 64-bit CAD software for mask layout
Materials required for Step 4: Characterizaiton of Acoustic Focusing Performance
Dual Pump Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA PHD ULTRA Series, 703007
5 ml syringes Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA 309646
Luer to Threaded port adapter IDEX, Oak Harbor, WA, USA P-659 Connects syringe to tubing
Union IDEX, Oak Harbor, WA, USA P-623 Connects world to chip connections to fluoropolymer tubing.  Can also use webbed 
Ferrule 1/4-28 flat bottom IDEX, Oak Harbor, WA, USA P-200 Used with nut to make connections between tubing and syringe, flow sensors and world to chip hardware
Nut  1/4-28 flat bottom IDEX, Oak Harbor, WA, USA P-202 Used with ferrule to make connections between tubing and syringe, flow sesnsors and world to chip hardware
1/16" OD Fluoropolymer tubing IDEX, Oak Harbor, WA, USA 1912L Tubing to connect syringe pumps to world to chip connections.  Tubing size is not critical during claibration steps (.01-.03" ID typically used, other suitable part numbers: 1907L, 1902L).
Small ID fluoropolymer tubing IDEX, Oak Harbor, WA, USA 1476-20 Used for Flow restrictors: 0.006" ID, 1/16" OD FEP 
PEEK tubing Connects from chip to fluoropolymer tubing.
Cooling fan Multicomp, Leeds, England MC19663
Function Generator Agilent, Santa Clara, CA, USA 33220A
RF amplifier ENI, Rochester, NY 325 LA Must be able to amplify signals from <1 V in the range of 1-2 MHz to 25 Vpp to the piezo.
CCD Camera Photometrics, Tucscon, AZ, USA CoolSnap HQ
Inverted Microscope Zeiss, Oberkochen, Germany Axiovert S100
FITC filter set Chroma Tech, VT, USA SP101
Objective, 10X Zeiss, Oberkochen, Germany ACHROPLAN
Oscilloscope Tektronix, Beaverton, OR, USA TDS3014B To monitor voltage output by RF amplifier
MatLab Mathworks, Natick, MA, USA R2014a
Driver interface software to integrate Photometrics camera with LabVIEW R Cubed Software, Lawrenceville, NJ, USA SITK
Tween 20 Sigma Aldrich, St. Lousi, MO, USA P9416
Dragon Green Fluorescent 5.76 or 7.32 µm Beads Bangs Laboratory, IN, USA FS06F
Additional materials required for Step 5: Automated Separation
Multiport valves VICI, Houston, TX, USA C25Z-3180EUHA In the current configuration 4 valves are needed
Flow Sensors Sensirion, Westlake Village, CA, USA SLI-1000
Fluoropolymer tubing, .01 and .03" ID IDEX, Oak Harbor, WA, USA 1902L and 1912L High purity PFA preferred
Nut VICI, Houston, TX, USA ZN1PK-10 Used with ferrule to make connections between tubing and valves. Alternative part numbers: MZN1PK-10, LZN1PK-10
Ferrule VICI, Houston, TX, USA ZGF1PK-10 Used with nut to make connections between tubing and valves.  
LabVIEW National Instruments, Austin, TX, USA LabVIEW Professional Development system Laboratory Automation Software
PBS Teknova, Hollister, CA, USA P0200
Raji Cells ATTC, Manassas, VA, USA CCL86
Boa Cells Kindly provided by the DeRisi Laboratory at UCSF
GGV Kindly provided by the DeRisi Laboratory at UCSF
DENV Kindly provided by Jose Pena at LLNL
Coulter Counter Z2 Beckman Coulter, Brea, CA, USA Z2
Hemacytometer Fisher Scientific, Waltman, MA, USA 0267151B

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gossett, D. R., Weaver, W. M., et al. Label free cell separation and sorting in microfluidic systems. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397, (8), 3249-3267 (2010).
  2. Lenshof, A., Laurell, T. Continuous separation of cells and particles in microfluidic systems. Chemical Society Reviews. 39, (3), 1203-1217 (2010).
  3. Sajeesh, P., Sen, A. K. Particle separation and sorting in microfluidic devices a review. Microfluidics and Nanofluidics. 17, (1), 1-52 (2014).
  4. Bhagat, A. A. S., Bow, H., Hou, H. W., Tan, S. J., Han, J., Lim, C. T. Microfluidics for cell separation. Medical & Biological Engineering & Computing. 48, (10), 999-1014 (2010).
  5. McGrath, J., Jimenez, M., Bridle, H. Deterministic lateral displacement for particle separation a review. Lab Chip. 14, (21), 4139-4158 (2014).
  6. Jubery, T. Z., Srivastava, S. K., Dutta, P. Dielectrophoretic separation of bioparticles in microdevices A review. ELECTROPHORESIS. 35, (5), 691-713 (2014).
  7. Jin, C., McFaul, S. M., et al. Technologies for label free separation of circulating tumor cells from historical foundations to recent developments. Lab on a Chip. 14, (1), 32 (2014).
  8. Trujillo, F. J., Juliano, P., Barbosa Cánovas, G., Knoerzer, K. Separation of suspensions and emulsions via ultrasonic standing waves – A review. Ultrasonics Sonochemistry. 21, (6), 2151-2164 (2014).
  9. Bridle, H., Miller, B., Desmulliez, M. P. Y. Application of microfluidics in waterborne pathogen monitoring A review. Water Research. 55, 256-271 (2014).
  10. Mariella Jr, R. Sample preparation the weak link in microfluidics-based biodetection. Biomedical microdevices. 10, (6), 777-784 (2008).
  11. Gor’kov, L. P. On the forces acting on a small particle in an acoustic field in an ideal fluid. Soviet Physics Doklady. 6, 773-775 (1962).
  12. Settnes, M., Bruus, H. Forces acting on a small particle in an acoustical field in a viscous fluid. Physical Review E. 85, (1), 016327 (2012).
  13. Barnkob, R., Augustsson, P., Laurell, T., Bruus, H. Acoustic radiation and streaming-induced microparticle velocities determined by microparticle image velocimetry in an ultrasound symmetry plane. Physical Review E. 86, (5), (2012).
  14. Bruus, H. Acoustofluidics 7 The acoustic radiation force on small particles. Lab Chip. 12, (6), 1014-1021 (2012).
  15. Fong, E. J., Johnston, A. C., et al. Acoustic focusing with engineered node locations for high performance microfluidic particle separation. Analyst. 139, (5), 1192-1200 (2014).
  16. Fong, E. J., Bora, M., et al. Continuously Variable Node Position in a High Throughput Acoustofluidic Device. Micro Total Analysis Systems. 1184-1186 (2014).
  17. Jung, S. Y., Notton, T., Fong, E., Shusteff, M., Weinberger, L. S. Spatial tuning of acoustofluidic pressure nodes by altering net sonic velocity enables high-throughput efficient cell sorting. Lab on a Chip. 15, (4), 1000-1003 (2015).
  18. Franssila, S. Deep Reactive Ion Etching. Introduction to Microfabrication. 255-270 (2010).
  19. Sharma Rao, B., Hashim, U. Microfluidic Photomask Design Using CAD Software for Application in Lab On Chip Biomedical Nanodiagnostics. Advanced Materials Research. 795, 388-392 (2013).
  20. Melin, J., Quake, S. R. Microfluidic Large Scale Integration The Evolution of Design Rules for Biological Automation. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 36, (1), 213-231 (2007).
  21. Madou, M. J. Fundamentals of microfabrication: the science of miniaturization. CRC Press. Boca Raton. (2002).
  22. Krulevitch, P., Benett, W., Hamilton, J., Maghribi, M., Rose, K. Polymer based packaging platform for hybrid microfluidic systems. Biomedical Microdevices. 4, (4), 301-308 (2002).
  23. Leslie, D. C., Easley, C. J., et al. Frequency specific flow control in microfluidic circuits with passive elastomeric features. Nature Physics. 5, (3), 231-235 (2009).
  24. Oh, K. W., Lee, K., Ahn, B., Furlani, E. P. Design of pressure driven microfluidic networks using electric circuit analogy. Lab on a Chip. 12, (3), 515-545 (2012).
  25. Mittelbrunn, M., Gutiérrez Vázquez, C., et al. Unidirectional transfer of microRNA loaded exosomes from T cells to antigen presenting cells. Nature Communications. 2, 282 (2011).
  26. Acosta, E. G., Castilla, V., Damonte, E. B. Functional entry of dengue virus into Aedes albopictus mosquito cells is dependent on clathrin mediated endocytosis. Journal of General Virology. 89, (2), 474-484 (2008).
  27. Stenglein, M. D., Sanders, C., et al. Identification Characterization and In Vitro Culture of Highly Divergent Arenaviruses from Boa Constrictors and Annulated Tree Boas Candidate Etiological Agents for Snake Inclusion Body Disease. 3, (4), e00180 12 (2012).
  28. Arenaviridae Viral Hemorrhagic Fevers (VHFs). CDC. Available from: http://www.cdc.gov/vhf/virus-families/arenaviridae.html (2013).
  29. Packard, M., Wheeler, E., Alocilja, E., Shusteff, M. Performance Evaluation of Fast Microfluidic Thermal Lysis of Bacteria for Diagnostic Sample Preparation. Diagnostics. 3, (1), 105-116 (2013).
  30. Lion, N., Reymond, F., Girault, H. H., Rossier, J. S. Why the move to microfluidics for protein analysis. Current Opinion in Biotechnology. 15, (1), 31-37 (2004).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats