持続的な障害と皮質虚血を研究するために高齢ラットにおける一般的な頸動脈閉塞と永久遠位中大脳の実行

1Wolfson Centre for Age-Related Diseases, King's College London, University of London, 2Department of Neuroimaging, James Black Centre, Institute of Psychiatry, King's College London, University of London, 3Institute of Neuroscience and Psychology, Wellcome Surgical Institute, College of Medical, Veterinary and Life Sciences, University of Glasgow, Glasgow, 4Research Service, Edward Hines Jr. VA Hospital, 5Neurology Service, Edward Hines Jr. VA Hospital, 6Department of Molecular Pharmacology and Therapeutics, Neuroscience Research Institute, Loyola University Chicago, 7Department of Oncology, The Gray Institute for Radiation, Oncology and Biology, University of Oxford
* These authors contributed equally
Published 2/23/2016
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Summary

ここでは、大規模な皮質梗塞と持続的な赤字を生成するために、頸動脈の同時閉塞と高齢雌ラットの永久遠位中大脳動脈閉塞を生成するためのプロトコルを提示します。私たちは、脳卒中後24時間および8週目に構造的MRIを用いて、病変の大きさの確認を示します。

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Wayman, C., Duricki, D. A., Roy, L. A., Haenzi, B., Tsai, S. Y., Kartje, G., et al. Performing Permanent Distal Middle Cerebral with Common Carotid Artery Occlusion in Aged Rats to Study Cortical Ischemia with Sustained Disability. J. Vis. Exp. (108), e53106, doi:10.3791/53106 (2016).

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Abstract

脳卒中は、一般的に頸動脈(または他の動脈)、アテローム性動脈硬化症、高血圧、肥満や糖尿病などの併存疾患の範囲で高齢者に起こります。動物での脳卒中の治療法を評価する際に、それは優れた表面的妥当性を持つモデルを選択することが重要です。虚血性卒中は、全卒中の80%を占め、これらの大部分は、身体の反対側に永続plegiaまたは麻痺を引き起こし、多くの場合、感覚運動皮質に影響を及ぼす梗塞を誘導し、中大脳動脈(MCA)の領域で起こります。私たちは、このビデオで持続的な感覚障害とかなりの皮質梗塞の原因となる高齢ラットにおける虚血性脳卒中の製造方法を示しています。具体的には、この動脈の短いセグメントを閉塞するジアテルミー鉗子を使用して、高齢雌ラットに永久遠位中大脳動脈閉塞(MCAO)を誘導します。病変と同側の側の頸動脈は、p次いでermanently閉塞および反対頸動脈を一時60分間閉塞しました。我々は、24時間および脳卒中後8週で、構造T2加重磁気共鳴画像(MRI)を用いて梗塞サイズを測定します。この研究では、平均梗塞容積は24時間で同側半球の2.0%(標準偏差)±4.5%であった(Gerrietの式を用いて脳腫脹について補正、N = 5)。このモデルは、病態生理学的メカニズムおよび新規治療法の解明のために重要である、それは持続的な感覚赤字の誘導を可能にするように実現可能と臨床的に関連しています。

Introduction

脳卒中は、現在、世界中で死亡の第三の最も一般的な原因と障害1の主な原因です。すべてのストロークの80%を占める虚血性脳卒中は、多くの場合、運動機能に影響を受けた側2-4へのこだわりで、( 例えば 、固有受容)感覚の損失を引き起こす皮質梗塞になります。中大脳動脈(MCA)は、ウィリス動脈輪から供給を描画し、内頸動脈5から生じる血管の最大です。 MCAは、この地域でのストロークがすべての虚血性脳卒中6,7の65%を占めて、最も一般的な虚血性脳卒中に影響を受けた脳血管です。 MCAは、閉塞7の正確な場所に応じて異なり皮質と皮質下領域およびMCA脳卒中によって引き起こされる神経学的異常の両方を提供します。近位MCA閉塞はlenticulostriatal動脈を通じて深い領土に影響を与え、コルティの両方を包含する大きな梗塞を引き起こしますCALおよび皮質下の領域。対照的に、血流の単独皮質領域を奪うより遠位の閉塞は、より小さな皮質梗塞を生成する傾向があります。

大集団研究では、ヒト脳卒中病変が同側半球8,9の5から14パーセントの範囲です。悪性のストロークはストロークの10%を占め、頭蓋内圧を減少させるためにhemicraniectomyを必要とする、より大きな梗塞をもたらす、小さい病変を有する患者は、10を生き残る可能性が高いです。我々は、多くの人間のストロークのような半球の同様の割合を占める病変を生成する再現可能なモデルを示しています。

脳卒中は、不均一な疾患です。虚血性脳卒中の75%が(頭蓋内小血管の閉塞から)ラクナ梗塞のいずれかによって誘導されます。心原ストローク;ストロークの30%を占めているか大動脈アテローム性動脈硬化症、。症候性アテローム性動脈硬化症は、最も頻繁に共通のC点で観察されます内部および外部の頸動脈11にarotid動脈(CCA)の支店。

脳卒中の前臨床モデルは、その病態生理をシミュレートするために、できるだけ人間の条件と同様であるべきであり、脳卒中の危険因子を組み込む必要があります。虚血性脳卒中の92%は65歳以上の人々において発生し、以前に12を説明したように、他の危険因子には、肥満、高血圧、およびアテローム性動脈硬化症が挙げられます。より良いこれらの危険因子を表すには、自然状態の病態生理学的特徴のいくつかを共有することができるモデルを使用することをお勧めします。このプロトコルでは、我々は、頸動脈を介して高度な年齢や閉塞血流が含まれています。

中大脳動脈閉塞(MCAO)の古典的なモデルは、前部および中大脳動脈の血流を減少させ、近位MCA閉塞の腔内フィラメントモデルです。このモデルを使用して短い閉塞時間は、Lを集光皮質下の領域にesion、長い閉塞時間は高齢ラットで高い死亡率で、その結果、両方の皮質および皮質下領域の面積を募集大きな病変をもたらすことができる一方。比較では、私たちのグループによって使用されるモデルは、開頭術と双極性焼灼鉗子を使用して、MCAの小さな部分の血と破壊の凝固に続いて硬膜の開口部が実施されます。このジアテルミーモデルは23。田村らにより 1981紙から適応され、頭蓋骨切除術の使用は、閉じ頭蓋骨の特徴である頭蓋内圧亢進を制限し、当社の手術コホートにおいて高い再現性と低い死亡率の結果かもしれいくつかの他のモデル13に比べ。再現性梗塞と持続的な障害を発生させるために、我々は、(Chen14我々は、使用する非侵襲性のT2強調磁気共鳴画像ごとにMRIを遠位CCAを恒久的に近位CCAを閉塞し、一過性閉塞します)程度と脳梗塞の位置、および感覚皮質において脳腫脹の程度を評価します。

Protocol

このプロトコルは、キングス・カレッジ・ロンドンが設定し、機関のガイドラインにより承認され、1986年ガイドラインの法は金融機関の間で変化してもよい英国内務省ガイドライン及び動物(科学的手順)に従って行われました。この手順を実行する前に、機関のガイドラインへの準拠を確認してください。機器に触れるときに無菌操作を維持するために、アルミニウム箔の大部分をオートクレーブし、機器は、顕微鏡や麻酔マシン上のような扱いを包み込むためにこれを使用します。無菌の密着フィルム(ラップ)を用いてもよいです。

1.準備

  1. ストローク手術前にゲル流体パック(獣医学の回復ゲル)と、少なくとも48時間のためのソフト飼料でラットを習熟。動物は、多くの場合、手順の後に食べたり飲んだりと難しさを見つけるように、新奇性恐怖を最小限にするために、手術前に、これらの項目に動物をご紹介します。木製チュウBLOとハウス高齢ラットCKSが生い茂った歯の発生率を低下させるために(第6節を参照してください)​​。
  2. オートクレーブ(最小121°C、15分間15 PSIを、)の外科的処置を開始する前に、すべての手術器具を滅菌します。 70%エタノール中の1%クロルヘキシジンを使用して、すべての作業面を消毒し、手術用ドレープを使用して、手順の期間無菌技術を維持します。
  3. 好適な足の半球の反対側に病変を誘発。 ( 図4を参照)モントーヤの階段テスト15における術前のベースラインにより決定された各ラットの優先前足に応じて左または右半球のいずれかに病変を割り当てます。この原稿では、この手順を説明するときに簡単にするために、左足は好適な足で、手術は右半球上で実行されます。彼らはすぐに学ぶように、これらの行動試験のためにリスターフードやロングエバンスラットを使用してください。
    注:階段試験は両方の罰金と総熟練メートルの変化を測定するように設計されています運動系の損傷後ovements。階段は中央のプラットフォームのそれぞれの側に7つのステップで構成されています。階段のテストのための機器が使用できない場合は、シリンダテストは、テスト利き手に適した選択肢ですが、そこ脳卒中のこのモデルでは、このテストで唯一の過渡赤字であるため、以下の長期的な回復を測定することが不適当であることに注意して処理。
    1. 各ステップのウェル中の3砂糖ペレット(片面あたり21ペレット)を配置します。 10分間の階段装置にラットを配置し、検索されたペレットの数とそれぞれの側にずれたペレットの数を記録します。
      注:手術後のタスクに含まれるために、ラットは、ベースラインで75%のペレットの最小値を取得する必要があります。

2.手術

  1. 16-18ヶ月で女性高齢者リスター・フード付きラットを使用します(250〜400グラム)と麻酔の誘導後、1.5L /分のO 2、5%イソフルランで麻酔を誘導し、削減イソフルランのレベルとは、手術のための十分なものの、最小化深さ( 例えば 、1.5から2パーセント)でそれを維持します。フェイスマスクによって動物に麻酔を配信、およびイソフルランへの外科医の露出を制限するために掃気システムを使用しています。
    1. この手順では、行動障害16を生成することができますように、偽動物に開頭手術を含めまでのすべての手順を実行しますが、ありません。 MCAO実験を設計する際に、実験の目標を考慮し、開頭術のために制御するために、偽群が含まれるべきかどうかを判断します。
  2. 疼痛緩和の前を管理または(Carprieveは、0.25ミリグラム/キログラム、秒。カット)作動周産期。
    1. ストック溶液を作製し、300グラムのラット当たり0.6ミリリットルを注入するために1ミリリットル〜19ミリリットルを0.9%滅菌生理食塩水を追加します。前者は室温で安定であるためCarprieveの使用がカルプロフェンより好ましいです。
  3. 肌を露出するように右半球の腹側ネック領域および時間領域上の毛皮を剃ります。手術部位のuを駆除エタノール綿棒を歌います。脱毛のためのローカルIACUCのガイドラインに従ってください。
    1. 切開部位での毛皮の量を最小限にするために離れて動作領域からこの手順を実行します。
  4. 加熱パッド上の仰臥位中の滅菌ドレープで覆われたコルクボードにラットを置きます。頭頸部の毛を剃った領域にリドカインクリームを適用します。恒温システムで36.5から37.5°Cの間、動物の温度を監視し、維持するために、直腸プローブを挿入します。
    1. 乾燥を防ぐために、目にlacrilube軟膏を入れてください。ラットに気管分泌物を減らすためにアトロピン硫酸溶液の注射(皮下を600μg/ mlの溶液0.05ミリリットル)を与えます。
      注:研究者は、このような血液ガスや圧力などの生理学的変数を測定することを検討する必要があります。
  5. 手術を開始する前に、後肢のピンチ撤退を確認し、完全な麻酔を確認するために、反射神経を点滅させます。
  6. 解剖マイクロの下でスコープ、メスを用いて露光首に2センチメートル中央正中切開を行います。両側の気管にそっと横唾液腺を移動します。
  7. 片側の総頸動脈を覆っている皮膚の周りにループ非吸収性絹縫合糸。静かに絹縫合糸を使用してサイトから皮膚を引き離すと総頸動脈を明らかにするために、外科用テープを使用して、コルクボードにこれらを下に貼り付けます。慎重に周囲の筋膜と細かい鉗子を使用して、迷走神経から無料で動脈を解剖鈍いです。
    1. これは摂食、嚥下と呼吸を損なうように、このステップの間に筋肉や迷走神経を傷つけないように注意してください。
  8. 総頸動脈を露出されると、最初の逆細かい鉗子で解剖し、神経と接触しないように注意されることによって迷走神経から頸動脈を分離し、頸動脈を単離するために、非吸収性絹縫合糸(5/0)を使用します。容器は、縫合糸、トンでループ(しかし結びついていない)されたら元に戻すされ、このステップを防止するために、外科手術用テープを使用して一緒に縫合糸の端をまねます。覆っている皮膚をバック保持縫合糸を取り外します。
  9. もう一方の側のために繰り返して(セクション2.7から2.8)
  10. 手術の残​​りの中に湿った組織を維持するために創傷内に滅菌生理食塩水に浸したガーゼを置きます。ゆるく皮膚を縫合し、さらに脱水を防ぐために、領域の上に追加の生理食塩水に浸したガーゼを置きます。
  11. 横方向の位置にラットを置き、右眼窩と外耳道との間の中間点で皮膚切開を行います。コルクボードにピン5弾性3ミリメートルフック開創まで使用して皮膚を撤回した後、頭蓋骨を明らかにするために頭筋を解剖鈍らせます。
  12. (オープンサイト(流速約2 ml /分)の上に親指ホイール-調整重力駆動生理食塩水の点滴を置き、骨の破片を除去する手術のこの相全体に露出している部位から少量の出血をクリアするには、アスピレータシステムを設定宗派イオン2.13から2.16)。
    1. 最低点で耳の近くに頭蓋骨の最高点での生理食塩水供給ノズルと、吸引ノズルを配置します。より良い動物が麻酔下にある時間の量を減らす、血管の焼灼のための任意のブリードのソースを視覚化するための領域に、より生理食塩水を供給するための採血時にホイールを調整します。

図1
永久遠位中大脳動脈閉塞モデルの図1.外科セットアップ。ラットの開頭手術が右半球のために示されているために設定し、挿入図に使用される機器、クレイニエクトミ部位周辺のアスピレーターと生理食塩水の点滴のポジショニング。また、血管系の主要な特徴も示されています。中大脳動脈(赤)と下大脳静脈(青)が示されており、動脈の凝固が発生する場所斜線部分を示します。閉塞の確認は、下大脳静脈の下にMCAを切断することによって行われる。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

  1. 露出面積を掘削しながら、円形や側圧はなく下向きの圧力の適用を確保、粗1.6ミリメートルダイヤモンドコーティングされたドリルバリで約8000 rpmので歯科用ドリルを用いて露光領域の上に開頭術を実行します(約5ミリメートル×5ミリメートル) 。骨はそれが完全に透明に見えることは十分に薄くすると、鉗子を使用して削除します。
  2. 彼らは繊細で破裂するのが容易であるように、慎重に、大きな表面の血管を避けるために慎重であること、硬膜を開くには、約180°の円弧を形成するために微細な鉗子の1先端を折り曲げて作られた自家製の硬膜フックを使用します。
    注:脳の露出面積は、中大脳動脈(MCA)を明らかにします。目的のセグメント施策長さ約2ミリメートル( 図1、挿入図を参照)。
  3. 下大脳静脈が交差するところから、動脈分岐のポイントにした後、完全に閉塞した17までジアテルミーピンセットを用いて、MCAの尾側枝に沿ってMCAを凝固。 0.25ミリメートルの尖った先端を有する傾斜したジュエラージアテルミー鉗子を使用してください。
    1. 動脈を閉塞する際、生理食塩水を血管に付着凝固鉗子を防止クールこの領域を維持するために必要な流れ変えます。閉塞すると、血管が黒表示され、血流の兆候は存在してはなりません。血流が部分的に閉塞した血管に見られます。
    2. 完全な閉塞を確認するために、この時点でMCAをカットします。下大脳静脈はMCAと交差する下のカット、微小血管ハサミを使用。
    3. 次のステップに進む前に、生理食塩水に浸したガーゼパッドと露出面積をカバーしています。
  4. 仰向けポジに戻っラットを回しションは、頸動脈を再公開するために首にゆるく結ばれた縫合糸を再び開くと。左頸動脈が60のための125グラムの圧力で13ミリメートルのステンレス鋼動脈クリップを使用して一時的に閉塞される一方で、恒久的に頸動脈の周りの絹縫合糸に結び目を結ぶことにより、閉塞したMCA(右)と同じ側の頸動脈を結紮分。ゆるくこの時間の間に首の切開部を縫合し、脱水を防ぐために、上に滅菌生理食塩水に浸したガーゼを置きます。
  1. 動物の右手側は仰臥位ポジショニング与えられ、外科医の左側にあることに注意してください。
  2. 偽動物のために、首や側頭部の腹の部分を開き、総頸動脈を見つけることが、閉塞しない筋肉を分離します。この手順では、行動障害16を生成することができるように偽動物は、開頭術を含めた手順までではなくを受けています。他トンの盲検化を維持するために、EAMのメンバー( 例えば 、後に行動試験中)は、切開および縫合を行います。

図2
図2タンデム頸動脈閉塞中大脳動脈閉塞後、右総頸動脈(CCA)を恒久的に(画像の左側に)血管周囲に絹縫合糸(5/0)を結びつけることによって閉塞されます。 (右側)左CCAは、微小血管クランプを使用して、1時間閉塞されます。これらの手術は、各側の迷走神経(白)と接触しないように注意しながら行った。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

  1. 左総頸動脈閉塞の1時間の間に時間的な地域の切開部を縫合。
  2. 水和を維持するために、ラットに生理食塩水を皮下の20ミリリットル(各脇腹上の2つのサイトに5ミリリットル)を得(参照6.2)。
  3. 60分が経過すると、クリップを削除します。周囲の筋肉に局所的に生理食塩水を適用し、吸収性縫合糸(4/0)の皮下連続縫いを使用して首に切開部を閉じます。

3.術後のケア

  1. 最大4時間、麻酔から回復するために31℃のインキュベーターにラットを置きます。
    注:研究者は現地の慣行に従って、他の温度および期間を使用することもできます。
  2. 24時間での疼痛緩和のための繰り返しcarprieve(0.25ミリグラム/キログラム)、。すべての動物がCarprieveの同じ用量を受けているので、この因子を系統的に制御されます。 Carprieveの任意の神経保護効果は無視できる可能性があります。
  3. 少なくとも最初の3日間、脱水を防ぐために、毎日、生理食塩水注射を与えます。ラットは体重kg(各24時間)あたり65 mLの流体を必要とすることを前提に、各300グラムのラットは、1日あたり〜22ミリリットルの液体を受け取ることを確認してください。

4.コン梗塞のfirmation

  1. 梗塞体積を測定するためには、構造的MRIを使用します。
    注:別の方法は、以前に構造的MRIデータ18に相関しているような塩化テトラゾリウム(TTC)などの組織染色を、使用することができます。しかし、これは、長手方向だけではなく、研究のエンドポイントで使用することができます。
    1. 24時間MCAO誘発後、0.9 L /分医療航空直交バードケージの磁気共鳴コイルでセキュア1 L /分のO 2にイソフルラン(誘導5%、維持のための1-1.5%)でラットを麻酔(43ミリメートルの直径)と7テスラ水平ボアスキャナに配置します。
    2. 時間エコー(TE)60ミリ秒、繰り返し時間(TR)4000ミリ秒、視野(FOV)40×40ミリメートル、取得行列40×0.5ミリメートルを取得する128×128、:T2加重高速スピンエコーシーケンスを使用してスキャンを取得約8分で厚さにスライス。その後、resamplを使用して20×1mm厚のスライスに40のスライスを変換医療用画像処理ソフトウェアで機能をる。
  2. 20ボリュームで梗塞の断面積を測定することにより、医用画像表示パッケージ内の病変のボリュームを取得します。厚さ(1ミリメートル)することにより、これらの面積の合計を乗じて総容量を取得します。ボリュームと標準偏差を群平均を計算します。パーセンテージ病変体積の計算のために、またipsilesionalとcontralesional半球のボリュームを獲得。
  3. Gerriets「数式18を使用して、これらの値を調整し、浮腫による脳腫脹を修正するには。唯一の皮質を含み、これは負の病変のボリュームを生成することができるように、過補正を回避するために、標準的なラットアトラス19に従って小脳や嗅球を含まないスライスが含まれます。
    1. 8週間ストローク手術後再びT2強調画像を取得します。

神経保護および行動回復を<評価今後の研究のため5.サンプルサイズの計算/ P>

  1. 使用して三つの異なる大きさの治療効果(25%減少、50%の減少、75%の減少)を識別するために、2つの群処置対コントロール)を使用して、将来の仮定的な神経保護の実験に必要とされる最小のサンプルサイズを推定するために、サンプルサイズの計算を行いますパワー解析ソフトウェア20に実装さアプリオリアルゴリズム。
    注:独自のデータと同様の計算を行うために、読者を有効にするには、自由に利用可能な電力解析ソフトウェアからのスクリーンショット(代表的な結果を参照)があります。 ;≤0.05、およびパワー(1-βに等しい)≥0.80( すなわち 、80%の電力よりも大きい)許容可能な偽陽性率(α すなわち 、タイプIエラーしきい値):次のパラメータを使用します。説明や議論の21については、以下を参照してください。

ストローク手術後6高齢動物福祉

  1. 利用可能な追加ソフト餌aを作りますND再水和ゲルは、ラットを簡単に到達するための、拡張ヒントと水のボトルに加えて、手術前に慣らしたことをパックします。また、最初の24時間( すなわち 、木材チップを避けるため)ケージ内吸収性回復パッドの代わりに、緩い寝具を使用していて、余分なネストベッドを提供しています。嚥下障害を持つラットは窒息することができるようピューレ食品( 例えば 、ベビーフード)を使用しないでください。
  2. 回復を監視するために7日間毎日、動物を計量。減量は、脱水やストレスの主要な指標です。手術後の最初の数日間で体重減少は、主に(むしろ減少給餌による体重の減少よりも)脱水を反映しています。
  3. 老化ラットが手術に関係のない減量を示し、ここで、流体の当量で失われた体重を交換し、上部と下部の歯を検査します。歯が生い茂っている場合には、(セクション2.1のように)イソフルランでラットを麻酔し、仰臥位での場所
    1. teの後ろに1ミリリットルのシリンジバレルを配置軟組織を保護するためのETH。高回転速度ではなくゆっくりと、しっかりと手の動き( 例えば 、3秒カット)で手持ち丸鋸( 例えば 、約直径3cm)を使用してカットします。ラットの歯がカットの間に冷却することができます。のこぎりの歯は、回転方向に向くように回転式鋸がマンドレルに装着されていることを確認してください。このような事態のために準備ができて、個別に滅菌し、包装された回転式のこぎりを維持する価値があります。
      注意:ハードペレット食餌で維持した場合にも異常増殖が高齢ラットで発生する可能性があります。私たちは、歯が定期的に高齢ラットでチェックされることをお勧めします。
  4. 高齢ラットは体重減少および手術とは無関係の立毛を示している場合には、獣医師による治療の選択肢を議論します。動物を殺す人道的に考えてみましょう。このような動物のMRIが動作不能と致命的である(多くの場合、高齢者の雌ラットの)下垂体腫瘍を表示することができます。

Representative Results

永久MCAOは、永久ipsilesional総頸動脈の閉塞とcontralesional総頸動脈の60分間の閉塞と組み合わせるジアテルミーにより中大脳動脈の凝固及び破壊に続いて、実行開頭術によって誘導されました。機器のセットアップの概略とMCAの閉塞は、図1に示されており、 図2(上記)で頸動脈の

ストローク結果は、医用画像表示パッケージに関心ツールキットの領域を使用して(嗅球の吻側端から脊髄の吻側端まで)40×0.5ミリメートルのスライスに梗塞体積を測定することにより、脳卒中後24時間および8週間を評価しました。代表的なT2加重構造MRIスキャン24時間及び8週目( 図3A)で同じ動物について示されています。梗塞体積は、高強度信号を示すラット脳の領域により同定しました。 T2の重みとしてEDの画像は明るい白領域として水または血漿を示します。脳卒中後の腫脹浮腫および脳の増加があることが知られており、これは、梗塞体積18の組織学的測定値と相関しているT2強調スキャンから測定することができます。 Gerrietの式を用いたが、本浮腫は初期のストローク( 例えば 、24時間で)後の最終病変体積( 例えば 、8週の時点で)の過大評価につながることができますので、我々はまた、本平均梗塞ボリューム調整。 図3Bは、からの平均データを示しています62.8ミリメートル3として24時間で生(未調整)病変体積(25.4ミリメートル3 SD、上段のグラフ±)。これは、影響を受ける半球(±4.2%のSD、中央のグラフ)の9.8%を占めています。脳はGerriets '式を用いて膨潤について補正する場合は、この値は(2.0%のSD、下のグラフ±)4.5%に低減されます。

脳卒中の重症度もモントーヤの階段テスト15を用いて測定しました。簡単に説明すると、Aはnimalsは4週間前MCAOにストローク手術のために砂糖ペレットを取得するために、事前に訓練を受け、かつ持続的な赤字を確認するためのストローク( 図4)は、次の8週間にわたって試験しました。ラットは、10分間の階段装置に入れ、検索されたペレットの数は、(21ペレットから)を記録し、パーセント(グループは平均±標準誤差を意味する)として表示しました。回帰分析は、データラインにフィットするように行きました。

図5は、(候補治療法の潜在的な効果のために)梗塞容積データを用いて、サンプルサイズの計算を示し、「二つの独立した手段(両群)との差」を使用して(未補正を用いたt検定のための電力解析ソフトウェアのアルゴリズムを用いて分析図3Bからの)平均と標準偏差。 12匹のラットはinfファイルを縮小治療を検出するために、グループごとに必要とされるであろうことを、図5に記載されている情報および1ショー図6ながら24時間で50%ARCT量は、電力の「XYプロット」は、動物の様々な数を使用して達成示している。 表1は、全ての時点のためのサンプルサイズの計算をまとめたものです。

図3
図3. T2強調構造的MRIは脳卒中後の腫脹梗塞や脳の大きさを測定するために使用される。(A)と同じラット脳24時間と脳卒中の誘導後8週間のT2強調磁気共鳴画像。白い領域は、病変を表すだけでなく、8週目までに解決し、いくつかの血管原性浮腫が含まれています。 (B)梗塞容積は、目的のツールキットの医用画像表示パッケージ領域を使用して測定し、そして使用する3時点について平均±SDを表すグラフ上にプロットされた(n = 6)。エドによる脳腫脹のために補正していない生の病変容積(絵馬)、影響を受けた半球の割合病変(腫れのために補正されていない)、およびGerriets '式を用いて脳腫脹に対して補正半球の割合病変はここに示されています。 SDは、サンプルサイズの計算を( 図5参照)を実行するために、むしろSEMよりも使用された。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図4
図4. 階段テストが把握し、ペレットを検索する際に障害を示している。この脳卒中モデルでは非常に少ない自然回復がありました。高齢ラットにおける脳卒中は、永続的にペレットに達するの「階段テスト」を使用しての毎週試験で示され、器用さを損ないます。挿入図:行動試験を行ったラットの絵。グラフは、平均(±スタンドを示しています21のうち(検索されたペレットのARDエラー)数は、影響を受けた前足により週パーセント)として表しました。 n = 5 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図5
所望の治療効果を検出するのに必要なラットのグループ番号を決定するために、図5のサンプルサイズの計算パワー解析ソフトウェアから採取したこのスクリーンショットは、群あたり12匹のラットを50%の梗塞体積を減少療法を検出するために必要とされるであろうことを示しています24時間で。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図6
図6.電源は、動物の種々の総数を使用して達成パワー解析ソフトの「値の範囲について、XYプロットを「高齢ラットの種々の(合計)の数値を用いた実験のために得られる力を示すパラメータ指定されました表1は、すべての我々の結果をまとめたものである。 図5に示す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

脳卒中後の時間: 病変の容積の減少を検出するために必要なグループあたりのラット数:
75パーセント 50% 25%
24時間 6 12 42
8週間 4 5 17

仮定の将来の実験のために、グループごとにサンプルサイズの表1の計算パワー解析ソフトウェアを用いて計算し (図5および 6を参照)。表は、この研究における時点のそれぞれにおける病変容積の25%、50%および75%の減少を検出するための2つのグループの実験のために必要なグループあたりのラット数を示します。

Discussion

げっ歯類におけるMCAOは、多くの場合、人間のストロークをモデル化するために使用される技術です。このモデルは、プロトコルに注意すべきいくつかの詳細を持っています。第一に、梗塞のサイズおよび研究における死亡数に影響を与えるように実験を通して、動物の体温を維持するために不可欠です。右CCAの一過性閉塞中にイソフルランを中止し、イソフルランへの曝露を減らすことにより、生存率を高めるために温め、静かな環境でラットを維持することが可能です。研究者は、追加の誘導のストレスを上回る短い麻酔期間かどうかを検討する必要があります。ラットの血管系( 例えば 、MCA分岐)は、内および動物22のコホート間で変化します。新しい研究を始めたときには、この点に注意を負担することが重要です。別のCCAの閉塞時間を評価することができる例えば、30、45、60及び90分)。この研究では60分間の閉塞時間が使用されます。他の研究では、45ことを発見しました分閉塞は、同様のサイズの皮質梗塞を引き起こすが、改善された生存率の事例証拠と。したがって、外科医が得られるだけにして、必要な場合に閉塞時間を増加させるために十分な病変のボリュームかどうかを確認(および/ ​​または行動障害を必要)するために、短い閉塞時間( 例えば 、30分)で開始しています。行動の赤字は、同一の閉塞時間を持つ高齢ラットと比較して成体ラットに持続されていません。

MRI(特に閉塞時間後)病変容積は、研究目的のために適切であるか否かを判断するために使用することができます。小さな病変は(40のうち)10個未満の0.5ミリメートルの冠状スライスにまたがることになります。中規模の病変が10と20の冠状スライスの間にまたがることになります。大きな病変が20と30の冠状スライスの間にまたがることになります。非常に大規模な病変が40スライス以上の30に及ぶことになります。私たちの経験では、非常に大きな病変(以上30スライス)および/またはヘルニアのアクロスの証拠を有するラットsの正中線は通常、予後不良を持っている:短い閉塞時間が考慮されることがあります。 MRIはまた梗塞の位置を評価するために有用である:いくつかは、より尾側に位置しており、一部はより吻側に位置しています。

両方の総頸動脈から迷走神経を分離する際に細心の注意を払ってください。ラ音(ガリガリ)は、脳卒中手術後に発生する可能性があり、原因は現在不明であるが、これは、いくつかの動物では神経損傷に起因することができます:私たちの経験では、予後はこれらの動物のために非常に貧弱であり、それは通常、人道的に彼らを殺すことをお勧めします。

再現性皮質梗塞や高齢ラットにおいて許容術後生存率の恒久的ジアテルミーMCAOモデルの結果。技術は、しかしながら、実体顕微鏡下侵襲手術を必要としません。動物は、手術から十分に回復することである場合、無菌技術を維持することが重要です。ケアは、動脈を露出させ、凝固しながら、MCAを損傷しないように注意する必要があり、皮質表面へのダメージは、そうでなければ皮質の露出面積は、梗塞領域の一部を形成することができる最小にすべきです。手順を確立するために、一貫性梗塞を達成するために、研究は、例えば、候補治療法をテストするために実行される前に、閉塞時間を決定し、できるだけ多くの経験を得ることが推奨されます。実験者は、(「ブロックランダム化」)の可能な手術セッション内の任意の治療をランダム化する必要があります。これは、(過渡MCAライゲーションではなくジアテルミーのに使用されていない限り)このモデルは、MCAの再灌流を伴わないことは注目に値します。死亡率は、これらの大規模な皮質梗塞と高齢ラットにおいて高いことができますが、短い閉塞時間を使用し、可能な場合( 例えば 、閉塞中に)全身麻酔への暴露を最小限に抑えることにより、死亡率を減少させることが可能であるべきです。イソフルランの低いレベルを可能にすることができる担体として70%N 2 Oおよび30%O 2の使用は、使用される:isofluこの縮小露光をRANEは、より高い生存率をもたらすことができます。

考慮すべきもう一つのポイントは、このプロトコルでは、我々は急性CCA閉塞とそれをシミュレートするのに対し、アテローム性動脈硬化症は、漸進的なプロセスであることです。しかし、血流と持続的な赤字の大幅な削減は、多くの脳卒中患者で発生するタンデム閉塞をシミュレートします。ラットにおける永久遠位MCAOタンデムCCAのない閉塞は、再現性14ストロークを誘導するために失敗します。また、タンデムCCA閉塞することなく、我々はかなりの自発的回復はそれが8週間にわたって脳卒中治療の長期的な行動の評価を妨げる発生を発見しました。これとは対照的に、我々はタンデムCCA閉塞遠位MCAOは、高齢ラットにおける長期的な赤字を誘導することを示しています。

結論として、ラットでこの手順では、持続的な1は、新規治療法のテストを可能にするために使用することができます障害や再の解明と、人間の状態で見られるものにサイズと位置が似ているストロークを引き起こし虚血性脳卒中後のペアメカニズム。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Carprofen Norbrook Vm No; 02000/4229 give 0.25 mg/kg
Atropine Sulfate AmTech RXATRINJ-100
Alcohol swabs UHS 20021
Lidocaine cream (Emla) AstraZeneca 0012901 Apply a pea sized drop to the shaved neck and temporal regions
Homeothermic Blanket System Harvard Instruments 507222F
Forceps Fine Science Tools 11019-12
Isoflurane Abbott B506
Silk sutures Harvard Apparatus 723288
Cautery system Eschmann
0.25 mm Jeweler cautery forceps Eschmann 8330349
fine Dumont forceps Fine Science Tools 11251-10
Thumb driven saline drip system
Vacusafe aspirator system INTEGRA BIOSCIENCES 158320
1.6 mm coarse diamond coated Steel burrs K801 104 016
Handheld dental drill NSK NSKVMAXVRE (Handpiece NSKEX6B)
Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 15000-03
Microvascular scissors World Precision Instruments 501790
4-0 Vicryl sutures Ethicon
Vascular clip and applicator
Operating microscope Zeiss
Compact Anaesthesia System Isoflurane K/F Single Gas VetTech Solutions
Carbon Steel Scalpel blades No. 10 Swann-Morton 201
25 g needles Terumo NN-2525R
syringes (1 ml and 5 ml) Terumo SS+01T1 / SS*05SE1
Saline (Sodium Chloride 0.9%) Fresenius Kabi Pl 08828/0178
cotton buds Johnson and Johnson 5000207582502 sterilize before use
gauze sterilize before use
Medical Imaging Package (Jim) Xinapse Free software
Statistical Parametric Mapping Software (SPM8) UCL Free software
Power Analysis Software (G*Power) Universität Düsseldorf Free software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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