Performing מוחות תיכונים דיסטלי קבוע עם ספיגה עורקת Common הראש אצל חולדות בנים לחקר קורטיקלי איסכמיה עם נכות קבועה זה

1Wolfson Centre for Age-Related Diseases, King's College London, University of London, 2Department of Neuroimaging, James Black Centre, Institute of Psychiatry, King's College London, University of London, 3Institute of Neuroscience and Psychology, Wellcome Surgical Institute, College of Medical, Veterinary and Life Sciences, University of Glasgow, Glasgow, 4Research Service, Edward Hines Jr. VA Hospital, 5Neurology Service, Edward Hines Jr. VA Hospital, 6Department of Molecular Pharmacology and Therapeutics, Neuroscience Research Institute, Loyola University Chicago, 7Department of Oncology, The Gray Institute for Radiation, Oncology and Biology, University of Oxford
* These authors contributed equally
Published 2/23/2016
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Medicine
 

Summary

כאן אנו מציגים פרוטוקול לייצר חסימת עורק המוח אמצעית דיסטלי קבעה חולדות נקבות קשישים עם חסימה זמנית של עורקי הראש כדי ליצור אוטמי קורטיקליים גדולים וגירעונות מתמשכים. אנו מציגים אישור של הגודל הנגע באמצעות MRI מבני ב 24 שעות ו -8 שבועות לאחר אירוע מוחי.

Cite this Article

Copy Citation

Wayman, C., Duricki, D. A., Roy, L. A., Haenzi, B., Tsai, S. Y., Kartje, G., et al. Performing Permanent Distal Middle Cerebral with Common Carotid Artery Occlusion in Aged Rats to Study Cortical Ischemia with Sustained Disability. J. Vis. Exp. (108), e53106, doi:10.3791/53106 (2016).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

שבץ בדרך כלל מתרחשת אצל אנשים קשישים עם מגוון של מחלות רקע כולל התרדמה (או עורקים אחרים) טרשת עורקים, לחץ דם גבוה, השמנת יתר וסוכרת. בהתאם לכך, כאשר אנו מעריכים טיפולים לשבץ בחיות, חשוב לבחור דגם עם תוקף פנים מעולה. שבץ איסכמי מהווה 80% מכל מקרי השבץ, ואת רוב אלה להתרחש בשטח של עורק המוח האמצעי (MCA), לעתים קרובות התרמה אוטמים המשפיעים על הקורטקס הסנסורי, גרימת plegia או paresis מתמשך בצד הנגדי של הגוף. אנו מדגימים בסרטון הזה שיטה להפקת שבץ איסכמי בחולדות קשישים, הגורם נכות הסנסורית מתמשכות אוטמי קורטיקליים משמעותיים. באופן ספציפי, אנחנו לגרום לחסימת עורק המוח האמצעית דיסטלי קבעה (MCAO) בחולדות נקבות קשישים באמצעות מלקחי דיאתרמיה כדי לחסום קטע קצר של עורק זה. עורק התרדמה בצד ipsilateral כדי הנגע היה אז permanently occluded ואת העורק הראשי הנגדי היה occluded זמני למשך 60 דקות. אנו מודדים את הגודל האוטם באמצעות תהודה מגנטית T2-weighted מבנית (MRI) ב 24 שעות ו -8 שבועות לאחר אירוע מוחי. במחקר זה, היקף האוטם הממוצע היה 4.5% ± 2.0% (סטיית התקן) של האונה ipsilateral ב 24 שעות (לאחר תיקון המוח נפיחות באמצעות המשוואה של Gerriet, n = 5). המודל זה אינו ריאלי ורלוונטי קליני כפי שהוא מאפשר אינדוקציה של גירעונות הסנסורית מתמשכים, שהנה חשוב להבהרת המנגנונים pathophysiological וטיפולי רומן.

Introduction

שבץ מוחי הוא כיום הגורם השלישי בשכיחותו למוות בכל העולם ואת הגורם המוביל נכות 1. שבץ איסכמי, המהווה 80% מכל מקרי שבץ, לעתים קרובות תוצאות אוטמות בקליפה גורמת לאובדן בתחושה (למשל, פרופריוספציה), בתפקוד מוטורי וגם לב בצד הפגוע 2-4. עורק המוח האמצעי (MCA) הוא גדול של הכלי שמושך אספקת ממעגל ויליס נובעת עורק התרדמה הפנימי 5. MCA הוא כלי מוחין ביותר האזורים הנגועים ביותר בקרב שבץ איסכמי, עם משיכות בשטח זה והיוו 65% מכלל מקרי שבץ איסכמי 6,7. MCA מספקת הן אזורים קורטיקליים קורטיקליים וחריגות נוירולוגית הנגרמת על ידי שבץ MCA משתנות בהתאם למיקום המדויק של חסימה 7. חסימות MCA הפרוקסימלי להשפיע על השטח העמוק דרך עורקי lenticulostriatal ולגרום אוטמים גדולים המקיף הוא קורטיקאל ואזורים קורטיקליים. לעומת זאת, חסימות דיסטלי יותר כי לשלול אזורים בקליפת המוח אך ורק של זרימת הדם נוטים לייצר אוטמים קורטיקליים קטנים.

במחקרי אוכלוסייה גדולים, נגעי שבץ אדם נעים בין 5-14% של חץ כדור ipsilateral 8,9; שבץ ממאיר מהווה 10% ממקרי שבץ ואת המוליד האוטם גדול, הדורשים hemicraniectomy להפחית לחץ תוך גולגולתי, וחולים עם נגעים קטנים נוטים יותר לשרוד 10. אנו מדגימים מודל לשחזור שמייצר נגעים שמעסיקות שיעור דומה של חצי הכדור כמו משיכות אדם רבים.

שבץ הוא מחלה הטרוגנית; 75% ממקרי שבץ איסכמי הם המושרה על ידי אחד אוטמי אַגמִימִי (מחסימה של כלי דם קטנים תוך גולגולתי); שבץ cardioembolic; או טרשת עורקים בעורק גדול, המהווה 30% ממקרי השבץ. טרשת עורקים סימפטומטית הוא הנצפה ביותר בנקודה שבה ג נפוצהעורק arotid (CCA) סניפים לתוך עורקי הראש הפנימיים והחיצוניים 11.

מודלים פרה-קליני של שבץ צריכים להיות דומים למצב אנושי ככל האפשר כדי לדמות פתופיזיולוגיה שלה וצריך לשלב את גורמי סיכון לשבץ. 92% לשבץ איסכמי מתרחשים אצל אנשים מעל גיל 65, וגורמי סיכון אחרים כוללים השמנה, לחץ דם גבוה, טרשת עורקת, כמו בעבר דנו 12. כדי לייצג בצורה טובה יותר גורמי סיכון אלה, מומלץ להשתמש במודל זה עשוי לשתף חלק מהתכונות pathophysiological של המצב הטבעי. בפרוטוקול זה, יש לנו כלל גילו המתקדם ואת זרימת הדם חסום דרך עורקי הראש.

המודל הקלאסי של חסימה בעורק המוח האמצעי (MCAO) הוא מודל נימה intraluminal של חסימה הפרוקסימלי MCA, אשר מפחית את זרימת הדם בתוך הקדמי ועורקים המוח האמצעי. פעמי חסימה קצרות באמצעות מודל זה מתמקדת lesion לאזור קורטיקליים, ואילו פעמים חסימה כבר יכול לגרום נגעים גדולים בגיוס בתחומי הן אזורים בקליפת המוח ואת קורטיקליים, וכתוצאה מכך שיעור תמותה גבוה בחולדות קשישים. לשם השוואה, את המודל המשמש על ידי הקבוצה שלנו כרוך ביצוע craniotomy ופתיחת הדורה ואחריו קרישה של דם והרס של חלק קטן של MCA באמצעות מלקחיים צריבה דו קוטבית. מודל דיאתרמיה זה מותאם מהעיתון 1981 על ידי טאמורה et al. 23 ואת שימוש craniectomy עלול להגביל העלה לחץ תוך גולגולתי, אשר הוא התכונה של גולגולת הסגורה, וכתוצאה מכך השחזור גבוה ושיעור תמותה נמוך במדגם הניתוח שלנו 13 לעומת כמה דגמים אחרים. כדי ליצור אוטמים לשחזור ונכות שנגרמו לנו לצמיתות לחסום את הפרוקסימלי CCA ויוצרת באורח זמני לחסום את CCA דיסטלי לפי חן et al. 14 אנו משתמשים לא פולשנית הדמיה בתהודה מגנטית משוקלל T2 (MRI) כדי להעריך את היקף ומיקום של אוטם מוחי, ומידת המוח נפיחות בקליפת הסנסורית.

Protocol

פרוטוקול זה אושר על ידי הנחיות מוסדיות שנקבעו על ידי בקינגס קולג 'בלונדון, וכן בוצע בהתאם להנחיות משרד הפנים בבריטניה וחיות (הליכים מדעיים) Act of 1986. הנחיות עשוי להשתנות בין מוסדות; בבקשה לפקח על קיום הנחיות מוסדיות תנסה בכל זאת. על מנת לשמור על טכניקת aseptic כשנוגע ציוד, חיטוי חתיכה גדולה של רדיד אלומיניום להשתמש בזה כדי לעטוף ציוד מטפל כגון במחשב מיקרוסקופ והרדמה. הסרט נצמד סטרילי (בניילון נצמד) עשוי לשמש גם.

1. הכנה

  1. להכיר חולדות עם חבילות נוזל ג'ל (ג'ל לשיקום וטרינרים) ו צ'או רך לפחות 48 שעות לפני ניתוח שבץ. כמו חיות לעיתים קרובות מתקשים עם אכילה ושתייה לאחר ההליך, להציג את בעלי החיים פריטים אלה לפני הניתוח, כדי למזער neophobia. חולדות קשישי בית עם blo ללעוס עץcks להפחית את השכיחות של שיני מגודל (ראה סעיף 6).
  2. לעקר את כל כלים כירורגיים לפני תחילת הליכים כירורגיים ידי מעוקר (מינימום 121 ° C, 15 PSI, במשך 15 דקות). לטהר את כל משטחי העבודה באמצעות כלורהקסידין 1% באתנול 70% ולהשתמש וילאות כירורגי ולתחזק טכניקה מזוהמת למשך ההליך.
  3. להשרות נגעים על הנגדי האונה אל כפה המועדפת. להקצות נגעים השמאלי או האונה הימנית תלוי בכפו המועדפת של כל עכברוש, שקבע ערכי הבסיס טרום ניתוחית במבחן המדרגות מונטויה 15 (ראה איור 4). לשם הפשטות, כאשר תיאר הליך זה בכתב היד הזה, הכף השמאלית הוא כפה המועדפת, ואת הניתוחים מבוצעים על האונה הימנית. השתמש ליסטר סלעי או הארוך אוונס חולדות עבור בדיקות התנהגותיות אלו כאשר הם לומדים מהר.
    הערה: המבחן המדרג נועד למדוד שינויים בשני עדין וגס מ מיומןovements בעקבות נזקים במערכת המוטורית. גרם המדרגות מורכב משבעה שלבים בכל צד של פלטפורמה מרכזית. אם ציוד עבור בדיקה המדרגת אינו זמין, מבחן הגליל הוא אלטרנטיבה מתאימה handedness בדיקות, אך מציין כי קיים גרעון חולף רק במבחן זה במודל זה של שבץ מוחי, ולכן יהיה מתאים למדידת התאוששות לטווח הארוך הבא יַחַס.
    1. מניח שלושה כדורי סוכר הבאר של כל שלב (21 כדורים לכל צד). מניח חולדות במנגנון המדרג במשך 10 דקות ולהקליט את מספר הכדוריות לאחזר ומספר הכדורים העקורים בכל צד.
      הערה: על מנת להיכלל המשימה שלאחר הניתוח, חולדות צריכה לקבל מינימום של 75 כדורי% בתחילת המחקר.

2. כירורגיה

  1. השתמש נשי חולדות קשישים ליסטר-סלעית ב 16-18 חודשים (250 עד 400 גרם) ולגרום הרדמה עם isoflurane 5% ב 1.5 L / min O 2. בעקבות אינדוקציה של הרדמה, להפחיתרמת isoflurane ולתחזק אותו בעומק נאות אך ממוזער לכירורגיה (למשל, 1.5-2%). לספק הרדמת החיה ידי מסיכת פנים, ולהשתמש מערכת הדחה להגביל את החשיפה של מנתח isoflurane.
    1. לבצע את כל ההליכים עד, אך לא כולל craniotomy על חיות דמה, כמו הליך זה יכול לייצר גירעונות התנהגותיות 16. שקול מטרות הניסוי בעת תכנון ניסויים MCAO, ולהחליט אם לא קבוצה דמה לשלוט עבור craniotomy צריך להיכלל.
  2. נהל טרום הקלה בכאב או peri- הניתוח (Carprieve, 0.25 מ"ג / ק"ג, ים. לחתוך).
    1. הוסף 1 מ"ל ל 19 מ"ל סליין 0.9% סטרילי כדי להפוך את פתרון המניות ולהזריק 0.6 מ"ל לכל עכברוש 300 גרם. שימוש Carprieve עדיף על פני Carprofen משום שהראשונה הוא יציבה ב RT
  3. לגלח את הפרווה על באזור הצוואר הגחון ובאזור הזמני על האונה הימנית כדי לחשוף את העור. לחטא את האתרים כירורגית uלשיר מטליות אתנול. הקפד למלא אחר הנחיות IACUC מקומיות להסרת שיער.
    1. בצע פעולה זו הרחק מאזור ההפעלה כדי למזער את כמות פרווה במקום חתך.
  4. מניח את החולדה על שעם מכוסה וילון סטרילית במצב שכיבה על כרית חימום. החל קרם לידוקאין לאזורים המגולח של הראש והצוואר. הכנס בדיקה רקטלית כדי לפקח ולשמור על טמפרטורה חיה בין 36.5-37.5 מעלות צלזיוס עם מערכת homeothermic.
    1. שים משחה lacrilube על העיניים כדי למנוע התייבשות. תן החולדה זריקה של פתרון סולפט אטרופין (0.05 מ"ל של פתרון 600 מיקרוגרם / מ"ל, תת עורי) כדי להפחית הפרשות קנה הנשימה.
      הערה: חוקרים לשקול מדידת משתנים פיזיולוגיים כגון גזים בדם ולחץ.
  5. לפני תחילת הניתוח, לבדוק את נסיגת hindpaw קמצוץ ולמצמץ רפלקסים כדי לאשר הרדמה מלאה.
  6. תחת מיקרו לנתחהיקף, לעשות חתך קו האמצע מרכזי 2 ס"מ על הצוואר חשוף באמצעות אזמל. הזז את בלוטות הרוק לרוחב בעדינות אל קנה הנשימה משני הצדדים.
  7. Loop תפר משי שאינם נספגים סביב העור כי overlies עורק התרדמה המשותף בצד אחד. משוך בעדינות את העור מן האתר באמצעות תפר המשי מקל אלה ללוח שעם באמצעות פלסטר כדי לחשוף את העורק הראשי המשותף. בזהירות בוטה לנתח העורקים ללא שמסביב fascia ואת העצבים מחנק באמצעות מלקחיים בסדר.
    1. היזהר שלא לפגוע שריר או עצב תועה במהלך שלב זה, כמו זה יהיה לפגוע האכלה, בבליעה ובנשימה.
  8. לאחר עורק התרדמה המשותף חשוף, השתמש תפר משי שאינו נספג (5/0) כדי לבודד את הראש, הראשון הפרדת הראש מן עצב התועה ידי לנתח הפוך עם מלקחיים בסדר נזהרים שלא ליצור קשר עם העצב. ברגע הספינה כבר בלולאה (אבל לא קשור) עם תפר, tלחקות את הקצוות של תפר ביחד באמצעות פלסטר כדי למנוע שבוטלה להיות צעד זה. הסר את התפרים מתאפקים העור שמעליה.
  9. חזור על הפעולה עבור הצד השני (סעיפים 2.7-2.8)
  10. מניחים גזה סטרילי ספוג מלוחים לתוך הפצע לשמור רקמות לחות במהלך שארית הניתוח. רופף לתפור את העור ושמי גזה נוספת מלוחה ספוגות רחבי אזור כדי למנוע התייבשות נוספת.
  11. מניחים חולדות בעמדה לרוחב ולעשות חתך בעור בנקודת האמצע בין למסלול הנכון ואת תעלת השמע החיצונית. לחזור בו העור באמצעות עד חמש כתיבת וו אלסטי 3 מ"מ מוצמדת ללוח שעם ואחר כך להקהות לנתח את שריר temporalis כדי לחשוף את הגולגולת.
  12. מניחים הכביד מונחה מתואמת גלגל אגודל טפטוף מלוח מעל האתר הפתוח (קצב זרימה כ 2 מיליליטר / דקה) ולהקים מערכת aspirator כדי להסיר שאריות עצם כדי לנקות דימום מינורי המאתר החשוף במשך שלב זה של הניתוח ( כַּתיוני 2.13-2.16).
    1. מניחים את זרבובית משלוח מלוחים בנקודה הגבוהה ביותר של הגולגולת ליד האוזן, ואת זרבובית aspirator בנקודה הנמוכה ביותר. התאם את הגלגל במהלך דימומים לספק מלוח יותר לאזור כדי להמחיש את המקור טוב של כל לדמם עבור כווייה של כלי שיט, הפחתת כמות זמן החיות נמצאות תחת הרדמה.

איור 1
איור 1. הגדרת כירורגים של מודל עורק חסימת המוח האמצעית דיסטלי קבע. הציוד המשמש להגדיר עבור craniotomy העכברוש מוצג עבור האונה ימנית, ו הבלעה, המיצוב של טפטוף aspirator המלוח סביב אתר craniectomy. מוצג גם הם תכונות עיקריות של כלי הדם; עורק המוח האמצעי (אדום) וריד המוחין נח (הכחול) מוצג, והאזור המוצל מציין היכן קרישה של עורק מתרחשת.אישור של החסימה מתבצע על ידי חיתוך MCA מתחת וריד המוחין הנח. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

  1. בצע craniotomy על האזור החשוף (כ 5 מ"מ x 5 מ"מ) באמצעות מקדח שיניים עם בר תרגיל גס 1.6 מ"מ מצופה יהלומים כ -8,000 סל"ד, הבטחת היישום חוזר ולחץ לרוחב לחץ כלפי מטה לא תוך קידוח באזור חשוף . לאחר העצם הוא דק מספיק שזה נראה שקוף לגמרי, להסיר באמצעות מלקחיים.
  2. השתמש וו dural תוצרת בית, שנעשה על ידי כיפוף קצה אחד של מלקחיים בסדר כ 180 מעלות כדי ליצור קשת, כדי לפתוח את הדורה בזהירות, להיות זהיר, כדי למנוע את כלי דם הפנים גדולים, כפי שהם עדינים ופשוטים להתפקע.
    הערה: שטח חשוף של המוח יגלה את עורק המוח האמצעי (MCA); המקטע הרצויבגודל של כ 2 מ"מ אורך (ראה איור 1, הבלעה).
  3. להקריש את MCA מאיפה וריד המוחין הנח חוצה, עד לנקודה של הסתעפות עורקת ואז לאורך ענפי הזנב של MCA בעזרת זוג מלקחי דיאתרמיה עד 17 מלאים מוסתרים. שימוש במלקחיים דיאתרמיה Jeweler זוויתי עם טיפים 0.25 מ"מ מחודד.
    1. כאשר הגורם לחסימה בעורק, לשנות את מלוחים לזרום כנדרש כדי לשמור על האזור זה מגניב, מניעת המלקחיים המקרישים מ דבקות כלי הדם. כאשר האפילו, כלי הדם מופיעים שחורים ושום סימן של זרימת דם צריך להיות נוכח; זרימת דם ניתן לראות כלי מוסתר חלקית.
    2. חותכים את MCA בנקודה זו כדי לאשר חסימה מלאה. בעזרת מספרי כלי דם, לחתוך ממש מתחת למקום וריד המוחין הנח חוצה את MCA.
    3. מכסה את האזור החשוף עם פד גזה ספוג מלוח לפני שימשיך לשלב הבא.
  4. הפעל את העכברוש חזרה posi פרקדןtion ופתח מחדש את התפר הקשור ברישול על הצוואר מחדש ולחשוף את עורקי הראש. ולקשור את העורק הראשי באותו צד כמו MCA המוסתרת (מימין) לצמיתות על ידי קשירת קשר ב תפר המשי סביב הצוואר, תוך העורק הראשי שנותר הוא occluded באמצעות זמני קליפ העורק חלד 13 מ"מ פלדה עם לחץ 125 גרם במשך 60 דקות. רופף לתפור את החתך בצוואר במהלך הזמן הזה ואת המקום גזה סטרילי ספוג מלוחים על גבי כדי למנוע התייבשות.
  1. ראוי לציין, כי מצד ימין של חיה יהיה בצד שמאל של מנתח, בהתחשב מיצוב שכיבה.
  2. חיות דמה, פתח את החלק הגחוני של צוואר והאזורים זמניים ולהפריד את השרירים כדי לאתר את עורקי הראש הנפוצים, אך לא לחסום. האם חיות דמה לעבור הליכים עד אך לא כולל פתיחת גולגולת, כמו הליך זה יכול לייצר גירעונות התנהגותיות 16. כדי לשמור מסנוור של t האחרחברי EAM (למשל, במהלך בדיקות התנהגותיות מאוחר יותר), לבצע חתכי תפירה.

איור 2
איור 2. חסימת תרדמת טנדם הבאה חסימת עורק מוח אמצעית. עורק התרדמה המשותף הזכות (CCA) הוא occluded לצמיתות על ידי קשירת תפר משי (5/0) סביב כלי הדם (בצד השמאל של התמונה). שמאל CCA (בצד ימין) הוא occluded עבור שעת 1 באמצעות מהדק כלי דם. ניתוחים אלו בוצעו נזהרים שלא ליצור קשר עם העצב תועה בכל צד (לבן). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

  1. לתפור את החתך באזור הזמני במהלך 1 hr של חסימת הראש נפוצה עזבה.
  2. תן חולדות 20 מיליליטר של תת-עורית מלוח (5 מיליליטר לשני אתרים על כל אגף) לשמור על הידרציה (ראה6.2).
  3. כאשר 60 דקות שחלף, להסיר את הקליפ. החל מלוח מקומי לשריר שמסביב, לסגור את החתך בצוואר באמצעות תפרים רציפים עורית תפרים נספגים (4/0).

3. טיפול אופרטיבי הודעה

  1. מניחים את החולדה C חממה 31 ° להתאושש מההרדמה עבור עד 4 שעות.
    הערה: חוקרים עשויים להעדיף להשתמש בטמפרטורות משכים אחרים, על פי מנהג מקום.
  2. carprieve חזור (0.25 מ"ג / ק"ג), להקלה על הכאב לאחר 24 שעות. כי כל חיות מקבלים אותה המנה של Carprieve, הגורם זה נשלט על שיטתי. כל השפעה נוירו של Carprieve צפויה להיות זניח.
  3. תן זריקות מלוחות מדי יום כדי למנוע התייבשות לפחות בשלושה הימים הראשונים. בהנחה עכברוש דורש 65 נוזל מ"ל לכל ק"ג משקל גוף (כל 24 שעות), להבטיח כי בכל עכברוש 300 גרם מקבל ~ 22 מ"ל נוזלים ליום.

4. קוןfirmation של אוטם

  1. כדי למדוד את נפח האוטם להשתמש MRI המבני.
    הערה: שיטה חלופית יכולה להיות להשתמש מכתים היסטולוגית, כגון tetrazolium כלוריד (TTC), אשר כבר בקורלציה בעבר לנתוני MRI המבניים 18. עם זאת, זה יכול לשמש רק בנקודה בסוף המחקר, ולא אורכים.
    1. עשרים וארבע שעות לאחר האינדוקציה של MCAO, להרדים חולדות עם isoflurane (5% לזירוז, 1-1.5% לצורך תחזוקה) ב 0.9 L / min אוויר רפואי 1 ליטר / דקה O 2, בטוח סליל תהודה מגנטי כלוב נצב (43 מ"מ קוטר) ומניחים בתוך סורק נשא אופקי 7 טסלה.
    2. השג סריקות T2 משוקלל באמצעות רצף הד מהר-ספין: הד הזמן (TE) 60 msec, זמן החזרה (TR) 4,000 msec, שדה הראייה (FOV) 40 x 40 מ"מ, מטריקס רכישת 128 x 128, רכישת 40 x 0.5 מ"מ פרוסות עבות של כ -8 דקות. בהמשך לכך, להמיר 40 פרוסות לתוך 20 x 1 מ"מ פרוסות עבות באמצעות resamplפונקצית ing בתוכנות הדמיה רפואית.
  2. השג כרכי נגע בחבילת תצוגת תמונות רפואיות על ידי מדידת השטח החתך של אוטם ב -20 כרכים. השג את הנפח הכולל על ידי הכפלת הסכום של אזורים אלה על ידי העובי (1 מ"מ). חשב את הקבוצה מתכוון נפח סטיית התקן. עבור חישובי נפח אחוז הנגע, גם לרכוש את הכרכים של ההמיספרות ipsilesional ו contralesional.
  3. כדי לתקן את המוח נפיחות עקב בצקת, לשנות ערכים אלה באמצעות נוסחאות 'Gerriets 18. רק לכלול פרוסות המכילות קליפה ואינם מכיל המוחון או נורה חוש ריח פי אטלס עכברוש תקן 19 על מנת למנוע תיקון יתר, כמו זה יכול ליצור כרכי נגע שליליים.
    1. לרכוש תמונות T2 משוקלל שוב 8 שבועות לאחר הניתוח שבץ.

5. חישובי גודל מדגם למחקרים עתידיים הערכת שחזור neuroprotection והתנהגותי </ P>

  1. לבצע חישובי גודל מדגם כדי להעריך את גודל המדגם המינימאלי שיידרש בניסויי נוירו היפותטי עתידיים באמצעות שתי קבוצות (שליטה לעומת טיפול.) לזהות שפעות טיפול של שלוש בהירויות שונות (ירידה של 25%, 50% הפחתה, 75% הפחתה) באמצעות האלגוריתמים אפריורי מיושמים תוכנת ניתוח כוח 20.
    הערה: כדי לאפשר לקוראים לעשות חישובים דומים עם נתונים משלהם, יש צילומי מסך מתוך תוכנת ניתוח כוח בחופשיות-זמינה (ראה תוצאות נציג). השתמש בפרמטרים הבאים: שיעור חיובי כוזב מקובל (כלומר, סף טעות מסוג I; α) ≤0.05, וכוח (אשר שווה 1-β) ≥0.80 (כלומר, יותר מ -80% כוח). ראה להלן הסברים ודיון 21.

6. כירורגיה שבץ לאחר קשישים צער בעלי חיים

  1. ערוך צ'או רך נוסף זמיןnd התייבשות ג'ל חבילות כי חולדות היו מורגל כדי לפני הניתוח, בנוסף בקבוקי מים עם טיפים מורחבים יותר קל לכת. בנוסף, יש כרית התאוששות נספגת בכלובים במקום מצעים רופפים (כלומר, להימנע שבב עץ) עבור 24 השעות הראשונות, ולספק מצעי קינון נוספים. אל תשתמש מזון מרוסק (למשל, תינוק אוכל) כמו חולדות עם בליעה עלולות להיחנק.
  2. לשקול בעלי חיים מדי יום במשך 7 ימים לפקח התאוששות. ירידה במשקל היא אינדיקציה ראשונית של התייבשות ומתח. איבוד משקל אצל בימים הראשונים לאחר ניתוח בעיקר משקף התייבשות (ולא אובדן משקל גוף עקב האכלה מופחתת).
  3. איפה עכברוש הזדקנות תערוכות הרזיה קשורה לניתוח, להחליף משקל גוף אבוד עם משקל שווה ערך של נוזלים לבדוק את השיניים העליונות והתחתונות. איפה שיניים הם מגודלים, להרדים את העכברוש עם isoflurane (כמו בסעיף 2.1), ומניח בתנוחה אופקית
    1. מניחים חבית מזרק 1 מ"ל מאחורי teת 'כדי להגן על הרקמות הרכות. חותכים בעזרת מסור עגול כף יד (למשל, כ 3 ס"מ קוטר) במהירות סיבובית גבוהה אבל עם תנועות ידיים איטי, פירמה (לדוגמה, 3 חתכים שניות). אפשר השיניים של העכברוש להתקרר בין חתכים. ודא מסור רוטרי הוא רכוב על mandrel כך שיניים המסורות להתמודד בכיוון סיבוב. ראוי שמירה עטוף בנפרד, מעוקר מסורים רוטרי מוכן לקראת אירועים כאלה.
      הערה: צמיחת יתר יכולה להתרחש אצל חולדות קשישים גם כאשר שמר על דיאטה גלולה קשה. אנו ממליצים שיניים נבדקות בחולדות קשישים בקביעות.
  4. איפה עכברוש קשישים תערוכות הרזיה piloerection קשור לניתוח, לדון באפשרויות הטיפול עם וטרינר. שקול להרוג את החיה בצורה הומאנית. MRI של חיות כאלו יכולות להופיע גידול יותרת המוח (לעיתים קרובות חולדות נקבות קשישים) כי הוא שמיש וקטלנית.

Representative Results

קבוע MCAO הושרה על ידי craniotomy ביצוע, ואחריו קרישה והרס של עורק המוח האמצעי ידי דיאתרמיה בשילוב עם חסימה קבועה של עורק התרדמה המשותף ipsilesional ו -60 חסימה דקות של עורק התרדמה המשותף contralesional. סכמטי של ההתקנה של הציוד האפיל MCA מוצג באיור 1, ושל עורקי הראש באיור 2 (לעיל).

תוצאת השבץ הוערכה 24 שעות ו -8 שבועות לאחר אירוע מוחי על ידי מדידת היקף האוטמת על 40 x 0.5 מ"מימ פרוסים (מקצה מקורי של נורת חוש ריח כדי הסוף המקורי של חוט שדרה) באמצעות האזור של ערכת כלי ריבית בחבילת תצוגת תמונות רפואית. T2 נציג סריקה MRI מבני המשוקללים עבור אותו בעל החיים ב 24 שעות ו -8 שבועות (איור 3 א). ההיקף האוטם זוהה על-ידי האזורים במוח החולדה מראים אות hyperintense; כמו משקל T2תמונות ed להראות מים או פלזמה כאזור לבן בוהק. זה ידוע כי יש עלייה בצקת במוח הנפיחות לאחר שבץ, וזה יכול להימדד מסריקת T2-weighted אשר כבר מתואמת מדידות היסטולוגית של נפח אוטם 18. עם זאת, בצקת מתנה מוקדם לאחר שבץ (למשל, ב 24 שעות) יכולה להוביל יתר של נפח הנגע הסופי (למשל, אחרי 8 שבועות) ולכן גם אנחנו כרכי אוטם נוכחיים מתכוונים מותאמות באמצעות הנוסחות של Gerriet. האיור 3 ב מציג נתונים ממוצעים מתחילת נפח נגע הגלם (ללא התאמות) ב 24 שעות כמו 62.8 מ"מ 3 (± 25.4 מ"מ 3 SD, גרף עליון); זו תופסת 9.8% של האונה המושפע (SD ± 4.2%, גרף באמצע). כאשר תקנו עבור המוח נפיחות באמצעות נוסחאות 'Gerriets ערך זה מצטמצם ל -4.5% (± 2.0% SD, הגרף התחתון).

חומרת שבץ גם נמדדה באמצעות מבחן המדרגות מונטויה 15. בקיצור,nimals מולא מראש מאומן לאחזר כדורי סוכר למשך 4 שבועות לפני MCAO ניתוח שבץ, ונבדק במשך 8 שבועות לאחר השבץ (איור 4) כדי לאשר גירעון מתמשך. חולדות הונחו במנגנון המדרג במשך 10 דקות ומספר הכדורים לאחזר נרשם (מתוך 21 כדורים) ומוצג כאחוז (הקבוצה כאמצעי ± סטיות תקן). ניתוח רגרסיה בוצע כדי להתאים את הקו לנתונים.

איור 5 מראים את חישוב גודל המדגם באמצעות נתוני נפח אוטם (השפעות פוטנציאליות של טיפולים מועמדים), ונותח באמצעות אלגוריתם תוכנה לניתוח כוח עבור מבחן t באמצעות "הבדל בין שני אמצעי עצמאי (שתי קבוצות)" ושימוש (לא מתוקן אמצעי) וסטיות תקן מהתרשים 3B. המידע באיור 5 ולהראות טבלה 1 כי 12 חולדות יידרשו לכל קבוצה כדי לזהות טיפול המפחית infנפח arct ב -50% ב -24 שעות, בעוד איור 6 מראה "מזימת XY" של כוח מושג באמצעות מספרים של בעלי חיים שונים. טבלה 1 מסכמת חישובי גודל מדגם עבור כל נקודות הזמן.

איור 3
איור 3. MRI מבניים משוקלל T2 משמש כדי למדוד את גודל האוטם והמוח נפיחות לאחר שבץ. (א) תמונה תהודה מגנטית משוקלל T2 של hr אותו עכברוש המוח 24 ו -8 שבועות לאחר גיוס של שבץ. האזור הלבן מייצג את הנגע, אלא גם מכיל כמה בצקת vasogenic שפותר ב -8 שבועות. (ב) כרכים אוטמים נמדדו באמצעות אזור תצוגת חבילת תמונה רפואית של Toolkit הריבית, והם זממו על הגרף המייצג את הממוצע ± סטיית התקן 3 נקודות זמן השימוש (n = 6). נפח נגע גלם (לא תקן עבור מוח נפיחות בשל edEMA), הנגע אחוז בחצי הכדור מושפע (שלא תוקנו עבור נפיחות), ואחוז הנגע של האונה תיקן עבור המוח נפיחות באמצעות נוסחאות 'Gerriets מוצגים כאן. SD שמש ולא SEM כדי לבצע חישובי גודל מדגם (ראו איור 5). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4. המבחן מדרג תערוכות ליקויים לאחוז ואחזור כדוריים. במודל שבץ זה חל החלמה ספונטנית מעט מאוד. שבץ בחולדות קשישים פוגע כשרון בהתמדה, שמוצג על ידי בדיקות שבועיות באמצעות "מבחן המדרגות" של גלולת לכת. הבלעה: תמונה של עכברוש ביצוע מבחן התנהגותי. הגרף מראה את הממוצע (± עמדשגיאת ארד) מספר כדורי לאחזר (מתוך 21, מבוטא באחוזים) בשבוע על ידי בכפו הפגועה. n = 5. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
איור 5. חישובי גודל מדגם כדי לקבוע מספרי קבוצת החולדות נדרשו לזהות השפעה טיפולית רצויה. צילום מסך זה, לקוחי תוכנת ניתוח כוח, מראה כי 12 חולדות לכל קבוצה תהיינה צורך לזהות טיפול כי הקטין את היקף אוטם ב -50% ב 24 שעות. נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 6
איור 6. כוח מושג באמצעות מספרים כוללים שונים של בעלי חיים. צירוף "עלילת XY עבור מגוון של ערכים" מפני תוכנות ניתוח כוח מראה את הכח שהיה מתקבל עבור ניסויים בעזרת שונים (סה"כ) מספרים של חולדות קשישים, בהתחשב בפרמטרים 5 שמוצג באיור. טבלה 1 מסכמת את כל התוצאות שלנו. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

זמן לאחר שבץ: מספר חולדות לכל קבוצה נדרש לזהות ירידה בנפח הנגע של:
75% 50% 25%
24 שעות 6 12 42
8 שבועות 4 5 17

טבלה 1. חישובים של גודל מדגם לכל קבוצת ניסויים עתידיים היפותטי. מחושב באמצעות תוכנת ניתוח כוח (ראה איורים 5 ו -6). טבלה מציג מספר חולדות לכל קבוצה נדרש עבור ניסוי עם שתי קבוצות לזהות 25%, 50% ו -75% ירידה בנפח נגע בכל אחד מן timepoints במחקר זה.

Discussion

MCAO במכרסמים הוא טכניקה המשמש לעתים קרובות מודל שבץ אדם. האם יש מודל זה יש כמה פרטים לציין בפרוטוקול. ראשית, זה הכרחי כדי לשמור על טמפרטורת הגוף של בעל החיים לאורך הניסוי כמו זה משפיע על גודל האוטם ומספר תמותה במחקר. ייתכן שניתן יהיה להפסיק isoflurane במהלך החסימה החולפת של זכות CCA ולשמור חולדות בסביבה התחממה, שקטה כדי להגדיל את שיעורי הישרדות על ידי הקטנת חשיפת isoflurane. חוקר לבחון האם תקופת הרדמה קצרה עולה על הלחץ של אינדוקציה נוספת. כלי הדם (למשל, MCA הסתעפות) של חולדות משתנה בתוך ובין קבוצות של בעלי חיים 22. חשוב לזכור זאת כאשר מתחילים מחקר חדש. פעמי חסימת CCA שונות ניתן להעריך (למשל, 30, 45, 60 ו -90 דקות). במחקר זה זמן ספיגה של 60 דק 'משמש. במחקרים אחרים מצאנו כי 45חסימות דקות לגרום אוטם קליפת מוח בגודל דומה אבל עם ראיות אנקדוטיות שיעורי הישרדות משופרות. בהתאם לכך, יש המנתחים להתחיל עם זמן חסימה קצרה (למשל, 30 דקות) כדי לראות אם כרכי נגע נאותים (ו / או גירעונות התנהגותי חובה) מתקבלים ורק אז להגדיל פעמי חסימה במידת הצורך. גירעונות התנהגות, אין הן מאוששים חולדות מבוגרות בהשוואה לחולדות קשישים עם פעמי חסימה זהות.

MRI יכול לשמש כדי לשפוט אם (לאחר זמן ספיג מסוים) כרכי נגע מתאימים מטרות המחקר. פצע קטן היה span פחות מעשרה 0.5 מ"מ פרוסות עטרה (מתוך 40). פצע בגודל בינוני היה span בין עשר לעשרים פרוסות עטרה. פצע גדול היה span בין עשרים לשלושים פרוסות עטרה. פצע גדול מאוד היה היקף יותר משלושים של הפרוסות הארבעים. מניסיוננו, חולדות עם נגעים גדולים מאוד (יותר משלושים פרוסות) ו / או עדות acros הבקיעהיש ים קו האמצע בדרך כלל פרוגנוזה גרועה: פעמי חסימה קצרות עשויים להיחשב. MRI הוא גם שימושי להערכת מיקום האוטם: חלקם יותר caudally ממוקם וחלקם יותר rostrally ממוקם.

לטפל נוספת כאשר מפרידים העצב התועה משני עורקי הראש המשותף. Rales (צורם) עלולה להתרחש לאחר הניתוח שבץ זה יכול להיות בגלל נזק עצבי אצל בעלי חיים מסוימים, אם כי הסיבה היא כיום ברור: מניסיוננו, הפרוגנוזה היא גרועה מאוד עבור החיות האלה וזה בדרך כלל מומלץ להרוג אותם בצורה אנושית.

תוצאות המודל קבע דיאתרמיה MCAO ב אוטמים קורטיקליים לשחזור ושיעורי ההישרדות שלאחר הניתוח מקובל אצל חולדות קשישים. הטכניקה עושה, לעומת זאת, דורשת ניתוח פולשני תחת סטראו. חשוב לשמור על הטכניקה aseptic מבעלי חיים כאשר הם להתאושש היטב מהניתוח. יש להקפיד שלא לפגוע MCA תוך חשיפת ו קרישה העורק,ו נזק למשטח קליפת המוח צריך להיות ממוזער אחרת באזור החשוף של קליפת עשוי להוות חלק באזור האוטם. מומלץ לקבל ניסיון ככל האפשר כדי לבסס את ההליך כדי להשיג אוטמים עקביים ולקבוע פעמי חסימה לפני מחקר מתבצע על מנת לבדוק טיפולים מועמדים, למשל. מבצעי הניסוי צריך באקראי כל הטיפולים במהלך פעילויות ניתוח ( "אקראיות בלוק") במידת האפשר. ראוי לציין כי מודל זה אינו כרוך reperfusion MCA (אלא קשירת חולף MCA משמש במקום דיאתרמיה). תמותה יכול להיות גבוה בחולדות קשישים עם אוטמים קורטיקליים הגדולות האלה אבל זה צריך להיות אפשרי כדי להפחית תמותה באמצעות פעמים חסימה קצרה ועל ידי צמצום החשיפה להרדמה כללית במידת האפשר (למשל, במהלך חסימה). השימוש 70% N 2 O ו 30% O 2 כנשא עשוי לאפשר רמות נמוכות יותר של isoflurane לשמש: חשיפה מופחת זה isofluRANE עלול לגרום סיכויי הישרדות גבוהים יותר.

נקודה נוספת שיש לקחת בחשבון הוא כי טרשת עורקים היא תהליך הדרגתי, ואילו בפרוטוקול זה אנו לדמות את זה עם חסימה חריפה CCA. עם זאת, הצמצום משמעותי בזרימת דם וגירעונות מתמשכים לדמות occlusions טנדם המתרחש בחולי שבץ רבים. MCAO דיסטלי קבועה ללא טנדם חסימת CCA בחולדות לא מצליחה לגרום שבץ reproducibly 14: יתר על כן, ללא חסימת טנדם CCA, מוצאים אנו החלמה ספונטנית ניכרת מתרחשת דרך שמבטלים להערכה התנהגותית לטווח הארוך של טיפולי שבץ במשך 8 שבועות. לעומת זאת, אנו מראים כי דיסטלי MCAO עם טנדם חסימת CCA גורמת גירעונות לטווח ארוך בחולדות קשישים.

לסיכום, הליך זה בחולדות גורם משיכות הדומים בגודל ובמיקום לאלו לראות את מצבו של האדם, עם נכות מתמשכת שאפשר להשתמש בו כדי לאפשר בדיקה של טיפולים והבהרה הרומן מחדשמנגנוני זוג לאחר שבץ איסכמי.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Carprofen Norbrook Vm No; 02000/4229 give 0.25 mg/kg
Atropine Sulfate AmTech RXATRINJ-100
Alcohol swabs UHS 20021
Lidocaine cream (Emla) AstraZeneca 0012901 Apply a pea sized drop to the shaved neck and temporal regions
Homeothermic Blanket System Harvard Instruments 507222F
Forceps Fine Science Tools 11019-12
Isoflurane Abbott B506
Silk sutures Harvard Apparatus 723288
Cautery system Eschmann
0.25 mm Jeweler cautery forceps Eschmann 8330349
fine Dumont forceps Fine Science Tools 11251-10
Thumb driven saline drip system
Vacusafe aspirator system INTEGRA BIOSCIENCES 158320
1.6 mm coarse diamond coated Steel burrs K801 104 016
Handheld dental drill NSK NSKVMAXVRE (Handpiece NSKEX6B)
Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 15000-03
Microvascular scissors World Precision Instruments 501790
4-0 Vicryl sutures Ethicon
Vascular clip and applicator
Operating microscope Zeiss
Compact Anaesthesia System Isoflurane K/F Single Gas VetTech Solutions
Carbon Steel Scalpel blades No. 10 Swann-Morton 201
25 g needles Terumo NN-2525R
syringes (1 ml and 5 ml) Terumo SS+01T1 / SS*05SE1
Saline (Sodium Chloride 0.9%) Fresenius Kabi Pl 08828/0178
cotton buds Johnson and Johnson 5000207582502 sterilize before use
gauze sterilize before use
Medical Imaging Package (Jim) Xinapse Free software
Statistical Parametric Mapping Software (SPM8) UCL Free software
Power Analysis Software (G*Power) Universität Düsseldorf Free software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pendlebury, S. T., et al. Underfunding of stroke research: a Europe-wide problem. Stroke. 35, 2368-2371 (2004).
  2. Doyle, S., Bennett, S., Fasoli, S. E., McKenna, K. T. Interventions for sensory impairment in the upper limb after stroke. Cochrane Database Syst Rev. 6, CD006331 (2010).
  3. Reep, R. L., et al. A rodent model for investigating the neurobiology of contralateral neglect. Cogn Behav Neurol. 17, 191-194 (2004).
  4. Carey, L. M., et al. Relationship between touch impairment and brain activation after lesions of subcortical and cortical somatosensory regions. Neurorehabil Neural Repair. 25, 443-457 (2011).
  5. Mohr, J. P., Lazar, R. M., Marshall, R. S., et al. Ch. 24. Stroke: Pathophysiology, Diagnosis and Management. Mohr, J. P., et al. Elsevier. 384-424 (2011).
  6. Sacco, R. L., et al. Subarachnoid and intracerebral hemorrhage: Natural history, prognosis, and precursive factors in the Framingham Study. Neurology. 34, 847-847 (1984).
  7. Hossmann, K. A., Heiss, W. D. Ch. 1. Textbook of Stroke Medicine. Brainin, M., Heiss, W. D. Cambridge University Press. 1-27 (2009).
  8. The National Institute of Neurological Disorders and Stroke rt-PA Stroke Study Group. Tissue Plasminogen Activator for Acute Ischemic Stroke. N Engl J Med. 333, 1581-1587 (1995).
  9. Brott, T., et al. Measurements of Acute Cerebral Infarction: Lesion Size by Computed Tomography. Stroke. 20, 871-875 (1989).
  10. Lövblad, K. O., et al. Ischemic Lesion Volumes in Acute Stroke by Diffusion-Weighted Magnetic Resonance Imaging Correlate with Clinical Outcome. Ann Neurol. 42, 164-170 (1997).
  11. Norrving, B. Ch. 2. Textbook of Stroke Medicine. Brainin, M., Heiss, W. D. Cambridge University Press. 28-39 (2009).
  12. Truelsen, T., et al. Stroke incidence and prevalence in Europe: a review of available data. Eur J Neurol. 13, 581-598 (2006).
  13. Ord, E. N., et al. Positive impact of pre-stroke surgery on survival following transient focal ischemia in hypertensive rats. J Neurosci Methods. 211, 305-308 (2012).
  14. Chen, S. T., Hsu, C. Y., Hogan, E. L., Maricq, H., Balentine, J. D. A model of focal ischemic stroke in the rat: reproducible extensive cortical infarction. Stroke. 17, 738-743 (1986).
  15. Montoya, C. P., Campbell-Hope, L. J., Pemberton, K. D., Dunnett, S. B. The 'staircase test': a measure of independent forelimb reaching and grasping abilities in rats. J Neurosci Methods. 36, 219-228 (1991).
  16. Adams, F. S., Schwarting, R. K., Huston, J. P. Behavioral and neurochemical asymmetries following unilateral trephination of the rat skull: is this control operation always appropriate? Physiol Behav. 55, 947-952 (1994).
  17. Macrae, I. M. Ch. 5. Rodent Models of Stroke, Neuromethods. U, D. irnagl 47, Humana Press, Springer. 41-53 (2010).
  18. Gerriets, T., et al. Noninvasive Quantification of Brain Edema and the Space-Occupying Effect in Rat Stroke Models Using Magnetic Resonance Imaging. Stroke. 35, 566-571 (2004).
  19. Paxinos, G., Watson, C. R., Emson, P. C. AChE-stained horizontal sections of the rat brain in stereotaxic coordinates. J Neurosci Methods. 3, 129-149 (1980).
  20. Faul, F., Erdfelder, E., Buchner, A., Lang, A. G. Statistical power analyses using G*Power 3.1: tests for correlation and regression analyses. Behav Res Methods. 41, 1149-1160 (2009).
  21. Button, K. S., et al. Power failure: why small sample size undermines the reliability of neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 14, 365-376 (2013).
  22. Fox, G., Gallacher, D., Shevde, S., Loftus, J., Swayne, G. Anatomic variation of the middle cerebral artery in the Sprague-Dawley rat. Stroke. 24, 2087-2093 (1993).
  23. Tamura, A., Graham, D. I., McColloch, J., Teasdale, G. M. Focal cerebral ischemia in the rat: 1. Description of technique and early neuropathological consequences following middle cerebral artery occlusion. J. Cereb. Blood Flow Metab. 1, 53-60 (1981).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats