Mikrofluidapparat platform for Precision Small-volumen prøve behandling og dens anvendelse til Størrelse Separate biologiske partikler med en akustisk Microdevice

1Materials Engineering Division, Lawrence Livermore National Laboratory, 2Department of Biomedical Engineering, Boston University
Published 11/23/2015
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Bioengineering
 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Fong, E. J., Huang, C., Hamilton, J., Benett, W. J., Bora, M., Burklund, A., et al. A Microfluidic Platform for Precision Small-volume Sample Processing and Its Use to Size Separate Biological Particles with an Acoustic Microdevice. J. Vis. Exp. (105), e53051, doi:10.3791/53051 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

En stor fordel ved mikrofluidapparater er evnen til at manipulere små prøvevolumener, hvorved reagens affald og konservering ædle prøve. Men for at opnå robust prøve manipulation er det nødvendigt at tage fat enhed integration med Makroskalaplacering miljø. For at realisere gentagelig, følsomme partikelseparation med mikrofluidapparater, denne protokol viser en komplet automatiseret og integreret mikrofluid platform, der muliggør nøjagtig behandling af 0.15-1.5 ml prøver ved anvendelse mikrofluidenheder. Vigtige aspekter af dette system omfatter modulære enhed layout og robuste armaturer resulterer i pålidelig og fleksibel verden til chip-forbindelser, og fuldt automatiseret håndtering væske, der udretter lukkede kredsløb prøvetagning, systemet rengøring og priming skridt til at sikre gentagelig drift. Forskellige mikrofluidenheder kan bruges i flæng med denne arkitektur. Her har vi indarbejde en acoustofluidic enhed, detalje sin characterization, performance optimering, og demonstrere dets anvendelse til størrelsen-adskillelse af biologiske prøver. Ved at bruge real-time feedback under adskillelse eksperimenter, er prøveindsamling optimeret til at bevare og koncentrere prøve. Selvom kræver integration af flere stykker udstyr, fordelene ved denne arkitektur indbefatter evnen til at behandle ukendte prøver uden yderligere optimering, nem udskiftning af enheden, og præcis, robust prøve behandling.

Introduction

Prøve separation og fraktionering er en af ​​de mest lovende områder for anvendelsen af ​​mikrofluide teknologier. Sådanne prøve håndtering trin er integreret for effektive klinisk diagnostik, terapi udvikling, biosurveillance indsats og fremskridt inden for life science forskning og teknologi. Et utal mikrofluide adskillelse strategier er blevet påvist for fluid-suspenderede partikler og kolloider, samt til kemiske og biologiske arter; flere anmeldelser giver oversigter over de seneste fremskridt og udviklingen på disse områder 1 - 9. Selv om mange af disse mikrofluide separationsteknologier (i det følgende benævnt "Core Devices") er blevet grundigt karakteriseret, har få rapporter betragtes prøven adskillelse problem på et systemniveau. Core-enheder er typisk individuelle centimeter skala chips, grænseflader til fluoropolymer slanger, med væske leveret af en fortrængning eller tryk pumpe.Men hvis løftet om mikrofluidik - herunder øget automatisering, pålidelighed og reduktion i prøvevolumener - er at blive til virkelighed, i hvert fald en tilsvarende indsats skal afsættes til design af en fuldstændig adskillelse system, som Core Device er integreret .

Desuden er en stor udfordring for mikrofluide tilgange til Biodetection er makro til mikro-interface. Det vedrører ikke kun til de fysiske "verden-til-chip" forbindelser af en mikrofluid enhed til makroskala komponenter, og misforholdet mellem typiske kliniske eller analytisk prøvevolumener (~ 0,1-10 ml) og den interne volumen af ​​mikrofluide chips (~ 0,01-10 pi), men også til de statistiske begrænsninger prøveudtagning følge af at bygge bro disse størrelse skalaer. Disse spørgsmål bidrager til opfattelsen af, at prøven forbehandling og forberedelse er "svage led" af Biodetection. 10. beskrevet i dette arbejde ta platformKES store skridt i retning af at tage disse udfordringer.

Tage et system-niveau visning, denne protokol detaljer pålidelig behandling af præcist afmålte analytisk skala mængder (der spænder fra 0,15 til 1,5 ml) på ~ 10 min tidsplaner. Dette er en "one-knappen" operation: når kilden hætteglas indeholdende prøven og destination hætteglas for fraktion indsamlingen er placeret i systemet, kommandoen "run" indleder proceduren, og alle trin er computerstyret. Ved afslutningen af ​​en kørsel, kan hætteglassene indsamling fjernes fra systemet til nedstrøms analyse af de separerede fraktioner.

Core Device i dette system er en akustoforese chip, som udtrækker pattedyrscellelinier størrelse (5-20 um) partikler fra prøven. Acoustophoretic adskillelse Her vælges først og fremmest fordi det er high-throughput (op til 100s ul / min), label-fri og ikke-kontakt, hvilket giver fordele i at adskille levedygtig ViruSES fra celler, som kun få andre mikrofluide teknikker kan matche. Fysik akustisk partikel fokusering er blevet grundigt beskrevet, 11-13 og er ikke i fokus i denne protokol, men et kort resumé af de underliggende begreber følger at hjælpe med at forstå ansøgningen til mikrofluid adskillelse.

Ultralyd stående bølger resonating i væskefyldte mikrokanaler producerer tryk felter, som giver anledning til kræfter, der driver partikler mod knudepunkter i lavt tryk. Kraften størrelse afhænger af partiklens volumen, og på et akustisk kontrast faktor afledt af de relative tætheder og compressibilities af partiklen og suspenderingsfluidet. 14 Som sådan akustisk fokus er velegnet til separation af celle-størrelse (~ 7-15 um) fra virus-størrelse (~ 50-200 nm) partikler. De større partikler migrerer mod et tryk node; Men da kraften størrelse er meget lille forpartikler mindre end 2-3 um, disse små partikler eller opløste arter næsten ikke bevæge sig overhovedet. Vores specifik gennemførelse af akustisk separation, som tidligere beskrevet, 15 inkorporerer en tynd væg at opdele væskekanalen og tillader justerbar, asymmetrisk placering af fokuseringsposition. Dette tilføjer fleksibilitet i enheden design, og de ​​fordele, inklusive øget adskillelse kvalitet og ydeevne speed-er fuldt beskrevet andetsteds. 16,17

, En stor fordel af det system-niveau design tilgang beskrevet i dette arbejde er, at det kan tilpasses til et stort udvalg af mikrofluide Core Enheder. For eksempel kan de fleste andre kontinuerlig flow separation modes, herunder inerti, flow-felt fraktionering, deterministisk sideforskydning (DLD), og forskellige typer af elektrokinetiske enheder let integreres med passende justeringer for at tage højde for ændringer i indløb / udløb konfiguration , strømningshastigheder,og prøvevolumener. Enheder med forskellige former for on-chip felter (elektriske, magnetiske) eller gradienter (termisk, kemiske) kan kræve yderligere forbindelser til chippen, eller integration af ekstra hardware, som denne platform kan rumme.

Denne protokol giver de nødvendige skridt til at designe en mikrofluid adskillelse enhed, og at fremstille silicium-glas chips ved dyb reaktiv ion ætsning (DRIE, plasma-etch proces fås i mange microfabrication faciliteter, som bruger skiftevis cykler af ætsning og passivering at opnå dyb funktioner med lodrette sidevægge 18). Dernæst beskriver vi karakterisering af acoustofluidic enhed at bestemme den optimale driftsparametre for separation, og endelig detaljeret fuldt integreret separationssystem og proceduren for behandling af biologiske prøver. Typiske enhed karakterisering resultater og prøve databehandling derefter præsenteret og diskuteret, og de vigtigste fordele ved denne releach er fremhævet, herunder modularitet, robusthed, præcision og automatisering.

Protocol

1. Acoustophoretic Device Design og fotomaske Layout

BEMÆRK: Generelle overvejelser og vejledning til mikrofabrikation proces design og maske layout kan findes i tekster om mikrofabrikation og tutorials for fotomaske design 19-21.

  1. Læg Maske 1, fluidik Layer (forsiden), ved hjælp af passende CAD-software. Vælg en geometri, der tillader injektion af prøve og separation egnet til den ønskede anvendelse.
    1. For akustisk fokus, skal du indstille fluidisk kanalbredde w for at give en resonansfrekvens f n større end 1 MHz ifølge ligningen f n = nc / 2w, hvor c er lydens hastighed i den pågældende væske og n er antallet af stående bølge knudepunkter (f.eks, for en 900-um bred kanal, den to- node resonans forventes ved f 2 = 1,65 MHz).
      BEMÆRK: Partikels indtager forskellige laterale positioner nær slutningen af ​​adskillelsen kanal skal forlade forskellige forretninger. I denne protokol, er partikler adskilt af størrelse, så udløbene er betegnet SPO LPO, til små partikler og store partikeludgangen henholdsvis som vist i figur 1.
    2. Indstil fluidkanalen længde for at kontrollere, hvor længe partikler udsættes for adskillelsen felt ved en bestemt strømningshastighed. Længere on-chip opholdstid for partikler til at migrere på grund af adskillelse kræfter skal handles ud mod større krævede chip fodaftryk.
      BEMÆRK: I vores akustiske fokus anordninger, strømningskanalen gør tre passerer ned chippen for øget opholdstid (figur 2a). Ved en typisk total strømningshastighed på 200 ul / min, partikler strømmer gennem 300 x 200 um tværsnit, 117 mm lang separationskanalen tilbringer i gennemsnit 2,1 sekunder i det akustiske område.
  2. Medtag fluide havne i masken layout for forbindelser til standard slange arrangeret på en standardiseret gitter (5-mm stigning). Omfatte passende referencemærker for tilpasning af masker til hinanden under fremstilling og opskæring i skiver af individuelle enheder.
  3. Læg Mask 2, Via Layer (bagsiden), som kun omfatter fluide porte. Medtag referencemærkernes for tilpasning til Mask 1.

Figur 1
Figur 1. Acoustofluidic enhed. Skematisk skitser af acoustophoretic enhed arkitektur. (A) Ovenfra, der viser den samlede H-filter konfiguration (ikke målfast). (B) Skematisk af kanalen tværsnit på det sted markeret med den sorte stiplede linje i (a), der viser trykket inden (blå stiplede linier), og følelsen af de akustiske primære stråling kræfter (PRF), der driver partiklerne mod nodal fly (røde pile). Kanalen tværsniter 900 x 200 um med en væg ca. 10 um tyk adskille den vigtigste (300 um bred) og bypass-kanaler. (C) 3D-gengivelse af partikel adskillelse. Klik her for at se en større version af dette tal.

2. renrum Fabrikation af Mikrofluid Chips for akustoforese

  1. Mønster bagsiden væskeporte hjælp Mask 2 på en dobbelt-side poleret 0,5-mm tyk, en diameter på 100 mm <100> silicium wafer ved standard styret modstå fotolitografi. Etch denne geometri ved dyb reaktiv ion ætsning (DRIE) til en dybde på 350-400 um.
  2. Vend skiven om, og mønsteret front-side fluidkanal geometri ved hjælp Mask 1 ved standard-positive modstå fotolitografi på den anden side af silicium. Derefter montere enheden wafer til en anden (blank silicium) luftfartsselskab wafer hjælp fotoresist.
  3. Etch kanalerne, også af DRIE, til en dybde på 200 um, gennemgående ætsning af silicium i havnen steder (bæreren wafer beskytter DRIE værktøjet overflade). De-montere enheden wafer fra råemnet Si wafer ved opblødning i modstå-stripping løsning.
  4. Rengør enheden wafer og en karakterløs 0,5 mm tykt borosilikatglas wafer hjælp Piranha-opløsning (svovlsyre og hydrogenperoxid i et 3: 1 forhold).
  5. Forsegl fluidkanalerne ved anodisk binding af glas og silicium wafers anvendelse af følgende parametre: kammertryk på 3 mTorr, stempeltryk ved 1000 N, temperaturen på 350 ° C, og anvende 750 V, indtil strømmen falder under 0,2 mA.
  6. Skær de individuelle chips fra hinanden med en diamant klinge på en udskæringssav.

3. Afsluttende Device Assembly

  1. Piezo Transducer Attachment
    BEMÆRK: Ultralyd genereres i mikrofluid chip af en piezokeramisk transducer knyttet til silicium side.
    1. Fra påwo-komponent lav viskositet epoxy kit, afvejes den anbefalede forhold mellem begge komponenter og bland dem grundigt.
    2. Dispenser epoxy blanding med en pipette og fordeles jævnt over en blyzirconattitanat (PZT) piezokeramiske at skabe et tyndt, jævnt lag (ca. 10 pi epoxy blanding til en piezo med dimensionerne 37,5 × 10 × 0,5 mm).
    3. Anvendelse af et egnet jig eller stativ, tilslutter epoxy side af piezokeramiske med mikrofluid chip, der giver en overhængende område på den ene side til senere wire fastgørelse (se figur 2a), og bringe de to komponenter i kontakt med. Klemme samlingen i en skruestik, pas på ikke at knække nogen af ​​komponenterne, og helbredelse ved den temperatur og varighed anbefales af epoxy producenten.
    4. Efter epoxyen er hærdet, vedhæfte fin gauge ledning fører til hver side af piezokeramiske, ved lodning med en fin-spids loddekolbe, hvilket gør kortest mulige kontakt med piezo at undgå thermally de-polariserende det. Alternativt kan du bruge en ledende lim til at lime ledningerne til piezo.

Figur 2
Figur 2. Fluidsystem Breadboard, Chip Montering og World-til-Chip Interface. Billeder af (a) den akustiske microfluidic chip (eksterne dimensioner af 70 × 9 × 1 mm) med vedhæftede piezo transducer wire kundeemner, som viser tre gennemkørsler af adskillelsen kanal ned chip, (b) custom fluide forskruninger og bearbejdede slanger komponenter til chip-til-verden interface, (c) chippen monteret på undersiden af fluide breadboard hjælp fastspænding inventar, der spænder en åbning i breadboard at tillade fan køling, (d) et billede set ovenfra af breadboard med vedhæftede slangeforbindelser og køler, og (e) et tværsnit skematisk af forskruninger, som interface Tubing med de monterede mikrofluid chip. Klik her for at se en større version af dette tal.

  1. Enhed Montering og World-To-Chip Interfacing
    1. Fastgør chip til "fluide breadboard" (en plade med et gitter af regelmæssigt fordelte gevindskårne gennemgående huller) under anvendelse af fastspænding inventar. Vedhæft en køleventilator til breadboard at regulere temperaturen under akustiske eksperimenter (se figur 2).
      BEMÆRK: Betjening uden ventilatoren ved typiske drev spændinger hæver enheden temperaturen til 70-80 ° C. Dette forskyder betydeligt resonansfrekvensen skyldes ændret lydhastighed i væsken og kan have negativ indflydelse på holdbarheden af ​​de biologiske partikler, der behandles.
    2. Skru chip-til-verden-stik, som tidligere beskrevet andetsteds 22 og vist i figur 2. Deltag disse interface rør til ekstra slange ved de ind- og udgange ved hjælp af standard ¼ "-28 fagforeninger til 1/16" slange.

4. Karakterisering af Acoustic Fokusering ydeevne

BEMÆRK: System komponenter, der kræves til akustisk fokus karakterisering er samlet i Materials List. Trin 4.1 og 4.2 nedenfor gælder for alle Core Enhed bruges med denne platform, mens de efterfølgende trin beskriver operationer specifikke for acoustofluidic enhed diskuteret her.

  1. Systemkonfiguration
    1. Saml microfluidic chip bruger verden-til-chip-forbindelser på fluide breadboard, som beskrevet i afsnit 3. Lav-forbindelser ved hjælp af slanger (såsom 1/16 "udvendig diameter fluorpolymer slanger) til en væske pumpe og indsamling hætteglas. Monter breadboard forsamling på scenen af ​​et mikroskop i stand til fluorescens billeddannelse udstyret med en CCD-kamera.
    2. Tilslut længder af lille indre diameteR (ID) rør (0,006 "anbefales) umiddelbart efter chippen (se figur 4) for at tjene som strømningsbegrænsere, som stabiliserer systemet og styrer strømmen opdeling mellem chip forretninger. Brug større ID rør, såsom 0,01 "eller 0,03", for alle andre tilslutninger.
      1. Estimere hydrodynamiske strømningsmodstand Rh af hvert stykke slange med en længde L og indvendige diameter D ved anvendelse af ligningen Rh = 128 pi / πD 4, hvor μ er væskens dynamiske viskositet. Trykfaldet Δ P grund hvert slangestykke ved en given strømningshastighed Q er givet ved P = Δ QR h.
      2. Vælg et forhold på restrictor længder at opdele strømningen mellem udløbene som passende til den anvendte separationsmetode. Optimal adskillelse med de akustiske chips i denne protokol kræver en SPO: LPO flow forholdet opstillet cately 65: 35%.
      3. Vælge længden af ​​udløbet strømningsbegrænsere således at deres fluide modstand er mindst 3-4 gange større end den totale modstand i resten af ​​systemet (passende summeres i serie eller i parallel). For akustoforese anordning, der anvendes i dette arbejde, rørstykker 35 og 65 cm for LPO og SPO er egnede.
        BEMÆRK: Omhyggelig overvejelse skal gives til F h nogen mikrofluid Core Enhed. Til vores akustiske fokus chip i dette arbejde, R h er lav på grund af dens relativt store kanal dimensioner, så de tilsluttede slanger modstand nemt overstige det. For enheder med mindre kanal dimensioner, kan chippen modstand dominerer resten af systemet slanger, i hvilket tilfælde design og kontrol af on-chip-kanal R h er en ekstra overvejelse under trin 1 i denne protokol. Detaljerede design principper og retningslinjer er tilgængelige i litteraturen. 23,24
  2. System Verification
    1. Kontroller for lækager at kontrollere, at mikrofluidanordning har ingen defekter og alle slanger tilslutninger er forseglet. Dispenser vand gennem indløbet rør efter behov med en sprøjte og overvåge for enhver væske lækker i hovedkanalen.
    2. Dispensere en kendt volumen gennem chippen, og måle indsamlet fra udløbene mængder for at sikre, at strømmen ratio som forventet. Afvigelser fra den forventede volumen-forholdet kan indikere blokeringer i en af ​​de forretninger eller utætte tilslutninger.
      1. For at opretholde systemets renlighed og forhindre tilstopning skyl hele systemet (fluidisk slanger og chip) med passende rengøringsmidler (f.eks blegemiddel, ethanol, vand) før og efter at køre nogen eksperimenter.
      2. I tilfælde af træsko eller blokeringer i en af ​​udløbene, skylle systemet, mens tilstopning den klare udløb for at fjerne blokeringen. Hvis dette ikke lykkes, vende strømmen retning under skylning,eventuelt at anvende hurtige pulser af reverse flow (ved hjælp af en manuelt aktiveret sprøjte). Endelig, hvis blokeringen stadig ikke kan fjernes, udskifte slanger eller chip, som nødvendigt.
  3. Frekvens Scan Opsætning til Akustisk Fokusering
    1. Fyld bypass-kanal (se figur 1) med væske, såsom deioniseret vand, ethanol eller phosphatbufret saltvand (PBS) ved manuel injektion med en sprøjte. Bemærk, at denne væske ikke kommer i kontakt med prøven, der behandles. Detaljerne i justering node position ved hjælp af forskellige bypass væsker beskrevet andetsteds 16,17. Kort sagt, hvis knuden skal være tættere på skillevæggen, anvende en lavere massefylde bypass væske, såsom ethanol; for node placering tættere på input prøvestrømmen, vælge en tættere fluidum, såsom en glycerolopløsning.
    2. Lav en perle opløsning på ca. 0,01% (w / v) 5-8 um fluorescerende polymerperler suspenderet i en puffer, såsom PBS med0,05% Tween-20 og fylde prøveindsuget sprøjten med perleopløsning. Fyld buffer indløb sprøjten med den samme buffer (dette behøver ikke at være den samme fluid som i bypass-kanalen). Bemærk, at i almindelighed, er bufferen vælges til at passe ansøgningen (se trin 5.1).
    3. Med fluide breadboard på objektbordet, fokusere omtrent halvvejs ind i dybden af ​​kanalen på en lige kanal region lige før udløbet med begge kanaler (separation og bypass) i synsfeltet. En ekstra skrå vinkel ekstern lyskilde kan være nødvendigt at foretage kanalvæggene synlige, for en vellykket efterbehandling af billeddata.
  4. Automatiseret Frekvens Scan og Billedoverførsel
    1. Foretag elektriske forbindelser ved hjælp af afskærmede kabler (f.eks RG-58 er udstyret med BNC-stik) til en funktion generator med radiofrekvens (RF) forstærker til at levere excitationssignalet til piezo transducer. Eventuelt slutte et oscilloskop tiloutput af funktionen generator til overvågning af aktuelle spænding føres til transduceren.
    2. Tænd ventilatoren og indstille funktionen generator, således at udgangen af RF-forstærker til piezo transducer er i området 12-25 volt peak-to-peak (V pp).
    3. Indstil begge sprøjter til samme strømningshastighed mellem 50 og 200 pl / min. Det anbefales at bruge en enkelt sprøjtepumpe til at drive begge sprøjter med samme motor for at minimere forstyrrelser til strømmen.
    4. Udfør en frekvens scanning procedure ved at angive start og slut frekvenser, trin størrelse mellem frekvens værdier og piezo-drevet spænding ved hjælp af et laboratorium automatisering toolkit såsom National Instruments LabVIEW.
    5. På hvert frekvens trin, anvende spændingen i 15 sekunder for at tillade, at systemet i ligevægt, og derefter fange 10 billeder af perler, der strømmer gennem chippen til efterfølgende analyse (eksponeringstider mellem 10 og 100 ms kan anbefales).
    6. Mellem eACH anvendte frekvens trin, skal du slukke for spændingen i ca. 20 sek at lade perlerne redistribuere ensartet i hele kanalen og fjern skævhed i fokus fra det tidligere anvendte frekvens skridt.
  5. Billede analyse for at fastslå resonansfrekvens og Fokusering holdning
    1. Kør en billedanalyse script (såsom AF_freqScanPlotter.m Matlab script, forsynet med denne protokol), og indtaste de nødvendige oplysninger på prompter: vælge listen over billedfiler genereret i trin 4.4, indtast scanningen start og stop frekvenser og trin størrelse, den fulde kanalbredde, væggen beliggenhed, og endelig vælge det billede regionen til at analysere, herunder både separation og bypass-kanaler.
    2. Overhold gennemsnit analysen scriptet det sæt af billeder taget ved hver frekvens skridt, og gennemsnittet af intensitetsværdier langs strømretningen. Dette resulterer i et tværsnit line-scanning af fluorescensintensitet.
      BEMÆRK: Hyppigheden svarer til den highe st defineres som resonansfrekvensen (figur 3, midterste række), og positionen i den kanal, hvor den højeste intensitet opstår, er fokuseringen position (figur 3, nederste række).

Figur 3
Figur 3. Repræsentant Frekvens Scan. Eksempel på frekvens scan data for godt koblede (A) og dårligt koblede (B) piezo og chip. Øverste række: fluorescerende intensitet af perler (rød repræsenterer høj og blå repræsenterer lav intensitet). Midterste række: maksimal intensitet ved hver frekvens. Nederste række: placeringen af ​​maksimal intensitet, hvor den røde stiplede linje angiver forudsagt fokus position, og røde diamanter indikerer resonansfrekvens som bestemt af den maksimale intensitet.g "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

5. Automatiseret Separation

BEMÆRK: Den automatiserede adskillelse forsøg køres for at adskille store partikler fra små partikler på grund af størrelsen afhængige akustiske fokus kræfter, der udøves i mikrofluid chip. De nødvendige systemkomponenter er samlet i Materials List.

  1. Systemkonfiguration og Prøveforberedelse
    1. Slut mikrofluid chip til sprøjtepumpen, computerstyrede multi-port udvælgelse ventiler, PC-interface flowmålere og slanger, som vist i figur 4. Denne konfiguration muliggør automatiseret behandling af prøver gennem mikrofluid adskillelse chip, samt automatiseret rengøring trin mellem eksperimenter for at fjerne krydskontaminering og prøve fremførsel.
    2. Brug en prøvepuffer egnet til cellerne eller partikler, der skal separeres, eller som kræves ifølge analysen assay tilanvendes efter separation. Som i trin 4.3.2, skal genopretning buffer (men ikke nødvendigvis bypass væske) passer prøvevæsken.
      BEMÆRK: Alle vandige puffere, der typisk anvendes med biologiske prøver (f.eks PBS) har akustiske egenskaber svarende til vand og vil ikke mærkbart ændre ydeevnen af akustiske anordning. Brugen af ​​prøvevæsker med massefylde og viskositet signifikant forskellig fra vandet er mulig, men kun anbefales for operatører med en stærk akustoforese oplevelse.


Figur 4
Figur 4. Akustisk Systemkonfiguration til automatiseret Separation Eksperimenter. De blå linjer spore hovedstrømmen vej gennem systemet. Alle grønne og sorte linjer er 0,03 "indvendig diameter (ID) rør, og alle blå og grå-farvet linjer er 0,01" ID slange, med exception af bedriften spoler, som er 0,03 "ID, og ​​strømningsbegrænsere, som er 0,006" ID. Sprøjterne er fyldt med buffer, og afholdelsen spoler har tilstrækkelig volumen (550 pi) for at forhindre optagelse af eventuelle prøver eller rengøring reagenser i sprøjterne. Klik her for at se en større version af dette tal.

  1. Separation Procedure
    1. Pre-run tilstand. Før kører adskillelsen, at de rengøring reagenskar (blegemiddel, ethanol, buffer) har tilstrækkelig fluid til, at mængderne reservoirer er ikke fuld, og væskeslangerne er primet (dvs. fyldt med opløsning). Hvis sidstnævnte betingelse er usikker, eller hvis systemet køres for første gang efter tomgang (fx første gang på en given dag), køre en automatiseret rengøring (se trin 5.3 nedenfor). Set Ventiler 3 og 4 på chip forretninger til at strømme til spilde Reservoirs i første omgang.
    2. Tænd for ventilatoren, og indstille funktionen generatoren ved resonansfrekvensen for den akustiske chip bliver brugt, som bestemt i trin 4.5. Juster spænding setpunkt på funktion generator, således at RF forstærkerens udgange mellem 12 og 25 V pp, som er relevant for den ønskede separation.
    3. Slut Sample Input Vial, Buffer Input Vial, og passende indsamling hætteglas til systemet. Lige før fastgørelse af Sample Input Vial til sin pickup slanger, at vortex hætteglasset kortvarigt igen suspendere partikler, der kan have afregnet. Derefter lægger hætteglasset og indlede adskillelse rutine uden forsinkelse.
      ADVARSEL: Hvis prøven, der skal bearbejdes indeholder potentielt infektiøse agenser, skal hætteglassene være af en skrue-top form, til at opretholde en forseglet system, og forhindre prøven aerosolisering. Hertil kommer, når der arbejdes med biologisk farlige materialer, håndtere alle hætteglas og slanger, mens det nødvendige beskyttelsesudstyr iført og brug af reqgendannes for fare kontroller og procedurer for Biologisk Risk Group og biosikkerhed niveau svarende til materialet. Rådfør institutionelle politikker og protokoller i tilfælde af usikkerhed.
    4. Bruge et program i et laboratorium automatisering toolkit til at styre ventilerne, flowmålere og pumpe til at udføre fuldautomatiske separation rutine.
      BEMÆRK: Rutinen skifter ventilerne, aktiverer sprøjtepumpe tilbagetrækning og infusion, og overvåger flowmåleren data for korrekt timing indsamling af output prøve fraktioner. De vigtigste trin er opsummeret nedenfor i 5.2.4.1 gennem 5.2.4.3, som hvis udført manuelt.
      1. Prime pickup slangen. Træk ca. 15 pi fra prøven Input Vial til helt at fylde røret slutte den til Valve 1. Samtidig prime røret forbinder Buffer Input Vial til ventilen 2. I en lignende måde, prime luftindtaget af Valve 1 for at sikre, at det indeholder ingen væske. Endelig skifte ventiler 1 og 2 for at udvise til spildeoverskydende væske eller luft, der er kommet ind i lastning spole.
      2. Indlæse prøven spolen, som vist i figur 5a. En typisk lasterækkefølgen til behandling af en 250 pi prøve at trække 25 pi luft ved 50 pl / min, derefter 250 pi af prøven ved 200 ul / min, efterfulgt af 35 pi førende buffer ved 200 pl / min, og endelig yderligere 25 pi luft ved 50 pl / min.
        BEMÆRK: Alle rumfang og strømningshastigheder er vælges af brugeren. Bemærk, at denne belastning sekvens er i omvendt rækkefølge af, hvordan flydende propper vil strømme gennem skilleindretningen.
      3. Begynd prøven infusion. Indstil sprøjtepumper til infusion af de fyldte fluid stik med den ønskede hastighed (typisk 100 ul / min). Overvåg strømningshastighederne på SPO og LPO med flow sensorer til at sikre, at strømmen er stabil og ved forholdet bestemt i trin 4.1, og at tilstopning ikke har fundet sted.
      4. Saml adskilte fraktioner. Når flowsensorerne registrerer en stigning i strømningshastighed, hvilket indikerer passage af den første luftgab, skifter den tilsvarende output ventilen fra affald (hvor det startede i trin 5.2.1) til en prøve samling hætteglas.
      5. Efter passage af prøven fra chippen, observere flow detektere andet luftgab. På dette tidspunkt, skifte output ventiler tilbage til spilde. Efter indlæst fra trin 5.2.4.2 fuld volumen dispenseres, stoppe sprøjtepumpen infusion og afslutte automatisering rutine, når strømningshastigheden når nul.
    5. Efter adskillelsen eksperimentet er færdig, skal du afbryde SPO og LPO prøve indsamling hætteglas og gemme dem korrekt til efterfølgende analyse.
  2. Automatiseret rengøring og dekontaminering
    BEMÆRK: Før behandling hver prøve, flush og dekontaminering hele fluidsystem hjælp af følgende automatiseret rutine.
    1. Fastgør SPO og LPO samling hætteglas rør, samt prøve pickup røret i tomme hætteglas til at indsamle overskydende rengøring løsninger, der vil blive skyllet through rørene.
    2. Start automatiseret system rengøring rutine. Som med den Automatiseret Separation proceduren i trin 5.2, at programmet bør kontrollere ventiler og sprøjtepumpen sekventielt indlæse den bedrift spole med rengøring reagenser, og skyl dem gennem systemet.
    3. Udfør efter rengøring rutine: flugter med 10% blegemiddel, derefter med 70% ethanol, og slutter med vand eller en passende puffer saltvand (fx 1 x PBS eller buffer anvendes til prøve behandling). Brug følgende flush mængder: 450 pi for blegemiddel og ethanol, og 1.000 pi til vand / buffer.
    4. Under rødmen trin, skylle hvert reagens i SPO mens LPO udløbsventil er indstillet til en port, der er blokeret, så omvendt, at fjerne eventuelle træsko i stikkontakten strømningsbegrænsere. Bevar tilbagetrækning og infusion strømningshastigheder på 300-500 ul / min for at minimere boble generation i slanger og modtryk oprustning, når enten SPO eller LPO er blokeret.
    5. DiscaRD overskydende rødmen løsninger og hætteglassene, hvor de indsamlede ved at følge passende procedurer for håndtering af biologisk eller kemisk affald.

Representative Results

Hovedelementerne i akustisk mikrofluidapparatet design er fremhævet i figur 1, og beskrevet fuldstændigt andetsteds. 15 I korte træk to fluidstrømme flow side-by-side i en separationskanal, adskilt fra en parallel omløbskanal af en tynd silicium væg. Da den primære stråling force størrelsesorden skalaer med partikel volumen, store partikler migrerer ud af det blandede prøven input stream mod det akustiske tryk node placeret i den tilstødende opsving fluidstrømmen, mens små partikler forbliver i den oprindelige strøm (figur 1B, C). Den opdelt to-kanals arkitektur forbedrer partikelseparation 17 og tillader justering af noden position ved hjælp af forskellige bypass kanal væsker. 16 fluidisk breadboard og inventar giver en solid platform for verden til chip-forbindelser, og det modulære design muliggør hurtig udskiftning mellem fluide chips (figur 2). Denne configuration ligeledes tillader vendbare væske tilslutninger, som sæl op til 1.000 psi, der skal gøres hurtigt og pålideligt (figur 2B, E).

Resonansfrekvensen f res af en chip kan estimeres ved hjælp af simple 1D analytiske beregninger (se trin 1.1.1). Fra en mere komplet 2D finite-element model i vores enhed tværsnit, 16 den forventede fokuseringsposition for 2-node resonans er 225 um fra væggen og den forventede frekvens er 1,68 MHz. F res af rigtige udstyr, kan imidlertid variere med ± 100 kHz, afhængigt af driftstemperaturen og kobling af langsgående og laterale resonanser. Derfor, efter enheden samling, f res skal empirisk verificeres ved relevante strømningshastigheder og piezo drev spændinger, som beskrevet i trin 4 i protokollen. Figur 3 viser repræsentative frekvens scanninger taget ved 200 ul / min, med vand i hoved- og bypass-kanaler, og 20 V pp leveres til piezo. Når kobling mellem piezo og mikrofluidapparatet er god, vil partikler fokusere tæt ved resonansfrekvensen, hvilket resulterer i en klar top i fluorescensintensiteten og migration til den forventede fokuseringsposition (figur 3A). I modsætning hertil, når der er dårlig kobling, partikler vil ikke fokusere godt og frekvens scanningsresultater vil svare til figur 3B. I sådanne anordninger, kan piezo transducer skal re-monteret, hvis der er brugt en reversibel klæbemiddel; ellers dette apparat er uegnet, når der fokuseres høj kvalitet eller hurtigt flow er afgørende for den ønskede applikation. Dataene i figur 3 informere valget af driftsfrekvensen for efterfølgende eksperimenter, og spændingen og flowhastigheden sortiment til effektiv adskillelse partikler.

filer / ftp_upload / 53051 / 53051fig5.jpg "/>
Figur 5. Automatiseret prøve behandling. (A) Skematisk af prøve indlæst i prøven spolen. (B) repræsentant strømprofil af en vellykket adskillelse eksperiment. (C) Flow profil fra en adskillelse køre hvorunder SPO stikkontakt tilstoppet ved ca. 220 sek. Klik her for at se en større version af dette tal.

Efter at have identificeret chips, der er effektive separatorer, bliver de indarbejdet i afbildet i figur 4-systemet. Samlet system, slagvolumen minimeres ved hjælp af slanger med 0,01 "indvendig diameter langs de vigtigste strømningsbane (blå linjer). Figur 5A illustrerer make-up af en typisk prøve plug infunderes gennem systemet. En lille mængde af "førende buffer" (~ 35 pi) er forpligtet til at precede prøven i strømmen for at fjerne strømningsfluktuationer medens prøven bevæger sig gennem adskillelse chip. Figur 5B viser flow data fra en vellykket automatiseret akustisk adskillelse eksperiment. Centrale elementer i en vellykket spil omfatter: (1) en forbigående stigning i strømningshastighed i både LPO og SPO som trykket opbygges og væske begynder at strømme gennem systemet, (2) en skarp spids angiver passagen af ​​en luftboble (den indsatte viser en udvidet profil af en enkelt boble), som bør nå SPO før LPO grund af den ulige flow fra de to udløb, (3) stabilt flow gennem begge udløb mellem de to luftbobler Når prøven bevæger sig gennem systemet, og (4) et gradvist fald i strømningshastigheden i begge forretninger efter den fulde prøvevolumen leveres til systemet. Problematiske kørsler er umiddelbart fremgår af flow profiler svarende til figur 5C, hvor det fremgår, at SPO blev tilstoppet efter ca. 220 sekunder. I thi s tilfælde en rengøring fremgangsmåde svarende til den, der er beskrevet i trin 5.3 skal køres til rense kanalen.

Figur 6
Figur 6. Enhed justerbarhed: partikelstørrelse og Spænding Effekter. Procent af polystyrenmikrosfærer ekstraheret i LPO afhænger af partikelstørrelsen og spænding, der leveres til piezokeramiske. Hver linje svarer til en anden driftsspænding ved resonansfrekvensen, bestemt som beskrevet i trin 4. totale strømningshastighed gennem indretningen 200 pl / min, med påsat drev frekvenser mellem 1,62 og 1,64 MHz. Fejlsøjler repræsenterer standardafvigelsen for mindst tre separate forsøg. Gengivet og modificeret med tilladelse fra Royal Society of Chemistry fra http://pubs.rsc.org / da / Indhold / ArticleLanding / 2014 / AN / c4an00034j.target = "_ blank"> Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 6 viser kompileret adskillelse resultater ved hjælp af forskellige polystyren partikelstørrelser og piezo kørsel spændinger, der viser de driftsparametre, der er nødvendige for en effektiv adskillelse. Generelt er højere spænding (dvs. større akustiske kræfter), der kræves for at udtrække mindre partikler, som forventet. Drivspændinger kan ikke i det uendelige øges, men på grund af større varmespredning og stigende virkningerne af akustisk streaming. 13 Handlingen tjener som en generel vejledning for partikeladskillelse-partikelstørrelser, der viser signifikant forskellige helbredelse på et bestemt drev spænding (f.eks 10- og 2-um partikler ved 8,8 V pp) vil adskille godt. Generelt partikelpopulationer med en stor størrelsesforskel, såsom vira (~ 100 nm) og celler (~ 10 um) kan adskilles hurtigt og effektivt, så kan celler af different størrelser (fx 6-8 um discoidale erythrocytter og leukocytter 8-15 um). De specifikke betingelser, der kræves for at arbejde med andre celletyper skal bestemmes empirisk, som celleform, tæthed og kompressibilitet påvirke dens akustiske kontrast, foruden cellestørrelse. Til dette formål procedurerne i trin 4 er nyttige til bestemmelse af brugbare adskillelse betingelser for enhver ny celle eller partikel type, og ikke kun for at vurdere kvaliteten af ​​en bestemt akustoforese enhed.

Figur 7
Figur 7. Adskillelse Effektivitet af Cell-Virus prøver med tilsætning. Separation resultater fra (A) Raji celler tilsat Dengue-virus (DENV) og (B) Raji celler og Boa nyreceller tilsat Golden Gate virus (GGV). Procentdele indsamlede defineres som den del af vira eller celler som forlader en specifikudløb i forhold til den samlede mængde forlader chippen. Fejlsøjlerne for (A) er standardafvigelsen af 3 forsøg, mens prøverne i (B) kun blev behandlet én gang på grund af de lave disponible mængder. 1x PBS blev anvendt som prøven buffer og fluidisoleringsudstyret, med vand i bypass-kanalen for alle forsøg. Chip driftsfrekvenser varierede mellem 1,60 og 1,64 MHz, med drev spændinger mellem 16 og 20 V pp. Klik her for at se en større version af dette tal.

For at demonstrere anvendeligheden af denne platform for biologisk partikel separation, vi først brugt det til at behandle velkarakteriserede biologiske prøver: humane Raji-celler (10 5 celler / ml, gennemsnitlig diameter 8-10 um 25) tilsat dengue virus (DENV, 10 5 pfu / ml, omtrentlige diameter 50 nm 26). Figur 7A viser procentdelen af Raji-celler og DENV indsamlet i både SPO LPO (defineret som den del af hver partikel type, indsamlet fra hvert udløb i forhold til den samlede mængde af hver partikel indsamlet fra chippen). Forsøget blev gentaget tre gange, og Raji-celler blev kvantificeret ved anvendelse af en Coulter-tæller, mens DENV blev kvantificeret under anvendelse af en revers transkription-kvantitativ polymerasekædereaktion (RT-qPCR).

Dernæst blev systemets ydeevne testet i en situation, der er mere realistisk til behandling af kliniske prøver, hvor de nøjagtige fysiske egenskaber af partiklerne kan være ukendte, og de foreliggende prøvemængder er lavere. Her har vi vurderet adskillelse af den nyligt identificerede golden gate virus (GGV), en slange patogen inficerer kvælerslange nyreceller. 27 Størrelsen af GGV viruspartikel er endnu ikke blevet målt, men da GGV hører til Arenaviridae familien, sandsynligvis ensamme størrelse, mellem 100 og 150 nm. 28 Vi behandlede prøver med GGV tilsat (10 4 pfu / ml) i Raji humane celler (ikke en infektion mål for virus) og boa nyre celler (infektion mål for GGV, omtrentlige størrelse 10 um 27), med begge celletyper ved 10 4 celler / ml. Da disse prøver var tilgængelige i små mængder, er adskillelse resultater fra kun én eksperimentel løb rapporteret i dette arbejde. Figur 7B viser procentdelen af Raji celler, Boa celler, og GGV indsamlet fra SPO og LPO. Celler blev kvantificeret i disse forsøg ved tælling på et hæmacytometer og virus blev kvantificeret ved hjælp af RT-qPCR.

Discussion

Denne protokol viser integrationen system-niveau for mikrofluidenheder til makroskala udstyr til at udføre automatiseret biologisk prøve behandling. Modulopbygningen af ​​denne platform gør det muligt at kunne tilpasses enhver sammenhængende flowmeteret, og som et eksempel, de præsenterede protokol fokuserer på karakterisering og optimering af en acoustofluidic partikelseparation enhed. Tre store fordele ved denne protokol fremhæves: (i) modularitet og chip-til-verden interface, (ii) robust karakterisering af enhedens ydeevne, og (iii) automatisk behandling af præcist afmålte prøvevolumener for partikel adskillelse.

jeg. Modularitet og chip-til-interfacing verden

Som vist i figur 2, er den mikro chip monteret på en brugerdefineret breadboard for nemt at passe på en mikroskopbordet til direkte observation. Breadboard indeholder # 6-40 UNF gevind huller på en 5 mm-stigning nettet, enabling chippen skal fastgøres, og fluidforbindelser skal foretages. Væskeforbindelserne er PEEK rør med bearbejdede ender, som tætner mod fluide chip med en gummi face-pakning og en rustfri stål krave. Denne grænseflade ordning gør for nem chip udskiftning og hurtig enhed redesign, som kræver få eller ingen ændringer i andre systemkomponenter, forudsat chip fodspor overholder nettet format. For eksempel har vi brugt denne platform med mikrofluide chips til kontinuerlig strømning elektroforese, termisk cellelyse, 29 hurtig blanding af reagenser til kemisk syntese, og encellede opsamling og forhør.

ii. Robust karakterisering af enhedens ydeevne

For at optimere ydeevnen af ​​enhver mikrofluid adskillelse enhed, dens drift skal først grundigt karakteriseret. Den her beskrevne system støtter udviklingen af ​​hurtige og automatiserede protokoller til at gøre dette. For den specifikke example af akustiske fokus enheder, fokuseringen kvalitet, driftsfrekvens og placering af fokuserede partikler i mikrofluid kanal skal måles for hver enkelt enhed. Disse målinger kræver fejer gennem en række piezokeramisk drev frekvenser, spændinger og flowhastigheder, at identificere de optimale parameterkombinationer til separation af høj kvalitet. De præsenterede protokol varierer automatisk disse indstillelige parametre og fanger den relevante data- dvs. fluorescerende billeder af partikler, der strømmer i kanalen, som er efterbehandlet for at generere de nødvendige målinger af partikel fokus kvalitet, hyppighed og position (figur 3).

Fuld karakterisering af akustisk anordning præstationer kræver gentage trin 4.4 og 4.5 efter behov under forskellige eksperimentelle betingelser. For eksempel er den absolutte fokusering positionen af ​​en chip fundet ved at køre frekvensgennemløbet ved relativt lave strømningshastigheder og højspændings for at sikre fuldstændig migration til knudepunktet placering. Derudover kan sådanne frekvens scanninger vurdere kvaliteten af ​​enheden samling (når systemet drives med polystyrenperler med kendt størrelse), eller til at bestemme, hvordan en tidligere ukendt partikeltype vil opføre sig i systemet (efter en chip er blevet karakteriseret med perler). En chip med god energi overførsel fra piezokeramiske til mikrofluid kanal vil resultere i stramme fokusering ved høje flowhastigheder (> 1 ml / min) og lave spændinger (12-15 V PP), mens dem med dårlig energi overførslen ikke vil fokusere endnu ved lave flowhastigheder (<100 ul / min) og høje spændinger (> 20 V pp). Vi har fundet, at intim kontakt mellem mikrofluid chip og piezokeramiske er kritisk for effektiv energioverførsel i væsken. Yderligere undersøgelse af den optimale metode til at binde den mikrofluid chip og den piezokeramiske vil muliggøre pålidelig produktion af højtydende enheder.

Endelig et kompletbillede af en acoustophoretic enhedens drift kan opnås ved at kombinere billedbaserede frekvens scan målinger af trin 4 (og figur 3) med partikel tæller indsamlet fra SPO og LPO som funktioner af de relevante driftsparametre, fra separation forsøg udført med mikrokugler som beskrevet i trin 5. Som vist i figur 6, kan en sådan række automatiserede eksperimenter hurtigt at karakterisere en enkelt enhed ydeevne og justerbarhed, informerer brugeren af den optimale parameter plads til at betjene indretningen til partikeladskillelse.

iii. Automatiseret små-prøve behandling for partikelseparation

For vellykkede og nøjagtig mikrofluid chip-baserede prøve behandling, er det vigtigt at pålideligt og præcist måler, belastning, levere og indsamle de mængder af væske, når de passerer igennem. Denne præcisering er især vigtigt, når prøvevolumenet er lille(~ 0,1-1 ml), som er almindelig i kliniske eller forskning laboratorium indstillinger. 30 Præcis prøvehåndtering er udfordrende i traditionelle mikrofluide eksperimenter, der beskæftiger manuel tilbagetrækning af prøven i en sprøjte og infusion i en enhed med ingen feedback på, når prøven har været adskilt, og når det skal indsamles. Den præsenterede protokol beskæftiger automatiseret prøve spole lastning og dispensering kombineret med real-time feedback fra flowmålere for at muliggøre reproducerbare separationer af små prøvevolumener.

Figur 5 viser flow profiler målt ved SPO og LPO fra en typisk adskillelse eksperiment. Først fører buffer på mindst 35 pi indlæst at sikre en stabil strøm, før prøven når den akustiske chip. Prøvevolumener mindre end 100 pi anbefales ikke til dette system konfiguration, fordi prøvefortynding på grund af den førende buffer bliver for stor. En prop af luft anvendes i begyndelsen af ​​the injektion inden den førende buffer til at separere stikket fra væsken, der følger, forhindrer blanding og fortynding af prøve og tjener som en indikator til flowmålere. Efter en indledende forbigående som fluid begynder at bevæge sig gennem systemet, skarpe spike signaler i begge forretninger indikerer passage af den første luftboble. Disse transienter efterfulgt af en lang periode med stabil strømning som prøven flyder gennem systemet, så en anden spike når den anden luftboble passerer, og endelig en eventuel nedgang i strømningshastigheden til nul, efter at sprøjten pumpen stopper.

Passagen af ​​luft gennem stik flowsensorerne anvendes som triggerpunkter at skifte ventilerne at starte og stoppe prøveindsamling, hvilket minimerer tabte prøve og fortynding af ikke-prøvevæsken mængder. Lukket-sløjfe måling af forarbejdede prøvevolumener eliminerer behovet for at omprogrammere disse værdier før starten af ​​forsøget, hver gang inputsample ændres. Denne funktion erisær vigtigt, når prøvevolumenet er begrænset, for eksempel i tilfælde af mange kliniske prøver. Real-time flow overvågning også hjælper med fejlfinding; en dårlig løb (fx en træsko dannelse i et af udløbene) er umiddelbart indlysende fra de resulterende flowprofiler, som i figur 5b.

For at demonstrere den fleksibilitet og effektivitet i acoustofluidic adskillelse ved hjælp af den præsenterede systemarkitektur, renset DENV og GGV virusstammer blev tilsat i celle lagre og adskilt af behandling gennem mikrofluid chip. Figur 7a viser, at Raji celler blev godt adskilt fra virus, som 97 % af Raji-celler forlader chippen fandtes at være i LPO, hvorved der efterlades et højt beriget prøve af DENV i SPO. Til sammenligning effektiviteten af ​​DENV adskillelse var lavere, med 70% af DENV forlader chippen findes i SPO. Dette kan tilskrives mindre konvektive blanding induceret af vindinger separator;på kanal, men mere sandsynligt, at nogle DENV partikler migrerer sammen med Raji celler i LPO. Celler migrerer lateralt tværs strømliner trække noget væske med dem, selv ved lave Reynolds tal. Ved denne mekanisme, samt ikke-specifik overfladeadsorption, overføre virale partikler i LPO. Ikke desto mindre, højt beriget prøve af DENV i SPO er en betydelig fordel, for eksempel når de novo-sekventering anvendes til at detektere og identificere virus.

Figur 7b viser, at i en forsøgskørsel, blev kun omkring 70% af Boa celler forlader chippen findes i LPO, sammenlignet med næsten 100% separationseffektivitet for Raji-celler. Forskellen i separationsydeevnen mellem de to celletyper kan skyldes en mindre gennemsnitsstørrelse eller en lavere tæthed af Boa celler sammenlignet med Raji-celler, således resulterer i mindre akustiske kræfter. For at bekræfte eller afkræfte disse formodninger, størrelse, tæthed og morfologi Boaceller i suspension (som normalt vokser vedhængende) i Boa celler skal måles nøjagtigt, en indsats for yderligere undersøgelser. I de samme forsøg, på samme måde som forsøgene med DENV, størstedelen af ​​det udvundne GGV forladt SPO, hvilket indikerer en berigelse af det virale fraktion.

De præsenterede data fremhæve de iboende udfordringer i engineering bredt gældende platforme til behandling af en bred vifte af biologiske prøver. Det er vigtigt, kan de biologiske vekselvirkninger begynder at spille så stor en rolle som de fysiske og mekaniske påvirkninger. Men disse indledende forsøg også demonstrere magt og løftet om at bruge denne systemarkitektur for prøve behandling i kliniske og forskningsmæssige applikationer. Som en robust, velkarakteriseret manipuleret systemet, denne platform giver mulighed for at søge svar på nye videnskabelige spørgsmål.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials required for Steps 1-3: Device Design, Fabrication and Assembly
Double Sided Polished Silicon Wafer Silicon Quest International, Inc. San Jose, CA, USA 100 mm <100>  prime wafer 1-20 ohm-cm, 495 ± 25 µm Double-side polished
Glass Wafer Bullen Ultrasonics, Eaton, OH, USA 100 mmx0.5 mm Boro
Photoresist, AZ 1518 MicroChemicals GmbH, Ulm, Germany AZ 1518 Photoresist used to adhere wafer to blank wafer for DRIE etching
Photoresist, AZ 4620 MicroChemicals GmbH, Ulm, Germany AZ 4620 Photoresist to define fluidic and via mask patterns
DRIE plasma etcher STPS, Newport, NP, United Kingdom Multiplex Advance Oxide Etch (AOE) ICP system
Wafer Bonder Electronic Visions Group,  St.Florian am Inn, Austria EVG 501
Dicing saw Kulicke & Soffa Industries, Singapore K&S 982
Epoxy kit Epoxy Technology, Billerica, MA, USA EPO-TEK 301 Epoxy used to couple piezo and microfluidic chip
PZT piezoceramic  Piezo Systems, Woburn, MA, USA PSI-5A4E 37.5 × 10 × 0.5 mm
28 AWG Kynar-insulated solid wire Squires Electronics, Cornelius, OR, USA UL1422
2-part silver epoxy  MG Chemicals, Surrey, BC, Canada 8331 Conductive adhesive for attaching wire leads to PZT
L-edit Tanner EDA, Monrovia, CA, USA Ledit v15.1 64-bit CAD software for mask layout
Materials required for Step 4: Characterizaiton of Acoustic Focusing Performance
Dual Pump Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA PHD ULTRA Series, 703007
5 ml syringes Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA 309646
Luer to Threaded port adapter IDEX, Oak Harbor, WA, USA P-659 Connects syringe to tubing
Union IDEX, Oak Harbor, WA, USA P-623 Connects world to chip connections to fluoropolymer tubing.  Can also use webbed 
Ferrule 1/4-28 flat bottom IDEX, Oak Harbor, WA, USA P-200 Used with nut to make connections between tubing and syringe, flow sensors and world to chip hardware
Nut  1/4-28 flat bottom IDEX, Oak Harbor, WA, USA P-202 Used with ferrule to make connections between tubing and syringe, flow sesnsors and world to chip hardware
1/16" OD Fluoropolymer tubing IDEX, Oak Harbor, WA, USA 1912L Tubing to connect syringe pumps to world to chip connections.  Tubing size is not critical during claibration steps (.01-.03" ID typically used, other suitable part numbers: 1907L, 1902L).
Small ID fluoropolymer tubing IDEX, Oak Harbor, WA, USA 1476-20 Used for Flow restrictors: 0.006" ID, 1/16" OD FEP 
PEEK tubing Connects from chip to fluoropolymer tubing.
Cooling fan Multicomp, Leeds, England MC19663
Function Generator Agilent, Santa Clara, CA, USA 33220A
RF amplifier ENI, Rochester, NY 325 LA Must be able to amplify signals from <1 V in the range of 1-2 MHz to 25 Vpp to the piezo.
CCD Camera Photometrics, Tucscon, AZ, USA CoolSnap HQ
Inverted Microscope Zeiss, Oberkochen, Germany Axiovert S100
FITC filter set Chroma Tech, VT, USA SP101
Objective, 10X Zeiss, Oberkochen, Germany ACHROPLAN
Oscilloscope Tektronix, Beaverton, OR, USA TDS3014B To monitor voltage output by RF amplifier
MatLab Mathworks, Natick, MA, USA R2014a
Driver interface software to integrate Photometrics camera with LabVIEW R Cubed Software, Lawrenceville, NJ, USA SITK
Tween 20 Sigma Aldrich, St. Lousi, MO, USA P9416
Dragon Green Fluorescent 5.76 or 7.32 µm Beads Bangs Laboratory, IN, USA FS06F
Additional materials required for Step 5: Automated Separation
Multiport valves VICI, Houston, TX, USA C25Z-3180EUHA In the current configuration 4 valves are needed
Flow Sensors Sensirion, Westlake Village, CA, USA SLI-1000
Fluoropolymer tubing, .01 and .03" ID IDEX, Oak Harbor, WA, USA 1902L and 1912L High purity PFA preferred
Nut VICI, Houston, TX, USA ZN1PK-10 Used with ferrule to make connections between tubing and valves. Alternative part numbers: MZN1PK-10, LZN1PK-10
Ferrule VICI, Houston, TX, USA ZGF1PK-10 Used with nut to make connections between tubing and valves.  
LabVIEW National Instruments, Austin, TX, USA LabVIEW Professional Development system Laboratory Automation Software
PBS Teknova, Hollister, CA, USA P0200
Raji Cells ATTC, Manassas, VA, USA CCL86
Boa Cells Kindly provided by the DeRisi Laboratory at UCSF
GGV Kindly provided by the DeRisi Laboratory at UCSF
DENV Kindly provided by Jose Pena at LLNL
Coulter Counter Z2 Beckman Coulter, Brea, CA, USA Z2
Hemacytometer Fisher Scientific, Waltman, MA, USA 0267151B

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gossett, D. R., Weaver, W. M., et al. Label free cell separation and sorting in microfluidic systems. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397, (8), 3249-3267 (2010).
  2. Lenshof, A., Laurell, T. Continuous separation of cells and particles in microfluidic systems. Chemical Society Reviews. 39, (3), 1203-1217 (2010).
  3. Sajeesh, P., Sen, A. K. Particle separation and sorting in microfluidic devices a review. Microfluidics and Nanofluidics. 17, (1), 1-52 (2014).
  4. Bhagat, A. A. S., Bow, H., Hou, H. W., Tan, S. J., Han, J., Lim, C. T. Microfluidics for cell separation. Medical & Biological Engineering & Computing. 48, (10), 999-1014 (2010).
  5. McGrath, J., Jimenez, M., Bridle, H. Deterministic lateral displacement for particle separation a review. Lab Chip. 14, (21), 4139-4158 (2014).
  6. Jubery, T. Z., Srivastava, S. K., Dutta, P. Dielectrophoretic separation of bioparticles in microdevices A review. ELECTROPHORESIS. 35, (5), 691-713 (2014).
  7. Jin, C., McFaul, S. M., et al. Technologies for label free separation of circulating tumor cells from historical foundations to recent developments. Lab on a Chip. 14, (1), 32 (2014).
  8. Trujillo, F. J., Juliano, P., Barbosa Cánovas, G., Knoerzer, K. Separation of suspensions and emulsions via ultrasonic standing waves – A review. Ultrasonics Sonochemistry. 21, (6), 2151-2164 (2014).
  9. Bridle, H., Miller, B., Desmulliez, M. P. Y. Application of microfluidics in waterborne pathogen monitoring A review. Water Research. 55, 256-271 (2014).
  10. Mariella Jr, R. Sample preparation the weak link in microfluidics-based biodetection. Biomedical microdevices. 10, (6), 777-784 (2008).
  11. Gor’kov, L. P. On the forces acting on a small particle in an acoustic field in an ideal fluid. Soviet Physics Doklady. 6, 773-775 (1962).
  12. Settnes, M., Bruus, H. Forces acting on a small particle in an acoustical field in a viscous fluid. Physical Review E. 85, (1), 016327 (2012).
  13. Barnkob, R., Augustsson, P., Laurell, T., Bruus, H. Acoustic radiation and streaming-induced microparticle velocities determined by microparticle image velocimetry in an ultrasound symmetry plane. Physical Review E. 86, (5), (2012).
  14. Bruus, H. Acoustofluidics 7 The acoustic radiation force on small particles. Lab Chip. 12, (6), 1014-1021 (2012).
  15. Fong, E. J., Johnston, A. C., et al. Acoustic focusing with engineered node locations for high performance microfluidic particle separation. Analyst. 139, (5), 1192-1200 (2014).
  16. Fong, E. J., Bora, M., et al. Continuously Variable Node Position in a High Throughput Acoustofluidic Device. Micro Total Analysis Systems. 1184-1186 (2014).
  17. Jung, S. Y., Notton, T., Fong, E., Shusteff, M., Weinberger, L. S. Spatial tuning of acoustofluidic pressure nodes by altering net sonic velocity enables high-throughput efficient cell sorting. Lab on a Chip. 15, (4), 1000-1003 (2015).
  18. Franssila, S. Deep Reactive Ion Etching. Introduction to Microfabrication. 255-270 (2010).
  19. Sharma Rao, B., Hashim, U. Microfluidic Photomask Design Using CAD Software for Application in Lab On Chip Biomedical Nanodiagnostics. Advanced Materials Research. 795, 388-392 (2013).
  20. Melin, J., Quake, S. R. Microfluidic Large Scale Integration The Evolution of Design Rules for Biological Automation. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 36, (1), 213-231 (2007).
  21. Madou, M. J. Fundamentals of microfabrication: the science of miniaturization. CRC Press. Boca Raton. (2002).
  22. Krulevitch, P., Benett, W., Hamilton, J., Maghribi, M., Rose, K. Polymer based packaging platform for hybrid microfluidic systems. Biomedical Microdevices. 4, (4), 301-308 (2002).
  23. Leslie, D. C., Easley, C. J., et al. Frequency specific flow control in microfluidic circuits with passive elastomeric features. Nature Physics. 5, (3), 231-235 (2009).
  24. Oh, K. W., Lee, K., Ahn, B., Furlani, E. P. Design of pressure driven microfluidic networks using electric circuit analogy. Lab on a Chip. 12, (3), 515-545 (2012).
  25. Mittelbrunn, M., Gutiérrez Vázquez, C., et al. Unidirectional transfer of microRNA loaded exosomes from T cells to antigen presenting cells. Nature Communications. 2, 282 (2011).
  26. Acosta, E. G., Castilla, V., Damonte, E. B. Functional entry of dengue virus into Aedes albopictus mosquito cells is dependent on clathrin mediated endocytosis. Journal of General Virology. 89, (2), 474-484 (2008).
  27. Stenglein, M. D., Sanders, C., et al. Identification Characterization and In Vitro Culture of Highly Divergent Arenaviruses from Boa Constrictors and Annulated Tree Boas Candidate Etiological Agents for Snake Inclusion Body Disease. 3, (4), e00180 12 (2012).
  28. Arenaviridae Viral Hemorrhagic Fevers (VHFs). CDC. Available from: http://www.cdc.gov/vhf/virus-families/arenaviridae.html (2013).
  29. Packard, M., Wheeler, E., Alocilja, E., Shusteff, M. Performance Evaluation of Fast Microfluidic Thermal Lysis of Bacteria for Diagnostic Sample Preparation. Diagnostics. 3, (1), 105-116 (2013).
  30. Lion, N., Reymond, F., Girault, H. H., Rossier, J. S. Why the move to microfluidics for protein analysis. Current Opinion in Biotechnology. 15, (1), 31-37 (2004).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats