En mikrofluid Plattform for Precision Small-volum prøvebehandling og bruken til Size Separate Biologiske Partikler med en akustisk Microdevice

1Materials Engineering Division, Lawrence Livermore National Laboratory, 2Department of Biomedical Engineering, Boston University
Published 11/23/2015
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Bioengineering
 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Fong, E. J., Huang, C., Hamilton, J., Benett, W. J., Bora, M., Burklund, A., et al. A Microfluidic Platform for Precision Small-volume Sample Processing and Its Use to Size Separate Biological Particles with an Acoustic Microdevice. J. Vis. Exp. (105), e53051, doi:10.3791/53051 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

En stor fordel med microfluidic anordninger er muligheten til å manipulere små prøvevolumer, og dermed redusere reagens avfall og bevare verdifulle prøven. Men for å oppnå robust prøven manipulering er det nødvendig å ta enheten integrasjon med makromiljø. For å realisere repeterbare, følsom partikkelseparasjon med microfluidic enheter, presenterer denne protokollen et komplett automatisert og integrert mikrofluid plattform som gjør det mulig presis behandling av 0.15-1.5 ml prøver ved hjelp microfluidic enheter. Viktige aspekter ved dette systemet inkluderer modulær enhet layout og robuste inventar resulterer i pålitelig og fleksibel verden å chip-tilkoblinger, og helautomatisk væskehåndtering som oppnår lukket prøvetaking, system rengjøring og grunning skritt for å sikre repeterbare drift. Ulike microfluidic enheter kan brukes om hverandre med denne arkitekturen. Her vi innlemme en acoustofluidic enhet, detalj sin characterizasjon, ytelse optimalisering, og demonstrere bruken for størrelsen-separasjon av biologiske prøver. Ved å bruke sanntid tilbakemelding under separasjons eksperimenter, er prøvetaking optimalisert for å bevare og konsentrere prøven. Selv krever integrering av flere stykker av utstyr, fordelene med denne arkitekturen inkluderer muligheten til å behandle ukjente prøver uten ekstra system optimalisering, brukervennlighet erstatningsenhet, og presis, robust utvalgets behandling.

Introduction

Eksempel separering og fraksjonering er en av de mest lovende anvendelsesområder for microfluidic teknologier. Slike prøvehåndtering trinnene er integrert for effektiv klinisk diagnostikk, terapi utvikling, biosurveillance innsats og fremgang i life science forskning og teknologi. En myriade microfluidic separasjons strategier har blitt demonstrert for væske suspendert partikler og kolloider, samt for kjemiske og biologiske arter; flere vurderinger gi oversikter av nyere fremskritt og utviklingen i disse områdene 1 - 9. Selv om mange av disse microfluidic separasjonsteknologier (heretter referert til som "Core-enheter") er blitt grundig karakterisert, er det få rapporter anses prøven separasjonen problem på et systemnivå. Core Devices er typisk individuelle centimeter stilt chips, integreres med fluor tubing, med væske levert av en forskyvning eller trykkpumpe.Likevel, hvis løftet om MicroFluidics - blant annet økt automatisering, pålitelighet og reduksjon i prøvevolum - er å bli virkelighet, minst en tilsvarende innsats skal være viet til utformingen av et fullstendig skille system der Core Device er integrert .

I tillegg er en stor utfordring for microfluidic tilnærminger til biodetection makro til mikro-grensesnitt. Dette gjelder ikke bare for de fysiske "verden-til-chip" forbindelser i et mikrofluid enhet til mesoklimatisk komponenter, og til mismatch mellom typiske kliniske eller analyseprøvevolumer (~ 0,1-10 ml) og det indre volum av microfluidic chips (~ 0,01 til 10 pl), men også til de statistiske prøvetakings begrensninger som oppstår fra disse brodannende størrelse skalaer. Disse problemene bidrar til oppfatningen om at prøven pre-prosessering og tilberedning er de "svake leddet" av biodetection. 10 Plattformen er beskrevet i dette arbeidet taKES store skritt mot å adressere disse utfordringene.

Tar en systemnivå syn detaljer denne protokollen pålitelig prosessering av nettopp vannmåler analytisk stilt volumer (varierer fra 0,15 til 1,5 ml) på ~ 10 min tidsfrister. Dette er en "one-button" operasjon: når kilden hetteglasset med prøven og målet ampuller for brøkdel samlingen er plassert inn i systemet, starter "run" -kommandoen prosedyren, og alle trinnene er datastyrt. Ved slutten av en kjøring, kan oppsamlingshetteglass fjernes fra systemet nedstrøms for analyse av de separerte fraksjoner.

Innretningens kjerne i dette system er en acoustophoresis brikke som ekstraherer pattedyrcellestørrelse (5-20 um) partikler fra prøven. Acoustophoretic separasjon er valgt her først og fremst fordi det er høy gjennomstrømming (opp til 100s av mL / min), etikett-fri, og ikke-kontakt, og tilbyr dermed fordeler i å skille levedyktig Viruses fra celler som få andre microfluidic teknikker kan matche. Fysikken i akustisk partikkel fokusering har blitt grundig beskrevet, 11 - 13, og er ikke fokus for denne protokollen, men en kort oppsummering av de underliggende begrepene følger for å hjelpe til med å forstå søknaden til microfluidic separasjon.

Ultralyd stående bølger resonnerende i væskefylte mikro produsere trykkfeltene, noe som gir opphav til krefter som driver partiklene mot noder med lavt trykk. Kraften størrelse er avhengig av partikkelens volum, og på en akustisk steilhetsfaktor utledet fra de relative tettheter og compressibilities av partikkelen og den suspenderende væske. 14 Som sådan akustisk fokusering er ideelt egnet til separering av celle-størrelse (~ 7-15 mikrometer) fra virus-sized (~ 50-200 nm) partikler. De større partikler migrerer mot en trykk node; men siden kraften størrelse er meget liten forpartikler mindre enn 2-3 um, disse små partikler eller oppløste arter knapt bevege seg i det hele tatt. Vår spesifikk implementering av akustiske atskillelse, som tidligere beskrevet, inneholder 15 en tynn vegg for å dele fluidkanalen og tillater fleksibel, asymmetrisk plassering av fokuseringsstilling. Dette gir økt fleksibilitet i enheten design, og ytelesesfordelene-inkludert økt separasjon kvalitet og hastighet-er fullstendig beskrevet andre steder. 16,17

Men en stor fordel av systemet-level design tilnærming beskrevet i dette arbeidet er at det er tilpasningsdyktig til et stort utvalg av microfluidic Kjerne Devices. For eksempel kan de fleste andre kontinuerlig strømning separasjonsmåter, inkludert treghet, strømningsfeltfraksjonering, deterministisk lateral forskyvning (DLD), og forskjellige typer av elektrokinetiske anordninger lett bli innarbeidet, med passende justeringer gjøres for å ta høyde for endringer i innløp / utløp konfigurasjon , strømningshastigheter,og prøvevolumer. Enheter med ulike typer on-chip felt (elektriske, magnetiske) eller gradienter (termisk, kjemisk) kan kreve ytterligere forbindelser til chip, eller integrering av ekstra maskinvare, som denne plattformen plass.

Denne protokollen gir trinnene som kreves for å designe en mikrofluidseparasjonsenhet, og å dikte silisium-glass chips ved dypreaktiv etsing (DRIE, en plasma-etseprosess tilgjengelig i mange microfabrication fasiliteter, som bruker vekslende sykluser av etsing og passivisering å oppnå dyp funksjoner med vertikale sidevegger 18). Deretter beskriver vi karakterisering av acoustofluidic enheten for å bestemme de optimale operasjonsparametere for separasjon, og til slutt detalj fullt integrert separasjonssystem, og fremgangsmåten for behandling av biologiske prøver. Typiske enhet karakterisering resultater og utvalgets behandling av data blir deretter presentert og diskutert, og de viktigste fordelene med denne hensiktsach er uthevet, inkludert modularitet, robusthet, presisjon og automatisering.

Protocol

1. Acoustophoretic Device Design og fotomaske Layout

MERK: Generelle betraktninger og veiledning for microfabrication prosessdesign og maske layout kan bli funnet i tekster om microfabrication og tutorials av fotomaske utforming 19-21.

  1. Legg ut Mask 1, den Fluidic Layer (forsiden), ved hjelp av egnet CAD-programvare. Velge en geometri som tillater prøveinjeksjon og separasjon egnet for den ønskede anvendelse.
    1. For akustisk fokusering, sette fluidic kanalbredden w for å gi en resonansfrekvens f n større enn 1 MHz i henhold til ligningen f n = nc / 2w, hvor c er lydhastigheten i det aktuelle fluidet, og n er antallet av stående-bølge-noder (f.eks, for en 900-um bred kanal, den to- node resonans forventes på f 2 = 1,65 MHz).
      MERK: Partikkels opptar forskjellige laterale posisjoner nær enden av separasjonskanalen bør gå ut fra forskjellige uttak. Ved denne protokollen blir partikler separeres etter størrelse, slik at uttakene er betegnet SPO og LPO, for små og store partikkel-partikkel-utløp, henholdsvis, som vist i figur 1.
    2. Still fluidkanallengden til å kontrollere lengden av tids partikler er utsatt for separasjonsfeltet ved en bestemt strømningshastighet. Lengre on-chip oppholdstid for partikler å migrere på grunn av separasjons styrker må handles off mot større kreves chip fotavtrykk.
      MERK: I våre akustisk fokus enheter, gjør strømningskanalen tre passerer nedover chip for økt oppholdstid (figur 2a). Ved en typisk total strømningshastighet på 200 mL / min, partikler som strømmer gjennom 300 x 200 mikrometer tverrsnitt, 117 mm lang separasjonskanal bruker i gjennomsnitt 2,1 sek i det akustiske feltet.
  2. Inkluder fluidic havner i masken Layoutca for tilkoblinger til standard rør arrangert på en standardisert grid (5 mm-banen). Inkluder egnede fiducial karakterer for justering av masker til hverandre under fabrikasjon og dicing til de enkelte enhetene.
  3. Legg ut Mask 2, Via Layer (baksiden), som bare inkluderer fluidic porter. Inkluder fiducial markerer for justering til Maske 1.

Figur 1
Figur 1. Acoustofluidic Device. Skjematisk skisser av acoustophoretic enhet arkitektur. (A) sett ovenfra, som viser den totale H-filter konfigurasjon (ikke i målestokk). (B) Skjematisk fremstilling av kanalens tverrsnitt ved stedet merket med den svarte stiplede linjen i (a), som viser trykkfeltet (blå punkterte linjer), og følelsen av de akustiske primære strålingsstyrker (PRF) som driver partikler mot nodal flyene (røde piler). Kanaltverrsnitter 900 x 200 um med en vegg omkring 10 um tykk separering av hoved (300 um bred) og bypass-kanaler. (C) 3D-representasjon av partikkelseparasjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

2. renrom Fabrikasjon av microfluidic Chips for Acoustophoresis

  1. Mønster back-side væske porter ved hjelp Mask 2 på en dobbel-side polert 0,5 mm tykk, diameter 100 mm <100> silisium wafer av standard positive-motstå fotolitografi. Etse denne geometrien av dypreaktiv ioneetsing (DRIE) til en dybde på 350 til 400 um.
  2. Snu wafer over, og mønster på frontsiden fluidkanal geometri ved bruk av en maske ved hjelp av standard-positive fotolitografi motstå på den andre siden av silisium. Deretter montere enheten wafer til en andre (blank silisium) carrier wafer fotoresist.
  3. Etse de kanaler, også av DRIE, til en dybde på 200 mikrometer, gjennom-etsing av silisium i port stedene (bæreplaten beskytter DRIE verktøyet overflaten). De-montere enheten wafer fra emnet Si wafer ved bløtlegging i motstå-stripping løsning.
  4. Rengjøre enheten platen og et særpreg 0,5 mm tykt borsilikatglass platen ved hjelp av Piranha løsning (svovelsyre og hydrogenperoksyd i et 3: 1 forhold).
  5. Forsegle væskekanalene ved anodisk binde glass og silisiumskiver med følgende parametre: kammertrykk på tre mTorr, stempeltrykk på 1000 N, temperatur på 350 ° C, og gjelder 750 V til dagens faller under 0,2 mA.
  6. Skjær de enkelte chips fra hverandre med en diamantskive på en dicing sag.

3. Endelig Device Assembly

  1. Piezo Svinger Attachment
    MERK: Ultralyd genereres i mikrofluid chip ved en piezoceramic transduser festet til silisium side.
    1. Fra iwo-komponent lav viskositet epoxy kit, veie opp den anbefalte forholdet mellom begge komponentene og bland dem grundig.
    2. Tilsett epoxy blanding med en pipette og spredt jevnt over et blyzirkonattitanat (PZT) piezoceramic å skape et tynt, jevnt lag (ca. 10 ul av epoxy blanding for en piezo med dimensjoner på 37,5 x 10 x 0,5 mm).
    3. Ved hjelp av en passende jigg eller ligaen, justere epoxy siden av piezoceramic med microfluidic chip, noe som gir en overhengende område på den ene siden for påfølgende ledning vedlegg (se figur 2a), og bringe de to komponentene i kontakt. Klem montering i en skrustikke, tar seg ikke å knekke noen av komponentene, og kurere ved temperatur og varighet anbefalt av epoxy produsenten.
    4. Etter at epoksyen har herdet, feste fin-gauge fører til hver side av piezoceramic, ved lodding med en fin spiss loddebolten, noe som gjør den korteste mulige kontakt med piezo å unngå thermally de-polariserende det. Alternativt kan du bruke en ledende lim til å lime ledningene til piezo.

Figur 2
Figur 2. Fluidic Breadboard, Chip Montering og World-til-Chip Interface. Bilder av (a) den akustiske microfluidic chip (ytre mål på 70 × 9 × 1 mm) med tilhørende piezo svinger ledningen fører, viser tre passeringer av separasjon kanal ned brikken, (b) tilpasset fluidic skrueforbindelser og maskinerte rørkomponenter til chip-til-verden grensesnitt, (c) at brikken er montert på undersiden av den fluid brødfjel ved hjelp av klem inventar, som strekker seg over en åpning i brødfjel å tillate vifte kjøling, (d) et grunnriss av breadboard med vedlagte slangekoblinger og kjølevifte, og (e) en tverrsnitts skjematisk av skruebeslag som grensesnittet tubing med montert microfluidic chip. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

  1. Monterings og World-To-Chip Grensesnitt
    1. Feste brikken til "fluidic brødfjel" (en plate med et gitter av regelmessig avstandsplasserte gjengede gjennomgående hull) ved hjelp av klem inventar. Fest en kjølevifte til brødfjel å regulere temperaturen i løpet av akustiske eksperimenter (se figur 2).
      MERK: Ved bruk uten kjølevifte ved typiske drivspenninger hever temperaturen enheten til 70-80 ° C. Dette forskyver betydelig resonansfrekvensen på grunn av endret lydhastigheten i fluidet, og kan negativt påvirke levedyktigheten av eventuelle biologiske partikler som er under arbeid.
    2. Skru inn chip-til-verden-kontakter, som tidligere beskrevet et annet sted 22 og vist i figur 2. Bli med disse interface rør til ekstra slange ved innløp og utløp ved hjelp av standard ¼ "-28 fagforeninger for 1/16" rør.

4. Karakterisering av Acoustic Fokusering Ytelse

MERK: System komponenter som kreves for akustisk fokusering karakterisering er gruppert sammen i Materials List. Trinn 4.1 og 4.2 nedenfor gjelder for alle Core enhet som brukes med denne plattformen, mens etterfølgende trinn beskriver operasjoner knyttet til den spesifikke acoustofluidic enheten diskutert her.

  1. Systemkonfigurasjon
    1. Monter microfluidic chip bruker verden-til-chip tilkoblinger på fluidic brødfjel, som beskrevet i punkt 3. Kople til å bruke slangen (for eksempel 1/16 "ytre diameter fluoropolymer rør) til en væskepumpe og samling ampuller. Monter brødfjel forsamlingen på scenen av et mikroskop kan fluorescens bildebehandling utstyrt med en CCD-kamera.
    2. Koble lengder liten indre diameter (ID) rør (0,006 "anbefales) umiddelbart etter at brikken (se figur 4) for å tjene som strømningsbegrenserne, som stabiliserer systemet og styrer strømningen splitting mellom chip-uttak. Bruke større ID-rør, slik som 0,01 "og 0,03", for alle andre forbindelser.
      1. Estimer hydrodynamiske strømningsmotstanden R h av hver slange med lengde L og den indre diameteren D ved hjelp av ligningen R h = 128 pl / πD 4, hvor μ er fluidets dynamiske viskositet. Trykkfallet Δ P på grunn av hver rørlengde ved en gitt strømningshastighet Q er gitt ved P = Δ QR timer.
      2. Velge et forhold mellom restriktor lengder for å dele strømmen mellom uttak som passer for den separasjonsmetode som benyttes. Optimal separasjon med de akustiske chips i denne protokollen krever en SPO: LPO flyt forholdet mellom den tilnærmettely 65: 35%.
      3. Velge lengden av utløpsstrømningsbegrenserne slik at deres fluidmotstanden er minst 3-4 ganger større enn den samlede motstand i resten av systemet (hensiktsmessig summert i serie eller i parallell). For acoustophoresis enhet som brukes i dette arbeidet, rørlengder 35 og 65 cm for LPO og SPO er egnet.
        MERK: Nøye vurdering må gis til Rh av noen microfluidic Kjerne Device. For vår akustisk fokus chip i dette arbeidet, er R h lav på grunn av sin relativt store kanal dimensjoner, så de tilkoblede tubing motstander lett overstige det. For enheter med mindre kanaldimensjoner, kan brikkens motstands dominerer resten av systemet rør, i hvilket tilfelle utforming og styring av on-chip kanal R h er en ytterligere betraktning under Trinn 1 i denne protokollen. Detaljerte design prinsipper og retningslinjer finnes i litteraturen. 23,24
  2. System Verification
    1. Sjekk for lekkasjer for å kontrollere at microfluidic enheten har ingen defekter og alle slangekoblinger er forseglet. Tilsett vann gjennom på nyanlegg som nødvendig med en sprøyte og overvåke for enhver væskelekkasje i hovedkanalen.
    2. Dispensere et kjent volum gjennom chip, og måle mengdene samlet fra utløpene for å sikre at strømningsforholdet er som forventet. Avvik fra den forventede volumforhold kan tyde blokkeringer i en av uttak eller lekker tilkoblinger.
      1. For å opprettholde systemet renslighet og forhindre tilstopping flush hele systemet (fluidic slange og chip) med egnede rengjøringsløsninger (f.eks, blekemiddel, etanol, vann) før og etter å ha kjørt noen eksperimenter.
      2. Ved tresko eller blokkeringer i en av uttak, skylle systemet mens du kobler den klare utløp for å fjerne blokkeringen. Hvis dette ikke lykkes, snu strømningsretningen under spyling,eventuelt påføre raske pulser av motsatt strøm (ved hjelp av en manuelt betjent sprøyte). Til slutt, hvis blokkeringen fortsatt ikke kan fjernes, må den byttes eller chip, som er nødvendig.
  3. Frekvens Skanneoppsett for Acoustic Fokusering
    1. Fyll bypasskanalen (se figur 1) med fluid, slik som deionisert vann, etanol, eller fosfatbufret saltoppløsning (PBS) ved manuell injeksjon med en sprøyte. Legg merke til at denne væsken ikke kommer i kontakt med prøven som blir behandlet. Detaljene for justering node posisjon ved hjelp av ulike omkjørings væsker er beskrevet andre steder 16,17. I korte trekk, hvis noden må være nærmere til skilleveggen, å bruke en lavere tetthet bypass fluid, slik som etanol; for node plassering nærmere input prøvestrømmen, å velge en tettere væske, for eksempel en glycerol-løsning.
    2. Foreta en vulst oppløsning av 0,01% (w / v) 5-8 nm fluoriserende polymerkuler suspendert i en buffer så som PBS med0,05% Tween-20 og fylle prøveinnløpet sprøyte med vulsten løsningen. Fyll buffer innløpet sprøyten med den samme buffer (dette behøver ikke å være den samme væske som i bypass-kanal). Legg merke til at generelt, er bufferen valgt å passe programmet (se trinn 5.1).
    3. Med fluid brødfjel på mikroskopet scenen, fokusere omtrent halvveis inn i dybden av kanalen ved en rett kanal området like før utløpet med begge kanaler (separasjon og bypass) i synsfeltet. Kan være nødvendig for en ytterligere skrå vinkel ekstern lyskilde for å gjøre kanalveggene synlig, for vellykket post-prosessering av bildedata.
  4. Automatisert Frequency Scan og Image Capture
    1. Gjør elektriske tilkoblinger med skjermede kabler (for eksempel RG-58 er utstyrt med BNC-kontakter) til en funksjon generator med radiofrekvens (RF) forsterker for å levere eksitasjonssignalet til piezo svinger. Eventuelt koble et oscilloskop tilutgangssignalet fra funksjonsgeneratoren for å overvåke den faktiske spenningen som påtrykkes transduseren.
    2. Slå på kjølevifte, og angir funksjonsgenerator, slik at utgangssignalet fra RF-forsterkeren til piezo transduseren er i området fra 12 til 25 volt topp-til-topp (V pp).
    3. Angi både sprøyter til den samme strømningshastighet mellom 50 og 200 ul / min. Ved hjelp av en eneste sprøytepumpe for å drive begge sprøyter med den samme motor er anbefalt å minimalisere perturbasjoner i strømningen.
    4. Utfør en frekvens skanning prosedyre ved å angi start- og slutt frekvenser, trinnstørrelsen mellom frekvensverdier, og piezo stasjonen spenning ved hjelp av et laboratorium automatisering verktøykasse som National Instruments LabVIEW.
    5. På hvert frekvenstrinn, gjelder spenningen i 15 sekunder for å la systemet stabilisere seg, så ta 10 bilder av perler som strømmer gjennom chip for påfølgende analyse (eksponeringstider mellom 10 og 100 msek anbefales).
    6. Mellom each brukt frekvenstrinn, slå av spenningen for ca 20 sek å la perlene omfordele jevnt over kanalen og fjerne skjevhet i fokus fra tidligere søkt frekvenstrinn.
  5. Bildeanalyse fastslår Resonant Frequency og Fokusering plassering
    1. Kjøre en bildeanalyse script (for eksempel AF_freqScanPlotter.m MATLAB script som følger med dette Protocol) og legg inn nødvendig informasjon på instruksjonene: velg listen over bildefiler som genereres i trinn 4.4, angir skanne start og stopp frekvenser og trinnstørrelse, hele kanalbredden, veggen sted, og til slutt velge bildet for å analysere regionen, inkludert både separasjon og bypass-kanaler.
    2. Observere analysen script gjennomsnitt sett av bilder tatt på hvert frekvenstrinn, og gjennomsnittlig intensitetsverdiene langs strømningsretningen. Dette resulterer i et tverrsnitt linje-avsøkning av fluorescensintensitet.
      MERK: frekvens som svarer til den høyeste kvalitet standar st intensitet er definert som resonansfrekvensen (figur 3, midterste rad), og den stilling i kanalen, hvor den høyeste intensiteten forekommer er fokuseringsposisjon (figur 3, nedre rad).

Figur 3
Figur 3. Representant Frequency Scan. Eksempel på frekvens scan data for godt koblet (A) og dårlig kombinert (B) piezo og chip. Øverste rad: fluorescentintensiteten av perler (rød representerer høy og blå representerer lav intensitet). Midterste rad: maksimal intensitet på hver frekvens. Nederste rad: plassering av maksimal intensitet, hvor den røde stiplet linje angir forutsagte fokusering stilling, og røde diamanter indikere resonansfrekvens som bestemmes av den maksimale intensitet.g "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

5. Automatisert Separation

NB: Den automatiserte separasjon eksperiment kjøres for å separere store partikler fra små partikler på grunn av den størrelsesavhengige akustiske fokuserte krefter som utøves i mikrofluid brikken. De nødvendige systemkomponenter er gruppert sammen i Materials List.

  1. Systemkonfigurasjon og Prøvepreparering
    1. Koble microfluidic chip til sprøytepumpen, datastyrte multi-port utvalgs ventiler, PC-grensesnitt strømningsmålere, og rør, som vist i Figur 4. Denne konfigurasjonen muliggjør automatisert behandling av prøver gjennom microfluidic separasjon chip, samt automatisert rengjøring skritt mellom eksperimenter for å fjerne kryssforurensning og sample carry-over.
    2. Bruke en prøvebuffer er egnet for cellene eller partiklene som skal separeres, eller slik det kreves i analysen for å assaybrukes etter separasjon. Som i trinn 4.3.2, må gjenvinnings buffer (men ikke nødvendigvis den bypass fluid) svarer til den prøvefluid.
      NOTE: Alle vandige buffere som typisk anvendes med biologiske prøver (f.eks PBS) har akustiske egenskaper som ligner på vann og vil ikke vesentlig endre ytelsen av den akustiske anordning. Bruken av prøvevæsker med tetthet og viskositet signifikant forskjellig fra vann er mulig, men bare anbefalt for aktører med sterk acoustophoresis erfaring.


Figur 4
Figur 4. Acoustic Systemkonfigurasjon for Automated Separation Eksperimenter. De blå linjene spore hovedstrømningsbanen gjennom systemet. Alle grønne og sorte linjene er 0,03 "indre diameter (ID) tubing, og alle blå og grå-farget linjene er 0,01" ID tubing, med exception av holding spoler, som er 0,03 "ID, og ​​strømningsbegrensere, som er 0.006" ID. Sprøytene er fylt med buffer, og holding spoler har tilstrekkelig volum (550 mL) for å hindre opptak av eventuelle prøver eller rengjørings reagenser i sprøytene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

  1. Separasjon Prosedyre
    1. Pre-run tilstand. Før du kjører separasjon, sikre at rengjøring reagensstasjonene reservoarer (blekemiddel, etanol, buffer) har tilstrekkelig væske, avfalls reservoarene er ikke full, og de ​​flytende linjer er primet (dvs. fylt med løsning). Hvis sistnevnte tilstanden er usikker, eller hvis systemet blir kjørt for første gang etter tomgang (f.eks første gang på en gitt dag), kjøre en automatisert rengjøringsprosedyren (se trinn 5.3 nedenfor). Still Ventiler 3 og 4 på chip utsalgssteder å strømme til avfall Reservoirs utgangspunktet.
    2. Slå på kjølevifte, og angi funksjonen generator ved resonansfrekvens for den akustiske chip som brukes, som bestemt i trinn 4.5. Justere spenningen sett punkt på funksjonen generator slik at RF forsterker utganger mellom 12 og 25 V pp, som er aktuelle for den ønskede separasjon.
    3. Koble Sample Input Vial, Buffer Input Vial, og riktige innsamlings ampuller til systemet. Like før du fester Sample Input Vial til sin pickup tubing, Vortex hetteglasset kort til å re-suspendere eventuelle partikler som kan ha avgjort. Deretter fester du hetteglasset og initiere separasjon rutine uten forsinkelse.
      ADVARSEL: Hvis prøven som skal behandles inneholder potensielt smittestoffer, bør ampullene være av en skrue-top-type, for å opprettholde et lukket system og hindre prøven aerosolisering. I tillegg, når du arbeider med biologisk farlig materiale, håndtere alle ampuller og slanger mens iført nødvendig verneutstyr og bruk av required fare kontroller og prosedyrer for Biological Risk Group og biosikkerhet tilpasset materialet. Størst institusjonelle retningslinjer og protokoller i tilfelle noen usikkerhet.
    4. Bruker et program i et laboratorium automatisering verktøykasse for å styre ventiler, strømningssensorer og pumpe for å gjennomføre den helautomatiske separasjon rutine.
      MERK: Rutinen bytter ventilene, aktiverer sprøytepumpe tilbaketrekking og infusjon, og skjermer flyte sensordata for riktig timing innsamling av produksjonen eksempel fraksjoner. De viktigste trinnene er oppsummert nedenfor i 5.2.4.1 gjennom 5.2.4.3, som om utført manuelt.
      1. Prime pickup slangen. Uttak fra omtrent 15 pl prøve Input Vial fullstendig å fylle røret som forbinder den til ventilen 1. Samtidig prime røret som forbinder Buffer Input Vial til ventilen 2. På en lignende måte, prime luftinntaket av en ventil for å sikre at den inneholder ingen væske. Til slutt, bytter ventiler 1 og 2 for å utvise å kaste bort noenoverflødig væske eller luft som har kommet inn i laste coil.
      2. Laste prøven spiral, som vist i figur 5a. En typisk lastesekvens for behandling av en 250 pl prøve er å ta ut 25 ul av luft ved 50 mL / min, og deretter 250 ul av prøven på 200 pl / min, fulgt av 35 ul av ledende buffer ved 200 ul / min, og til slutt ytterligere 25 ul av luft på 50 ul / min.
        MERK: Alle volumer og hastigheter er velges av brukeren. Merk at dette lasting sekvensen er i motsatt rekkefølge av hvordan væskepluggene vil strømme gjennom separasjonsinnretningen.
      3. Begynn prøven infusjon. Still sprøytepumper å sette mot lastet væskepluggene på ønsket hastighet (typisk 100 mL / min). Overvåke mengder ved SPO og LPO med sensorer for å sikre at flyten er stødig og at forholdet ble bestemt i punkt 4.1, og at tilstopping har ikke skjedd.
      4. Samle skilt fraksjoner. Når strømnings sensorene registrerer en økning i strømningshastighet, noe som indikerer passage av den første luftspalte, slå den tilsvarende produksjonen ventilen fra avfall (der det startet i trinn 5.2.1) til en prøveoppsamlingsbeger.
      5. Etter passering av prøven fra brikken, observere strømn sensoren registrerer den andre luftspalten. På dette punktet, bytte utgangsventilene tilbake til avfall. Etter full volum lastet fra trinn 5.2.4.2 dispenseres, stoppe sprøytepumpen infusjon og avslutte automatisering rutine når strømningshastigheten når null.
    5. Etter separasjonen eksperimentet er fullført, kobler SPO og LPO prøveinnsamlings ampuller og lagre dem på riktig måte for nærmere analyse.
  2. Automatisert rengjøring og dekontaminering
    MERK: Før behandlingen hver prøve, flush og rense hele fluidic systemet ved hjelp av følgende automatisert rutine.
    1. Fest SPO og LPO samling ampulle rør, samt prøven pickup røret i tomme hetteglass å samle overflødig rengjøring løsninger som vil bli spylt igjennomgh rørene.
    2. Start automatisert system rengjøring rutine. Som med Automatisert Separation prosedyren i trinn 5.2, til programmet skal kontrollere ventiler og sprøytepumpe sekvensielt laste holde kveil med rengjøring reagenser, og skylle dem gjennom systemet.
    3. Utfør følgende rengjøring rutine: i flukt med 10% blekemiddel, og deretter med 70% etanol, og avsluttes med vann eller et egnet saltvannsbuffer (f.eks, 1 x PBS eller buffer som brukes for prøvebehandling). Bruk følgende flush volum: 450 ul i blekemiddel og etanol, og 1000 ul for vann / buffer.
    4. Under rødme trinn, skylle hver reagens til SPO mens LPO utløpsventilen er satt til en port som er blokkert, da vice versa, for å fjerne eventuelle tresko i uttaket strømningsbegrensere. Opprettholde tilbaketrekning og infusjonsstrømningshastigheter på 300 til 500 ul / min for å minimalisere bobledannelse i røret og mottrykk oppbygning når enten SPO eller LPO blokkert.
    5. Discard overflødig spyle løsninger og hetteglassene der de samlet inn ved å følge egnede prosedyrer for håndtering av biologisk eller kjemisk avfall.

Representative Results

Viktige trekk ved den akustiske-mikrofluid enhet utforming er fremhevet i figur 1, og beskrevet i detalj et annet sted. 15 I korte trekk, to fluidstrømmer strømnings side-ved-side i en separasjonskanal, atskilt fra en parallell omløpskanal med en tynn silikon vegg. Siden den primære strålingsstyrken størrelse skaleres med partikkelvolum, store partikler migrerer ut av den blandede-sample inngangsstrømmen mot det akustiske trykket node ligger i den tilstøtende utvinning fluidstrømmen, mens små partikler forblir i det opprinnelige strømmen (figur 1 B, C). Den deles tokanals arkitektur forbedrer partikkelseparasjon 17 og tillater justering av node posisjon ved hjelp av ulike bypass kanal væsker. 16 fluidic brødfjel og inventar gir en robust plattform for verden å chip-tilkoblinger, og modulær design muliggjør rask endring mellom fluid chips (figur 2). Dette configuration likeså gjør reversible forbindelser væske, som sel opp til 1000 psi, gjøres raskt og pålitelig (figur 2B, E).

Resonansfrekvens f res av en chip kan anslås ved hjelp av enkle 1D analytiske beregninger (se trinn 1.1.1). Fra en mer fullstendig 2D finite-element-modell av vår enhet tverrsnitt, 16 den forventede posisjon for fokuserings 2-node resonans er 225 mikrometer fra veggen og den forventede frekvens er 1,68 MHz. Imidlertid kan f res av virkelige enheter varierer med ± 100 kHz, avhengig av driftstemperaturen og kobling av langsgående og sideveis resonanser. Derfor, etter montasje-enhet, f res må empirisk verifiseres ved aktuelle strømningshastigheter og piezo drivspenninger, som beskrevet i trinn 4 av protokollen. Figur 3 viser representative frekvensskanning tatt på 200 ul / min, med vann i de viktigste og bypass kanaler, og 20 V pp levert til piezo. Når koplingen mellom den piezo og mikrofluid anordning er god, vil partiklene fokusere tett ved resonansfrekvensen, noe som resulterer i en klar topp i det fluorescerende intensitet og migrering til den forventede fokuseringsposisjon (figur 3A). I motsetning til dette, når det er dårlig kobling, vil partiklene ikke fokusere godt og frekvensskannings resultatene vil være i likhet med figur 3B. I slike anordninger kan det piezo transduseren må re-montert, hvis en reversibel klebemiddel har blitt brukt; ellers er denne enheten uegnet når høy kvalitet med fokus eller rask flyt er avgjørende for det aktuelle programmet. Dataene i figur 3 informere om valg av driftsfrekvensen for etterfølgende eksperimenter, og spenningen og strømningshastighetsområdet er tilgjengelig for effektiv separering partikler.

filer / ftp_upload / 53051 / 53051fig5.jpg "/>
Figur 5. Automatisert prøvebehandling. (A) Skjematisk av prøven som er lagt i prøven spolen. (B) Representative strømningsprofil for en vellykket separasjons eksperiment. (C) Strømnings profil fra en separasjon kjøre under hvilket SPO uttaket tett på ca 220 sek. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Etter identifisering av flis som er effektive separatorer, blir de inkorporert i systemet vist i figur 4. Totalt system slagvolum blir minimalisert ved bruk av rør med 0,01 "indre diameter langs hovedstrømningsbanen (blå linje). Figur 5A illustrerer make-up av en typisk prøve plugg tilført gjennom systemet. En liten mengde "ledende buffer" (~ 35 mL) kreves for å precede prøven i strømmen for å eliminere svingninger i strømnings mens prøven beveger seg gjennom separasjons brikken. Figur 5B viser strømningsdata som følge av et vellykket automatisert akustisk atskillelse eksperiment. Viktige egenskaper for en vellykket kjøre omfatter: (1) en forbigående økning i strømningshastighet i både LPO og SPO som trykket bygger og fluid begynner å strømme gjennom systemet, (2) en skarp pigg som angir passasje av en luftboble (i innfelt viser en utvidet profil av en enkelt boble), som skal komme på SPO før LPO grunn av den skjeve strømmen fra de to utløp, (3) stabil strømning gjennom begge utløp mellom de to luftbobler som prøven beveger seg gjennom systemet, og (4) en gradvis reduksjon i strømningshastigheten i begge utløp etter at hele prøvevolumet blir levert til systemet. Problematiske løper er umiddelbart synlig fra strømningsprofiler som ligner på figur 5C, hvor det fremgår at den SPO ble tett etter omtrent 220 sekunder. I thi s Ved en rense prosedyre lik den som er beskrevet i trinn 5,3 bør kjøres for å rense kanalen.

Figur 6
Figur 6. Device Tunbarhet: partikkelstørrelse og Spenning Effects. Prosent av polystyren-mikrokuler ble ekstrahert på LPO er avhengig av partikkelstørrelsen og spenningen som leveres til den piezoceramic. Hver linje svarer til en annen driftsspenning på resonansfrekvens, bestemt som beskrevet i trinn 4. Total strømningsrate gjennom anordningen er 200 mL / min, med anvendt driv frekvenser mellom 1,62 og 1,64 MHz. Feilstolpene representerer standardavviket av minst tre separate forsøk. Reproduseres og modifisert med tillatelse fra The Royal Society of Chemistry fra http://pubs.rsc.org / no / Innhold / ArticleLanding / 2 014 / AN / c4an00034j.target = "_ blank"> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 6 viser samlet separasjons resultater ved hjelp av ulike polystyren partikkelstørrelser og piezo kjører spenninger som viser rammebetingelsene som er nødvendige for effektiv separasjon. Generelt er høyere spenninger (dvs. større akustiske krefter) som kreves for å trekke ut mindre partikler, som forventet. Drivspenninger ikke kan ubestemt tid økes, men på grunn av større varmetap og øker effekten av akustisk streaming. 13 Plottet tjener som en generell veiledning for partikkelseparasjon-partikkelstørrelser som viser signifikant forskjellig utvinning ved en bestemt drivspenning (for eksempel 10- og 2-mikrometer partikler på 8,8 V pp) vil skille godt. Vanligvis partikkelpopulasjoner med stor størrelse forskjell, for eksempel virus (~ 100 nm) og celler (~ 10 nm) kan skilles raskt og effektivt, som kan celler av different størrelser (f.eks 6-8 mikrometer skiveformede erytrocytter og 8-15 mikrometer leukocytter). De spesifikke betingelser som kreves for å arbeide med andre celletyper, må bestemmes empirisk, som celle form, tetthet og sammentrykkbarhet påvirke dens akustiske kontrast, i tillegg til cellestørrelsen. For dette formål er fremgangsmåten i trinn 4 er nyttig for å bestemme brukbare separasjonsbetingelser for en hvilken som helst ny celle eller partikkeltype, og ikke bare for å vurdere kvaliteten av en spesiell acoustophoresis enhet.

Figur 7
Figur 7. Separasjon Effektivitet av Cell-Virus Spiked Samples. Separasjon resultater fra (A) Raji celler tilsatt Dengue virus (DENV) og (B) Raji celler og Boa nyreceller tilsatt Golden Gate Virus (GGV). Prosentandeler innsamlede er definert som den fraksjon av virus eller celler som går ut fra en spesifikkutløp i forhold til den totale mengden som kommer ut av chip. De feilfelt for (A) er standardavviket for 3 forsøk, mens prøvene i (B) ble kun behandlet én gang på grunn av de lave mengder tilgjengelig. 1 x PBS ble anvendt som prøvebuffer og gjenvinning av væske, med vann i bypasskanal for alle eksperimenter. Chip arbeidsfrekvenser varierte mellom 1,60 og 1,64 MHz, med drivspenninger mellom 16 og 20 V pp. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

For å demonstrere nytten av denne plattformen for biologisk partikkelseparasjon, vi først brukte den til å behandle velkarakteriserte biologiske prøver: menneske Raji celler (10 5 celler / ml, gjennomsnittlig diameter 8-10 mikrometer 25) tilsatt dengue virus (DENV, 10 5 pfu / ml, omtrentlig diameter på 50 nm). 26 Figur 7A viser den prosentandel av Raji-celler og DENV innsamlet i både SPO og LPO (definert som den fraksjon av hver partikkel typen samlet opp fra hvert utløp i forhold til den totale mengden av hver partikkel hentet fra chip). Forsøket ble gjentatt i triplikat, og Raji-celler ble kvantifisert ved anvendelse av en Coulter-teller, mens DENV ble kvantifisert ved anvendelse av en revers-transkripsjon kvantitativ polymerasekjedereaksjon (RT-qPCR).

Deretter ble ytelsen til systemet testes i et scenario som er mer realistisk for behandling av kliniske prøver, hvor de nøyaktige fysikalske egenskapene til partiklene kan være ukjent, og de tilgjengelige prøvemengder er lavere. Her vurderte vi separering av den nylig identifiserte Golden Gate virus (GGV), en slange patogener som infiserer boa innsnevrende nyreceller. 27 Størrelsen på GGV viruspartikkel har ennå ikke blitt målt, men siden GGV tilhører Arenaviridae familie, det er sannsynlig av entilsvarende størrelse, mellom 100 og 150 nm. 28 Vi behandlet prøvene med GGV piggete (10 4 PFU / ml) til Raji menneskeceller (ikke en infeksjon målet for virus), og boa nyreceller (infeksjon mål for GGV, omtrentlig størrelse 10 27 um) med begge celletyper 10 4 celler / ml. Som disse prøvene var tilgjengelig i små mengder, er atskillelse skyldes bare én forsøkskjøring rapportert i dette arbeidet. Figur 7B viser prosentandelen av Raji celler, Boa celler, og GGV hentet fra SPO og LPO. Celler ble kvantifisert i disse forsøkene ved å telle på en hemacytometer og virus ble kvantifisert ved RT-qPCR.

Discussion

Denne protokollen presenterer systemnivå integrasjon av microfluidic enheter til macroscale utstyr for å utføre automatisert biologisk utvalgets behandling. Modulariteten av denne plattformen gjør det mulig å kunne tilpasses en hvilken som helst kontinuerlig strømningsanordning, og, som et eksempel, fokuserer den presenterte protokollen på å karakterisere og å optimalisere ytelsen til en acoustofluidic partikkelseparasjonsanordning. Tre store fordeler av denne protokollen er uthevet: (i) modularitet og chip-til-verden grensesnitt, (ii) robust karakterisering av ytelse fra enheten, og (iii) automatisk behandling av nøyaktig oppmålte prøvevolum for partikkelseparasjon.

jeg. Modularitet og chip-til-verden grensesnitt

Som vist i figur 2, er microfluidic brikken montert på en tilpasset brødfjel for enkelt å passe inn i en objektbord for direkte observasjon. Breadboard inneholder # 6-40 UNF gjengede hull på en 5 mm-banen rutenett, enabling brikken som skal sikres, og væskekoplinger skal gjøres. Væsken tilkoblinger er TITT rør med maskinerte ender, som tetning mot fluidic chip med en gummi ansikt-pakning og en rustfritt stål krage. Dette grensesnittet ordningen gjør for enkel chip utskifting og rask enhet redesign, krever få eller ingen endringer i andre systemkomponenter, levert chip fotavtrykk er i samsvar med rutenett format. For eksempel har vi brukt denne plattformen med microfluidic chips for kontinuerlig strømning elektroforese, termisk cellelysis, 29 hurtig blanding av reagenser for kjemisk syntese, og encellede fangst og avhør.

ii. Robust karakterisering av enhetens ytelse

For å optimalisere ytelsen til alle mikrofluidseparasjonsenhet, sin drift må først bli grundig karakterisert. Systemet er beskrevet her støtter utviklingen av raske og automatiserte protokoller for å gjøre dette. For den spesifikke example av akustiske fokusere enheter, fokuserings kvalitet, driftsfrekvens, og stillingen fokusert partikler i mikrofluidkanalen må måles for hver enkelt enhet. Disse målingene krever sveiper gjennom en rekke piezoceramic driv frekvenser, spenninger og strømningsrater, for å identifisere de optimale parameterkombinasjoner for høy kvalitet separasjon. Den presenterte protokollen varierer automatisk avstembare disse parametrene og fanger opp den aktuelle data- dvs. fluorescerende bilder av partiklene som strømmer i kanalen som er etterbehandlet for å generere de nødvendige målinger av partikkel fokus kvalitet, frekvens og posisjon (figur 3).

Full karakterisering av akustisk ytelse enheten krever gjenta trinn 4.4 og 4.5 etter behov under ulike eksperimentelle forhold. For eksempel er den absolutte fokuserte posisjonen av et chip funnet ved å kjøre frekvens scan ved relativt lave strømningshastigheter og høy spennings for å sikre fullstendig migrering til noden sted. I tillegg kan slike frekvens skanninger vurdere kvaliteten på enheten enheten (når det kjøres med isopor perler av kjent størrelse), eller å finne ut hvordan en tidligere ukjent partikkel type vil oppføre seg i systemet (etter en chip har vært preget med perler). En brikke med god energioverføring fra piezoceramic til mikrofluidkanalen vil resultere i tett fokusering ved høye strømningshastigheter (> 1 ml / min) og lav spenning (V pp 12-15), mens de med dårlig energioverføringen ikke vil fokusere enda ved lave hastigheter (<100 mL / min) og høye spenninger (> 20 V pp). Vi har funnet at intim kontakt mellom mikrofluid chip og piezoceramic er kritisk for effektiv energioverføring inn i fluidet. Videre undersøkelser av optimal metode for liming microfluidic chip og piezoceramic vil gjøre det mulig pålitelig produksjon av høy ytelse enheter.

Til slutt, en komplettbilde av et acoustophoretic enhetens drift kan oppnås ved å kombinere de bildebaserte frekvensskannings målinger av trinn 4 (og fig 3) med partikkeltellinger oppsamlet fra SPO og LPO som funksjoner av de relevante driftsparametre, fra separasjons eksperimenter utført med mikrokuler , som beskrevet i trinn 5. Som vist i figur 6, kan en slik rekke automatiske eksperimenter hurtig karakterisere et individ enhetens ytelse og tunability, informerer brukeren av den optimale parameter plass for drift av enheten for partikkelseparasjon.

iii. Automatisert små-utvalgets behandling for partikkelseparasjon

For vellykket og nøyaktig mikrofluid chip-baserte type behandling, er det viktig å pålitelig og nøyaktig måler, belastning, levere og samle volumene av fluid etter hvert som de passerer gjennom. Denne nøyaktighet er særlig viktig når prøvevolumet er lite(~ 0,1-1 ml), noe som er vanlig i klinisk eller forsknings laboratoriet 30 Presis prøvehåndtering er utfordrende i tradisjonelle microfluidic eksperimenter som benytter manuell tilbaketrekking av prøven inn i en sprøyte og infusjon i en enhet uten tilbakeføring av når prøven. har blitt skilt, og når det skal samles. Den presenterte protokollen benytter automatisert prøve spiral lasting og Levering er kombinert med tilbakemelding i sanntid fra sensorer for å aktivere reproduserbare separasjoner av små prøvevolumer.

Figur 5 viser de strømningsprofiler målt på SPO og LPO fra en typisk separasjon eksperiment. Først blir ledende buffer på minst 35 ul belastet for å sikre stabil strømning før prøven når den akustiske chip. Prøvevolumer mindre enn 100 ul er ikke anbefalt for denne systemkonfigurasjon, fordi prøvefortynning på grunn av det ledende bufferen blir for stor. En plugg av luft blir brukt ved begynnelsen av the injeksjon før den ledende buffer for å separere prøven pluggen fra den væske som følger, hindrer blanding og fortynning av prøven, og tjener som en indikator for de sensorer. Etter en innledende transient som fluid begynner å bevege seg gjennom systemet, skarp pigg signaler i begge utløp indikere passeringen av den første luftboble. Disse transientene blir etterfulgt av en lang periode med stabil strømning som prøven strømmer gjennom systemet, og deretter en annen spiss når den andre luftboble passerer, og til slutt en eventuell reduksjon i strømningshastigheten til null etter at sprøyten pumpen stopper.

Passasjen av luft gjennom pluggene sensorer blir benyttet som triggerpunkter for å skifte ventilene for å starte og stoppe prøvetaking, og dermed minimere tapt prøven og fortynning av ikke-prøvefluidvolumer. Lukket-sløyfe måling av behandlet prøvevolum eliminerer behovet for å omprogrammere disse verdiene før starten av eksperimentet hver gang inngangs prøven endres. Denne funksjonen erspesielt viktig når prøvevolumet er begrenset, for eksempel i tilfelle av mange kliniske prøver. Sanntidsvæskeovervåkning bistår også i feilsøking; en dårlig run (f.eks, en tresko forming i ett av utløpene) er umiddelbart tydelig fra de resulterende strømningsprofiler, som vist på figur 5b.

For å demonstrere fleksibiliteten og effektiviteten av acoustofluidic separasjon bruke presenteres systemarkitektur, renset DENV og GGV virus aksjer ble tilsatt i celle aksjer og adskilt med behandling gjennom microfluidic chip. Figur 7a viser at Raji celler ble godt adskilt fra virus, som 97 % av Raji-celler som kommer ut av brikken ble funnet å være i LPO, for derved å etterlate et høyt anriket prøve av DENV i SPO. Til sammenligning, effektiviteten av DENV separasjon var lavere, med 70% av DENV som kommer ut av brikken befinner seg i samme SPO. Dette kan tilbakeføres til svak konvektiv blanding indusert av omdreininger av separatipå kanal, men mer sannsynlig at noen DENV partikler som migrerer sammen med Raji-celler i LPO. Celler migrerer lateralt over strømlinjene dra litt væske med dem, selv ved lave Reynolds tall. Ved denne mekanisme, så vel som ikke-spesifikk overflateadsorpsjon, viruspartikler overføres til LPO. Likevel er svært anriket prøve av DENV i SPO en betydelig fordel, for eksempel når de novo-sekvensering blir brukt til å detektere og identifisere virus.

Figur 7b viser at i en forsøkskjøring ble bare omtrent 70% av Boa celler som kommer ut av brikken befinner seg i samme LPO, sammenlignet med nesten 100% separasjonseffektivitet for Raji-celler. Forskjellen i separasjonsevne mellom de to celletypene kan skyldes en mindre gjennomsnittlig størrelse eller en lavere tetthet av Boa celler sammenlignet med Raji-celler, og derfor resulterer i mindre akustiske krefter. For å bekrefte eller avkrefte disse antakelser, størrelse, tetthet og morfologi av Boaceller i suspensjon (som normalt vokser tilhenger) fra Boa celler må måles nøyaktig, en innsats for videre etterforskning. I de samme eksperimentene, på samme måte som forsøkene med DENV, mesteparten av den gjenvunnede GGV gått ut fra SPO, noe som indikerer en berikelse av viral fraksjon.

De presenterte data markere iboende utfordringene i ingeniør bredt-aktuelle plattformer for behandling av en rekke biologiske prøver. Viktigere, kan de biologiske interaksjoner begynner å spille en like stor rolle som de fysiske og mekaniske påvirkninger. Men disse foreløpige forsøkene også demonstrere makt og løfte om å bruke denne systemarkitektur for utvalgets behandling i kliniske og forskningssøknader. Som en robust, godt karakterisert utviklet system, gir denne plattformen muligheten til å søke svar på nye vitenskapelige spørsmål.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials required for Steps 1-3: Device Design, Fabrication and Assembly
Double Sided Polished Silicon Wafer Silicon Quest International, Inc. San Jose, CA, USA 100 mm <100>  prime wafer 1-20 ohm-cm, 495 ± 25 µm Double-side polished
Glass Wafer Bullen Ultrasonics, Eaton, OH, USA 100 mmx0.5 mm Boro
Photoresist, AZ 1518 MicroChemicals GmbH, Ulm, Germany AZ 1518 Photoresist used to adhere wafer to blank wafer for DRIE etching
Photoresist, AZ 4620 MicroChemicals GmbH, Ulm, Germany AZ 4620 Photoresist to define fluidic and via mask patterns
DRIE plasma etcher STPS, Newport, NP, United Kingdom Multiplex Advance Oxide Etch (AOE) ICP system
Wafer Bonder Electronic Visions Group,  St.Florian am Inn, Austria EVG 501
Dicing saw Kulicke & Soffa Industries, Singapore K&S 982
Epoxy kit Epoxy Technology, Billerica, MA, USA EPO-TEK 301 Epoxy used to couple piezo and microfluidic chip
PZT piezoceramic  Piezo Systems, Woburn, MA, USA PSI-5A4E 37.5 × 10 × 0.5 mm
28 AWG Kynar-insulated solid wire Squires Electronics, Cornelius, OR, USA UL1422
2-part silver epoxy  MG Chemicals, Surrey, BC, Canada 8331 Conductive adhesive for attaching wire leads to PZT
L-edit Tanner EDA, Monrovia, CA, USA Ledit v15.1 64-bit CAD software for mask layout
Materials required for Step 4: Characterizaiton of Acoustic Focusing Performance
Dual Pump Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA PHD ULTRA Series, 703007
5 ml syringes Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA 309646
Luer to Threaded port adapter IDEX, Oak Harbor, WA, USA P-659 Connects syringe to tubing
Union IDEX, Oak Harbor, WA, USA P-623 Connects world to chip connections to fluoropolymer tubing.  Can also use webbed 
Ferrule 1/4-28 flat bottom IDEX, Oak Harbor, WA, USA P-200 Used with nut to make connections between tubing and syringe, flow sensors and world to chip hardware
Nut  1/4-28 flat bottom IDEX, Oak Harbor, WA, USA P-202 Used with ferrule to make connections between tubing and syringe, flow sesnsors and world to chip hardware
1/16" OD Fluoropolymer tubing IDEX, Oak Harbor, WA, USA 1912L Tubing to connect syringe pumps to world to chip connections.  Tubing size is not critical during claibration steps (.01-.03" ID typically used, other suitable part numbers: 1907L, 1902L).
Small ID fluoropolymer tubing IDEX, Oak Harbor, WA, USA 1476-20 Used for Flow restrictors: 0.006" ID, 1/16" OD FEP 
PEEK tubing Connects from chip to fluoropolymer tubing.
Cooling fan Multicomp, Leeds, England MC19663
Function Generator Agilent, Santa Clara, CA, USA 33220A
RF amplifier ENI, Rochester, NY 325 LA Must be able to amplify signals from <1 V in the range of 1-2 MHz to 25 Vpp to the piezo.
CCD Camera Photometrics, Tucscon, AZ, USA CoolSnap HQ
Inverted Microscope Zeiss, Oberkochen, Germany Axiovert S100
FITC filter set Chroma Tech, VT, USA SP101
Objective, 10X Zeiss, Oberkochen, Germany ACHROPLAN
Oscilloscope Tektronix, Beaverton, OR, USA TDS3014B To monitor voltage output by RF amplifier
MatLab Mathworks, Natick, MA, USA R2014a
Driver interface software to integrate Photometrics camera with LabVIEW R Cubed Software, Lawrenceville, NJ, USA SITK
Tween 20 Sigma Aldrich, St. Lousi, MO, USA P9416
Dragon Green Fluorescent 5.76 or 7.32 µm Beads Bangs Laboratory, IN, USA FS06F
Additional materials required for Step 5: Automated Separation
Multiport valves VICI, Houston, TX, USA C25Z-3180EUHA In the current configuration 4 valves are needed
Flow Sensors Sensirion, Westlake Village, CA, USA SLI-1000
Fluoropolymer tubing, .01 and .03" ID IDEX, Oak Harbor, WA, USA 1902L and 1912L High purity PFA preferred
Nut VICI, Houston, TX, USA ZN1PK-10 Used with ferrule to make connections between tubing and valves. Alternative part numbers: MZN1PK-10, LZN1PK-10
Ferrule VICI, Houston, TX, USA ZGF1PK-10 Used with nut to make connections between tubing and valves.  
LabVIEW National Instruments, Austin, TX, USA LabVIEW Professional Development system Laboratory Automation Software
PBS Teknova, Hollister, CA, USA P0200
Raji Cells ATTC, Manassas, VA, USA CCL86
Boa Cells Kindly provided by the DeRisi Laboratory at UCSF
GGV Kindly provided by the DeRisi Laboratory at UCSF
DENV Kindly provided by Jose Pena at LLNL
Coulter Counter Z2 Beckman Coulter, Brea, CA, USA Z2
Hemacytometer Fisher Scientific, Waltman, MA, USA 0267151B

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gossett, D. R., Weaver, W. M., et al. Label free cell separation and sorting in microfluidic systems. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397, (8), 3249-3267 (2010).
  2. Lenshof, A., Laurell, T. Continuous separation of cells and particles in microfluidic systems. Chemical Society Reviews. 39, (3), 1203-1217 (2010).
  3. Sajeesh, P., Sen, A. K. Particle separation and sorting in microfluidic devices a review. Microfluidics and Nanofluidics. 17, (1), 1-52 (2014).
  4. Bhagat, A. A. S., Bow, H., Hou, H. W., Tan, S. J., Han, J., Lim, C. T. Microfluidics for cell separation. Medical & Biological Engineering & Computing. 48, (10), 999-1014 (2010).
  5. McGrath, J., Jimenez, M., Bridle, H. Deterministic lateral displacement for particle separation a review. Lab Chip. 14, (21), 4139-4158 (2014).
  6. Jubery, T. Z., Srivastava, S. K., Dutta, P. Dielectrophoretic separation of bioparticles in microdevices A review. ELECTROPHORESIS. 35, (5), 691-713 (2014).
  7. Jin, C., McFaul, S. M., et al. Technologies for label free separation of circulating tumor cells from historical foundations to recent developments. Lab on a Chip. 14, (1), 32 (2014).
  8. Trujillo, F. J., Juliano, P., Barbosa Cánovas, G., Knoerzer, K. Separation of suspensions and emulsions via ultrasonic standing waves – A review. Ultrasonics Sonochemistry. 21, (6), 2151-2164 (2014).
  9. Bridle, H., Miller, B., Desmulliez, M. P. Y. Application of microfluidics in waterborne pathogen monitoring A review. Water Research. 55, 256-271 (2014).
  10. Mariella Jr, R. Sample preparation the weak link in microfluidics-based biodetection. Biomedical microdevices. 10, (6), 777-784 (2008).
  11. Gor’kov, L. P. On the forces acting on a small particle in an acoustic field in an ideal fluid. Soviet Physics Doklady. 6, 773-775 (1962).
  12. Settnes, M., Bruus, H. Forces acting on a small particle in an acoustical field in a viscous fluid. Physical Review E. 85, (1), 016327 (2012).
  13. Barnkob, R., Augustsson, P., Laurell, T., Bruus, H. Acoustic radiation and streaming-induced microparticle velocities determined by microparticle image velocimetry in an ultrasound symmetry plane. Physical Review E. 86, (5), (2012).
  14. Bruus, H. Acoustofluidics 7 The acoustic radiation force on small particles. Lab Chip. 12, (6), 1014-1021 (2012).
  15. Fong, E. J., Johnston, A. C., et al. Acoustic focusing with engineered node locations for high performance microfluidic particle separation. Analyst. 139, (5), 1192-1200 (2014).
  16. Fong, E. J., Bora, M., et al. Continuously Variable Node Position in a High Throughput Acoustofluidic Device. Micro Total Analysis Systems. 1184-1186 (2014).
  17. Jung, S. Y., Notton, T., Fong, E., Shusteff, M., Weinberger, L. S. Spatial tuning of acoustofluidic pressure nodes by altering net sonic velocity enables high-throughput efficient cell sorting. Lab on a Chip. 15, (4), 1000-1003 (2015).
  18. Franssila, S. Deep Reactive Ion Etching. Introduction to Microfabrication. 255-270 (2010).
  19. Sharma Rao, B., Hashim, U. Microfluidic Photomask Design Using CAD Software for Application in Lab On Chip Biomedical Nanodiagnostics. Advanced Materials Research. 795, 388-392 (2013).
  20. Melin, J., Quake, S. R. Microfluidic Large Scale Integration The Evolution of Design Rules for Biological Automation. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 36, (1), 213-231 (2007).
  21. Madou, M. J. Fundamentals of microfabrication: the science of miniaturization. CRC Press. Boca Raton. (2002).
  22. Krulevitch, P., Benett, W., Hamilton, J., Maghribi, M., Rose, K. Polymer based packaging platform for hybrid microfluidic systems. Biomedical Microdevices. 4, (4), 301-308 (2002).
  23. Leslie, D. C., Easley, C. J., et al. Frequency specific flow control in microfluidic circuits with passive elastomeric features. Nature Physics. 5, (3), 231-235 (2009).
  24. Oh, K. W., Lee, K., Ahn, B., Furlani, E. P. Design of pressure driven microfluidic networks using electric circuit analogy. Lab on a Chip. 12, (3), 515-545 (2012).
  25. Mittelbrunn, M., Gutiérrez Vázquez, C., et al. Unidirectional transfer of microRNA loaded exosomes from T cells to antigen presenting cells. Nature Communications. 2, 282 (2011).
  26. Acosta, E. G., Castilla, V., Damonte, E. B. Functional entry of dengue virus into Aedes albopictus mosquito cells is dependent on clathrin mediated endocytosis. Journal of General Virology. 89, (2), 474-484 (2008).
  27. Stenglein, M. D., Sanders, C., et al. Identification Characterization and In Vitro Culture of Highly Divergent Arenaviruses from Boa Constrictors and Annulated Tree Boas Candidate Etiological Agents for Snake Inclusion Body Disease. 3, (4), e00180 12 (2012).
  28. Arenaviridae Viral Hemorrhagic Fevers (VHFs). CDC. Available from: http://www.cdc.gov/vhf/virus-families/arenaviridae.html (2013).
  29. Packard, M., Wheeler, E., Alocilja, E., Shusteff, M. Performance Evaluation of Fast Microfluidic Thermal Lysis of Bacteria for Diagnostic Sample Preparation. Diagnostics. 3, (1), 105-116 (2013).
  30. Lion, N., Reymond, F., Girault, H. H., Rossier, J. S. Why the move to microfluidics for protein analysis. Current Opinion in Biotechnology. 15, (1), 31-37 (2004).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats