En mikroflödessystem plattformen för Precision små volymer Sample Processing och dess användning till storlek Separata biologiska partiklar med en akustisk mikroanordning

1Materials Engineering Division, Lawrence Livermore National Laboratory, 2Department of Biomedical Engineering, Boston University
Published 11/23/2015
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Bioengineering
 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Fong, E. J., Huang, C., Hamilton, J., Benett, W. J., Bora, M., Burklund, A., et al. A Microfluidic Platform for Precision Small-volume Sample Processing and Its Use to Size Separate Biological Particles with an Acoustic Microdevice. J. Vis. Exp. (105), e53051, doi:10.3791/53051 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

En stor fördel med mikrofluidikanordningar är förmågan att manipulera små prowolymer, vilket minskar reagensavfall och bevara värdefulla prov. Emellertid är det nödvändigt att ta itu med anordning integration med makroskala miljö för att uppnå robusta provmanipulering. För att förverkliga repeterbar, känslig partikelavskiljning med mikrofluidikanordningar, presenterar detta protokoll en komplett automatiserad och integrerad mikroflödes plattform som möjliggör exakt bearbetning av 0.15-1.5 ml prover med mikrofluidikanordningar. Viktiga aspekter av detta system inkluderar modulär enhet layout och robusta fixturer resulterar i pålitlig och flexibel värld att chip anslutningar, och helt automatiserad hantering vätska som åstadkommer sluten slinga provtagning, systemrengöring och priming åtgärder för att säkerställa repeterbar drift. Olika mikrofluidikanordningar kan användas omväxlande med denna arkitektur. Här införliva vi en acoustofluidic enhet, detalj sin characterization, prestandaoptimering och visa dess användning för storleks separation av biologiska prover. Genom att använda återkoppling i realtid under separationsexperiment, är provsamling optimerad för att bevara och koncentrera provet. Trots krav på integration av flera delar av utrustning, fördelarna med denna arkitektur är förmågan att bearbeta okända prover utan extra systemoptimering, enkel anordning ersättning, och exakt, robust prov behandling.

Introduction

Prov separation och fraktionering är en av de mest lovande områdena användningsområden för mikroflödesteknik. Sådana provhanteringssteg är integrerade för effektiva klinisk diagnostik, terapi utveckling biosurveillance ansträngningar och framsteg inom biovetenskaplig forskning och teknik. En myriad mikroflödesstrategier separations har visats för vätske svävande partiklar och kolloider, samt för kemiska och biologiska arter; flera recensioner ger översikter över den senaste tidens framsteg och utvecklingen i dessa områden 1 - 9. Även om många av dessa mikroflödesteknik separations (nedan kallade "kärn Devices") har i stor utsträckning kännetecknas, har några rapporter ansåg provseparationsproblem på systemnivå. Kärn enheter är typiskt individuella centimeter skala chips, gränssnitt till fluorpolymerrör, med vätska levereras av en förskjutning eller tryckpump.Men om löftet om mikrofluidik - inklusive ökad automatisering, tillförlitlighet och minskning av provvolymer - är att bli verklighet, åtminstone en motsvarande ansträngningar måste ägnas åt att utformningen av en fullständig separation system i vilket Core Device är integrerad .

Dessutom är en stor utmaning för mikroflödes metoder för biodetection makro till mikro gränssnitt. Detta gäller inte bara de fysiska "världen mot chip" anslutningar en mikrofluidikanordning till makroskala komponenter, och obalansen mellan typiska kliniska eller analysprovvolymer (~ 0,1-10 ml) och den inre volymen av mikroflödessystem marker (~ 0.01-10 il), men också de begränsningar statistiska stickprovs till följd av att överbrygga dessa storleksskalor. Dessa frågor bidrar till uppfattningen att provet före bearbetning och beredning är "svaga länken" av biodetection. 10 Plattformen som beskrivs i detta arbete taKES viktiga steg mot att ta itu med dessa utmaningar.

Ta en systemnivå anser detta protokoll detaljer tillförlitlig behandling av just-doserade analytisk skala volymer (som sträcker sig från 0,15 till 1,5 ml) på ~ 10 min tidsramar. Detta är en "one-knappen" operation: när källan flaskan som innehåller provet och destinationsflaskor för fraktionsuppsamling placeras i systemet, "run" kommando initierar förfarandet, och alla steg är datorstyrda. Vid slutet av en körning, kan flaskorna insamlings avlägsnas från systemet för nedströms analys av de separerade fraktionerna.

Core Device i detta system är en akustofores chip som utvinner däggdjurscellstorlek (5-20 pm) partiklar från provet. Acoustophoretic separation Här väljs främst eftersom det är hög genomströmning (upp till 100-tals il / min), etikett-fri och icke-kontakt, vilket ger fördelar vid separation livskraftig viruSES från celler som få andra mikroflödesteknik kan matcha. Fysik akustisk partikel fokusering har utförligt beskrivits, 11-13 och är inte i fokus för detta protokoll, men en kort sammanfattning av de underliggande begreppen följer att underlätta förståelsen av ansökan till mikroflödes separation.

Ultraljud stående vågor får gehör i vätskefyllda mikro producerar tryckfält, vilket ger upphov till krafter som driver partiklar mot noder med lågt tryck. Kraften storlek beror på partikelns volym, och på en akustisk kontrast faktor som härrör från de relativa densiteter och kompressibiliteter av partikeln och suspensionsvätskan. 14 Som sådan akustisk fokus är idealiskt för separation av cellstorlek (~ 7-15 um) från virusstora (~ 50-200 nm) partiklar. De större partiklarna migrera mot en tryck nod; emellertid eftersom kraften magnitud är mycket liten förpartiklar mindre än 2-3 | im, dessa små partiklar eller lösta species knappast flytta alls. Vår specifikt genomförande av akustisk avskiljning, som tidigare beskrivits, 15 innehåller en tunn vägg för att underindela fluidkanalen och tillåter avstämbar, asymmetrisk placering av fokuseringspositionen. Detta ger flexibilitet i enheten design och prestandafördelarna-inklusive ökad kvalitet och separation hastighets beskrivs helt annat håll. 16,17

Men det är en stor fördel med systemnivå design strategi som beskrivs i detta arbete att det kan anpassas till en stor variation av mikroflödeskärn Devices. Till exempel kan de flesta andra kontinuerligt flöde separationslägen, inklusive tröghets, flödesfältfraktionering, deterministisk sidoförskjutning (DLD), och olika typer av elektrokinetiska enheter lätt införlivas, med lämpliga justeringar för att ta hänsyn till förändringar i inlopp / utlopp konfiguration , flödeshastigheter,och provvolymer. Enheter med olika typer av on-chip fält (elektriska, magnetiska) eller gradienter (termiska, kemiska) kan kräva ytterligare anslutningar till chip, eller integration av ytterligare hårdvara, som denna plattform rymmer.

Detta protokoll ger de åtgärder som krävs för att utforma en mikroflödesseparationsanordning, och att tillverka kiselglaschips med djup reaktiv jonetsning (DRIE, en plasma-etsningsprocessen finns i många mikrotillverkningsanläggningar, som använder alternerande cykler av etsning och passivering för att uppnå djup funktioner med vertikala sidoväggar 18). Härnäst beskriver vi karakterisering av acoustofluidic enheten för att bestämma de optimala driftsparametrar för separering, och slutligen detalj fullt integrerat system separation och förfarandet för bearbetning av biologiska prover. Typiska enhet karakterisering resultat och bearbetning av data prov Därefter presenteras och diskuteras, och de viktigaste fördelarna med denna förekommandeach markeras, inklusive modularitet, robusthet, precision och automation.

Protocol

1. Acoustophoretic Device Design och fotomask Layout

OBS: Allmänna överväganden och riktlinjer för mikroprocessdesign och mask layout kan hittas i texter om mikro och handledning av fotomasker designen 19-21.

  1. Lägg ut Mask 1, fluidic Layer (framsida), med hjälp av lämplig CAD-program. Välj en geometri som tillåter provinjektion och separation är lämpligt för den önskade applikationen.
    1. För akustisk fokus, ställa fluidic kanalbredd w för att ge en resonansfrekvens f n större än 1 MHz enligt ekvationen fn = nc / 2w, där c är ljudhastigheten i den aktuella fluiden och n är antalet stående-våg-noder (t.ex., för en 900 ^ m bred kanal, två- nod resonans väntas vid f 2 = 1,65 MHz).
      OBS: Partikels upptar distinkta sido platser nära slutet av separationskanalen bör lämna tydliga butiker. I detta protokoll är partiklar separeras genom storlek, så utloppen är betecknade SPO LPO, för små partiklar och stora partiklar utlopp, såsom visas i fig 1.
    2. Ställ in fluidkanallängden för att styra den tid under vilken partiklarna utsätts för separationsfält vid en specifik flödeshastighet. Längre on-chip uppehållstid för partiklarna att migrera på grund av separationskrafter måste handlas utanför mot större krävs chip fotavtryck.
      OBS: I våra akustiska fokuseringsanordningar, gör strömningskanalen tre passager ner chipet för ökad uppehållstid (figur 2a). Vid en typisk total flödeshastighet av 200 ul / min, partiklar som strömmar genom 300 x 200 ^ m tvärsnitt, 117-mm lång separationskanal bringar i genomsnitt 2,1 sekunder i det akustiska fältet.
  2. Inkludera fluidic hamnar i masken Layout för anslutningar till standardslang anordnade på ett standardiserat galler (5-mm delning). Inkludera lämpliga referenspunkter för anpassning av masker till varandra under tillverkning och tärning för enskilda enheter.
  3. Lägg ut Mask 2, Via Layer (baksida), som endast omfattar fluidic portarna. Inkludera referenspunkter för anpassning till Mask 1.

Figur 1
Figur 1. Acoustofluidic enhet. Schematisk skisser av acoustophoretic enhet arkitektur. (A) Uppifrån, som visar hela konfigurationen H-filter (ej i skala). (B) Schematisk bild av kanaltvärsnittet på den plats markeras med svarta streckade linjen i (a), som visar tryckfältet (blå prickade linjer), och känslan av de akustiska primära strålningsstyrkor (PRF) som driver partiklarna mot nodplan (röda pilar). Tvärsnittet kanalär 900 x 200 ^ m med en vägg ungefär 10 ^ m tjockt separerande huvud (300 | j, m bred) och förbiledningskanaler. (C) 3D representation av partikelavskiljning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

2. Renrums Tillverkning av Mikroflödes Chips för akustofores

  1. Mönster back-side vätskeportar använder Mask 2 på en dubbelsidigt polerade 0,5 mm tjock, 100 mm diameter <100> kiselwafer med standard positiv motstå fotolitografi. Etsa denna geometri genom djupreaktiv jonetsning (DRIE) till ett djup av 350 till 400 ^ m.
  2. Vänd skivan över, och mönstret framsidan vätskekanal geometri med hjälp av Mask 1 med standard positiv motstå fotolitografi på den andra sidan av kisel. Sedan montera enheten skivan till en andra (tom kisel) bärare skiva med hjälp av fotoresist.
  3. Etsa kanalerna, även av DRIE, till ett djup av 200 ^ m, genom-etsning av kisel på de platser portarna (bäraren wafern skyddar DRIE verktygsytan). De-montera enheten skivan från ämnet Si wafer genom blötläggning i motstå-stripplösning.
  4. Rengöra enheten skivan och en odefinierbar 0,5 mm tjockt borosilikatglas skiva med användning Piranha-lösning (svavelsyra och väteperoxid i en 3: 1-förhållande).
  5. Täta fluidumkanaler genom anodiskt binda glas och kiselskivor med hjälp av följande parametrar: kammartryck på 3 mTorr, kolvtrycket vid 1000 N, temperatur vid 350 ° C, och tillämpa 750 V tills strömmen understiger 0,2 mA.
  6. Skär de enskilda marker isär med diamantklinga på en tärnings såg.

3. Slutligt Device Assembly

  1. Piezo Givar Attachment
    OBS: Ultraljud alstras i mikroflödessystem chip med en piezokeramisk givare fäst kiselsidan.
    1. Från vidwo-komponent med låg viskositet epoxi kit, väg upp den rekommenderade förhållandet mellan de båda komponenterna och blanda dem noggrant.
    2. Dispensera epoxi blandningen med en pipett och spreds jämnt över en blyzirkonattitanat (PZT) piezokeramisk att skapa ett tunt, jämnt lager (approximativt 10 | il epoxiblandning för en piezo med dimensionerna 37,5 x 10 x 0,5 mm).
    3. Med hjälp av en lämplig jigg eller fixtur, rikta in epoxy sidan av piezokeramiska med mikroflödes chip, vilket ger ett överhängande område på ena sidan för efterföljande vajerfästet (se figur 2a), och föra de två komponenterna i kontakt med. Spänn fast montering i ett skruvstäd, noga med att inte knäcka någon av komponenterna, och härdar vid temperaturen och varaktigheten som rekommenderas av epoxi tillverkaren.
    4. Efter det att epoxin har härdat, bifoga fint gauge tråd leder till varje sida av den piezokeramiska, genom lödning med en fin spets lödkolv, vilket gör den kortaste möjliga kontakten med piezo att undvika thermally de-polariserande den. Alternativt kan du använda en ledande lim för att limma kablar till piezo.

Figur 2
Figur 2. Fluidic bakbord, Chip Montering och World-to-Chip gränssnitt. Foton av (a) den akustiska mikroflödes chip (yttermått 70 × 9 × 1 mm) med tillhörande piezo givartrådändar, visar tre passager av separationen kanal ner chipet, (b) anpassad fluidic skruvbeslag och maskinbearbetade rördelar för chip-till-världen gränssnitt, (c) chip-monterade på undersidan av den fluidkopplingsdäcket med hjälp av kläm fixturer, som spänner över en öppning i kopplingsdäcket för att tillåta fläktkylning, (d) en vy av bakbord med bifogade slanganslutningar och kylfläkten, och (e) ett tvärsnitt schematisk bild av skruvbeslag som gränssnittet tubing med monterad mikroflödessystem chip. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

  1. Monterings och World-To-Chip Gränssnitt
    1. Fäst chip till "fluidic bakbord" (en platta med ett rutnät av regelbundet åtskilda gängade genomgående hål) med hjälp av kläm fixturer. Bifoga en kylfläkt till bakbord att reglera temperaturen under akustiska experiment (se figur 2).
      OBS: Drift utan kylfläkten vid typiska drivspänningar höjer enheten temperaturen till 70-80 ° C. Detta skiftar avsevärt resonansfrekvensen på grund av förändrad ljudhastigheten i vätskan, och kan negativt påverka lönsamheten för varje biologiska partiklar som är under bearbetning.
    2. Skruva i chip-to-world-kontakter, som tidigare beskrivits på annat ställe 22 och visas i Figur 2. Gå dessa interface rör till ytterligare slang vid in- och utlopp med vanlig ¼ "-28 fackföreningar för 1/16" slang.

4. Karakterisering av Acoustic Fokusera Performance

OBS: System komponenter som krävs för akustisk fokus karakterisering grupperas tillsammans i materiallistan. Steg 4.1 och 4.2 nedan gäller för alla Core Device användas med denna plattform, medan efterföljande steg beskriver verksamheten som är specifika för acoustofluidic enheten diskuteras här.

  1. Systemkonfiguration
    1. Montera mikroflödes chip med hjälp av världen till-chip anslutningar på fluidic bakbord, som beskrivs i avsnitt 3. Gör anslutningar med hjälp av slangar (t.ex. 1/16 "ytterdiameter fluorpolymerrör) en vätskepump och insamling flaskor. Montera bakbord enheten på scenen av ett mikroskop som kan fluorescens avbildning utrustad med en CCD-kamera.
    2. Anslut längder av liten inner diameter (ID) slang (0,006 "rekommenderas) omedelbart efter chipet (se figur 4) för att tjäna som flödesbegränsare, som stabiliserar systemet och styr flödesdelning mellan utlopp chip. Använd större ID rör, såsom 0,01 "eller 0,03", för alla andra anslutningar.
      1. Uppskatta det hydrodynamiska strömningsmotstånd R h för varje slang med längden L och diametern D inre med hjälp av ekvationen R h = 128 mikroliter / πD 4, där μ är den vätska dynamiska viskositet. Tryckfallet Δ P på grund av varje slanglängd vid en given flödeshastighet Q är given av Δ P = QR h.
      2. Välj ett förhållande av begränsningslängder att dela flödet mellan utloppen på lämpligt sätt för separationsmetoden som används. Optimal separation med de akustiska marker i detta protokoll kräver en SPO: LPO flödesförhållande av approximately 65: 35%.
      3. Välj längden på utlopps flödesbegränsarna så att deras fluidmotståndet är minst 3-4 gånger större än det totala motståndet i resten av systemet (på lämpligt sätt summeras i serie eller parallellt). För akustofores anordning som används i detta arbete, slanglängder på 35 och 65 cm för LPO och SPO är lämpliga.
        OBS: Noggrann hänsyn måste tas till Rh någon mikroflödeskärnanordningen. För vår akustiska fokus chip i detta arbete, är Rh låg på grund av dess relativt stora kanaldimensioner, så de anslutna slangmotstånd lätt överstiga det. För enheter med mindre kanaldimensioner, kan chipet motstånd dominerar resten av systemet rör, i vilket fall utformning och styrning av on-chip kanal R h är ett ytterligare övervägande under Steg 1 av detta protokoll. Detaljerade konstruktionsprinciper och riktlinjer finns tillgängliga i litteraturen. 23,24
  2. System Verification
    1. Kontrollera efter läckor för att verifiera att mikroflödessystem enheten har inga defekter och alla slanganslutningar är förseglade. Fördela vatten genom inloppsrören som behövs med en spruta och övervaka varje fluid läckage i huvudkanalen.
    2. Dispensera en känd volym genom chipet, och mäta volymerna uppsamlade från utloppen för att säkerställa att flödesförhållandet är såsom förväntat. Avvikelser från den förväntade volymförhållandet kan tyda på blockeringar i en av butikerna eller läckande anslutningar.
      1. För att upprätthålla systemet renlighet och förhindra igensättning spola hela systemet (fluidic slang och chip) med lämpliga rengöringsmedel (t ex blekmedel, etanol, vatten) före och efter att ha kört några experiment.
      2. I händelse av träskor eller blockeringar i en av butikerna, spola systemet samtidigt ansluter klara utlopp för att rensa blockeringen. Om detta inte lyckas, vända flödesriktningen under spolning,eventuellt tillämpa snabba pulser av omvänt flöde (med en manuellt manövrerad spruta). Slutligen, om blockeringen fortfarande inte kan tas bort, byt ut slang eller chip, efter behov.
  3. Frekvens Scan Setup för akustiska fokus
    1. Fyll bypasskanalen (se figur 1) med vätska, såsom avjoniserat vatten, etanol, eller fosfatbuffrad saltlösning (PBS) genom manuell injektion med en spruta. Observera att denna vätska inte kommer i kontakt med provet som bearbetas. Detaljerna att justera nod position med hjälp av olika bypass vätskor beskrivs på annat håll 16,17. I korthet, om noden måste vara närmare skiljeväggen, använd en lägre densitet bypass vätska, såsom etanol; för noden placering närmare till ingången sampelström, välj en tätare fluid, såsom en glycerollösning.
    2. Gör en vulst lösning av approximativt 0,01% (vikt / volym) 5-8 ^ m fluorescerande polymerpärlor suspenderade i en buffert, såsom PBS med0,05% Tween-20 och fyll provinlopps sprutan med vulsten lösningen. Fyll sprutan buffert inlopp med samma buffert (detta behöver inte vara samma vätska som i bypasskanalen). Notera att i allmänhet, är bufferten väljs för att passa tillämpningen (se steg 5,1).
    3. Med fluidkopplingsdäcket på mikroskop scenen, fokus ungefär halvvägs in i djupet av kanalen vid en rak kanalområde strax före utloppet med båda kanalerna (separations- och bypass) i synfältet. En extra sned vinkel extern ljuskälla kan krävas för att göra kanalväggarna synliga, för framgångsrik efterbehandling av bilddata.
  4. Automatiserad Frekvens Scan och Bildinsamling
    1. Gör elektriska anslutningar med skärmade kablar (t.ex. RG-58 försedda med BNC-kontakter) till en funktionsgenerator med radiofrekvens (RF) förstärkare för att leverera excitationssignalen till piezo givaren. Eventuellt ansluter ett oscilloskop tillutsignalen från funktionsgeneratorn för att övervaka den faktiska spänningen som matas till omvandlaren.
    2. Slå på kylfläkten, och ställa in funktionsgeneratorn så att utsignalen från RF-förstärkaren till piezo givaren är i området av från 12 till 25 volt topp-till-topp (V pp).
    3. Ställ båda sprutorna till samma flödeshastighet mellan 50 och 200 | j, l / min. Med användning av en enda sprutpump för att driva båda sprutorna med samma motor rekommenderas för att minimera störningar i flödet.
    4. Utför en frekvens scan förfarande genom att ange start- och slutfrekvenserna, stegstorlek mellan frekvensvärden, och piezo drivspänningen med hjälp av en laboratorieautomation verktygslåda som National Instruments LabVIEW.
    5. På varje frekvensnivå, applicera spänningen i 15 sekunder för att låta systemet jämvikt, sedan ta 10 bilder av pärlor som strömmar genom chip för efterföljande analys (exponeringstider mellan 10 och 100 ms rekommenderas).
    6. Mellan each tillämpade frekvenssteg, stänga av spänningen för cirka 20 sekunder för att låta kulorna omfördela jämnt över kanalen och ta partiskhet i fokus från tidigare tillämpade frekvenssteg.
  5. Bildanalys att bestämma resonansfrekvensen och fokusering Position
    1. Kör en bildanalys skript (såsom AF_freqScanPlotter.m MATLAB manus försedd med detta protokoll) och ange den information som krävs på uppmaningarna: välja en lista över bildfiler som genereras i steg 4,4, anger skannings start och stopp frekvenser och stegstorleken, hela kanalbredd, vägg plats, och slutligen välja den bildområdet för att analysera, både separation och förbiledningskanaler.
    2. Observera analys script genomsnittet uppsättningen av bilder som tagits vid varje frekvenssteg, och i genomsnitt intensitetsvärdena längs flödesriktningen. Detta resulterar i ett tvärsnitt linjescann av fluorescensintensitet.
      OBS: frekvens som motsvarar highe st Intensiteten definieras som resonansfrekvensen (Figur 3, mellersta raden), och läget i kanalen där den högsta intensitet sker är fokuseringsläge (Figur 3, nedersta raden).

Figur 3
Figur 3. Representant Frekvens Scan. Exempel på frekvensscanningsdata för väl kopplad (A) och dåligt kopplade (B) piezo och chip. Övre raden: fluorescensintensitet av pärlor (rött står för hög, och blått representerar låg intensitet). Mellersta raden: maximal intensitet vid varje frekvens. Nedre raden: lokalisering av maximal intensitet, där den röda streckade linjen anger förutspått fokuseringsläge, och röda diamanter indikerar resonansfrekvens som bestäms av den maximala intensitet.g "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

5. Automatiserad Separation

OBS: Den automatiserade separations experiment körs för att separera stora partiklar från små partiklar på grund av storleksberoende akustiska fokus krafter som tillämpas i mikroflödessystem chip. De nödvändiga systemkomponenter är grupperade tillsammans i Materials List.

  1. Systemkonfiguration och Provberedning
    1. Anslut mikroflödes chip till sprutpumpen, datorstyrda flervägsventiler val, PC-gränssnitt flödesmätare, och slangar, som visas i Figur 4. Denna konfiguration möjliggör automatisk behandling av prover genom mikroflödesseparations chip, samt automatiserad rengöringssteg mellan experiment för att ta bort korskontaminering och prov carry-over.
    2. Använd en provbuffert som lämpar sig för cellerna eller partiklarna som skall separeras, eller som krävs av analysanalys för attanvändas efter separation. Som i steg 4.3.2, måste återställnings buffert (men inte nödvändigtvis bypass vätska) matchar provvätskan.
      NOTERA: Alla vattenhaltiga buffertar som typiskt används med biologiska prover (t.ex. PBS) ha akustiska egenskaper som liknar vatten och kommer inte att avsevärt inverka på prestanda hos den akustiska anordningen. Användningen av provvätskor med densitet och viskositet avsevärt skiljer sig från vatten är möjligt, men rekommenderas endast för operatörer med betydande akustofores erfarenhet.


Figur 4
Figur 4. Acoustic Systemkonfiguration för automatiserade separations Experiment. De blå linjerna spåra huvudflödesvägen genom systemet. Alla gröna och svarta linjer är 0,03 "inre diameter (ID) slang och alla blå och grå färgade linjer är 0,01" ID slang, med exception av håll spolar, som är 0,03 "ID, och flödesbegränsarna, som är 0,006" ID. Sprutorna är fyllda med buffert, och hållpolarna har tillräcklig volym (550 pl) för att förhindra upptag av några provexemplar eller rengöringsreagens i sprutorna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

  1. Separationsförfarande
    1. Förlöpstiden tillstånd. Innan du kör separationen, se till att rengöringsreagensbehållare (blekmedel, etanol, buffert) har tillräckligt med vätska, avfallsreservoarerna inte fullt ut, och vätske linjer primas (dvs, fylld med lösning). Om det sistnämnda villkoret är osäker, eller om systemet körs för första gången efter tomgång (t.ex. den första gången på en viss dag), köra en automatisk rengöring förfarande (se steg 5.3 nedan). Ställ Ventilerna 3 och 4 vid chip butiker att strömma till spillo reservoirs början.
    2. Slå på kylfläkten, och ställ in funktionsgeneratorn vid resonansfrekvensen för den akustiska chip som används, som bestämts i steg 4,5. Justera spänningen börvärdet på funktionsgeneratorn så att RF förstärkarutgångarna mellan 12 och 25 V pp, som är lämpligt för den önskade separationen.
    3. Anslut prov Input Vial, buffert Input Vial, och lämpliga flaskor insamling till systemet. Strax innan monteringen Sample Input Vial till sin pickup slangar, virvel flaskan kort att åter suspendera alla partiklar som kan ha avvecklats. Sedan fäster flaskan och initiera separations rutin utan dröjsmål.
      VARNING: Om provet som skall behandlas innehåller potentiellt smittämnen, bör flaskorna vara ett skruvlock typ, för att upprätthålla ett slutet system och förhindrar prov aerosolbildning. Dessutom, när man arbetar med biologiskt material, hantera alla flaskor och slangar samtidigt bär nödvändig skyddsutrustning och använda required risk kontroller och förfaranden för biologisk Risk Group och biosäkerhetsnivå tillägna till materialet. Rådgör institutionella politik och protokoll i händelse av osäkerhet.
    4. Använd ett program i ett laboratorium automation verktygslåda för att styra ventilerna, flödessensorer och pump för att utföra helautomatiska separations rutin.
      OBS: Rutinen växlar ventilerna, påverkar sprutpump tillbakadragande och infusion och övervakar flöde sensordata för korrekt timing insamling av utgångsprovfraktioner. De viktigaste stegen sammanfattas nedan i 5.2.4.1 till 5.2.4.3, som om de utförs manuellt.
      1. Prime pickup slangen. Dra cirka 15 pl från prov Input Vial att helt fylla röret som sammanbinder den till Valve 1. Samtidigt prime röret som sammanbinder buffert Input Vial till ventilen 2. På ett liknande sätt, prima luftintag Valve 1 för att säkerställa att det inte innehåller någon vätska. Slutligen, byta ventiler 1 och 2 för att utvisa att slösaöverflödig vätska eller luft som har kommit in i belastningsspole.
      2. Ladda provpolen, såsom visas i figur 5a. En typisk laddningssekvens för behandling av en 250-ul prov är att dra tillbaka 25 | il luft vid 50 | j, l / min, varefter 250 | il av provet på 200 | j, l / min, följt av 35 | il av ledande buffert vid 200 ul / min, och slutligen en annan 25 ul av luft vid 50 | j, l / min.
        OBS: Samtliga volymer och flödeshastigheter är valbar. Observera att denna laddningssekvensen är i omvänd ordning av hur fluidpluggar kommer att strömma genom separationsanordningen.
      3. Begin provinfusion. Ställ in sprutpumpar för att ingjuta de laddade vätskepluggarna i önskad takt (typiskt 100 ^ / min). Övervaka flödeshastigheter på SPO LPO med flödesgivare för att säkerställa att flödet är stabilt och på förhållandet bestämdes i steg 4.1, och att igensättning har inte ägt rum.
      4. Samla separata fraktioner. När flödesgivare upptäcker en pigg i flödeshastighet, vilket indikerar passage av den första luftspalten, växla motsvarande utgångsventilen från avfall (där det började i steg 5.2.1) till en provuppsamlingskärl.
      5. Efter passage av prov från chipet, observera flödessensorn upptäcka andra luftspalten. Vid denna punkt, växlar utgångsventilerna tillbaka till spillo. Efter full volym laddad från steg 5.2.4.2 utmatas, stoppa sprutpumpen infusionen och avsluta automatisering rutinen när flödeshastigheten når noll.
    5. Efter separationen experimentet är klar, koppla ur SPO LPO provinsamlingsflaskor och lagra dem på lämpligt sätt för efterföljande analys.
  2. Automatiserad rengöring och sanering
    OBS! Innan bearbeta varje prov, spola och sanera hela flödessystemet med hjälp av följande automatiserad rutin.
    1. Säkra SPO LPO uppsamlingskärl rör, liksom provupptagningsröret i tomma flaskor att samla överskott rengöringsmedel som ska spolas through rören.
    2. Starta det automatiserade systemet rengöring rutin. Som med Automated Separation förfarandet i steg 5.2, att programmet bör styra ventilerna och sprutpump sekventiellt ladda hållpolen med rengöringsreagens och spola dem genom systemet.
    3. Utför följande rengörings rutin: i jämnhöjd med 10% blekmedel och sedan med 70% etanol, och avslutas med vatten eller en lämplig saltlösningsbuffert (t.ex., 1x PBS eller buffert som användes för provbearbetning). Använd följande flush volymer: 450 pl för blekmedel och etanol, och 1.000 il för vatten / buffert.
    4. Under spolningssteg, spola varje reagens i SPO medan LPO utloppsventil är inställd på en port som är blockerad, då vice versa, för att avlägsna eventuella träskor i utlopps flödesbegränsarna. Behåll uttags- och infusionsflödeshastigheter av 300-500 il / min för att minimera bubbelalstring i slangen och mottrycksuppbyggnad när antingen SPO eller LPO är blockerad.
    5. Discard överskottet spolningslösningar och ampullerna där de samlats genom att följa lämpliga förfaranden för hantering av biologiskt eller kemiskt avfall.

Representative Results

Viktiga funktioner i den akustiska-mikroflödessystem enhet designen är markerade i figur 1, och beskrivs helt annat håll. 15 I korthet två fluidumströmmar flödes sida vid sida i en separationskanal, skild från en parallell bypass kanal genom en tunn kiselvägg. Eftersom den primära strålningskraft magnitud skalor med partikelvolymen, stora partiklar migrerar ut ur det blandade-provinmatningsflödet mot den akustiska trycknoden ligger i den intilliggande återhämtning fluidströmmen, medan små partiklar blir kvar i den ursprungliga strömmen (Figur 1B, C). Den delas tvåkanaliga arkitektur förbättrar partikelseparering 17 och medger justering av noden ställning genom att använda olika bypass kanalvätskor. 16 fluidic bakbord och inventarier ger en robust plattform för världen att chip anslutningar och den modulära designen möjliggör snabb växling mellan fluid chips (Figur 2). Denna configuration tillåter också reversibla fluid anslutningar, som tätar upp till 1000 psi, göras snabbt och tillförlitligt (figur 2B, E).

Resonansfrekvensen f res av ett chip kan uppskattas med hjälp av enkla 1D analytiska beräkningar (se steg 1.1.1). Från en mer komplett 2D finita elementmodell av vår enhet tvärsnitt, 16 den förväntade fokuseringsläget för två noder resonans är 225 pm från väggen och den förväntade frekvensen är 1,68 MHz. Däremot kan f res av verkliga enheter varierar med ± 100 kHz, beroende på arbetstemperatur och koppling av längs- och tvärresonanser. Därför efter anordningsenheten, f res måste empiriskt verifieras vid relevanta flöden och piezo drivspänningar, som beskrivs i steg 4 i protokollet. Figur 3 visar representativa frekvens skannar tagna vid 200 l / min, med vatten vid den nationella och förbiledningskanaler, och 20 V pp tillföres piezo. Vid koppling mellan piezo och mikrofluidanordning är bra, kommer partiklar fokusera tätt vid resonansfrekvensen, vilket resulterar i en tydlig topp i fluorescensintensiteten och migration till det förväntade fokuseringsposition (figur 3A). När däremot det finns dålig koppling, partiklar kommer inte fokusera väl och avsökningen av frekvens resultaten kommer att vara liknande den i fig 3B. I sådana anordningar kan piezo givaren måste åter monteras, om en reversibel limmet har använts; annars är denna anordning olämplig när högkvalitativa fokusering eller snabbt flöde är kritiska för den erfordrade applikationen. Data i fig 3 informera valet av arbetsfrekvensen för efterföljande experiment, och spänningen och flödeshastigheten intervallet som är tillgängligt för effektiv partiklar separering.

filer / ftp_upload / 53051 / 53051fig5.jpg "/>
Figur 5. Automatiserad prov behandling. (A) Schematisk bild av provet laddas i provpolen. (B) Representativa flödesprofil för en framgångsrik separation experiment. (C) Flödes profil från en separation körs under vilken SPO utlopp igensatt på cirka 220 sekunder. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Efter identifiering av marker som är effektiva separatorer, de införlivas i systemet som visas i figur 4. Hela systemet slagvolym minimeras genom att använda slang med 0,01 "inre diameter längs huvudflödesvägen (blå linjer). Figur 5A visar make-up av en typisk provplugg infunderas genom systemet. En liten mängd av "ledande buffert" (~ 35 | il) krävs för att precede provet i flödet för att eliminera flödets variationer medan provet rör sig genom separations chip. Figur 5B visar flödesdata till följd av en framgångsrik automatiserad akustisk separation experiment. Viktiga funktioner i en lyckad körning innefattar: (1) en övergående ökning av flödeshastigheten i både LPO och SPO som trycket byggs och fluidum börjar strömma genom systemet, (2) en skarp spik som indikerar passagen av en luftbubbla (den infällda bilden visar en utökad profil för en enda bubbla), som skall ha inkommit till SPO före LPO på grund av den ojämna flödet från två butiker, (3) stabilt flöde genom båda utloppen mellan de två luftbubblor som provet rör sig genom systemet, och (4) en gradvis minskning av flödeshastigheten i båda utloppen efter den fullständiga provvolymen avges till systemet. Problematiska körningar omedelbart framgår av flödesprofiler som liknar figur 5C, där det framgår att SPO blev tilltäppta efter ca 220 sekunder. I thi s fall en rengöringsprocedur liknande den som beskrivits i Steg 5,3 bör köras för att rensa kanalen.

Figur 6
Figur 6. Enhets avstämbarhet: partikelstorlek och spänningseffekter. Procent av polystyren-mikrosfärer som utvinns i LPO beror på partikelstorleken och spänning som tillförs piezokeramiska. Varje rad motsvarar ett annat driftsspänning vid resonansfrekvensen, bestämmes såsom beskrivits i Steg 4. Total flödeshastighet genom anordningen är 200 | j, l / min, med applicerade driv frekvenser mellan 1,62 och 1,64 MHz. Felstaplar representerar standardavvikelsen för minst tre separata experiment. Reproduceras och modifieras med tillstånd av The Royal Society of Chemistry från http://pubs.rsc.org / sv / Content / ArticleLanding / 2014 / AN / c4an00034j.target = "_ blank"> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 6 visar sammanseparations resultat med olika polystyren partikelstorlekar och piezo drivspänningar som visar drift parametrar som är nödvändiga för effektiv separation. I allmänhet är högre spänningar (dvs större akustiska krafter) som krävs för att utvinna mindre partiklar, som förväntat. Drivspänningar kan inte på obestämd tid ökade dock, på grund av ökad värmeavledning och ökande effekterna av akustisk strömning. 13 Tomten fungerar som en allmän vägledning för partikelseparationspartikelstorlekar som visar signifikant återhämtning vid en specifik drivspänning (t.ex. 10- och 2-im partiklar vid 8,8 V pp) separerar väl. Generellt partikelpopulationer med stora skillnader, såsom virus (~ 100 nm) och celler (~ 10 mikrometer) kan separeras snabbt och effektivt, liksom celler av difftekniker när storlekar (t.ex. 6-8 pm skivformiga erytrocyter och 8-15 pm leukocyter). De särskilda villkor som krävs för att arbeta med andra celltyper måste bestämmas empiriskt, eftersom cellform, densitet och kompressibilitet påverka dess akustiska kontrast, förutom cellstorlek. För detta ändamål skall de i steg 4 är användbara för att bestämma användbara separationsbetingelser för varje ny cell eller partikel typ, och inte bara för att bedöma kvaliteten på en viss akustofores enhet.

Figur 7
Figur 7. Separation Effektivitet av Cell-Virus spetsade prover. Separations resultat från (A) Raji-celler spetsade med Dengue-virus (DENV) och (B) Raji-celler och Boa njurceller spetsade med Golden Gate Virus (GGV). Procentsatser insamlade definieras som den del av virus eller celler som lämnar en specifikutlopp i förhållande till det totala beloppet lämnar chip. De felstaplar för (A) är standardavvikelsen för 3 prov, medan proven i (B) behandlas endast en gång på grund av de låga kvantiteter som finns tillgängliga. 1x PBS användes som provbufferten och återställning vätska, med vatten i förbiledningskanal för alla experiment. Chip driftsfrekvenser varierade mellan 1,60 och 1,64 MHz, med drivspänningar mellan 16 och 20 V pp. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

För att demonstrera användbarheten av denna plattform med avseende på biologisk partikelseparation, först använde vi den för att behandla välkaraktäriserade biologiska prover: humana Raji-celler (10 5 celler / ml, medeldiameter 8-10 fim 25) spetsades med denguevirus (DENV, 10 5 pfu / ml, ungefärlig diameter 50 nm 26). Figur 7A visar andelen Raji celler och DENV samlats i både SPO och LPO (definierat som andel av varje typ partikel som samlats in från varje utlopp jämfört med den totala mängden av varje insamlad från chipet partikel). Experimentet upprepades i triplikat, och Raji-celler kvantifierades med användning av en Coulter-räknare, medan DENV kvantifierades med användning av en omvänd-transkription kvantitativ polymeraskedjereaktion (RT-qPCR).

Därefter tillsattes den prestanda hos systemet testas i ett scenario som är mer realistiskt för bearbetning kliniska prover, i vilka de exakta fysikaliska egenskaperna hos partiklarna kan vara okända, och de tillgängliga provkvantiteter är lägre. Här bedömde vi separation av den nyligen identifierade golden gate-virus (GGV), en orm patogen infekterar boa constrictor njurceller. 27 Storleken på GGV viruspartikeln har ännu inte mätts, men eftersom GGV tillhör Arenaviridae familjen, det är sannolikt av enliknande storlek, mellan 100 och 150 nm. 28 Vi bearbetade prover med GGV spetsade (10 4 pfu / ml) i Raji humana celler (inte en infektion rikt för viruset), och boa njurceller (infektions mål för GGV, ungefärlig storlek 10 xm 27), med båda celltyper på 10 4 celler / ml. Eftersom dessa prover fanns tillgängliga i små mängder, är separations resultat från endast en experimentkörning rapporterats i detta arbete. Figur 7B visar den procentuella andelen av Raji-celler, Boa celler, och GGV hämtas från SPO LPO. Celler kvantifieras i dessa experiment genom att räkna på en hemacytometer och virus kvantifierades genom RT-qPCR.

Discussion

Detta protokoll presenterar systemintegration-nivå mikrofluidikanordningar till makroskala utrustning för att utföra automatiserad biologiskt prov behandling. Modularitet denna plattform gör det möjligt att kunna anpassas till varje kontinuerlig flödesmätaren, och som ett exempel, fokuserar presenterade protokollet om karakterisera och förbättra prestanda i en acoustofluidic partikelseparationsanordning. Tre stora fördelarna med detta protokoll är markerade: (i) modularitet och chip-to-world gränssnitt, (ii) robust karakterisering av enheten prestanda, och (iii) automatisk behandling av just doserade provvolymer för partikelavskiljning.

jag. Modularitet och chip-to-world gränssnitt

Såsom visas i fig 2, är mikroflödeschip monterat på ett anpassat kopplingsdäcket för att enkelt passa in på ett mikroskop scen för direkt observation. Bakbord innehåller # 6-40 UNF gängade hål på en 5 mm-pitch galler, ENAbling chipet att fästas, och vätskeförbindelser göras. Fluid anslutningar PEEK rör med maskinbearbetade ändar, som tätar mot fluidic chip med en gummi ansikte packning och en krage av rostfritt stål. Detta gränssnitt system gör det enkelt chip byte och snabb enhet redesign, som kräver få eller inga förändringar i andra systemkomponenter, som chip fotspår uppfyller nätet format. Till exempel har vi använt denna plattform med mikroflödessystem marker för kontinuerligt flöde elektrofores, termisk cellys, 29 snabb blandning av reagens för kemisk syntes, och encelliga avskiljning och förhör.

II. Robust karakterisering av enhetens prestanda

För att optimera prestandan hos någon mikroflödesseparationsanordning, dess funktion måste först noggrant karakteriseras. Det system som beskrivs här stöder utvecklingen av snabba och automatiserade protokoll att göra detta. För den specifika example akustiska fokuseringsanordningar, fokuserings kvalitet, arbetsfrekvens och ställning fokuserade partiklar i mikroflödessystem kanal måste mätas för varje enskild enhet. Dessa mätningar kräver sveper genom en rad piezokeramisk drivfrekvenser, spänningar och flöden, för att identifiera de optimala parameterkombinationer för högkvalitativ separation. De presenterade protokollet varierar automatiskt dessa avstämbara parametrar och fångar relevant data- dvs fluorescerande bilder av partiklar som strömmar i kanalen som är efterbehandlade för att generera de nödvändiga mätningar av partikel fokus kvalitet, frekvens och position (Figur 3).

Full karakterisering av akustisk enhetens prestanda kräver upprepa steg 4.4 och 4.5 som behövs under olika experimentella betingelser. Exempelvis är den absoluta fokuseringsposition av ett chips hittas genom att köra avsökningsfrekvensen vid relativt låga flödeshastigheter och hög spännings för att säkerställa fullständig migrering till noden plats. Dessutom kan sådana frekvens skannar bedöma kvaliteten på sammansatta enheten (när den körs med polystyrenpärlor med känd storlek), eller för att bestämma hur en tidigare okänd partikel typ kommer att bete sig i systemet (efter ett chip har präglats med pärlor). Ett chip med bra energiöverföring från piezokeramisk till mikroflödessystem kanal kommer att resultera i snäva fokus vid höga flöden (> 1 ml / min) och låga spänningar (12-15 V pp), medan de med dålig energiöverföring kommer inte att fokusera ännu vid låga flödeshastigheter (<100 | j, l / min) och höga spänningar (> 20 V pp). Vi har funnit att intim kontakt mellan mikroflödeschip och den piezokeramiska är kritisk för effektiv energiöverföring in i vätskan. Ytterligare undersökning av den optimala metoden för att binda mikroflödes chip och den piezoelektriska möjliggör tillförlitlig produktion av högpresterande enheter.

Slutligen, ett komplettbild av en acoustophoretic enhetens verksamhet kan erhållas genom att kombinera bildbaserade frekvens scan mätningar i Steg 4 (och figur 3) med partikelräkningar samlats in från SPO LPO som funktioner av de berörda driftsparametrarna, från separations experiment utförda med mikrosfärer , såsom beskrivs i steg 5. Såsom visas i fig 6, kan en sådan serie av automatiska experiment snabbt karakterisera en enskild enhet prestanda och avstämbarhet, informerar användaren av den optimala parameterrymden att driva anordningen för partikelseparation.

III. Automatiserad litet prov behandling för partikelavskiljning

För framgångsrik och exakt mikroflödes chip-baserade prov bearbetning, är det viktigt att på ett tillförlitligt och exakt meter, last, leverera, och samla volymer av vätska när de passerar genom. Denna precision är särskilt viktigt när prowolymen är liten(~ 0,1-1 ml), vilket är vanligt i kliniska eller forskning laboratorium inställningar. 30 Precise provhantering är en utmaning i traditionella mikroflödes experiment som använder manuell indragning av provet i en spruta och infusion i en enhet utan återkoppling av när provet har skilts och när det ska samlas in. De presenterade protokollet sysselsätter automatiserad provpolen lastning och doserings kombination med återkoppling i realtid från flödesgivare för att möjliggöra reproducerbara separationer av små provvolymer.

Figur 5 visar flödesprofilerna uppmätt på SPO LPO från ett typiskt separationsexperiment. För det första är ledande buffert av minst 35 fil laddad för att säkerställa stabilt flöde innan provet når den akustiska chipet. Prowolymer mindre än 100 ^ rekommenderas inte för denna systemkonfiguration, eftersom provutspädning på grund av den ledande bufferten blir överdriven. En plugg av luft används i början av the injektion innan ledande buffert för att separera provpluggen från den vätska som följer, förhindrar blandning och spädning av prov och fungerar som en indikator på flödesgivare. Efter en inledande transient som fluidum börjar rör sig genom systemet, skarpa spiksignaler i båda utloppen indikerar passagen av den första luftbubblan. Dessa transienter följs av en lång period av stabilt flöde som provet strömmar genom systemet, sedan en annan spik när den andra luftbubbla passerar, och slutligen en eventuell minskning i flödeshastigheten till noll efter sprutpumpen stannar.

Passagen av luft pluggar genom flödessensorerna används som triggningspunkter för att byta ventilerna för att starta och stoppa provsamling, vilket minimerar förlorad prov och utspädning av icke-urvalsvätskevolymer. Sluten slinga dosering av bearbetade prowolymer eliminerar behovet av att omprogrammera dessa värden före starten av experimentet varje gång provet ingången ändras. Den här funktionen ärsärskilt viktigt när prowolymen är begränsad, till exempel i fallet med många kliniska prover. Realtidsövervakning flödet bistår också vid felsökning; en dålig sikt (t.ex. en träsko bildas i ett av utloppen) är omedelbart uppenbart från de resulterande flödesprofiler, som i figur 5b.

För att visa flexibilitet och effektivitet acoustofluidic separation med hjälp av presenterade systemarkitektur, renat DENV och GGV virusstammar spetsades i cell lager och separeras genom bearbetning genom mikroflödes chip. Figur 7a visar att Raji-celler var väl separerade från virus, såsom 97 % av Raji-celler som lämnar chipset befanns vara i LPO och lämnar därigenom en höggradigt anrikad prov av DENV i SPO. I jämförelse, effektivitet DENV separation var lägre, med 70% av DENV lämnar chip som finns i SPO. Detta kan tillskrivas viss konvektiv omblandning inducerad av varven hos separatipå kanal, men mer sannolikt att vissa DENV partiklar migrerar tillsammans med Raji celler i LPO. Celler som migrerar i sidled över strömnings drar lite vätska med dem, även vid låga Reynolds tal. Genom denna mekanism, liksom ospecifik ytadsorption, viruspartiklar överföra till LPO. Ändå är höganrikat prov av DENV i SPO en stor nytta, till exempel när de novo-sekvensering används för att upptäcka och identifiera virus.

Figur 7b visar att i en experimentkörning, var endast cirka 70% av Boa celler som lämnar chipset finns i LPO, jämfört med nästan 100% avskiljningsgrad för Raji-celler. Skillnaden i separationsprestanda mellan de två celltyperna kan tillskrivas en mindre genomsnittlig storlek eller en lägre täthet av Boa celler jämfört med Raji-celler, vilket därför resulterar i mindre akustiska krafter. För att bekräfta eller vederlägga dessa antaganden, storlek, densitet och morfologi av Boaceller i suspension (som normalt växer anhängare) i Boa cellerna måste mätas noggrant, en insats för vidare utredning. I samma experiment, liknande de experiment med DENV, huvuddelen av den återvunna GGV lämnat SPO, vilket tyder på en anrikning av det virala fraktionen.

De presenterade uppgifterna belysa de inneboende utmaningar ingenjörs brett tillämpliga plattformar för behandling av en rad olika biologiska prover. Viktigt kan de biologiska interaktioner börjar spela en så stor roll som de fysikaliska och mekaniska effekter. Men dessa preliminära experiment visar också makt och löfte om att använda detta system arkitektur för prov bearbetning i kliniska och forskningsansökningar. Som en robust, väl karakteriserad konstruerade systemet, ger denna plattform möjlighet att söka svar på nya vetenskapliga frågor.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials required for Steps 1-3: Device Design, Fabrication and Assembly
Double Sided Polished Silicon Wafer Silicon Quest International, Inc. San Jose, CA, USA 100 mm <100>  prime wafer 1-20 ohm-cm, 495 ± 25 µm Double-side polished
Glass Wafer Bullen Ultrasonics, Eaton, OH, USA 100 mmx0.5 mm Boro
Photoresist, AZ 1518 MicroChemicals GmbH, Ulm, Germany AZ 1518 Photoresist used to adhere wafer to blank wafer for DRIE etching
Photoresist, AZ 4620 MicroChemicals GmbH, Ulm, Germany AZ 4620 Photoresist to define fluidic and via mask patterns
DRIE plasma etcher STPS, Newport, NP, United Kingdom Multiplex Advance Oxide Etch (AOE) ICP system
Wafer Bonder Electronic Visions Group,  St.Florian am Inn, Austria EVG 501
Dicing saw Kulicke & Soffa Industries, Singapore K&S 982
Epoxy kit Epoxy Technology, Billerica, MA, USA EPO-TEK 301 Epoxy used to couple piezo and microfluidic chip
PZT piezoceramic  Piezo Systems, Woburn, MA, USA PSI-5A4E 37.5 × 10 × 0.5 mm
28 AWG Kynar-insulated solid wire Squires Electronics, Cornelius, OR, USA UL1422
2-part silver epoxy  MG Chemicals, Surrey, BC, Canada 8331 Conductive adhesive for attaching wire leads to PZT
L-edit Tanner EDA, Monrovia, CA, USA Ledit v15.1 64-bit CAD software for mask layout
Materials required for Step 4: Characterizaiton of Acoustic Focusing Performance
Dual Pump Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA PHD ULTRA Series, 703007
5 ml syringes Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA 309646
Luer to Threaded port adapter IDEX, Oak Harbor, WA, USA P-659 Connects syringe to tubing
Union IDEX, Oak Harbor, WA, USA P-623 Connects world to chip connections to fluoropolymer tubing.  Can also use webbed 
Ferrule 1/4-28 flat bottom IDEX, Oak Harbor, WA, USA P-200 Used with nut to make connections between tubing and syringe, flow sensors and world to chip hardware
Nut  1/4-28 flat bottom IDEX, Oak Harbor, WA, USA P-202 Used with ferrule to make connections between tubing and syringe, flow sesnsors and world to chip hardware
1/16" OD Fluoropolymer tubing IDEX, Oak Harbor, WA, USA 1912L Tubing to connect syringe pumps to world to chip connections.  Tubing size is not critical during claibration steps (.01-.03" ID typically used, other suitable part numbers: 1907L, 1902L).
Small ID fluoropolymer tubing IDEX, Oak Harbor, WA, USA 1476-20 Used for Flow restrictors: 0.006" ID, 1/16" OD FEP 
PEEK tubing Connects from chip to fluoropolymer tubing.
Cooling fan Multicomp, Leeds, England MC19663
Function Generator Agilent, Santa Clara, CA, USA 33220A
RF amplifier ENI, Rochester, NY 325 LA Must be able to amplify signals from <1 V in the range of 1-2 MHz to 25 Vpp to the piezo.
CCD Camera Photometrics, Tucscon, AZ, USA CoolSnap HQ
Inverted Microscope Zeiss, Oberkochen, Germany Axiovert S100
FITC filter set Chroma Tech, VT, USA SP101
Objective, 10X Zeiss, Oberkochen, Germany ACHROPLAN
Oscilloscope Tektronix, Beaverton, OR, USA TDS3014B To monitor voltage output by RF amplifier
MatLab Mathworks, Natick, MA, USA R2014a
Driver interface software to integrate Photometrics camera with LabVIEW R Cubed Software, Lawrenceville, NJ, USA SITK
Tween 20 Sigma Aldrich, St. Lousi, MO, USA P9416
Dragon Green Fluorescent 5.76 or 7.32 µm Beads Bangs Laboratory, IN, USA FS06F
Additional materials required for Step 5: Automated Separation
Multiport valves VICI, Houston, TX, USA C25Z-3180EUHA In the current configuration 4 valves are needed
Flow Sensors Sensirion, Westlake Village, CA, USA SLI-1000
Fluoropolymer tubing, .01 and .03" ID IDEX, Oak Harbor, WA, USA 1902L and 1912L High purity PFA preferred
Nut VICI, Houston, TX, USA ZN1PK-10 Used with ferrule to make connections between tubing and valves. Alternative part numbers: MZN1PK-10, LZN1PK-10
Ferrule VICI, Houston, TX, USA ZGF1PK-10 Used with nut to make connections between tubing and valves.  
LabVIEW National Instruments, Austin, TX, USA LabVIEW Professional Development system Laboratory Automation Software
PBS Teknova, Hollister, CA, USA P0200
Raji Cells ATTC, Manassas, VA, USA CCL86
Boa Cells Kindly provided by the DeRisi Laboratory at UCSF
GGV Kindly provided by the DeRisi Laboratory at UCSF
DENV Kindly provided by Jose Pena at LLNL
Coulter Counter Z2 Beckman Coulter, Brea, CA, USA Z2
Hemacytometer Fisher Scientific, Waltman, MA, USA 0267151B

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gossett, D. R., Weaver, W. M., et al. Label free cell separation and sorting in microfluidic systems. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397, (8), 3249-3267 (2010).
  2. Lenshof, A., Laurell, T. Continuous separation of cells and particles in microfluidic systems. Chemical Society Reviews. 39, (3), 1203-1217 (2010).
  3. Sajeesh, P., Sen, A. K. Particle separation and sorting in microfluidic devices a review. Microfluidics and Nanofluidics. 17, (1), 1-52 (2014).
  4. Bhagat, A. A. S., Bow, H., Hou, H. W., Tan, S. J., Han, J., Lim, C. T. Microfluidics for cell separation. Medical & Biological Engineering & Computing. 48, (10), 999-1014 (2010).
  5. McGrath, J., Jimenez, M., Bridle, H. Deterministic lateral displacement for particle separation a review. Lab Chip. 14, (21), 4139-4158 (2014).
  6. Jubery, T. Z., Srivastava, S. K., Dutta, P. Dielectrophoretic separation of bioparticles in microdevices A review. ELECTROPHORESIS. 35, (5), 691-713 (2014).
  7. Jin, C., McFaul, S. M., et al. Technologies for label free separation of circulating tumor cells from historical foundations to recent developments. Lab on a Chip. 14, (1), 32 (2014).
  8. Trujillo, F. J., Juliano, P., Barbosa Cánovas, G., Knoerzer, K. Separation of suspensions and emulsions via ultrasonic standing waves – A review. Ultrasonics Sonochemistry. 21, (6), 2151-2164 (2014).
  9. Bridle, H., Miller, B., Desmulliez, M. P. Y. Application of microfluidics in waterborne pathogen monitoring A review. Water Research. 55, 256-271 (2014).
  10. Mariella Jr, R. Sample preparation the weak link in microfluidics-based biodetection. Biomedical microdevices. 10, (6), 777-784 (2008).
  11. Gor’kov, L. P. On the forces acting on a small particle in an acoustic field in an ideal fluid. Soviet Physics Doklady. 6, 773-775 (1962).
  12. Settnes, M., Bruus, H. Forces acting on a small particle in an acoustical field in a viscous fluid. Physical Review E. 85, (1), 016327 (2012).
  13. Barnkob, R., Augustsson, P., Laurell, T., Bruus, H. Acoustic radiation and streaming-induced microparticle velocities determined by microparticle image velocimetry in an ultrasound symmetry plane. Physical Review E. 86, (5), (2012).
  14. Bruus, H. Acoustofluidics 7 The acoustic radiation force on small particles. Lab Chip. 12, (6), 1014-1021 (2012).
  15. Fong, E. J., Johnston, A. C., et al. Acoustic focusing with engineered node locations for high performance microfluidic particle separation. Analyst. 139, (5), 1192-1200 (2014).
  16. Fong, E. J., Bora, M., et al. Continuously Variable Node Position in a High Throughput Acoustofluidic Device. Micro Total Analysis Systems. 1184-1186 (2014).
  17. Jung, S. Y., Notton, T., Fong, E., Shusteff, M., Weinberger, L. S. Spatial tuning of acoustofluidic pressure nodes by altering net sonic velocity enables high-throughput efficient cell sorting. Lab on a Chip. 15, (4), 1000-1003 (2015).
  18. Franssila, S. Deep Reactive Ion Etching. Introduction to Microfabrication. 255-270 (2010).
  19. Sharma Rao, B., Hashim, U. Microfluidic Photomask Design Using CAD Software for Application in Lab On Chip Biomedical Nanodiagnostics. Advanced Materials Research. 795, 388-392 (2013).
  20. Melin, J., Quake, S. R. Microfluidic Large Scale Integration The Evolution of Design Rules for Biological Automation. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 36, (1), 213-231 (2007).
  21. Madou, M. J. Fundamentals of microfabrication: the science of miniaturization. CRC Press. Boca Raton. (2002).
  22. Krulevitch, P., Benett, W., Hamilton, J., Maghribi, M., Rose, K. Polymer based packaging platform for hybrid microfluidic systems. Biomedical Microdevices. 4, (4), 301-308 (2002).
  23. Leslie, D. C., Easley, C. J., et al. Frequency specific flow control in microfluidic circuits with passive elastomeric features. Nature Physics. 5, (3), 231-235 (2009).
  24. Oh, K. W., Lee, K., Ahn, B., Furlani, E. P. Design of pressure driven microfluidic networks using electric circuit analogy. Lab on a Chip. 12, (3), 515-545 (2012).
  25. Mittelbrunn, M., Gutiérrez Vázquez, C., et al. Unidirectional transfer of microRNA loaded exosomes from T cells to antigen presenting cells. Nature Communications. 2, 282 (2011).
  26. Acosta, E. G., Castilla, V., Damonte, E. B. Functional entry of dengue virus into Aedes albopictus mosquito cells is dependent on clathrin mediated endocytosis. Journal of General Virology. 89, (2), 474-484 (2008).
  27. Stenglein, M. D., Sanders, C., et al. Identification Characterization and In Vitro Culture of Highly Divergent Arenaviruses from Boa Constrictors and Annulated Tree Boas Candidate Etiological Agents for Snake Inclusion Body Disease. 3, (4), e00180 12 (2012).
  28. Arenaviridae Viral Hemorrhagic Fevers (VHFs). CDC. Available from: http://www.cdc.gov/vhf/virus-families/arenaviridae.html (2013).
  29. Packard, M., Wheeler, E., Alocilja, E., Shusteff, M. Performance Evaluation of Fast Microfluidic Thermal Lysis of Bacteria for Diagnostic Sample Preparation. Diagnostics. 3, (1), 105-116 (2013).
  30. Lion, N., Reymond, F., Girault, H. H., Rossier, J. S. Why the move to microfluidics for protein analysis. Current Opinion in Biotechnology. 15, (1), 31-37 (2004).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats